heksasianoferat

8/2/2019 heksasianoferat

1/28

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tumbuhan Jengkol

2.1.1. Morfologi Tumbuhan Jengkol

Tumbuhan Jengkol atau lebih dikenal dengan tumbuhan Jering adalah termasuk dalam

FamiliFabaceae (suku biji-bijian). Tumbuhan kulit buah jengkol atau Jering dengan

nama latinnya yaitu (Pithecellobium lobatum Benth.) dengan sinonimya yaitu A.

Jiringa, Pithecollobioum jiringadan

Archindendron pauciflorumadalah tumbuhan

khas di wilayah Asia Tenggara. Jengkol merupakan salah satu tumbuhan dengan

ukuran pohon yang tinggi yaitu 20 m , tegak bulat berkayu, licin, percabangan

simpodial, cokelat kotor. Bentuk majemuk, lonjong, berhadapan , panjang 10 - 20 cm,

lebar 5 - 15 cm, tepi rata, ujung runcing, pangkal membulat, pertulangan menyirip,

tangkai panjang 0,5 1 cm, warna hijau tua. Struktur majemuk, berbentuk seperti

tandan, diujung dan ketiak daun, tangkai bulat, panjang 3 cm , berwarna ungu

kulitnya, bentuk buah menyerupai kelopak mangkok, benang sari kuning, putik

silindris, kuning mahkota lonjong, putih kekuningan. Bulat pipih berwarna cokleat

kehitaman, berkeping dua dan berakar tunggang. Pohon Jengkol sangat bermanfaat

dalam konservasi air disuatu tempat hal ini dikarenakan ukuran pohonnya yang sangat

tinggi.

2.1.2. Klasifikasi Ilmiah Jengkol adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Divisi : Magnoliophyta (berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (dikotil)

Ordo : Fabales

Famili : Mimosaceae (polong-polongan)

Genus : Pithecollobium

Spesies : Pithecollobium lobatum (Benth.) (Steenis, V., 2005)

Universitas Sumatera Utara


2/28

2.1.3. Manfaat kulit buah tumbuhan Jengkol

Salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai tumbuhan obat adalah kulit buah

tumbuhan Jengkol (Pithecollobium lobatum Benth.). Bagian dari Jengkol yang

digunakan adalah kulit buahnya yang dapat dimanfaatkan sebagai obat diabetes (gula

darah).(id.wikipedia.org/wiki/Jering) dan dapat digunakan sebagai herbisida alami

untuk menekan pertumbuhan gulma yang mengganggu pertanian.

(http://bdpunib.org/bdp/abstrak/2005/budinur.html)

2.2. Senyawa Flavonoida

2.2.1. Pendahuluan

Istilah senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan,

yang mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua

penyulih (pengganti) hidroksil. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air

karena umumnya mereka sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida, dan

biasanya terdapat vakuola sel (membran sel).

Beberapa ribu senyawa fenol alam telah diketahui strukturnya. Flavonoida

merupakan golongan terbesar, tetapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoida, dan

kuinon fenolik juga tertdapat dalam jumlah besar. Beberapa golongan bahan polimer

penting alam tumbuhan lignin, melanin, dan tanin adalah senyawa polifenol dan

kadang-kadang satuan fenolik dijumpai pada protein, alkaloida, dan diantara

terpenoida. Peranan beberapa golongan senyawa fenol sudah diketahui (misalnya

lignin sebagai bahan pembangun dinding sel, antosianin sebagai pigmen bunga),

sedangkan peranan senyawa yang termasuk golongan lain masih merupakan hasil

dugaan belaka. Flavonol. Misalnya, tampaknya penting pada pengaturan pengendalian

tumbuh pada tanaman kacang,Pisum sativum. Pengaruhnya yang merugikan terhadap

kebiasaan makan serangga telah menunjukkan bahawa flavonoida mungkin

merupakan faktor pertahanan alam.

http://bdpunib.org/bdp/abstrak/2005/budinur.htmlhttp://bdpunib.org/bdp/abstrak/2005/budinur.html


3/28

Bagi biokimiawan tumbuhan, senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan

gangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melalui

ikatan hidrogen. Bila kandungan sel tumbuhan bercampur dan membran menjadi

rusak selama proses isolasi, senyawa fenol cepat sekali membentuk kompleks dengan

protein. Akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja enzim pada ekstrak

tumbuhan kasar. Sebaliknya, fenol sendiri sangat peka terhadap oksidasi enzim dan

mungkin hilang pada proses isolasi akibat kerja enzim fenolase yang terdapat dalam

tumbuhan. Ekstraksi senyawa fenol-tumbuhan dengan etanol mendidih biasanya

mencegah terjadinya oksidasi enzim, dan prosedur ini seharusnya dilakukan secara

rutin.

Cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan

menambahkan larutan besi (III) klorida 1% dalam air atau etanol kepada larutan

cuplikan, yang menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat.

Cara ini, yang dimodifikasi dengan menggunakan campuran segar larutan besi (III)

klorida 1% dalam air dan kalium heksasianoferat (III) 1%, masih tetap digunakan

secara umum untuk mendeteksi senyawa fenol pada kromatogram kertas. Tetapi,

kebanyakan senyawa fenol (terutama flavonoida) dapat dideteksi pada kromatogram

berdasarkan warnanya atau fluoresensinya dibawah lampu UV, warnanya diperkuat

atau berubah bila diuapi amonia. Pigmen fenolik berwarna dan warnanya ini dapat

terlihat jadi, mudah disimak (dipantau) selama proses isolasi dan

pemurnian.(Harborne, 1987)

Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang

mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzene yang dihubungkan

menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon. Senyawa-senyawa

flavonoida adalah senyawa 1,3 diaril propana, senyawa isoflavonoida adalah 1,1 diaril

propana. Istilah flavonoida deiberikan pada suatu golongan besar senyawa yang

berasal dari kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon; suatu

jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto, dan atom karbon

benzil yang terletak disebelah cincin B. Senyawa heterosiklik ini, pada tingkat

oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk



4/28

yang mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi paling rendah dan dianggap

sebagai struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini. (Manitto,

1981)

Semua varian falvonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama,

yang memasukkan substrat dari alur sikimat dan alur asetat-malonat (Hahlbrock &

Grisebach, 1975; Wong, 1976), flavonoida pertama dihasilkan segera setelah kedua

alur itu bertemu. Sekarang, flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk pada

biosintesis ialah khalkon (Hahlbrock, 1980), dan semua bentuk lain diturunkan

darinya melalui berbagai alur. Modifikasi flavonoida pengurangan) hidroksilasi;

metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; isoprenilasi gugus hidroksil atau inti

flavonoida; metilenasi gugus orto- dihidroksil; dimerisasi (pembentukan

biflavonoida); pembentukan bisulfate; dan

O7

O

A C

B8

6

5

6'

5'

4'

3'

2'

1'2

1

9

104

3

(8a)

(4a)

yang terpenting, glikosilasi gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida)

atau inti flavonoida (pembentukan flavonoida C-glikosida).(Markham, 1988)

2.2.2. Struktur dasar Senyawa Flavonoida

Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti

fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat

digambarkan sebagai berikut :



5/28

C

C

C

A B

Kerangka dasar senyawa flavonoida

Cincin A adalah karakteristik phloroglusinol atau bentuk rosorsinol tersubstitusi.

HOO

C3

A

C6 (B)

Namun sering terhidroksilasi lebih lanjut :

OCH3

O

C3

OCH3

H3CO

H3CO

C6 (B)

A

Cincin B adalah karakteristik 4-,3,4-,3,4,5- terhidroksilasi

R

R

R

C3C6(A) B R = R' =H, R' = OH

R = H, R' = R" = OH

R = R' = R" = OH

(juga, R = R' = R"= H) (Sastrohamidjojo, 1996)

2.2.3. Klasifikasi Senyawa Flavonoid

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita

serapan yang kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,

umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida.

(Harborne, 1996). Pada flavonoida O-glikosida, suatu gugus hidroksil flavonoida (atau

HO O

C3

OH

A

C6 (B)

HOO

C3

A

C6 (B)HO

OH



6/28

lebih) terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan yang tahan asam. Glukosa

merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat

adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Waktu yang diperlukan

untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoida O-glikosida dengan hidrolisis

asam ditentukan oleh sifat gula tersebut.

Pada flavonoida C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoida dan

dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzene dengan suatu ikatan

karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan

pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoida, misalnya pada orientin. (Markham,

1988).

Flavonoid memiliki dua cincin benzene yang dipisahkan oleh sebuah unit

propane dan diturunkan dari senyawa flavone. Secara umum merupakan golongan

senyawa yang mudah larut dalam air. Kebanyakan senyawa terkonjugasi yang pada

umumnya berwarna cerah. Secara umum dapat dijumpai pada tumbuhan sebagai

glikosidanya yang meiliki struktur yang rumit. Perbedaan kelas antara golongan

senyawa flavonoida ini adalah adanya tambahan oksigen yang terikat pada cincin

heterosiklik dan gugus hidroksil. Senyawa yang termasuk dalam golongan tersebut

adalah katekin, leukoantosianidin, flavanone, flavanonol, flavone, antosianidin,

flavonol, khalkone, aurone, dan isoflavone. Struktur antara katekin dan

leukoantoasianidin memiliki struktur yang mirip dan jarang dijumpai bentuk

glikosidanya. Dan akan mengalami polimerisasi membentuk tanin yang terkandung

pada daun teh.

