galur cabai transgenik toleran kekeringan … filepernyataan mengenai disertasi dan sumber informasi...
TRANSCRIPT
GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN DENGAN GEN P5CS
PENYANDI ENZIM KUNCI BIOSINTESIS PROLINA: REGENERASI DAN KARAKTERISASI REGENERAN
YUSNIWATI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2008
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul : “Galur Cabai
Transgenik Toleran Kekeringan dengan Gen P5CS-Penyandi Enzim Kunci
Biosintesa Prolina : Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran” adalah karya
saya sendiri dengan arahan Komisi Pembimbing dan belum pernah diajukan
dalam bentuk apapun untuk memperoleh gelar program sejenis di perguruan
tinggi lain. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, November 2008
Yusniwati NRP A361040041/AGR
ABSTRACT
YUSNIWATI. Drought Tolerance Transgenic Hot Chilli Line Carrying P5CS Transgene Encoding Key Enzyme for Proline Biosynthese : Plantlet Regeneration and Characterization. Supervisors Committee : SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan DJOKO SANTOSO.
The objectives of this experiments were to evaluate effects of drought stress at vegetative stage on growth, yield and leaf proline content of hot pepper. Drought stress was conditioned by watering plants every five days during the period of 21 – 54 days after planting (DAP). Results of the experiment indicated that drought stress reduced plant height, branch numbers, stem diameter, root length, shoot, root and biomass dry weight and fruit yield. Sensivity index calculated based on biomass of five hot pepper cultivars showed that Prabu was the only tolerance cultivar while those based on proline concentration showed that Prabu, Laris and Jati Laba were the medium tolerance to drought stress. There was no drought tolerance cultivar if the sensitivity index was calculated based on fruit yield. Genetic engineering manipulation to develop drought tolerance transgenic plant through over-expression of gene P5CS-key enzyme for proline biosinthesis is hot chilli needed regeneration of chilli by in vitro. Regeneration of Chilli by in vitro by using young leaf have been conducted to 13 varietas of chilli. Eksplant of culture at medium induce callus that is elementary medium of MS with vitamin of L2 enhanced by BAP 4 ppm and IAA 0.5 ppm. Then for medium of regeneration and elong of cell, callus subculture at medium of MS added by vitamin L2 , BAP 1 ppm, GA3 2 ppm, Calsium Pantotenat 2 ppm and AgNO3 5 ppm. The result showed that all of the varieties were able to form callus, but do not all of callus can differentiate to be new bud. Amongs of 13 of varieties of hot chilli, the most responsive to differentiation and bud elongation was Tit Super variety.
With use chilli cv. Tit Super done genetic engineering, the objectives of this experiment were to (1) regenerate of transgenic chilli cv. Tit Super constitutively expressing P5CS transgene through Agrobacterium, (2) analyze integration of P5CS transgene in the genome of transgenic chilli by total nucleic acid PCR, (3) analyze proline accumulation in leaf tissues of the transgenic chilli. There were 67 transgenic line but only 5 transgenic line were positive based on total nucleic acid PCR testing. The transgenic line also accumulate higher proline than control plant under drought stress which induced by Poly Ethylene Glicol (PEG) 15%. Over-expression of gene P5CS for key enzyme for proline biosynthesis for tobacco as model plant to drought stress at vegetatif stage showed that drought stress reduced plant height, shoot diameter, leaf dry weight and leaf area. Keyword: Dehydration stress, hot pepper, drought sensitivity index, Direct shoot
regeneration, Agrobacterium-mediated transformation, proline
SUMMARY YUSNIWATI. Drought Tolerance Transgenic Hot Chilli Line Carrying P5CS Transgene Encoding Key Enzyme for Proline Biosynthese : Plantlet Regeneration and Characterization. Supervisors Committee : SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan DJOKO SANTOSO. Genetic engineering of chilli (Capsicum annuum L.), an important vegetable, crop is difficult to do. This was proven by the existence of only a few numbers of publication describing hot chilli genetic engineering in scientific journals. The difficulty of genetic engineering of this crop is because the in vitro bud regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation of hot chilli are both difficult to do.
This disertation was written based on results of experiments conducted to determine effects of drought stress on growth and development of hot chilli, to develop drought tolerance transgenic hot chilli, and to investigate possible drought tolerance mechanisms in transgenic plants using transgenic tobacco. Therefore, there are three major experiments associated with this dissertation.
The drought stress tolerance phenotype in various crops is a dynamic response. Testing for drought tolerance response need to be conducted at various stages of plant growth (i.e. vegetative and generatives stages). Moreover, glass house test might be the better alternative of evaluation techniques for drought tolerance than that of field evaluation since environmental conditions in the glass house test was more homogeneous than that of field stations. In this research a condition of reducing the amount of supplied water to irrigate the evaluated hot chilli cultivar was used as drought stress treatment.
Result of this experiment showed that the tested hot chilli cultivars (five cultivars) were all sensitive against drought stress. Drought stress under this experiments reduced production of hot chilli by as much as 50%. Such results further supported the need to develop more drought tolerance hot chilli cultivars.
Regeneration of drought tolerance transgenic hot pepper should be possible if the effective methods for in vitro bud regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation are available. Parts of this desertation research were conducted to answer those question. In this disertation effective research methods for inducing in vitro bud regeneration among chilli cultivars (13 cultivars) were evaluated. Direct shoot regeneration from young seedling associated-leaf approach was employed in this research. Result of the experiment showed that inducing in vitro bud regeneration from experiments of hot chilli cv. Tit Super was easiest.
In subsequent experiment, Agrobacterium mediated transformation was conducted to introduce P5CS transgene into hot chilli genome and regenerate transgenic hot chilli. After a numbers of phenotypic and molecular characterization of the regenerated putative transgenic shoots, the regenerated
they were evaluated for their respons against in vitro simulated drought stress using polyethylene glycol (PEG).
Result of the experiment showed 67 kanamycine resistance planlets were regenerated after Agrobacterium-mediated transformation of hot chilli, indicating that they were transgenic carrying at least nptII transgene and probably also carry the P5CS one.
The hot chilli plantlets positively identified carrying P5CS transgene showed different phenotype than that of non-transgenic control. The transgenic shoots carrying P5CS transgene showed broader leaves than that of non-transgenic one. Subsequent result also indicated, transgenic shoots identified as carrying P5CS transgene tolerance were more against PEG treatment up to 15% (w/v) concentration. They also exhibited different pattern of proline accumulation in evaluated leaves under in vitro PEG stimulated strees condition.
To answer the possible mechanisms of drought tolerance in transgenic plants carrying P5CS transgene, R2 generation of transgenic tobacco carrying P5CS transgene were evaluated under glass house conditions. The stress conditions were either applied by reducing water supplies or simulated using PEG (0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 and 15% (w/v).
Testing of drought stress tolerance on transgenic crops carrying P5CS transgene was conducted using R2 generation of transgenic tobacco. Drought stress treatment on R2 progeny transgenic tobacco resulted. But R2 generation of transgenic P5CS tobacco showed better performance than R2 generation of non- transgenic tobacco. The high increased of proline content was seen on the tested transgenic tobacco. It proved that increasing of proline accumulation caused by over-expression of P5CS gen reduced negative effect of drought stress. Crop age also influence accumulation of praline. Progressively increase of age may increased leaf praline accumulation.
Drought stress treatment using PEG at 2.5% to 15% concentrations caused decrease of growth. Higher accumulation of proline occured early in root, followed by in the leaf tissue. The higher accumulation of proline in transgenic tobacco probably have a role in decreasing of negative effect to drought stress.
RINGKASAN
YUSNIWATI. Galur Cabai Transgenik Toleran Kekeringan dengan Gen P5CS- Penyandi Enzim Kunci Biosintesa Prolina : Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran. Komisi Pembimbing: SUDARSONO, HAJRIAL ASWIDINNOOR, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, dan DJOKO SANTOSO. Tanaman cabai merah (Capsicum annuum L.) adalah tanaman sayuran penting dan teknik rekayasa genetika pada cabai sulit dilakukan. Hal ini terbukti dari sedikitnya publikasi tentang rekayasa genetika cabai merah di jurnal ilmiah. Rekayasa genetika pada cabai merah sulit dilakukan karena sulitnya meregenerasikan tunas cabai secara in vitro serta sulitnya meregenerasikan eksplan hasil inokulasi Agrobacterium.
Disertasi ini ditulis berdasarkan hasil-hasil percobaan untuk menentukan pengaruh dari cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan perkembangan cabai, mengembangkan tanaman cabai transgenik yang toleran kekeringan serta menentukan mekanisme tanggapan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik menggunakan tanaman tembakau transgenik. Dengan demikian ada tiga kelompok besar percobaan dalam disertasi ini.
Respon dari berbagai genotipe tanaman terhadap cekaman kekeringan bersifat dinamis, sehingga pengujian tingkat toleransi terhadap cekaman kekeringan perlu dilakukan pada berbagai tingkat pertumbuhan tanaman (fase vegetatif dan generatif). Selain itu pengujian toleransi terhadap cekaman kekeringan di rumah kaca perlu dilakukan, karena kondisi di rumah kaca lebih baik dibandingkan di lapangan serta kondisi di rumah kaca lebih homogen di bandingkan lapangan. Evaluasi cekaman kekeringan pada cabai dilakukan dengan pengurangan pemberian air.
Hasil penelitian pengujian cekaman kekeringan terhadap lima kultivar cabai unggul nasional menunjukkan tidak satupun dari ke lima kultivar yang diuji toleran terhadap cekaman kekeringan, cekaman kekeringan yang diberikan menurunkan hasil sampai 50%. Hal tersebut memperkuat alasan perlunya pengembangan kultivar cabai yang toleran kekeringan
Pengembangan cabai transgenik yang toleran cekaman kekeringan dapat dilakukan jika metode regenerasi tunas cabai secara in vitro dan metode transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium telah tersedia. Sebahagian dari penulisan disertasi ini digunakan untuk menjawab pertanyaan tersebut. Dalam disertasi ini dievaluasi metode in vitro yang efektif untuk meregenerasikan 13 genotipe cabai. Regenerasi tunas langsung dilakukan dengan menggunakan daun kecambah cabai. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kultivar Tit Super yang paling mampu menghasilkan regenerasi tunas secara in vitro paling banyak
Pada percobaan selanjutnya dilakukan transformasi genetika dengan menggunakan Agrobacterium untuk memasukkan gen P5CS ke dalam genom cabai dan meregenerasikan cabai transgenik. Setelah itu dilakukan karakterisasi
fenotipe secara molekuler dari calon tunas transgenik yang dihasilkan kemudian dievaluasi responnya terhadap kondisi cekaman kekeringan yang disimulasikan secara in vitro dengan menggunakan PEG.
Hasil percobaan menunjukkan 67 planlet yang resisten kanamysin berhasil diregenerasikan setelah transformasi dengan menggunakan Agrobacterium yang mengindikasikan bahwa planlet tersebut merupakan planlet transgenik yang membawa gen nptII dan kemungkinan juga membawa gen P5CS.
