histoteknik dasar
TRANSCRIPT
ZULHAMDEPARTEMEN HISTOLOGI FKUSU
DISAMPAIKAN PADAKULIAH PASCASARJANA ILMU BIOMEDIK FKUSU
8 OKTOBER 2009
Histoteknik Dasar
histologi.usu.ac.id
Tujuan Pertemuan
Setelah mengikuti pertemuan ini, peserta diharapkan:
Mampu melaksanakan tissue processing;Mampu melaksanakan pewarnaan HE.
Histoteknik adalah metoda membuat sajian histologi dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk dianalisis.
Sumber Jaringan:
3.Manusia
4.Hewan
Rangkaian Proses
• Pengawetan (Fixation);• Dehidrasi (Dehydration);• Pembeningan (Clearing);• Pembenaman (Infiltration/Impregnation/Embedding);• Pengecoran (Blocking/Casting);• Pengirisan Jaringan (Sectioning);• Pewarnaan (Staining);• Perekatan (Mounting);• Pelabelan (Labelling)
1. Pengawetan
Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses:2. Menghambat proses pembusukan dan autolisis3. Pengawetan jaringan4. Pengerasan jaringan5. Pemadatan koloid6. Differensiasi optik 7. Pengaruh terhadap pewarnaan
Cara melakukan fiksasi:10.Supravital/intravital;11.Merendam dalam larutan fiksatif.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam fiksasi jaringan histologi adalah:2.Tebal irisan. 3.Volume larutan pengawet. 4.Jenis larutan pengawet.
Kelompok Zat Pengawet
Formaldehyde Formaldehyde (Formalin), Paraformaldehyde, Glutaraldehyde,
Picrates Picric Acid → Bouin’s Solution
Mercurials Helly ‘s Fluid (Zenker Formol)
Oxidizing Agents Osmium tetroxide
Alcohol Methanol, Alcohol (etanol)
Potassium Dichromate Muller
JENIS CAIRAN FIKSATIF
FORMALIN MULLER BOUIN CARNOY ZENKER FORMAL (CAIRAN HELLY) ETANOL ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN
(TELLYESNICZKY) dll
FORMALIN
Yg digunakan adalah bentuk monomer: dibuat dengan menetralkan/alkalis larutan
Mengakibatkan crosslink protein Formal saline, formal calcium, 10% neutral buffered
formalin, buffer formalin sukrosa Kelebihan dan kekurangan
Human, 10% Formalin, HE 612x
BOUIN
Mengandung asam pikrat, meledak kalau kering Mudah dikenali saat pemotongan → warna kuning Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata Jaringan mengalami pengerutan
Rat, Bouin’s Solution,HE, Testis 400x
Zenker Formol (Cairan Helly)
Mengandung merkuri klorida Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan
penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi lunak karena underfixed
Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa, mitochondria.
Rat, Helly Fluid, HE 162x
Etanol
Cytological fixatives Etanol 95% Digunakan untuk Pap test, swab Mempertahankan antigenisitas → cocok IHC
LARUTAN CARNOY
mengawetkan substansia Nissl dan glikogen daya penetrasi yang cepat Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu
diagnosis perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya untuk diagnosis kanker pada saat pembedahan. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2 jam,sedangkan potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit.
efek pengerutan: kuat
Mus musculus, Carnoy, Liver
Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan khusus•Tulang: dekalsifikasi → formic acid 8%•Kulit: teknik lendrum
• Cuci dengan air kran mengalir/alkohol 90%• Fenol 4% dalam akuades (v/v) selama 1 -3 hari
dehidrasi
Tahapan dehidrasi Cara I
Alkohol 70% 3 hari ( 3x ganti) Alkohol 95% 3 hari ( 3x ganti) Alkohol 100% 3 hari ( 3x ganti)
Cara II Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari; Alkohol 95% 2 hari ( 2x ganti); Alkohol 100 % 2 hari ( 2x ganti).
Sukrosa 20% (untuk cryostat): Sukrosa 20% selama 2 hari; Metanol: jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti etanol; Aseton : 3 x 20 menit.