Flavanon dan flavanonol jarang dijumpai dalam bentuk glikosidanya. Flavon

dan flavonol secara luas terdistribusi sebagai senyawa fenolik. Antosianin adalah

pigmen tumbuhan yang secara umum berwarna merah dan jarang dijumpai berwarna

biru pada suatu bunga. Dan dapat dihasilkan sebanyak 30% dari bunga kering. Dapat

dijumpai sebagai glikosida. Khalkone termasuk butein, dengan cincin furan ditemukan

dalam senyawa flavonoid, meskipun hal ini sering digunakan sebagai titik pengkontrol



7/28

untuk pH. Auron merupakan pigmen berwarna kuning emas yang secara umum

dijumpai pada bunga. (Kaufman,P. 1999).

Isoflavone yang lebih dikenal sebagai 3- phenylkromon Dapat diketahui ada

sekitar 35 jenis isoflavone yang dikenal, yang mana contoh umumnya sebagai berikut

:Daidzein, Genistein, Tianlancuayin. Isoflavone dapat mengalami degradasi dengan

danya penambahan basa sehingga menghasilkan Desoxybenzoin dan asam formiat

selanjutnya Desoxybenzoin terpisah dan mengalami fusi (penggabungan dua inti

ringan menjadi inti yang lebih berat molekulnya) basa dan metilasi. Isoflavone banyak

digunakan sebagai estrogenic, insectidal, dan sebagai anti jamur, beberapa dari

senyawa itu adalah berpotensi dihasilkan dari racun ikan. (Raphael,I. 1991)

Menurut Robinson (1955), flavonoid dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman

pada rantai C3 yaitu :

1. Flavonol

Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon

flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai

antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan

merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana

basa dioksidasi oleh udara tetapi begitu cepat sehingga penggunaan basa pada

pengerjaannya masih dapat dilakukan.

O

O

OH

H

H

Struktur Flavonol



8/28

2. Flavon

Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-

hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi

warnaya. Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenis

glikosida pada flavonol. Flavon yang paling umum dijumpai adalah epigenin dan

luteolin. Luteolin merupakan zat warna yang pertama kali dipakai Eropa. Jenis yang

paling umum adalah 7-glikosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula

melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap

sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.

7

8 O

O

6

5

10

9

1

2

1'

2'

6'

5'

4'

3'

4 3

Struktur Flavon

3. Isoflavon

Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai

fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai

pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya

tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein)

memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi ammonia, tetapi

kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan ammonia

berubah menjadi cokelat.



9/28

O

O

Struktur Isoflavon

4. Flavanon

Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga.

Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah

jeruk; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat

dalam buah anggur dan jeruk.

O

O

Struktur Flavanon

5. Flavanonol

Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika

dibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena

konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.

O

O

OH

Struktur Flavanonol



10/28

6. Katekin

Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.

Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir

dan daun teh kering yang mengandungkira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai

antioksidan.

OH

OH

O

OH

HO

HO

Struktur Katekin

7. Leukoantosianidin

Leukoantosianidin merupakan senyawa tidak berwarna, terutama terdapat pada

tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat glikosida, contohnya melaksidin,

apiferol.

O

OH

OHHO

Struktur Leukoantosianidin

8. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam

tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab

hampir semua warna merah jambu, merah marak, ungu,. dan biru dalam daun, bunga,

dan buah pada tumbuhan tingkat tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan

turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari



11/28

pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau

dengan metilasi atau glikosilasi.

O

OH Struktur Antosianin

9. Khalkon

Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna cokelat kuat dengan sinar UV

bila dikromatografi kertas. Aglikon flvon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena

hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas

dalam pengembang air. (Harborne, 1996).

O

Struktur Khalkon

10. Auron

Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita.

Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi

kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah

menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. (Robinson, 1995)

O

O

HC

Struktur Auron



12/28

Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana

semua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan

semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni :

Golongan

FlavonoidaPenyebaran Ciri Khas

Antosianin

Proantosianidin

Flavonol

Flavon

Glikoflavon

Biflavonil

Khalkon dan Auron

Flavanon

Isoflavon

Pigmen bunga merah marak, danbiru juga dalam daun dan jaringan

lain.