Planlet cabai yang teridentifikasi secara positif sebagai pembawa gen P5CS menunjukkan fenotipe yang berbeda dibandingkan dengan tanaman kontrol non transgenik. Tunas cabai transgenik yang membawa gen P5CS menunjukkan daun yang lebih lebar dibandingkan dengan daun yang non transgenik. Hasil selanjutnya juga mengindikasikan bahwa tunas transgenik yang membawa gen P5CS lebih toleran terhadap perlakuan PEG pada konsentrasi 15% (w/v). Tunas transgenik juga menunjukkan pola yang berbeda pada akumulasi prolina daun.
Pengujian mekanisme cekaman kekeringan dilakukan pada tanaman tembakau transgenik generasi R2 yang membawa gen P5CS di rumah kaca Kondisi cekaman kekeringan disimulasikan dengan pengurangan pemberian air dan penyiraman dengan PEG (0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15% w/v).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa cekaman kekeringan menghambat pertumbuhan semua tanaman tembakau R2 (tembakau transgenik dan non transgenik), tetapi generasi R2 transgenik memperlihatkan penampilan yang lebih baik dibandingkan tanaman tembakau non transgenik. Tanaman tembakau transgenik R2 juga menunjukkan pola akumulasi prolina yan berbeda pada daun yang diuji. Umur tanaman juga mempengaruhi akumulasi prolina dimana dengan semakin bertambahnya umur tanaman akumulasi prolina juga semakin meningkat.
Perlakuan cekaman kekeringan dengan penyiraman larutan PEG pada konsentrasi 5% sampai 15%, menunjukkan penurunan pertumbuhan. Akumulasi prolina yang terjadi awalnya lebih tinggi di akar, tetapi kemudian produksi prolina yang tinggi terjadi di jaringan daun. Peningkatan kandungan prolina yang lebih tinggi pada tanaman tembakau transgenik diduga berperan dalam mengurangi dampak negatif terhadap cekaman kekeringan.
© Hak cipta milik IPB, tahun 2008 Hak cipta dilindungi
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tujuan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
GALUR CABAI TRANSGENIK TOLERAN KEKERINGAN DENGAN GEN P5CS-PENYANDI ENZIM KUNCI
BIOSINTESIS PROLINA : REGENERASI DAN KARAKTERISASI REGENERAN
YUSNIWATI
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor
pada Departemen Agronomi dan Hortikultura
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2008
Judul Disertasi : Galur Cabai Transgenik Toleran Kekeringan dengan Gen P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina: Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran
Nama Mahasiswa : Yusniwati
NRP : A. 361040041
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Sudarsono, MSc
Ketua
Dr Ir Hajrial Aswidinnoor, MSc Anggota
Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc
Anggota
Dr Ir Djoko Santoso, APU Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr Ir Munif Ghulamahdi, MS Prof Dr Ir Khairil Anwar Notodiputro, MS
Tanggal Ujian : 30 Oktober 2008 Tanggal Lulus : 19 November 2008
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil ‘alamin, puji syukur yang sangat dalam penulis
sampaikan kepada Allah SWT atas izin dan petunjuk-Nya yang Maha Rahman
dan Rahim yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penelitian dan
penulisan Disertasi ini dapat diselesaikan. Disertasi ini merupakan salah satu
syarat untuk mendapatkan gelar doktor dari Institut Pertanian Bogor.
Disertasi ini yang berjudul “Galur Cabai Transgenik Toleran
Kekeringan dengan Gen P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesa Prolina:
Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran”, disusun berdasarkan penelitian yang
dilakukan di Laboratorium Molekuler Tanaman Institut Pertanian Bogor dan
Rumah Kaca Balitbio Cimanggu Bogor.
Penelitian dan penulisan disertasi ini dapat diselesaikan karena peran dan
bantuan berbagai pihak. Oleh karena ini pada kesempatan ini penulis sampaikan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: Bapak Prof Dr Ir Sudarsono, MSc,
selaku Ketua Komisi Pembimbing, yang telah memberikan bimbingan intensif
dalam pelaksanaan penelitian, analisis data, penulisan publikasi, penulisan naskah
disertasi dan telah memberikan kesempatan dan fasilitas seluas-luasnya, serta
yang begitu sabar secara terus menerus memberikan perhatian dan wawasan baru.
Kepada Bapak Dr Ir Hajrial Aswidinnoor, MSc, Ibu Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat,
MSc dan Bapak Dr Ir Djoko Santoso, MSc sebagai Anggota Komisi Pembimbing;
yang telah memberikan bimbingan, arahan, dorongan moril dan semangat, kritik
serta saran yang sangat bermanfaat dalam penulisan disertasi ini. Penulis juga
tidak lupa menyampaikan ucapan terimakasih kepada Bapak Dr Ir Asep
Setiawan, M,Sc, selaku penguji luar komisi pada ujian prakulifikasi program
Doktor. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Bapak Dr Ir Agus Purwito,
M.Sc selaku penguji luar komisi pada ujian tertutup, juga untuk Prof Dr Ir
Nurhajati A Mattjik MS dan Dr Ir Ika Mariska, APU selaku penguji luar komisi
pada Ujian Terbuka. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada ketua
Program Studi, seluruh staf pengajar dan pegawai, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, SPs IPB, kepada Rektor, Dekan Fakultas Pertanian, dan Ketua
Jurusan Budidaya Pertanian, Ketua Program studi Pemuliaan Tanaman dan
kepada seluruh staf pengajar dan pegawai jurusan Budidaya Pertanian Universitas
Andalas Padang, atas izin, dukungan dan motivasi serta doa yang diberikan.
Kepada Pimpinan Proyek BPPS Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi
Departemen Pendidikan Nasional dan Yayasan DAMANDIRI yang telah
memberi kesempatan beasiswa.
Dengan segenap rasa hormat dan terima kasih khusus penulis sampaikan
kepada Ibunda tercinta Majiar dan Ayahanda tercinta Bismi Tk. Marajo, semua
Kakak, Kakak Ipar, Adik dan Adik Ipar serta ponakan yang telah melimpahkan
bantuan, kasih sayang, bimbingan, dan do’a yang tulus.
Terima kasih secara khusus disampaikan kepada Uda Apri Yendi, SPt, atas
motivasi dan do’anya.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada rekan-rekan mahasiswa dan
staf teknisi di Laboratorium Molekuler Tanaman yang selama ini banyak
membantu dalam pelaksanaan penelitian yaitu: Bapak Dr Ir Ahmad Riduan, MSi
Ibu Dr Ir Endang Puji Hartati,MSi, Ibu Dr Ir Enni S. Rahayu,Msi, Dr Ir Desta
Wirnas, MSi, Dr Susiyanti, SP.MP, Ibu Munarti, SP,MSi, Ibu Yuliasti, SP. M.Si,
Bapak Ir. Syamsudin, MSi, Ibu Ir Lollie Agustina P Putri, MSi, Ibu Ir. Sukendah,
M.Sc, Ibu Ir Reni, MSi, Darmawan S, SP.MSi, Zulherman S, SP, Susilawati, Mas
Agus, dan Pak Juanda yang banyak membantu dalam penyelesaian penelitian serta
semua anggota IMPACS (Ikatan Mahasiswa Pascasarjana Sumatera Barat) dan
rekan-rekan di pondokan Ponytail atas bantuan dan persahabatan dan semua pihak
yang tidak dapat disebutkan satu persatu dalam tulisan ini.
Akhirnya dengan segala kerendahan hati penulis berharap agar hasil
penelitian ini dapat digunakan untuk kepentingan penelitian, kemajuan ilmu
pengetahuan dan bermanfaat bagi kehidupan. Amin.
Bogor, November 2008 Penulis,
Yusniwati NRP A361040041
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bukittinggi pada tanggal 17 Desember 1970, dari
pasangan Bapak Bismi Tk. Marajo dan Ibu Majiar sebagai putri ke tiga dari lima
bersaudara.
Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1984 di SD Negeri 1 Teladan
Gadut Bukittinggi. Pendidikan menengah pertama diselesaikan pada tahun 1987
di SMP Negeri Gadut Bukittinggi. Pada tahun 1990 lulus dari SMA Negeri 3
Bukittinggi. Gelar Sarjana Pertanian diraih pada tahun 1995 pada Fakultas
Pertanian Universitas Andalas Padang. Pada tahun 2000 memperoleh gelar
Magister Pertanian dari Program Studi Agronomi, pada Program Pascasarjana
Universitas Andalas Padang, melalui Program Bea Siswa BPPS Ditjen Dikti. Pada
tahun 2004 melanjutkan studi ke program Doktor (S3) melalui program Bea Siswa
BPPS Ditjen Dikti pada program studi Agronomi Institut Pertanian Bogor. Sejak
Desember tahun 2000 sampai sekarang, penulis adalah staf pengajar pada Fakultas
Pertanian Universitas Andalas Padang.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ................................................................................................. xiii
DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xv
DAFTAR ISTILAH ...................................................................................... xx I PENDAHULUAN …………………………………………………….. 1 Latar belakang ………………………………..……………………… 1 Tujuan penelitian …………………………………………….…….…. 5 Garis Besar Disertasi…………………………………………………… 6 II TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………………. 11 Tanaman Cabai…………………………………………………………. 11 Perbanyakan Tanaman Cabai Secara In Vitro ........................................ 14
Cekaman Kekeringan pada Tanaman....................................................... 16 Respon Tanaman terhadap Cekaman Kekeringan dengan Penyesuaian Osmotik .............................................................................. 18 Plasmid pBI-P5CS ………………………………………..………….. 23 Sifat-sifat Biologi Agrobacterium ……………………..……………... 24 Transfer Gen pada Genom Tanaman dengan Bantuan Agrobacterium . 25
III DAMPAK FISIOLOGIS STRES KEKERINGAN TERHADAP PERTUMBUHAN, HASIL DAN KANDUNGAN PROLINA DAUN CABAI .................................................................................................. 26 Abstrak ………………………………………………………………. 26 Abstract ………………………………………………………………. 27 Pendahuluan ………............................................................................... 28 Bahan dan Metode ……….……………………………………………. 29 Hasil …………………………………………………………..……….. 31 Pembahasan ……….…………………………………………..………. 36 Simpulan ………..……………………………………………………… 39 IV STUDI REGENERASI BEBERAPA GENOTIPE CABAI (Capsicum annum L.) SECARA IN VITRO .......................... 40 Abstrak .................................................................................................... 40 Abstract ……………………………………………………………… 41 Pendahuluan ………............................................................................... 42 Bahan dan Metode …….……………………………………….……… 43 Hasil ………………………………………………………………….. 45 Pembahasan …………………………..……………………………… 52 Simpulan ……….…..………………………………………………… 54
V. INTRODUKSI GEN P5CS KE DALAM GENOM CABAI DENGAN BANTUAN Agrobacterium DAN EKSPRESI TERHADAP CEKAMAN AKIBAT PEMBERIAN PEG ............................................................. 55
Abstrak .................................................................................................... 55 Abstract ………………………………………………………………… 56 Pendahuluan ………................................................................................ 57 Bahan dan Metode …………………………………………………… 60 Hasil ………………………………………………………………….. 64
Pembahasan ………………………..……………………………… 69 Simpulan ……….…..………………………………………………… 72 VI TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP STRES KEKERINGAN AKIBAT PENGURANGAN PEMBERIAN AIR .. 73 Abstrak ………………………………………………………………… 73 Abstract…………………………………………………………… ....... 74 Pendahuluan ………................................................................................ 75 Bahan dan Metode …….……………………………………………… 76 Hasil ………………………………………………………………….. 78 Pembahasan …………………………..……………………………… 89 Simpulan ……….…..………………………………………………… 91 VII TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG
MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP STRES AKIBAT PENYIRAMAN POLIETILEN GLIKOL (PEG) ............................... 92
Abstrak………………………………………………………… ............ 92 Abstract ……………………………………………………………… 93 Pendahuluan ………............................................................................... 94 Bahan dan Metode …….……………………………………………… 97 Hasil ………………………………………………………………….. 97 Pembahasan …………………………..……………………………… 102 Simpulan ……….…..………………………………………………… 102 VIII PEMBAHASAN UMUM ...................................................................... 104 IX SIMPULAN DAN SARAN UMUM .................................................... 109 DAFTAR PUSTAKA ………………….…………………………………. 110
DAFTAR TABEL
Nomor J u d u l Halaman
1 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah tanam terhadap tinggi tanaman, jumlah cabang, diameter batang, dan panjang akar beberapa genotipe cabai........................