PEMBENINGAN (CLEARING)
Bahan yang digunakan : Cedar wood oil; Chloroform; Benzene/benzol; Benzyl benzoat; Methyl benzoat; Xylene/xylol; Toluene
Cedar Wood Oil
Keuntungan Sifat clearing-nya paling baik. Tak mengeraskan jaringan
Jaringan yang halus sangat baik. Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan jaringan
ikat padat)
Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan)
Chloroform
Keuntungan : Paling sering dipakai
Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa menjadi keras)
Kerugian Titik akhir tak dapat dilihat dengan mata
Saat menjadi bening dan transparan tak jelas Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang
Lebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedar wood oil.
Benzyl Benzoate
Metoda : Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga jaringan
tenggelam. Jaringan menjadi bening dan transparan. Benzyl benzoat II selama 2-3 jam. Benzol-Paraffin selama ½ - 1 jam. Campuran benzol
dan paraffin cair dengan perbandingan sama. Masukkan ke dalam paraffin cair.
Methyl Benzoate
Metode : Methyl benzoat I sampai jaringan tenggelam.
Daya penetrasi lebih cepat dari benzol benzoat; Jaringan mudah rapuh.
Methyl benzoat II selama 1-2 jam. Benzol-Paraffin. Campuran benzol dan paraffin
dengan perbandingan sama. Masukkan ke dalam paraffin cair.
Benzene dan Xylene
Keuntungan Waktu clearing cepat : ½ - 1 jam. Benzene lebih lambat dari xylene tetapi kerapuhan jaringan lebih
berkurang dibanding xylene Kerugian
Karsinogenik Metode
Direndam dalam xylol 2 kali @ 1 menit hingga bening dan transparan Volume 50 – 1000 kali volume jaringan Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair
Toluene
Sama dgn xylene tetapi lebih lambat Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi
jaringan Mudah menguap
PEMBENAMAN
Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening (clearing agent) dari jaringan dan menggantikannya dengan paraffin.
Dilakukan dengan menggunakan paraffin oven Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam
jaringan sehingga saat dipotong dengan mikrotom jaringan akan robek.
Teknik Pembenaman Paraffin/ paraplast I selama 2 jam; Paraffin/ paraplast II selama 1 jam; Paraffin/ paraplast III selama 2 jam.
Setelah pembenaman, proses dilanjutkan dengan pengecoran (blocking).
PENGECORAN (BLOCKING/CASTING)
Alat Cetak : Besi potongan berbentuk L (Leuckhart) Susun 2 buah potongan besi si atas lembaran logam sehingga
membentuk ruang kubus; Tuangkan sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor; Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris; Tuangkan paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya; Hindarkan terbentuknya air bubble. Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold). Spatula untuk melekatkan blok paraffin. Beri label identitas jaringan saat blocking.
PENGIRISAN JARINGAN (SECTIONING)
Persiapan:- Microtome knive vs Microtome blade (disposable)Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu. Rekatkan blok paraffin yang akan dipotong pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel blade yang panas. Letakkan holder berikut blok preparat pada tempatnya di mikrotom.- Siapkan coated slides:
Albumin (putih telur);Gelatin;SuperFrostPoly-L-Lysine
- Waterbath berisi air hangat 55oC;- Sengkelit.
Teknik Pemotongan ketebalan + 5 – 10 µm (disesuaikan kebutuhan) Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arah
pisau sedekat mungkin; Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis, Buang pita-pita paraffin awal yang tanpa jaringan; Setelah potongan mengenai jaringan, potong blok preparat
secara hati-hati; pindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di
dalam waterbath yang diatur pada suhu 55oC; Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan
paraffin ke kaca objek; Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan
sampai saatnya untuk diwarnai.