Terutama tidak berwarna dalam

tumbuhan berkayu.

Terutama ko-pigmen tidak

berwarna dalam bunga sianik danasianik; tersebar luas dalam daun.

Seperti flavonol

Seperti flavonol

Tidak berwarna; hampir

seluruhnya terbatas pada

gimnospermae(tumb.berbiji

terbuka)

-

Kadang-kadang terdapat juga

dalam jaringan lain.

Tidak berwarna; dalam daun dan

buah (terutama dalam Citrus) tidak

berwarna; sering kali akar; hanya

terdapat dalam satu suku,

Leguminosae(tumb. Kacang-

kacangan).

Larut dalam air, maks 51 5-545nm, bergerak dengan BAA pada

kertas.

Menghasilkan antosianidin

(warna dapat diekstraksi dengan

amil alkohol) bila jaringan

dipanaskan dalam HCl 2Mselama setengah jam.

Setelah hidrolisis, berupa bercak

kuning murup pada kromatogramForestal bila disinari dengan sinar

UV; maksimal spektrum pada

330-350.

Setelah hidrolisis, berupa bercak

cokelat redup pada kromatogram

Forestal maksimal spektrum pada

330-350 nm.Mengandung gula yang terikat

melalui ikatan C-C; bergerakdengan pengembang air, tidakseperti flavon biasa.

Pada kromatogram BAA berupa

bercak redup dengan Rf tinggi.

Dengan ammonia berwarna

merah; maksimal spektrum 370-

410 nm.

Berwarna merah kuat dengan

MgHCl kadang-kadang sangat

pahit.

Bergerak pada kertas dengan

pengembang air, tak ada uji

warna yang khas.



13/28

2.2.4. Metoda Isolasi Senyawa Flavonoida

Isolasi konstituen flavonoida dari tumbuhan akar serabut Glyccyrrhiza glabra pada

isolasi ini yang diisolasi adalah senyawa licoagrodin dan turunannya. Pada dasarnya

ekstrak methanol akar serabut tumbuhan G. glabra yang dipartisi antara air dan etil

asetat.Ekstrak etil asetat diteruskan untuk dipisahkan dengan menggunkan

kromatografi kolom dengan menggunakan silika gel dan selanjutkan dimurnikan

dengan menggunakan Fase-Normal HPLC untuk menghasilkan 5 jenis flavonoida

baru, licoagrodin, licoagrokalkone B, licoagrokalkone C, licoagrokalkone D ,

licoagroaurone dan 4 flavonoid yang dikenal lainnya ialah licoakalkone C. Lapisan

air dilanjutkan untuk dianalisa dengan kromatografi kolom Daion HP-20, yang dielusi

dengan menggunakan methanol. Eluate methanol dievaporasi vakum untuk

menghasilkan sebuah fraksi glikosida. Fraksi tersebut akan dianalisa dengan

kromatografi kolom ODS. (Yoshikawa,T.2000).

2.2.5. Sifat Kelarutan Flavonoida

Aglikon Flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa

fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat,

bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang

terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih(terganti), atau

suatu gula, flavonoida merupakan senyawa polar, dan seperti kata pepatah lama

mengatakan suatu golongan akan melarutkan golongannya sendiri maka

umumnya flavonoida larut cukupan dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH),

methanol(MeOH), butanol(BuOH), aseton, dimetilsulfoksida(DMSO),

dimetilformamida(DMF), air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida

(bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah

larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut diatas dengan air merupakan

pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti

isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih

mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.



14/28

2.3. Teknik Pemisahan

Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akan

ditentukan berad dalam keadaan murni, t idak tercampur dengan komponen-komponen

lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan :

1. Pemisahan Kimia

Pemisahan ini berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat

fisika

komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.

2. Pemisahan Fisika

Pemisahan ini berdasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat

fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan.

(Muldja, 1995).

2.4. Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan

dipisahkan terdistribusikan antara 2 fase, satu dari fase-fase ini membentuk lapisan

stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang

merembes lewat.