32
2 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah
tanam terhadap berat kering batang dan biomasa total beberapa genotipe abai.................................................................................
33
3 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari sesudah
tanam terhadap bobot biomassa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai....................................
34
4 Indeks kepekaan terhadap cekaman (S) yang dihitung berdasarkan
biomasa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai.................................................................
35
5 Kandungan Prolina daun beberapa genotipe cabai pada umur 37
HST pada kondisi tanam optimum dan cekaman kekeringan........ 36
6 Persentase pembentukan kalus dan tunas serta persentase tunas
yang terbentuk dari beberapa genotype cabai secara in vitro…… 46
7 Rata-rata berat kalus, diameter kalus, jumlah tunas dan panjang
tunas dari beberapa genotype cabai yang diinduksi secara in vitro………………………………………………………………
48
8 Perkembangan jaringan daun cabai var. Tit Super dalam berbagai
tahapan transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium hingga menjadi tanaman transgenik. Transformasi genetika untuk mengintroduksikan gen P5CS dengan bantuan Agrobacterium dilakukan sebanyak empat eksperimen.....................................................................................
65
9 Kandungan prolina daun cabai transgenik dan non transgenik pada
kondisi optimum dan dengan perendaman dalam larutan PEG 15% selama 10 hari ..............................................................
69
10 Pengaruh stres kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanam
(HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.............................
79
Nomor J u d u l Halaman
11 Pengaruh stres kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanaman
(HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik…………………………....
80
12
Pengaruh stres kekeringan pada periode 55 hari sesudah tanam (HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik..................................................... 81
13 Pengaruh stres kekeringan pada periode 55 hari sesudah tanaman
(HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik………………………..……… 82
14 Pengaruh stres kekeringan pada periode 78 hari sesudah tanam
(HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik..................................................... 83
15 Pengaruh stres kekeringan pada periode 78 hari sesudah tanaman
(HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik………………….……………… 84
16 Pengaruh perlakuan stres kekeringan pada periode 15-78 hari
sesudah tanam (HST) terhadap kandungan prolina daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik. Contoh daun diambil 78 HST..............................
86
17 Segregasi fenotipe bibit R2 yang ditanam dalam medium MS
selektif dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l, hasil analisis χ2, dan pendugaan jumlah lokus nptII fungsional yang terintegrasi dalam genom tembakau transgenik................................. 99
18 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi
0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 35 HST terhadap tinggi tanaman,bobot akar kering, bobot kering daun,dan panjang akar dari tanaman R1 zuriat tembakau GS transgenik P5CS generasi R2 dan tembakau GS non-transgenik........................ 100
19 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi
0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 55 HST terhadap tinggi tanaman, bobot akar kering, jumlah daun, berat kering daun,dan panjang akar dari tanaman R2 zuriat tembakau GS transgenik P5CS R2 dan tembakau GS non-transgenik……………... 101
DAFTAR GAMBAR
Nomor J u d u l Halaman
1 Skema strategi penelitian : Galur Cabai Transgenik dengan Gen
P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran ………………………………………… 9
2 Alur disertasi Galur Cabai Transgenik dengan Gen P5CS-
Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi Dan Karakterisasi Regeneran dan hubungan masing-masing topik penelitian………………………………………………………… 10
3 Lintasan biosintesis L-prolina dari L-glutamin dan berbagai gen
penyandi ensim yang diperlukan untuk biosintesis L-prolina. Gen P5CS merupakan gen penyandi ensim kunci dalam biosintesis prolina, yang ekspresinya meningkat dengan adanya stres kekeringan (dehidrasi) dan menurun dalam kondisi non-stres (rehidrasi)………………………………………………………... 22
4 Peta restriksi plasmid pBI-P5CS.................................................... 23
5 a) Bibit cabai umur 21 hari yang ditanam secara in vitro
b) Daun muda cabai yang ditanam pada media induksi kalus…... 45
6 Kalus-kalus yang terbentuk dari beberapa varietas dan galur cabai
secara in vitro……………………………………………... 47
7 Waktu yang diperlukan beberapa varietas cabai untuk membentuk
kalus………………………………………………… 48
8 Hubungan antara berat kalus dengan jumlah tunas yang terbentuk
pada beberapa varietas cabai………………………. 49
9 Kalus yang terbentuk dari daun muda setelah 14 hari induksi
(9A) kalus yang berwarna putih yang akan berubah menjadi kehijauan dalam beberapa hari dan kalus ini merupakan kalus organogenik (organogenic callus) (OC) (9B) kalus yang berwarna coklat merupakan kalus yang tidak dapat diregenerasikan (non-regenerable callus) (NRC)................ 50
10 Tahapan perkembangan kalus cabai organogenik mulai dari tahap
globular sampai membentuk tunas, (A) – (E) tahapan globular sampai kotiledonary, (F) terbentuknya tunas .................. 50
Nomor J u d u l Halaman
11 Tunas yang berkembang dalam media perpanjangan tunas (A)
tunas yang abnormal, dimana tidak menghasilkan batang, (B) tunas yang normal yang dapat berkembang membentuk batang....
51
12 Peta konstruksi plasmid biner pBI-P5CS yang membawa gen kimera P5CS, gen marker NPTII, dan gen marker GUS pada struktur T-DNA. Lokasi situs pemotongan oleh ensim restriksi pada T-DNA ditunjukkan dengan angka dan identitas ensimnya (Kavi Kishor et al., 1995)............................................................... 61
13 Hasil total nucleic acid PCR untuk mendeteksi integrasi gen
P5CS: dalam genom cabai transgenik dengan marker NPT II....... 65
14 Perkembangan eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam
tahapan transformasi dengan bantuan Agrobacterium (A1) Prekultur eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam media MSR-I, (A2) Kokultivasi eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam mdia MSR-I, (B1&2) Respon tunas cabai var Tit Super yang resisten dan sensitif terhadap kanamaycin dalam media MSR-II, (C1&2) Planlet cabai var Tit Super transgenik dalam media perakaran…………………………………………………. 66
15 Penampilan daun regeneran cabai cv Tit Super yang direndam
dalam larutan PEG 15% selama 10 hari secara in vitro (A) Kontrol dan (B) Transgenik P5CS………………………………. 67
16 Pengaruh perendaman PEG 0 dan 15% selama periode 10 hari
secara in vitro terhadap kandungan prolina total daun tanaman cabai kontrol dan transgenik R0…………………………………. 68
17 (A) Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenic R0
dan non transgenik dalam kondisi optimum, (B) Distribuís kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan non tansgenik dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari……………………………………………………. 68
18 Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan
non transgenik dalam kondisi optimum dan dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari pada genotype yang sama……………………………………………... 69
19 Penampilan regeneran cabai cv Tit Super secara in vitro (A)
Kontrol dan (B) Transgenik…………………………………….
71
20 Rangkaian reaksi oksidasi prolina.................................................. 72
Nomor J u d u l Halaman
21 Tanaman tembakau transgenik R2 dalam media kanamisin (A dan
B), tembakau R2 kontrol (non transgenik (C)......................... 78
22 Tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi
R1 dan tembakau GS non-transgenik pada kondisi optimum dan cekaman kekeringan, A1 = Tanaman tembakau non transgenik yang mendapat perlakuan cekaman kekeringan, B1= Tanaman tembakau non transgenik yang tidak mendapat perlakuan cekaman kekeringan, A2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A3= Tanaman tembakau transgenik GS-2 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B3= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang mendapat perlakuan cekaman, A5= Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B5=Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang mendapat perlakuan cekaman,A6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang mendapat perlakuan cekaman……………………………...
85
23 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi stres umur 35 dan 78 HST……………………………………………. 86
24 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi
optimum umur 35 dan 78 HST…………………………………... 86
25 Regresi antara kandungan prolina daun dari tembakau GS non-
transgenik dan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik R 1, dengan tinggi tanaman dan bobot kering daun per tanaman Kandungan prolina daun ditentukan umur 78 hari sesudah tanam (hst) sedangkan tinggi tanaman dan berat kering daun ditentukan 110 hari setelah tanam (hst). (■) tembakau GS-non transgenik, (♦) tembakau GS transgenik P5CS……………………………… 87
26 Keterkaitan antara indeks sensitivitas terhadap cekaman
kekeringan yang dihitung menggunakan data tinggi tanaman dan panjang akar dari tembakau GS non-transgenik (♦) dan transgenic (Ο,♦■). Nilai indeks sensitivitas ≤ 0.5 dikategorikan toleran, diantara 0,5 dan 1 dikategorikan medium, dan >1 dikategorikan peka......................................................................... 89
27 Menunjukkan bahwa ekspresi pembentukan senyawa prolina
lebih banyak di daun daripada di akar tanamn………………….. 99
DAFTAR ISTILAH
Aklimatisasi proses penyesuaian peralihan lingkungan hidup heterotroph menjadi autotroph pada planlet yang diperoleh melalui teknik in vitro
CaMV 35 S promotor yang terdapat pada DNA viral yang ekspresinya bersifat konstitutif (di seluruh bagian), yang merupakan strong promoter
Cekaman kekeringan kondisi ketersediaan air media tanaman yang tidak memadai baik jumlah maupun distribusinya, yang terjadi pada sebagian atau sepanjang siklus hidup tanaman sehingga tanaman tidak dapat mengekspresikan potensi genetiknya.