Pewarnaan (Staining)
Pertimbangan Pewarnaan
Unsur yang akan didemonstrasikan Pigmen pengganggu
Mis: melanin → bleaching
Fixing fluid/fixatives Muller fluid → jaringan dicuci dgn air mengalir selama 24 jam Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo
Jenis Pewarnaan
Hematoxylin & Eosin (Rutin) Khusus
PAS, PTAH, Impregnasi perak Sudan → lipid
Sitologik Pap test Blood smear Swab mucosa
Imunohistokimia
Hematoxylin dan Eosin
Paling banyak digunakan → rutin HE dapat menunjukkan sebagian besar struktur
histologi Demonstrasi nuklei adalah penting Variasi dalam hasil
Hematein (oxidized hematoxylin) adalah zat warna Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam) Hematoxylin mewarnai nuclei Afinitas hematein thd nuclei adalah jelek bila tanpa mordant.
Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhir
pewarnaan Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan
Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant
Natural ripening vs artificial ripening Artificial ripening: penggunaan mordant (Al, Fe, atau
Pb) Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru
(blueing) bila diperlakukan dgn alkali lemah (air kran atau lithium carbonate)
Methods are regressive Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm Counterstain (IHC)
Hematoxylin
Penggunaan Pewarnaan Nuclei Struktur selain nuclei
Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan nuclei
1. Dellafield (1885)2. Ehrlich (1886)3. Heidenhains (1896)4. Harris (1900)5. Mayer (1903)6. Weigert (1904) 7. Carazzi (1911)8. Cole (1943)
Haematoxyllin Mixtures
Connective tissue Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin
Elastic fibers Verhoeff’s method
Myelin Kultschitzky Loyez Spielmeyer Weigert
Copper and lead Mallory Parker
Mucin Mayer’s mucihematein
PEWARNAAN (STAINING)
Formula Hematoxylin Mayer Haematoxylin kristal 1 gr Akuades 1000 ml Sodium Iodate 0,2 gr Ammonium/potassium alum 50 gr Citric acid 1 gr Chloral hydrate 50 gr
Cara pembuatan Hematoxylin Mayer Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades. Tambahkan hematoxylin dan campurkan secara baik (aduk). Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.
Eosin
Zat warna xanthene Ikatan Van der Waals Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk
membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan serabut jaringan ikat yang berbeda
Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol Jenis eosin
Eosin Y (yellowish), water soluble Eosin B (Bluish) Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)
Eosin Y
water soluble Paling banyak digunakan Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein (basa) Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat
metakromatik Terdapat dalam 2 bentuk
Monomer: merah Dimer : oranye-merah
Hasil pewarnaan Sitoplasma: merah Eritrosit : oranye-merah Nukleus piknotik: ungu Nucleolus: merah
Eosin
Formula Eosin Eosin-alkohol Stok 1% Eosin y ws 1 gr Distilled water 20 ml Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml
Working Eosin Solution Eosin-alkohol stok 1 bagian Alkohol 80% 3 bagian Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial
0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.
Mewarnai Preparat
Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit); Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) – 95% (2 menit) – 90%(2 menit)
– 80% (2 menit) – 70% (2 menit) – air kran (3 menit); Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri klorida
mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam. Deposit merkuri dapat dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan diinkubasi dalam larutan iodine 0,5% dalam etanol 70% selama 5 – 10 menit. Irisan dibilas dengan air lalu diinkubasi dalam sodium thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicuci dengan air kran mengalir.
Inkubasi dalam larutan hematoxylin Mayer selama beberapa menit; Cuci dalam air mengalir selama 15-20 menit; Observasi di bawah mikroskop, Counterstaining dengan eosin working
solution selama beberapa menit. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat
Inkubasi dalam xylol 2x2 menit. mounting dengan entelan/balsam kanada. labelling
Acid Alcohol Rinse
Mengurangi warna biru hematoxyllin (to differentiate nuclear staining)
0.25 % acid rinse Akuades 975 ml HCl 25 ml
HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)
Blueing
Air kran (yang alkalis) Jakarta: pH air kran adalah 7.8
Lithium carbonate Lithium carbonate……………….... 0,5 gr Akuades……………………………… 1000 ml Campurkan dengan baik.
TERIMA KASIH
PRAKTIKUM HISTOTEKNIK DASAR14 DAN 15 OKTOBER 2009