Fase stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fase yang

bergerak mungkin suatu cairan atau suatu fase gas. Cara-cara kromatografi dapat

digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam, yang dapat berupa zat padat atau

zat cair. Jika fase diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat

cair atau gas maka ada empat macam system kromatografi yaitu :

1. Fase gerak cair-fase diam padat (kromatografi serapan)

a. Kromatografi Lapis Tipis

b. Kromatografi Penukar Ion

2. Fase gerak gas-fase diam padat, yakni kromatografi gas padat

3. Fase gerak cair-fase diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografi

kertas

4. Fase gerak gas-fase diam zat cair, yakni :

a. Kromatografi Gas-Cair

b. Kromatografi Kolom Kapiler



15/28

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa-

senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam dalam

perbandingan yang sangat berbeda-beda dari suatu senyawa terhadap senyawa yang

lain. (Sastrohamidjojo, 1991).

2.4.1. Kromatografi Lapis Tipis

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon Stahldengan

menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis.

KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi

partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera popular

karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang diperlukan sedikit,

murah, sederhana, waktu, analisis cepat dan daya pisah cukup baik. (Sudjadi, 1986)

2.4.1.1 Pembuatan Lapisan Tipis

Dalam pembuatan lapisan tipis digunkan plat-plat kaca yang memiliki ukuran 20 x 5

cm atau 20 x 20 cm, dan ukuran ini dianggap standart. Plat ini dicuci terlebih dahulu

dengan air dan detergen kemudian dikeringkan dengan aseton. Selanjutnya membuat

penyerap menjadi bubur dengan air, biasanya dalam perbandingan x gram penyerap

dan 2x ml air. Bubur diaduk dengan baik dan dibentangkan di atas plat kaca dengan

berbagai cara. Tebal standart adalah 250 mikron. Lapisan-lapisan yang lebih tebal

(0,5 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan

menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20 x 20 cm. Salah

satu keukaran dengan lapisan tebal ialah adanya tendensi mengelupas bila

kering.(Sastrohamidjojo, 1985)

Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam

kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :



16/28

1. Silika gel

Ada beberapa jenis silika gel, yaitu :

a. Silika gel G

Silika gel G adalah silika gel yang mengandung 13 % kalsium sulfat sebagai

perekat. Jenis silika gel ini biasanya mengandung ion logam, terutama ion besi.

Kandungan ion besi dapat dihilangkan dengan mengembangkan plat TLC silika gel G

dengan sstem pelarut metanol : asam HCl pekat 9 : 1.

b. Silika gel H

Perbedaan silika gel G dan silika gel H ialah, bahwa silika gel H tidak

menngandung perekat kalsium sulfat. Silika gel H dipakai untuk pemisahan yang

bersifat spesifik, terutama lipida netral.

c. Silika gel PF

Jenis silika gel ini diketemukan belakangan, yang dibuat sedemikian rupa

sehingga senyawa-senyawa organik terikat pada plat ini dapat mengadakan

fluoresensi. Oleh karena itu visualisasinya dapat dikerjakan dengan menempatkan plat

yang telah dikembangkan di dalam ruangan gelap atau dengan sinar ultra violet yang

bergelombang pendek.

2. Alumina

Penggunaan alumina dalam TLC, yang semula diperkenalkan oleh peneliti dari

Cekoslowakia, tidak sesering silika gel. Sebenarnya alumina netral mempunyai

kemampuan untuk memisahkan bermacam-macam senyawa, seperti terpena, alkaloid,

steroid, dan senyawa-senyawa alisklik, alifatik, serta aromatik. Sebagai zat perekat

alumina tidak mengandung zat perekat, memepunyai sifat alkalis dan dapat

digunakan baik tanpa maupun dengan aktivasi.



17/28

3. Kieselguhr

Kieselguhr merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika gel dan alumina,

oleh karena itu lebih cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa polar. (Adnan, M.,

1997)

Nilai utama KLT pada penelitian flavonoid ialah sebagai cara analisis cepat

yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, KLT memiliki peranan

penting dalam metoda pemisahan dan isolasi yaitu :

a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom

b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom

c. Menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi

d. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi

e. Isolasi flavonoida murni skala kecil.

2.4.2. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom atau tabung merupakan salah satu jenis pemisahan dengan

menggunakan prinsip aliran zat cair (pelarut) yang dipengaruhi oleh gaya tarik bumi

(gravitasi bumi) atau dikenal dengan sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari

kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur

aliran pelarut.(Gritter, 1991) . Pada isolasi flavonoida sebaiknya digunakan kolom

skala besar karena hal ini dapat meningkatkan proses pemisahan yang baik. Pada

dasarnya cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) di atas

kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulose, silika, atau poliamida),

dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok.

Kolom yang digunakan umumnya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keran

pada salah satu ujung, dan ukurannya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengah

terhadap panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30. Kemasan kolom harus

dipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi kolom karena ukuran

partikel penting. Jika ukuran partikel terlalu kecil, laju aliran pengelusi mungkin

terlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen secara



18/28

kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam ukuran 100-300mesh.