Embriosomatik proses pembentukan embrio secara aseksual dari sel somatik dalam kultur in vitro
Kultur in vitro suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma
sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak
diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Genersi R0 tanaman yang merupakan hasil regenerasi jaringan dari kultur in vitro Generasi R1 tanaman yang merupakan zuriat dari tanaman generasi R0 Mekanisme avoidance (ketahanan)
mekanisme respon terhadap cekaman kekeringan yang ditunjukkan dengan kemampuan tanaman untuk mempertahankan potensial air jaringan yang relatif tinggi pada saat mengalami cekaman kekeringan
Mekanisme escape (pelarian) mekanisme respon terhadap cekaman kekeringan yang ditunjukkan dengan kemampuan tanaman untuk menyelesaikan siklus hidupnya sebelum terjadi cekaman kekeringan sehingga tidak mengalami cekaman
Mekanisme tolerance (toleran) mekanisme respon terhadap cekaman kekeringan yang ditunjukkan
dengan kemampun tanaman untuk bertahan hidup dengan potensial air jaringan yang rendah
Nisbah akar/tajuk ratio bobot kering akar dan tajuk Osmolit senyawa yang terlarut dalam plasma sel yang dapat berperan untuk
mempertahankan potensial osmotik sel dan melindungi kerusakan struktur sel akibat senyawa radikal pada saat mengalami cekaman
PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifikasi enzimatik dari fragmen DNA spesifik dengan menggunakan
siklus berulang dari denaturasi, penempelan primer, dan elongasi Peka respon tanaman yang tidak mampu mempertahankan diri atau mengatasi
pengaruh cekaman kekeringan, yang ditunjukkan dengan menurunnya pertumbuhan dan atau hasil panen secara signifikan pada kondisi cekaman kekeringan
PEG (Poly Ethylene Glycol) senyawa polimer yang tersusun atas sub unit etilen-oksida yang mampu
mengikat molekul air pada atom oksigennya dengan ikatan hidrogen Plasmid elemen genetik ekstrakromosomal yang memiliki kemampuan untuk
menggandakan diri sendiri. Untaian DNA berbentuk lingkaran diluar kromosom yang terdapat dalam sel bakteri.
Potensial osmotik potensi suatu larutan untuk melakukan osmosis atau menarik molekul air,
yang nilainya negatif dan ditentukan oleh konsentrasi larutan, suhu, konstanta gas dan konstanta ionisasi
Primer sebuah oligonukleotida khusus yang komplemen pada region tertentu dari
strand template, yang mana sintesis DNA baru terjadi Prolina salah satu jenis asam amino yang terlarut dalam plasma sel dan dapat
berperan sebagai osmolit T-DNA utas nukleotida yang merupakan bagian dari sistem penginduksi tumor
yang dimiliki oleh Agrobacterium tumefaciens yang terintegrasi dalam genom tanaman. Segmen dari plasmid Ti yang di transfer dan masuk dalam lokasi kromosomal pada inti sel tanaman.
Terminator situs dimana transkripsi berhenti
Transforman sel yang telah mengalami proses transformasi Transgenik organisme yang genomnya telah disisipi dengan DNA asing Toleran respon tanaman yang mampu mempertahankan diri atau mengatasi
pengaruh cekaman kekeringan, yang ditunjukkan dengan menurunnya pertumbuhan dan atau hasil panen yang tidak signifikan pada kondisi cekaman kekeringan
Vektor molekul DNA yang dapat membawa DNA yang disisipkan dan
memindahkannya ke dalam sel inang
I PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cabai (Capsicum spp) merupakan sayuran penting di dunia dan termasuk
spesies pertama yang ditemukan telah digunakan manusia di seluruh dunia (Berke
2002a). Cabai dapat dikonsumsi dalam bentuk buah segar, kering atau bentuk
olahannya dan memiliki berbagai manfaat. Cabai telah menjadi bagian penting
dalam resep masakan (Berke 2002b), kaya akan vitamin C, A, dan B, potasium,
fosfor dan kalsium (Xuefeng 1999; Boslan and Votava 2000), dan kandungan
kimianya merupakan bagian penting dalam obat-obatan, pewarna makanan, dan
kosmetika (Taychasinpitak dan Taywiya 2003; IISR 2006).
Cabai merah (Capsicum annuum L.) merupakan spesies yang
dibudidayakan paling luas (Zhang 1989) karena merupakan spesies cabai pertama
yang ditemukan oleh Columbus dan diintroduksikan ke seluruh dunia. Cabai
merah masuk ke Indonesia dibawa oleh bangsa Portugis sekitar 450 – 500 tahun
yang lalu (Berke 2002b). Cabai merah beradaptasi dengan cepat dan diterima
oleh bangsa Indonesia sehingga menjadi komoditi sayuran penting, mempunyai
nilai ekonomis yang tinggi dan seiring dengan peningkatan jumlah penduduk
maka permintaan akan cabai juga terus meningkat. Di Indonesia ternyata luasnya
pertanaman cabai merah tidak diikuti oleh tingginya produktivitas. Data Dirjen
Bina Produksi Hortikultura tahun 2000, tercatat bahwa luas areal pertanaman
cabai merah adalah sebesar 183,347 ha, dengan rata-rata produktivitas 5,5 ton /ha,
dan tahun 2001 menurun menjadi 4,17 ton/ha, yang masih jauh di bawah rata-rata
produktivitas dunia sebesar 9,5 ton/ha, sehingga tidak mampu mencukupi
kebutuhan nasional (Dirjen Produksi Hortikultura dan Aneka Tanaman 2001).
Data BPS Produksi Tanaman Sayuran dan Buah-buahan Indonesia tahun 2002,
rata-rata hasil pertanaman cabai dari semua provinsi di Indonesia kurang dari 2
ton/ha, sedangkan potensi produksi cabai merah dapat berkisar antara 12 – 20
ton/ha (Duriat 1996)
Banyak faktor yang menyebabkan rendahnya produktivitas cabai di
Indonesia di antaranya adalah: penggunaan benih yang kurang bermutu, teknik
budidaya yang belum sempurna, dan tingginya serangan hama dan penyakit.
Secara umum pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi oleh faktor
genetik dan lingkungan. Kenyataan di lapangan lingkungan pertumbuhan
tanaman tidak selalu merupakan kondisi yang optimum bagi tanaman, sehingga
seringkali tanaman tidak mampu mengekspresikan seluruh potensi genetik yang
dimilikinya. Menurut Blum (1982) cekaman lingkungan merupakan faktor yang
paling berperan terhadap kesenjangan antara potensi dan hasil aktualnya.
Produksi cabai dapat ditingkatkan melalui program perluasan pertanaman
dan intensifikasi budidaya. Kedua program ini sangat membutuhkan benih yang
berkualitas, baik secara genetik maupun fisiologis. Benih yang berkualitas
genetik tinggi dapat diperoleh melalui persilangan konvensional yang diikuti
dengan proses seleksi dan melalui rekayasa genetika.
Kehadiran teknologi transformasi genetika memberikan wahana baru bagi
para pemulia tanaman untuk memperoleh gen-gen baru (Greenberg dan Glick
1993). Rekayasa genetika akan memberikan perbaikan dari karakter-karakter
penting pada tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa cekaman
biotik seperti gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat diperbaiki
dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan modifikasi
kualitas dan kuantitas produk tanaman (Bennet 1993). Suatu gen yang tidak
terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh
dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain (Herman
1996).
Teknik penyisipan gen (transformasi gen) akan menghasilkan tanaman
transgenik yang kemudian dapat dimanfaatkan sebagai sumber plasma nutfah atau
langsung diseleksi menjadi galur harapan. Transformasi gen secara in vitro
dengan menggunakan vektor Agrobacterium akan berhasil dan bermanfaat apabila
sudah diperoleh protokol regenerasi tanaman yang efisien dan stabil. Kompetensi
untuk beregenerasi yaitu kemampuan membentuk tanaman lengkap (mempunyai
tunas dan akar dan kompetensi untuk ditransformasi) merupakan dua kunci
penting penentu keberhasilan program transformasi genetik.
Kultur sel atau jaringan dan sistem regenerasinya memegang peranan yang
sangat penting di dalam aplikasi bioteknologi atau transformasi genetika untuk
program perbaikan sifat tanaman. Beberapa usaha yang dilakukan untuk
mencapai sistem regenerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter
penting yang spesifik pada tanaman (Parrot et al. 1992). Oleh karena itu, sebelum
dilakukan transformasi genetik untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan
terhadap kondisi cekaman kekeringan diperlukan adanya sistem regenerasi yang
efisien dan stabil secara in vitro.
Salah satu kendala pengembangan penanaman cabai adalah terbatasnya
lahan yang sesuai sehingga harus menggunakan lahan-lahan marginal. Lahan
marginal memiliki keterbatasan, khususnya dalam ketersediaan air yang
menyebabkan tanaman mengalami kekeringan. Disamping itu, perubahan suhu
global dengan siklus musim kemarau panjang yang semakin pendek (setiap 2-3
tahun) juga menyebabkan cekaman kekeringan pada tanaman (Winarso 1992).
Cekaman kekeringan menjadi masalah yang perlu diperhatikan dalam
budidaya cabai karena penanaman cabai biasanya di lahan sawah dilakukan pada
akhir musim hujan. Kondisi musim kemarau atau penanaman di lahan tegal
meyebabkan ketersediaan air tidak selalu terjamin sepanjang musim tanam.
Lahan pertanaman yang mengalami kekurangan air akan mengakibatkan fungsi
dan pertumbuhan akar sebagai bagian tanaman yang penting akan terganggu.
Akibatnya pertumbuhan seluruh tanaman akan ikut terganggu sehingga akan
berefek juga pada perkembangan tanaman cabai, akhirnya, mutu, dan produksi
cabai akan merosot (Setiadi 2004).
Penanaman kultivar cabai yang toleran terhadap cekaman kekeringan dan
yang berdaya hasil tinggi menawarkan harapan dapat mengembangkan budidaya
cabai di lahan kering. Toleransi terhadap cekaman kekeringan dapat terjadi jika
tanaman dapat bertahan terhadap kondisi yang terjadi dan adanya toleransi atau
mekanisme yang memungkinkan menghindari dari situasi cekaman tersebut.
Tanaman mempunyai toleransi yang berbeda terhadap cekaman kekeringan
karena perbedaan dalam mekanisme morfologi, fisiologi, biokimia dan molekuler
(Perez-Molphe-Balch et al. 1996).
Toleransi cekaman kekeringan pada tanaman hampir selalu melibatkan
akumulasi senyawa yang dapat melindungi sel dari kerusakan yang terjadi pada
saat potensial air rendah. Sejalan dengan itu, hasil penelitian menunjukkan bahwa
mekanisme adaptasi tanaman untuk mengatasi cekaman kekeringan adalah dengan
pengaturan potensial osmotik sel. Pada mekanisme ini terjadi sintesis dan
akumulasi senyawa organik yang dapat menurunkan potensial air dalam sel tanpa
membatasi fungsi ensim serta menjaga turgor sel. Beberapa senyawa yang
berperan dalam penyesuaian osmotikal sel diantaranya yaitu senyawa prolina dan
gula total. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ketahanan terhadap cekaman
kekeringan berhubungan dengan peningkatan kandungan prolina yang berperan
penting dalam menjaga pertumbuhan akar pada Potensial Osmotik (PO) air yang
rendah (Sharp 1994). Hasil penelitian lain menunjukkan terjadi peningkatan
konsentrasi prolina 5-6 kali pada padi toleran kering TKM 1 sedangkan pada padi
peka Sabarmati hanya meningkat 1-2 kali pada kondisi potensial osmotik –10 bar
(Mali dan Mehta 1977).