Selulosa

(Markham, 1988)

2.4.2.1. Pengisian Kolom

Pengisian kolom harus dikerjakan dengan seragam.Setelah adsorben

dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dalam kolom dengan menggunakan

vibrator atau dengan plunger (pemadat). Selain itu dapat juga dikerjakan dengan

memasukkan adsorben dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkan

mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam akan menghasilkan rongga-rongga

di tengah-tengah kolom. Cara untuk mengatasi masalah ini adalah dengan

mengadakan back fushing , sehingga terjadi pengadukan, yang seterusnya dibiarkan

lagi mengendap. Pada bagian bawah (dasar) dan atas dari isian kolom diberi wol kaca

(glass wool) atausintered glass disc untuk menyangga isian. Bila kolom telah diberi

bahan isian, permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahan

isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung udara

masuk ke kolom. (Adnan,M., 1997)

2.4.2.2. Memilih Kemasan Kolom

Kemasan kolom yang tersedia sangatlah banyak dan senarai di bawah memberikan

pedoman mengenai pemakaian dan cirri sejumlah jenis kemasan yang berguna.

Pemakaian selulosa serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk memisahkan

glikosida yang satu dengan yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon,

serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah.

SilikaBahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar,

misalnya isoflavon, flavanon, metal flavon, dan flavanol. Kapasitas

pertengahan.



19/28

PoliamidaBahan ini cocok untuk memisahkan semua flavonoid, meski juga ideal untuk

memisahkan glikosida. Merupakan pelengkap untuk KKt karena melibatkan

penyerap dan pengembang yang berlainan. Sebelum dipakai harus dicuci

dengan MeOH dan H2O agar poliamida yang larut tidak mencemari semua

fraksi. Kapasitas tinggi.

Gel sephadex (deret G)Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada

ukuran molekul (bila digunkan pelarut air); molekul besar terlebih dahulu.

Sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot

molekulnya. Kapasitasnya lebih besar karena ukurannya lebih teratur.

2.4.3. Kromatografi Preparatif

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan yang paling

murah dan memakai peralatan yang paling dasar ialah kromatografi lapis titpis

preparatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah

gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. KLTP bersama-sama

dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi

mengenai isolasi bahan alam, terutama dari laboratorium yang tidak dilengkapi

dengan cara pemisahan modern. Akan tetapi, seperti yang akan diterangkan kemudian,

tertdapat banyak masalah pada KLTP.

PenyerapDalam KLTP digunakan ketebalan adsorbent yang paling sering dipakai yaitu

0,5-2 mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.

Peneyerap yang paling umum ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan

campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil.

Penotolan Cuplikan



20/28

Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP.

Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri/organik (heksana, diklorometana, etil

asetat), karena jika pelarut kurang atsiri maka akan terjadi pelebaran pita.

Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%.

Pemilihan Fase GerakPilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai

KLT analitik. Karena ukuran partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang

dipakai pada plat KLT dapat dipakai langsung pada KLTP. Pengembangan

pelat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung

beberapa plat.

Isolasi senyawa yang sudah terpisahKebanyakan penyerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang

membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang

dipisahkan menyerap sinar UV. Akan tetapi, beberapa indikator menimbulkan

masalah yaitu bereaksi dengan asam kadang-kadang bahakan dengan asam

asetat.

Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa pilihan :

a). Menyemprot dengan air (misalnya saponin)

b). Menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan

pereaksi semprot

c). Menambahkan senyawa pembanding. (Hostettman,K.,1995)

2.4.4. Harga Rf ( Retension factor)

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik

dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi warna. Lazimnya identifikasi

menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila

dibandingkan pada kertas.



21/28

Dapat didefenisikan sbb :

Harga Rf =

Faktor-faktor yang memepengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang

juga mempengaruhi harga Rf :

1). Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan

2). Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya

3). Tebal keraataan dari lapisan penyerap

4). Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa gerak

5). Derajat kejenuhan dari uap

6). Jumlah cuplikan yang digunakan

7). Suhu

8). Kesetimbangan

9). Teknik percobaan (Sastrohamidjojo, 1985)

2.4.5. Ekstraksi

Ekstraksi dapat dilakukan pada bahan tumbuhan yang akan diisolasi. Umumnya kita

perlu membunuh jaringan tumbuhan untuk mencegah terjadinya oksidasi enzim atau

hidrolisis. Mencelupkan jaringan daun segar atau bunga, bila perlu dipotong-potong,.