Akumulasi prolina dalam respon terhadap cekaman kekeringan telah
dilaporkan pada beberapa tanaman secara in vitro dan ex vivo (Hanson et al.
1979; Handa et al, 1986; Sarkar1993; Madan et al. 1995; Girousse et al. 1996).
Jumlah prolina yang meningkat dianggap merupakan indikasi toleransi terhadap
cekaman kekeringan karena prolina berfungsi sebagai senyawa penyimpan N dan
osmoregulator dan/atau sebagai protektor ensim tertentu (Kim dan Janick 1991;
Madan et al. 1995; Prasad dan Potluri 1996; Yoshiba et al. 1997). Sebagai
akibatnya sel, jaringan atau tanaman yang overproduksi prolina dianggap
mempunyai sifat toleransi terhadap cekaman kekeringan yang lebih baik.
Akumulasi prolina pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan
disebabkan oleh aktivasi biosintesis prolina dan inaktivasi degradasi prolina. Pada
tanaman tingkat tinggi, prolina disintesis melalui lintasan asam glutamin dan
ornitin. Lintasan dari glutamin merupakan lintasan primer untuk biosintesis
prolina dalam kondisi cekaman kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et al.
1997). Prolina disintesis dari glutamin melalui dua senyawa antara yaitu glutamin
semialdehyde (GSA) dan Pyrroline-5-carboxylate (P5C). Ada dua ensim yang
berperan dalam biosintesis prolina yaitu P5C synthetase (P5CS) pada tahap awal
dan P5C reductase (P5CR) pada step kedua (Gambar 3). Gen yang menyandi
P5CS dan P5CR telah diisolasi dari berbagai tanaman dan ekspresi serta fungsinya
telah diteliti. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen P5CS merupakan penyandi
ensim yang menjadi faktor pembatas dalam biosintesis prolina pada tanaman
tingkat tinggi (Hu CA et al. 1992).
Over-ekspresi dari P5CS menghasilkan akumulasi prolina pada tanaman
transgenik dan terbukti meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman
kekeringan. Over-produksi prolina mampu meningkatkan secara signifikan
terhadap biomassa akar dan perkembangan bunga pada tanaman transgenik
dibawah kondisi cekaman kekeringan atau cekaman osmotik. Transformasi gen
P5CS yang berasal dari V. aconitifolia ke tanaman tembakau di bawah kendali
promoter konstitutif CaMV 35S, secara nyata terbukti meningkatkan produksi
prolina yang meningkatkan pula toleransi tanaman transgenik tersebut terhadap
cekaman kekeringan (Kavi Kishor et al. 1995). Pada tanaman transgenik padi,
over-ekspresi gen P5CS terbukti dapat meningkatkan kadar prolina daun dan
mampu menghasilkan peningkatan biomassa tanaman dalam kondisi stres air dan
garam tinggi (Zhu et al. 1998). Transformasi gen P5CS yang diikuti regenerasi
tanaman transgeniknya diperkirakan mampu menghasilkan tanaman cabai
transgenik yang toleran terhadap cekaman kekeringan.
Berdasarkan uraian di atas, terdapat peluang yang cukup besar dalam
pengembangan galur cabai transgenik dengan karakter toleran terhadap cekaman
kekeringan melalui over-ekspresi gen P5CS – penyandi enzim kunci biosintesis
prolina, yaitu dengan mengintroduksi gen P5CS menggunakan Agrobacterium ke
dalam genom cabai dan tembakau sebagai tanaman model.
Tujuan penelitian
1. Memperoleh informasi tentang respon fisiologis cabai sebagai bagian dari
mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan
2. Mendapatkan varietas cabai yang mempunyai daya regenerasi yang tinggi
secara in vitro
3. Mendapatkan populasi tanaman cabai yang diduga membawa gen P5CS,
hasil transformasi menggunakan Agrobacterium.
4. Mengevaluasi regeneran cabai hasil transformasi gen P5CS
5. Memperoleh informasi apakah pada kondisi optimum terjadi ekspresi P5CS
pada tanaman tembakau
6. Memperoleh informasi apakah over ekspresi terjadi di semua jaringan
tanaman tembakau
7. Apakah umur/developmental tanaman berpengaruh pada ekspresi P5CS
Garis Besar Disertasi
Disertasi ini disusun berdasarkan pemikiran bahwa keberhasilan untuk
mengembangkan tanaman cabai merah yang toleran terhadap cekaman kekeringan
dan berdaya hasil tinggi melalui pemuliaan tanaman akan lebih tinggi jika:
tersedia populasi tanaman cabai yang bersegregasi zuriat dari hasil persilangan
antara tetua donor yang membawa sifat daya hasil tinggi dengan tetua donor yang
membawa sifat toleransi cekaman kekeringan.
Toleransi terhadap cekaman kekeringan dikendalikan oleh banyak sifat
(Blum 1983) maka untuk memperoleh metode seleksi yang efektif perlu dilakukan
serangkaian percobaan identifikasi sifat toleransi cekaman kekeringan. Pada tahap
awal, percobaan untuk memperoleh karakter yang dapat memberi petunjuk
toleransi kekeringan pada cabai. Rangkaian percobaan respon cabai terhadap
cekaman kekeringan dilakukan terhadap lima genotipe cabai. Karena toleransi
kekeringan bersifat dinamik, diantaranya dipengaruhi oleh tingkat perkembangan
tanaman, maka identifikasi sifat toleran tersebut dilakukan pada tahap
pertumbuhan vegetatif dan pertumbuhan generatif.
Evaluasi toleransi terhadap cekaman kekeringan biasanya dilakukan
dengan dua pendekatan: (1) secara langsung, dengan mengamati pengaruh
langsung cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan, perkembangan, dan daya
hasil; (2) secara tidak langsung, dengan mengamati berbagai peubah morfologi,
fisiologi, atau molekuler yang terkait dengan sifat toleransi terhadap kekeringan.
Pada pendekatan secara langsung, tanaman diberi perlakuan cekaman kekeringan
dengan pengurangan pemberian air. Hasil yang diperoleh selanjutnya dibahas
pada BAB III, BAB IV, BAB V, dan BAB VI. BAB III membahas “Dampak
Cekaman Kekeringan Terhadap Pertumbuhan, Hasil dan Kandungan Total
Prolina Daun Cabai (Capsicum annuum L), dan tulisan ini telah diterbitkan di
jurnal ilmiah nasional terakreditasi AGRISTA volume 12 nomor 1, halaman 19-
27, April 2008, Universitas Syiah Kuala Banda Aceh. Percobaan-percobaan yang
dilakukan untuk pembahasan tersebut ditujukan untuk menentukan keefektifan
penggunaan simulasi cekaman kekeringan pada berbagai tahap pertumbuhan
menggunakan pot dengan pengurangan penyiraman air dalam menapis karakter
toleransi tanaman cabai. Hasil yang didapat akan dipakai sebagai penduga
toleransi tanaman cabai terhadap cekaman kekeringan. Peubah yang diukur dalam
percobaan ini adalah kandungan prolina daun, tinggi tanaman, jumlah cabang
utama, dan bobot kering tajuk dan akar. Peubah yang terkait dengan pertumbuhan
generatif meliputi jumlah dan bobot buah .
Sejalan dengan penelitian ini dilakukan penelitian tentang ”Studi
Regenerasi Beberapa Genotipee Cabai (Capsicum Annum L.) Secara In
Vitro” Hasil percobaan ditulis pada BAB IV, penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan genotipe cabai yang respon untuk dikembangkan secara in vitro
untuk digunakan dalam rekayasa genétika tanaman guna memasukan gen
ketahanan terhadap cekaman kekeringan pada genom cabai.
Hasil percobaan dan analisis studi tersebut kemudian digunakan untuk
tahapan penelitian yang ditulis dalam BAB V dengan judul “Introduksi Gen
P5CS ke dalam Genom Cabai dengan Bantuan Agrobacterium dan
Ekspresinya terhadap Cekaman Akibat Pemberian PEG”.
Untuk membuktikan bahwa gen P5CS dapat memberikan ketahanan
terhadap tanaman yang mengalami cekaman kekeringan dilakukan penelitian
terhadap tanaman model tembakau transgenik yang telah mengandung gen P5CS,
generasi R2, yang ditulis dalam BAB VI ”Toleransi Tembakau Transgenik
Generasi R2 yang Mengekspresikan Gen P5CS terhadap Cekaman
Kekeringan Akibat Pengurangan Pemberian Air”. Berdasarkan evaluasi
terhadap percobaan simulasi cekaman kering menggunakan pot dengan
pengurangan penyiraman yang telah dilakukan ada beberapa hal yang perlu
disempurnakan. Adanya perbedaan perawakan pada genotipe toleran (yang
cenderung lebih besar) dan genotipe peka (cenderung lebih kecil) menyebabkan
perbedaan kebutuhan air di antara keduanya.
Respon yang diberikan oleh masing-masing individu pada simulasi
kekeringan dalam pot dapat berbeda. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan
percobaan dengan menggunakan simulator yang lebih baik. Penggunaan larutan
PEG 6000 untuk mengatasi kelemahan yang muncul merupakan pilihan yang
diambil untuk percobaan selanjutnya. Pengamatan dilakukan terhadap berbagai
peubah pertumbuhan vegetatif. Hasil percobaan dan analisis penggunaan larutan
PEG dalam menapis sifat toleransi pada tembakau ditulis pada BAB VII dengan
judul “Toleransi Tembakau Transgenik Generasi R2 Yang Mengekspresikan
Gen P5CS terhadap Stres Akibat Penyiraman Polietilen Glikol ”.
Gambar 1 Skema strategi penelitian : Galur Cabai Transgenik dengan Gen
P5CS-Penyandi Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi dan Karakterisasi Regeneran
Transformasi genetika: Introduksi gen P5CS menggunakan Agrobacterium
Analisis respon
beberapa varietas cabai secara in vitro
Tahapan In Vitro Induksi kultur Embrio Somatik (ES) sebagai
eksplan
Plasma Nutfah Cabai
Analisis respon tanaman cabai transgenik terhadap cekaman
kekeringan
Analisis respon tanaman tembakau transgenik R2 yang membawa gen P5CS terhadap cekaman kekeringan
Regenerasi tanaman transgenik R0 yang mengandung gen P5CS
Evaluasi keberadaan transgene pada transforman R0 yang mengandung gen P5CS
Analisis respon tanaman tembakau transgenik T2 terhadap cekaman kekeringan dengan penyiraman PEG
Tanaman transgenik yang toleran cekaman kekeringan
Analisis respon tanaman cabai transgenik terhadap cekaman
kekeringan
Analisis respon tanaman tembakau transgenik R2 yang membawa gen P5CS terhadap cekaman kekeringan
Regenerasi tanaman transgenik R0 yang mengandung gen P5CS
Evaluasi keberadaan transgene pada transforman R0 yang mengandung gen P5CS
Analisis respon tanaman tembakau transgenik R2 terhadap cekaman kekeringan dengan penyiraman PEG
Tanaman transgenik yang toleran cekaman kekeringan
Gambar 2 Alur disertasi Galur Cabai Transgenik dengan Gen P5CS-Penyandi
Enzim Kunci Biosintesis Prolina Regenerasi Dan Karakterisasi Regeneran dan hubungan masing-masing topik penelitian
Dampak Cekaman Kekeringan Terhadap Pertumbuhan, Hasil, Dan Kandungan Prolina Daun Cabai (Capsicum annum L.) (Bab III)
Studi Regenerasi Beberapa Genotipe Cabai
(Capsicum annum L.) Secara In Vitro (Bab IV)
Toleransi Tembakau
Transgenik Generasi R2 Yang mengekspresikan Gen
P5CS terhadap Cekaman Kekeringan Akibat
Pengurangan Pemberian Air (Bab VI)
Toleransi Tembakau
Transgenik Generasi R2 Yang mengekspresikan
Gen P5CS terhadap Cekaman Kekeringan Akibat Penyiraman
Polietilen Glikol (PEG) (Bab VII)
Introduksi Gen P5CS dengan Bantuan
Agrobacterium dan Regenerasi Cabai
Transgenik (Bab V)
Luaran Penelitian : Dengan didapat genotipe cabai yang respon terhadap perbanyakan secara in vitro, dan dilakukan introduksi gen P5CS maka diharapkan di dapatkan tanaman cabai transgenik
yang tahan terhadap cekaman kekeringan
II TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Cabai
Berdasarkan klasifikasi tanaman cabai termasuk dalam kingdom: Plantae,
Divisio: Magnoliophyta, Kelas: Magnoliopsida; Ordo: Solanales; Famili:
Solanaceae; dan Genus: Capsicum. Kebanyakan spesies cabai adalah diploid
dengan 24 kromosom (2N = 2 x = 24) dan mempunyai 1 atau 2 pasang kromosom
acrosentrik dengan 10 atau 11 pasang metasentrik atau submetasentrik (Bosland
dan Votata 2000).
Genus Capsicum adalah anggota dari famili Solanaceae yang di dalamnya
termasuk tomat, kentang, tembakau dan petunia. Genus Capsicum terdiri dari 22
spesies liar dan 5 spesies yang dibudidayakan (Bosland 1994): C. annuum,
C. baccatum, C. chinense, C. frutescens, dan C, pubescens.
Cabai (Capsicum spp) merupakan sayuran penting di dunia dan termasuk
spesies pertama yang ditemukan telah digunakan manusia di seluruh dunia (Berke
2002a). Cabai dapat dikonsumsi dalam bentuk buah segar, kering atau bentuk
olahannya dan memiliki berbagai manfaat. Cabai telah menjadi bagian penting
dalam resep masakan (Berke 2002b), kaya akan vitamin C, A, dan B, potasium,
fosfor dan kalsium (Xuefeng 1999; Boslan dan Votava 2000), dan kandungan
kimianya merupakan bagian penting dalam obat-obatan, pewarna makanan, dan
kosmetika (Taychasinpitak dan Taywiya 2003; IISR 2006).
Jenis-jenis cabai yang sudah dibudidayakan secara komersial dan
berkembang di Indonesia ada dua spesies yaitu: cabai besar (Capsicum annuum L)
dan cabai kecil (Capsicum frutescens L.). Cabai besar dikenal 3 varietas, yaitu:
cabai merah (varietas longum), cabai keriting, dan cabai paprika (varietas
grossum). Perbedaan varietas cabai merah besar dengan cabai merah keriting
terletak pada morfologi buahnya. Cabai merah besar ukuran buahnya besar,
panjang, ujungnya runcing, dan rasanya sedikit pedas serta agak manis. Buah
pada saat muda berwarna hijau, dan setelah tua menjadi merah. Sedangkan cabai
merah keriting ukuran buahnya panjang, runcing, dan rasanya lebih pedas dari
cabai merah pedas besar. Disamping itu kulit buah agak tipis serta diameter
buahnya lebih kecil disbanding cabai merah besar (Messiaen 1992; Rukmana
1996).
Cabai besar (Capsicum annuum L.) termasuk tanaman semusim yang
berbentuk perdu, dan mempunyai akar yang menyebar. Penyebaran akarnya
dangkal sehigga cabang dan rambut akar banyak terdapat di permukaan tanah, dan
semakin ke dalam akar-akar tersebut semakin berkurang. Akar horizontal cepat
berkembang di dalam tanah dan menyebar dengan ke dalaman 10 – 15 cm
(Messiaen 1992). Tanaman ini mempunyai batang tegak, tingginya 50 – 90 cm
dari permukaan tanah. Daun berbentuk lonjong dan bagian ujungnya meruncing.
Panjang daun antara 4-10 cm, dan lebarnya antara 1,5 – 4 cm.
Cabai besar berbunga tunggal, yang keluar dari ketiak-ketiak daun. Posisi
bunga menggantung, dan memiliki 5-6 daun mahkota bunga. Panjang bunga
biasanya 1 - 1,5 cm, lebar 0,5 cm cm dan panjang tangkai bunga 1 – 2 cm.
Tangkai putik berwarna putih, panjangnya sekitar 0,5 cm, sedangkan kepala
putiknya berwarna kekuning-kuningan. Tangkai sari berwarna putih dengan
panjangnya sekitar 0,5 cm. Kepala sari yang belum matang berwarna biru atau
ungu (Rukmana 1996).
Berdasarkan data Informasi Hortikultura dan Aneka Tanaman,
Departemen Pertanian (2000) produsen terbesar cabai adalah Jawa Timur, Jawa
Barat, Jawa Tengah, Sumatera Utara, Nusa Tenggara Barat, dan Sulawesi selatan.
Tanaman cabai ini mempunyai nilai ekonomis yang tinggi, sehingga berpeluang
besar menjadi salah satu komoditas ekspor yang unggul. Berdasarkan data ekspor
komoditi hortikultura, cabai merah telah berhasil diekspor ke Negara Singapura,
Taiwan, Emirat Arab dan arab Saudi.
Data statistik menunjukkan bahwa areal pertanaman cabai merah adalah
yang terluas antara sayuran yang diusahakan di Indonesia yaitu sekitar 19,12
persen dari total areal pertanaman sayuran (Direktorat Jendral Bina Produksi
Hortikultura 2007). Jumlah penduduk yang semakin bertambah menggambarkan
permintaan cabai yang semakin besar. Pada tahun 2002 terjadi penambahan areal
pertanaman cabai dari 142,556 ha menjadi 150,598 ha. Namun luasnya areal
pertanaman belum diikuti dengan tingginya produktivitas. Produksi cabai merah
di Indonesia pada tahun 2000 adalah 4,2 ton/ha, sedangkan pada tahun 2004 dan
2005 berturut-turut 5,67 ton/ha dan 5,84 ton/ha (Direktorat Jendral Bina Produksi
Hortikultura 2007). Potensi produksi cabai merah dapat mencapai 12-20 ton/ha
(Duriat 1996). Jika dibandingkan dengan negara-negara Asia lainnya, daya hasil
cabai merah Indonesia tertinggal jauh. Sebagai contoh daya hasil cabai merah
Cina mencapai 14,5 ton/ha (Rubatzky dan Yamaguchi 1997).
Banyak faktor yang menyebabkan rendahnya produktivitas cabai di
Indonesia di antaranya adalah: penggunaan benih yang kurang bermutu, teknik
budidaya yang belum sempurna, dan tingginya serangan hama dan penyakit.
Secara umum pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi oleh faktor
genetika dan lingkungan. Kenyataan di lapangan lingkungan pertumbuhan
tanaman tidak selalu merupakan yang optimum bagi tanaman, sehingga seringkali
tanaman tidak mampu mengekspresikan seluruh potensi genetika yang
dimilikinya. Menurut Blum (1982) cekaman lingkungan merupakan faktor yang
paling berperan terhadap adanya kesenjangan antara potensi dan hasil aktualnya.
Produksi cabai dapat ditingkatkan melalui program perluasan pertanaman
dan intensifikasi budidaya. Kedua program ini sangat membutuhkan benih yang
berkualitas, baik secara genetika maupun fisiologis. Benih yang berkualitas
genetika tinggi dapat diperoleh melaui persilangan konvensional yang diikuti
dengan proses seleksi.
Pemuliaan tanaman cabai konvensional untuk merakit varietas unggul
merupakan cara yang banyak dilakukan untuk mengendalikan serangan hama
penyakit. Kehadiran teknologi transformasi memberikan wahana baru bagi para
pemulia tanaman untuk memperoleh gen baru yang lebih luas (Greenberg dan
Glick 1993). Rekayasa genetika akan memberikan perbaikan dari karakter-
karakter penting pada tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa
cekaman biotik seperti gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat
diperbaiki dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan
modifikasi kualitas dan kuantitas produk tanaman (Bennet 1993). Suatu gen yang
tidak terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat
diperoleh dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain
(Herman 1996).
Teknik penyisipan gen (transformasi gen) akan menghasilkan tanaman
transgenik yang kemudian dapat dimanfaatkan sebagai sumber plasma nutfah atau
langsung diseleksi menjadi galur harapan. Transformasi gen secara in vitro
dengan menggunakan vektor Agrobacterium akan berhasil dan bermanfaat apabila
sudah diperoleh protokol regenerasi tanaman yang efisien dan stabil. Kompetensi
untuk beregenerasi yaitu kemampuan membentuk tanaman lengkap (mempunyai
tunas dan akar) dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci
penting penentu keberhasilan program transformasi genetika.
Kultur sel atau jaringan dan sistem regenerasinya memegang peranan yang
sangat penting di dalam aplikasi bioteknologi atau transformasi genetika untuk
program perbaikan tanaman. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai
sistem regerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter penting yang
spesifik pada tanaman (Parrot et al. 1992). Oleh karena itu, sebelum dilakukan
transformasi genetika untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan terhadap
kondisi kekeringan diperlukan adanya sistem regenerasi yang efisien dan stabil.
Perbanyakan Tanaman Cabai Secara In Vitro
Terbatasnya informasi tentang regenerasi langsung atau organogenesis
tanaman cabai merah merupakan salah satu indikasi sulitnya tanaman ini untuk
diregerasikan secara in vitro. Informasi yang ada umumnya merupakan hasil
penelitian terhadap cabai manis atau páprika (Sweet pepper), sehingga penelitian
yang dilakukan terhadap cabai merah banyak mengacu kepada hasil penelitian
regenerasi tanaman cabai paprika.
Sistem transformasi genetika memerlukan sel/jaringan yang mampu untuk
membelah dan dapat diregenerasikan serta dapat ditumbuhkan dalam media
seleksi antibiotik atau herbisida yang sesuai dengan gen yang dibawa dalam DNA
yang tertransformasi.