Kedalam etanol mendidih adalah salah satu cara yang baik untuk mencapai tujuan.Selanjutnya, bahan dapat dimaserasi dalam suatu pelumat, lalu disaring. Bila

mengisolasi senyawa dari jaringan hijau, keberhasilan ekstraksi dengan alkohol

berkaitan langsung dengan seberapa jauh klorofil tertarik oleh pelarut itu. Bila ampas

jaringan, pada ekstraksi ulang, sama sekali tak berwarna hijau lagi, dapat dianggap

semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. (Harborne, 1987)



22/28

2.5. Teknik Spektroskopi

Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati

tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam

instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer.

Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut

sebagai\ spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor

yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer. (Muldja, 1955)

Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus

fungsi dalam suatu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi

tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi

yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen.

Kombinasinya dan data yang ada kadang-kadang menentukan struktur yang lengkap

dari molekulnya yang tidak diketahui. (Pavia, 1979)

2.5.1. Spektroskopi Ultra Violet-Visible

Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan

intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar

ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan

electron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis

biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan.

Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak

berada pada panjang gelombang 400-800 nm. (Dachriyanus, 2004)

Spektrum flavonoida bisanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut

methanol (MeOH, AR atau yang setara) atau etanol (EtOH), meski perlu diingat

bahwa spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan. Spektrum khas

terdiri atas dua maksimal pada rentang 240 285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I).

Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memebrikan informasi



23/28

yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum

tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon,

dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron,

dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi.

Tabel Rentangan serapan spektrum UV-tampak flavonoida

Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis flavonoida

250-280

250-280250-280245-275

275-295

230-270(kekuatan rendah)

230-270(kekuatan rendah)

270-280

310-350

330-360350-385310-330 bahu kira-

kira320 puncak

300-330 bahu340-390

380-430

465-560

Flavon

Flavonol (3-OH tersubstitusi)Flavonol(3-OH bebas)Isoflavon

Isoflavon (5-deoksi-6,7-deoksigenasi)Flavanon dan dihidroflavanol

Khalkon

Auron

Antosianidin dan antosianin

(Markham, 1988)

Dibawah ini daftar beberapa pengaruh substituent untuk senyawa aromatik. Hal ini

dapat menjadi catatan bahwa ion phenoxide (-O-), yang dapat dijunpai dalam larutan

basa senyawa fenol, dimana dapat menyerap panjang gelombang yang lebih panjang

dari pada senyawa induk fenol (-OH). Secara umum menyumbangkan elektron dan

substituent pasangan sunyi (lone pair) yang dapat menyebabkan pergeseran kimia

berwarna merah dan penyerapan yang lebih tinggi. Senyawa kompleks memiliki

pergeseran kimia yang meningkat saat ada sejumlah lebih substituent yang terikat.



24/28

Tabel. Absorbsi max untuk beberapa monosubstitusi benzene Ph-R (methanol :

air)

R maksimum (nm)

-H 204 254

-CH3 207 261

-Cl 210 264

-OH 211 270

-OCH3 217 269

-CO2- 224 271

-COOH 230 280

-NH2 230 280

-O- 235 287

(Kealey,D. 2002)

Absorbsi radiasi UV oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzene terpadu

bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknya

cincin itu karena bertambahnya konjugasi dan membesarnya stabilisasi-resonansi dari

keadaan eksitasi. Daerah yang paling berguna dari spektrum UV adalah daerah dengan

panjang gelombang di atas 200 nm. Dalam absorbsi yang ditimbulkan oleh senyawa

aromatik dihasilkan warna dalam spektrum tampak. Warna merupakan hasil dari suatu

perangkat kompleks (dari) respons faali maupun psikologis terhadap panjang

gelombang cahaya antara 400-750 nm, yang jatuh pada selaput jala.

Tabel. Warna dalam spektrum tampak

maks (nm) Warna Warna komplementer(substraksi)

400-424 Ungu Hijau-kuning

424-491 Biru Kuning

491-570 Hijau Merah

570-585 Kuning Biru

585-647 Jingga Hijau-biru

647-700 Merah Hijau

(Fessenden,F. 1986)



25/28

Tabel Pita absorbsi UV dari flavonoida

No. Jenis Flavonoida Struktur Umum Pita II Pita I

1. Flavon

7

8 O

O

6

5

10

9

1

21'

2'

6'

5'

4'

3'

4 3

240-285 304-350

2. Flavonol

O

O

OH

240-285 352-390

3. Flavanon

O

O 270-295 300-350

4. Dihidroflavonol

O

O

OH

R2

R1

270-295 300-320

5. Khalkon O 220-270 340-390

6. Auron

O

O

HC

220-270 370-430

7. Antosianidin

O

OH 270-280 465-550

(Sujata,V., 2005)



26/28

2.5.2. Spektrofotometri Infra Merah (FT-IR)

Radiasi infra merah ditemukan oleh Sir William Hercshel pada tahun 1880, yang

melaporkan penemuannya kepada Royal Society. Pada waktu itu para saintis belum

memahami secara jelas keadaan transisi. Daerah inframerah terletak antara spektrum

electromagnetic cahaya tampak dan spektrum radio; yakni antara 4.000-400 cm-1.