Teori totipotensi yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann pada
tahun 1838 merupakan dasar dari kultur jaringan. Teori tersebut menyatakan
bahwa setiap sel tanaman memiliki informasi genétika lengkap sehingga mampu
beregenerasi membentuk tanaman lengkap bila ditumbuhkan dalam lingkungan
yang sesuai (Pierik 1987). George dan Sherington (1984) menyatakan bahwa
keberhasilan perbanyakan tanaman dengan metode kultur jaringan dipengaruhi
banyak faktor antara lain : sifat genetikaa tanaman, pemilihan bagian tanaman
yang digunakan sebagai sumber eksplan, umur eksplan, komposisi media tumbuh,
zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur.
Bagian tanaman cabai yang digunakan sebagai eksplan adalah kotiledon,
hipokotil, daun muda, embrio muda, dan embrio matang. Untuk studi regenerasi
langsung eksplan kotiledon, hipokotil, dan daun muda banyak digunakan (Hyde
dan Philips 1996; Valera-Montero dan Ochoa-Alejo 1992; Philips dan
Hubstenberger 1985; Agrawal et al. 1989; Ochoa-Alejo dan Garcia-Bautista 1992;
Ebida dan Hu 1993).
Umur eksplan dan orientasi pengambilan eksplan mempengaruhi
kemampuan eksplan untuk membentuk tunas secara in vitro (Fari dan Zcako
1981; Kato et al. 1996). Fari dan Zcako (1981) melaporkan bahwa segmen bagian
hipokotil dapat terinduksi membentuk tunas, segmen bagian tengah dominan
membentuk akar, dan segmen bagian bawah cendrung membentuk kalus yang
banyak. Kato et al. (1996) melaporkan bahwa umur kecambah 25 hari merupakan
umur terbaik sebagai sumber eksplan daun.
Eksplan daun muda dan hipokotil mempunyai potensi yang sama dalam
kapasitasnya untuk membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan respon terutama
disebabkan oleh perbedaan genotip tanaman (Mahmood et al. 1995). Menurut
hasil penelitiannya, Christopher dan Rajam (1996) bahwa eksplan daun lebih
konsisten untuk membentuk tunas dibandingkan dengan eksplan hipokotil dan
kotiledon. Efisiensi tunas tergantung kepada eksplan yang digunakan (Fari dan
Zcako 1981; Zhu et al. 1998).
Sistem regenerasi tanaman secara in vitro paling tidak tiga faktor penting
yang sangat berpengaruh. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tipe eksplan dan
komposisi media (Moghaieb et al.1999; Gubis et al. 2003). Media dasar yang
paling banyak digunakan adalah mediaum dasar MS (Murashige dan Skoog
1962). Walaupun terdapat komposisi medium dasar lain, sampai sekarang belum
ditemukan komposisi medium dasar lain yang digunakan terhadap regenerasi
tanaman cabai.
Umumnya zat pengatur tumbuh yang paling banyak digunakan untuk
regenerasi tanaman cabai adalah komposisi antara BAP dan IAA (Gunay dan Rao
1978; Fari dan Zcako; 1981; Philips dan Hubstenberger 1985; Agrawal et al.
1989; Arroyo dan Revilla 1991; Valer-Monero dan Ochoa-alejo 1992; Mahmood
et al. 1996). Pada studi generasi tanaman cabai secara in vitro kombinasi BAP
dan IAA ekstensif digunakan. Penggunaan BAP tinggi dan IAA rendah untuk
induksi tunas adventif, BAP rendah dan IAA rendah untuk pemanjangan tunas,
dan IAA rendah untuk merangsang perakaran (Gunay dan Rao 1978; Philips dan
Hubstenberger 1985). Beberapa laporan juga menyatakan bahwa medium
regenerasi tunas yang han ya ditambah dengan BAP saja berhasil dilakukan
(Mahmood et al. 1995; Agrawal et al. 1989).
Cekaman Kekeringan pada Tanaman
Cekaman kekeringan merupakan salah satu faktor lingkungan terpenting
yang menjadi faktor pembatas pertumbuhan tanaman yang menghambat aktivitas
fotosintesis dan translokasi fotosintat (Yakushiji et al. 1998; Savin dan Nicolas,
1996), selanjutnya mempengaruhi produktivitas tanaman. Istilah kekeringan ini
menunjukkan bahwa tanaman mengalami kekurangan air akibat keterbatasan air
dari lingkungan tumbuhnya yaitu media tanam. Menurut Levit (1980) dan Bray
(1997) cekaman kekeringan yang biasa disebut drought stress pada tanaman dapat
disebabkan oleh dua hal yaitu (1) kekurangan suplai air di daerah perakaran dan
(2) permintaan air yang berlebihan oleh daun akibat laju evapotranspirasi melebihi
laju absorpsi air walaupun keadaan air tanah tersedia cukup. Pada lahan kering,
cekaman kekeringan pada tanaman terjadi karena suplai air yang tidak mencukupi.
Menurut Wang et al. (1995) cekaman kekeringan yang dialami tanaman
pada setiap periode pertumbuhan dan perkembangan dapat menurunkan hasil
meskipun besar penurunannya tergantung fase pertumbuhan pada saat terjadi dan
lamanya cekaman. Pada fase pertumbuhan vegetatif, ketersediaan air berpengaruh
pada beberapa asfek fisiologi serta morfologi, antara lain: menurunkan laju
kecepatan fotosintesis dan luas daun. Jika tanaman terkena cekaman kekeringan,
potensial air daun akan menurun, pembentukan klorofil daun akan terganggu dan
struktur kloroplas akan mengalami disintegnasi (Alberte et al. 1977). Kramer
(1983) menjelaskan lebih lanjut bahwa pengaruh cekaman kekeringan pada
pertumbuhan vegetatif terutama pada perluasan area daun dan pertumbuhan tunas
baru dan nisbah akar-tajuk. Sedangkan pada pertumbuhan reproduktif
mengakibatkan ketidaknormalan pembungaan, aborsi embrio, ketidaknormalan
perkembangan biji dan buah. Ditambahkan oleh Sloane et al. (1990) bahwa
tanaman pada fase perkembangan reproduktif sangat peka terhadap cekaman
kekeringan. Kondisi cekaman kekeringan dapat menyebabkan gugurnya bunga,
polong, dan biji yang telah terbentuk. Hal ini berhubungan dengan penurunan
kecepatan fotosintesis akibat keterbatasan ketersediaan air.
Bray (1997) menyatakan respon tanaman terhadap cekaman kekeringan
tergantung pada jumlah air yang hilang, tingkat kerusakan dan lama cekaman
kekeringan, dan juga sangat tergantung pada genotipe tanaman, lama dan jenis
penyebab kehilangan air, umur dan fase perkembangan, tipe organ dan tipe sel
dan bagian-bagian sub seluler. Kehilangan air pada tingkat seluler dapat
menyebabkan perubahan konsentrasi senyawa osmotik terlarut, perubahan volume
sel dan bentuk membran, perubahan gradien potensial air, kehilangan turgor,
kerusakan atau kehancuran integrasi membran dan denaturasi protein. Menurut
Savin dan Nicolas (1996), cekaman kekeringan tidak hanya mengurangi laju
fotosintesis tetapi juga dapat mengakibatkan terjadinya senesen pada organ-organ
fotosintesis. Akibat cekaman kekeringan dapat menyebabkan perbedaan
penurunan hasil antara pada tanaman yang peka, dan juga pada tanaman yang
toleran tetapi berbeda tingkat penurunannya.
Toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan dapat terjadi jika
tanaman dapat bertahan terhadap cekaman yang terjadi dan adanya toleransi atau
mekanisme yang memungkinkan menghindari dampak buruk dari situasi cekaman
tersebut. Karakter morfologi atau fenotipik (secara konvensional) umumnya
digunakan untuk menduga tingkat toleransi tanaman terhadap cekaman
kekeringan yaitu dengan mengamati gejala secara visual di tingkat in vitro
(Hooker dan Thorpe 1997), maupun di lapang (Vallejo dan Kelly 1998), misalnya
perkembangan perakaran, gejala layu sebagian atau keseluruhan pada organ
vegetatif atau organ reproduktif, merosotnya hasil panen dan kualitas hasil, serta
ketidaktahanan hasil dalam penyimpanan.
Respon Tanaman terhadap Cekaman Kekeringan dengan Penyesuaian Osmotik Beberapa tanaman dapat mempertahankan tekanan turgor yang tinggi juga
pada potensial air yang agak rendah dengan cara meningkatkan potensial osmotik
melalui akumulasi zat terlarut yang meningkat di dalam sel. Proses ini disebut
penyesuaian osmotik (osmotic adjustment) atau regulasi osmotik. Adanya
penyesuaian osmotik, berarti menjaga turgor sel sehingga berarti pula menjaga
integritas dan proses fisiologi sitoplasma. Penyesuaian osmotik berpotensi
menjaga proses fotosintesis dan pertumbuhan tanaman (Riduan et al 2007).
Naiola dan Syarif (1996) dan Blum (1982) menyatakan bahwa potensial
turgor merupakan faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan atau perluasan
sel. Jika terjadi akumulasi atau peningkatan senyawa osmotik atau perpindahan
K+, maka potensial osmotik menurun, sehingga air berdifusi ke dalam sel dan
potensial turgor meningkat. Kandungan air tanaman untuk mempertahankan
turgor ini dijaga oleh keseimbangan laju transpirasi dan penyerapan air oleh akar.
Jika tanaman mengalami cekaman kekeringan, maka potensial turgor tanaman
akan terganggu sebagai akibat ketidakseimbangan antara laju transpirasi yang
terjadi dengan jumlah air yang dapat diserap oleh tanaman.
Respon tanaman yang mengalami cekaman kekeringan akan mengurangi
dampak negatif yang ditimbulkan melalui mekanisme pertahanan yang dimiliki
oleh tanaman itu sendiri. Menurut Jones (1981) mekanisme ketahanan tanaman
terhadap kekeringan adalah (1) penghindaran terhadap defisit air yang meliputi: a)
melepaskan diri dari cekaman misalnya dengan memperpendek siklus
pertumbuhan dan memperpanjang periode dorman, b) konservasi air pada
tanaman yang diwujudkan dalam bentuk ukuran daun yang kecil, penutupan
stomata dan penyerapan air yang efektif, diwujudkan dalam bentuk morfologi
akar yang memanjang, dalam dan tebal, (2) toleran terhadap defisit air yaitu
dengan cara: a) memelihara tekanan turgor, b) mengaktifkan larutan-larutan
pelindung untuk aktivitas enzim-enzim yang toleran kekeringan, dan (3)
mekanisme efisiensi yaitu penggunaan air yang tersedia secara efisien dan
memaksimalkan indeks panen.
Penyesuaian osmotik terjadi pada tanaman yang mengalami cekaman
kekeringan secara perlahan dan juga pada cekaman medium. Namun, tidak semua
tanaman mengembangkan penyesuaian osmotik sebagai respon terhadap cekaman
kekeringan. Penyesuaian osmotik dipegaruhi oleh laju perkembangan cekaman,
tingkat cekaman, kondisi lingkungan dan perbedaan genotipe tanaman.