Mulai tahun 1903 William dan N. Coblentz mahasiswa di Cornel University

memperbaiki teknik-teknik percobaan dan menyusun sederetan spectra serapan zat

murni.

a. Ada beberapa daerah penyerapan terpenting dalam Spektrum Infra Merah :

1. Daerah vibrasi regang hidrogen : 3.700-2.700 cm-1.

3.700 3.100 cm-1, serapan oleh vibrasi regang O-H dan N-H. Serapanoleh vibrasi lentur O-H biasanya terdapat pada bilangan gelombang

lebih besar dan pita serapannya dalam spektrum sering lebih lebar dari

pita serapan N-H.

3.200 2.850 cm-1, daerah vibrasi regang C-H alifatik.

2. Daerah vibrasi regang ikatan ganda tiga, 2.700 1.850 cm-1

Gugus fungsional yang menyerap di daerah ini terbatas, karena itu ada atau

tidaknya serapan tersebut dalam suatu molekul dapat dilihat.

3. Daerah ikatan ganda dua, 1.950 1.550 cm-1

Vibrasi regang untuk ikatan ganda dua, yaitu :

- C = C , - C = N -, 1690 1600 cm-1 1.650 1.450 cm-1, puncak serapan dalam daerah ini memberi keterangan

yang penting mengenai cincin aromatik.



27/28

4. Daerah sidik jari finger print, 1.500 700 cm-1

Beberapa frekuensi gugusan (group frequency) juga bisa ditemukan di daerah sidik

jari ini : C-O-C (vibrasi regang) dalam eter, ester kira-kira 1.200 cm-1 dan vibrasi

regang C-Cl pada 700 800 cm-1

. Pada bilangan gelombang dibawah 1.200 cm-1

terdapat puncak-puncak serapan beberapa gugusan anorganik seperti : sulfat, fosfat,

nitrat dan karbonat.

b. Vibrasi kerangka suatu molekul (skeletal vibrations)

Vibrasi kerangka terletak di derah spektrum lebih dari 1.500 cm-1. Kelompik-

kelompok vibrasi di daerah spektrum kecil dari 1.500 cm-1

adalah :

a. Vibrasi regang (stretching) ikatan ganda yang tidak mengandung atom C

b. Vibrasi regang ikatan tunggal

c. Vibrasi-vibrasi lentur (bending) (Noerdin, 1985)

2.5.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Spektrometri Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan

alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan

informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam. Struktur NMR memberikan

informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam

setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom

hydrogen.(Cresswell,1982)

Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua

proton-proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa

kadang-kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa

memberikan penaikan menjadi puncak absorbsi tunggal dalam spektrum

NMR.(Bernasconi,1995)

Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalah

tetrametilsilana (TMS). Senyawa ini mempunyai beberapa kelebihan; lamban secara



28/28

kimia, isotop magnet, serta larut dalam kebanyakan pelarut organik; TMS meberikan

puncak serapan tajam tunggal serta menyerap pada medan lebih tinggi daripada semua

proton organik. (Silverstein, 1974).

Si CH3

CH3

CH3

H3C

Pada spektormetri NMR integrasi sangat penting. Harga integrasi

menunjukkan daerah atau luas puncak dari tiap-tiap proton. Sedangkan luas daerah

atau luas puncak tersebut sesuai dengan jumlah proton. Dengan demikian

perbandingan tiap integrasi proton sama dengan perbandingan jumlah proton dalam

molekul. (Muldja, 1955)

Di dalam medan magnet, perputaran elektron-elektron valensi dari proton

menghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan. Hingga

setiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang digunakan dan

bahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada kerapatan elektron yang

mengelilingnya. Makin besar kerapatan elektron yang mengelilingi inti, maka makin

besar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan yang digunakan. Akibat

secara keseluruhan adalah inti/proton merasakan adanya pengurangan medan yang

mengenainya. (Sastrohamdijojo, 1991)

heksasianoferat

Documents