Disamping itu penyesuain osmotik melalui perubahan potenasial osmotik
dipengaruhi oleh akumulasi senyawa terlarut, ukuran sel, volume senyawa terlarut
dan ketebalan dinding sel. Menurut Levitt (1980) dan Blum (1996) penurunan
potensial osmotik disebabkan oleh dua hal yaitu akibat menurunnya kadar air pada
sel karena terjadi kehilangan air dan karena adanya tambahan akumulasi senyawa
terlarut sehingga lebih menurunkan potensial osmotik. Ingram dan Bartels (1996)
menyatakan potensial air daun total dapat dipelihara selama cekaman kekeringan
sedang, melalui penyesuaian osmotik dengan melibatkan senyawa osmotik
kompatibel.
Menurut Ingram dan Bartels (1996) dan Nguyen et al. (1977) senyawa
organik terlarut yang terlibat pada penyesuaian osmotik bervariasi, antara lain
gula-gula, asam organik, asam amino, dan senyawa terlarut kompatibel. ABA dan
prolina merupakan senyawa yang memegang peranan penting untuk toleransi
tanaman terhadap cekaman kekeringan (Kim & janick 1991; Hanson et al. 1979)
Prolina merupakan salah satu senyawa osmotik yang dibiosintesis dan
diakumulasi pada berbagai jaringan tanaman yang dicekam kekeringan, terutama
pada bagian daun (Yang dan Kao 1999). Fungsi lain yaitu memproteksi adanya
denaturasi protein, sebagai sumber energi dari group asam amino dan merupakan
protektan bagi enzim akibat pengaruh toksik biologi seperti urea, oleh karena itu
prolina dikenal sebagai salah satu osmoprotektan (Notle et al. 1997). Sebagai
osmoprotektan, prolina diduga sangat terlibat dalam osmoregulasi, menjaga
kelarutan protein, kestabilan membran fosfolipid dan juga sebagai sumber
cadangan karbon, nitrogen dan energi (Walton et al. 1998). Peranan prolina tidak
hanya terbatas pada penyesuaian osmotik yang dikaitkan dengan status air, tetapi
juga mempunyai peranan lain seperti menetralisir pengaruh toksik NH; hasil
hidrolisis protein sebagai sumber energi dan sumber N bagi pemulihan proses
tanaman pasca cekaman kekeringan (Levitt 1980).
Prolina dijumpai terakumulasi lebih banyak pada tanaman yang lebih
toleran terhadap cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman yang peka
(Kirkham 1990; Yoshiba et al. 1997). Akumulasi prolina merupakan salah satu
respon pada tanaman akibat cekaman kekeringan. Hasil penelitian Maesteri et al.
(1995) menunjukkan bahwa kandungan prolina pada Coffea arabica clan C.
canehora dapat meningkat dua kali lebih bayak pada kondisi cekaman kekeringan
dibandingkan dengan tanpa perlakuan kekeringan. Dingkuhn et al. (1991)
melaporkan bahwa akumulasi prolina berbeda antar kultivar padi dan berkorelasi
negatif dengan potensial air dan berkorelasi positif dengan penyesuaian osmotik.
Delauney dan Verna (1983) menyatakan bahwa ditemukan indikasi
korelasi positif antara akumulasi prolina dan adaptasi tanaman terhadap cekaman
kekeringan dan garam positif. Oleh karena itu sejumlah peneliti menyatakan
bahwa prolina dapat dipertimbangkan sebagai indikator seleksi menyangkut
adaptasi tanaman terhadap cekaman lingkungan, terutama cekaman kekeringan
dan salinitas (Kuznetsov dan Shevyakova 1997; Yoshiba et al. 1997).
Akumulasi prolina pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan
disebabkan oleh aktivasi biosintesis prolina dan inaktivasi degradasi prolina. Hasil
penelitian hubungan antara ekspresi gen-gen untuk enzim yang terlibat dalam
biosintesis dan metabolisme prolina dan akumulasi prolina dibawah kondisi
cekaman kekeringan menunjukkan bahwa level prolina pada tanaman diatur
pada level transkripsi selama terjadinya cekaman kekeringan. Pada tanaman
tingkat tinggi, prolina disintesis melalui lintasan asam glutamin dan ornitin.
Lintasan dari glutamin merupakan rute primer untuk biosintesis prolina dalam
kondisi cekaman kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et al. 1997). Prolina
disintesis dari glutamin melalui dua senyawa intermediet yaitu glutamin
semialdehyde (GSA) dan Pyrroline-5-carboxylate (P5C). Ada dua enzirn yang
berperan dalam biosintesis prolina yaitu P5C synthetase (P5CS) pada step awal
dan P5C reductase (P5CR) pada step kedua (Gambar 3).
Enzim P5CS adalah senyawa yang mengkatalis biosintesis prolina
melalui jalur glutamat pada tanaman. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
P5CS merupakan penyandi enzim yang menjadi faktor pembatas dalam
biosintesis prolina pada tanaman tingkat tinggi (Hu CA et al. 1992). Gen yang
menyandi P5CS telah berhasil diisolasi dari berbagai tanaman yaitu dari Vigna
aconitifolia (Hu CA et al. 1992), Arabidopsis thaliana dan padi serta
ekspresi dan fungsinya telah diteliti. Dalam kondisi salinitas tinggi dan
kekeringan, stimulasi biosistesis prolina berkorelasi dengan meningkatnya
level P5CS.
Over-ekspresi dari P5CS menghasilkan akumulasi prolina pada tanaman
transgenik dan terbukti meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman
kekeringan. Over-produksi prolina mampu meningkatkan secara significan
terhadap biomassa akar dan perkembangan bunga pada tanaman transgenik di
bawah kondisi cekaman kekeringan atau cekaman osmotik. Transformasi gen
P5CS yang berasal dari V. aconitifolia ke tanaman tembakau di bawah kendali
promoter konstitutif CaMV 35S, secara nyata terbukti menghasilkan aktivitas
enzim P5CS yang lebih tinggi dan meningkatkan produksi prolina 10 sampai
18 kali lebih banyak dibandingkan tanaman non transgenik. Hasil
membuktikan bahwa aktivitas enzim P5CS mempunyai peranan penentu dalam
sintesis prolina. Hasil penelitian ini menyimpulkan bahwa over-ekspresi gen
P5CS mampu meningkatkan kandungan prolina secara nyata dan over-produksi
prolina dapat meningkatkan pula toleransi tanaman transgenik tersebut
terhadap cekaman kekeringan (Kavi Kishor et al. 1995).
Hasil penelitian pada tanaman padi yang diintroduksi gen P5CS dari
mothbean (Vigna aconitifolia L.) mampu menunjukkan peningkatan aktivitas
gen P5CS 5,3 sampai 9,8 kali lebih tinggi dan meningkatkan kandungan
prolina 167 sam 252 % lebih tinggi dibandingakn tanaman control. Tanaman
padi transgenik yang membawa gen P5CS juga dapat meningkatakn biomassa
tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan melalui peningkatan panjang akar
48%, berat tajuk 32% dan berat akar 164% lebih tinggi dibandingkan tanaman
control (Zhu et al. 1998).
(A) Lintasan biosintesis L-prolina dari L-glutamin:
(B) Berbagai gen penyandi enzim untuk biosintesis L-prolina: Gambar 3 Lintasan biosintesis L-prolina dari L-glutamin dan berbagai gen
penyandi enzim yang diperlukan untuk biosintesis L-prolina. Gen P5CS merupakan gen penyandi enzim kunci dalam biosintesis prolina, yang ekspresinya meningkat dengan adanya cekaman kekeringan (dehidrasi) dan menurun dalam kondisi non-cekaman (rehidrasi)
L-glutamine (L-glu)
Pyrroline-
5-
b l t
Glutamic-
semialdehy
d
L-prolinae (L-pro)
P5C dehydroge- nase (P5CDH)
Prolinae dehydro- genase (ProDH)
Spontan
Pyrroline 5-carboxylase synthetase (P5CS)
P5C reductase (P5CR)
Spontan
Dehidrasi Rehidrasi
ABA
L-glu P5C GSA L-pro
P5CDH ProDH Spontan
P5CS P5CR Spontan
P5CDH gene ProDH gene
P5CS gene P5CR gene
Dehidrasi
Dehidrasi Rehidrasi Rehidrasi
Plasmid pBI-P5CS
Molekul DNA sirkular yang terdapat bebas di dalam sitoplasma sel bakteri
dikenal dengan nama plasmid. Plasmid pBI-P5CS merupakan plasmid
rekombinan yang digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik. Plasmid ini
telah dimodifikasi dari plasmid alami. Plasmid alami direkonstruksi, dikurangi
dan ditambah dengan sifat-sifat tertentu sehingga dihasilkan plasmid rekombinan.
Plasmid rekombinan ini digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen ke
dalam kromosom sel tanaman. Plasmid rekombinan P5CS, mempunyai promotor
konsitutif 35S CaMV, dilengkapi juga gen npt II untuk seleksi ketahanan terhadap
antibiotik kanamisin dan gen reporter GUS untuk mendeteksi keberadaan gen
dalam jaringan tanaman tertentu. Peta restriksi dari plasmid pBI-P5CS dapat
dilihat pada Gambar 4.
Plasmid dari bakteri yang satu dapat memasuki sel bakteri lain. Plasmid
juga mempunyai kemampuan memperbanyak diri dalam sel bakteri. DNA plasmid
mempunyai kisaran ukuran dari 1 kb sampai 200 kb, plasmid ini berlaku sebagai
unit genetika pelengkap yang bereplikasi dan diwariskan secara independen dari
kromosom bakteri. Plasmid hampir selalu membawa satu gen yang merupakan
ciri penting yang ditunjukkan bakteri donor, seperti kemampuan hidup dalam
antibiotik tertentu dengan konsentrasi yang biasanya bersifat toksik seperti
kanamisin dan higromisin. Hal ini disebabkan adanya plasmid yang membawa
gen resistensi di dalam bakteri.
Gambar 4 Peta restriksi plasmid pBI-P5CS
EcoR1
RB LB NPT II NPT II NPT II NosNosNos 3”3”3”NosNos Nos PPP 35S P35S P35S P GUSGUSGUS NosNos Nos 3”3” 3”
P5CSP5CSP5CS35S P 35S P 35S P Nos Nos Nos 3” 3”3” P5CS 35S P Nos 3”
NPT II NPT II NPT II NosNosNos 3”3”3”NosNos Nos PPP 35S P35S P35S P GUSGUSGUS NosNos Nos 3”3” 3”NPT II Nos 3” Nos P 35S P GUS Nos 3”
Sifat-sifat biologi Agrobacterium
Agrobacterium adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit
tumor (crown gall) atau akar rambut (hairy root) pada bagian tanaman terifeksi.
Hal ini disebabkan karena bakteri ini mampu menstranfer T-DNA yang terdapat
pada plasmid Ti ataupun plasmid Ri ke dalam sel tanaman (Zambryski et al.
1989). Dengan melakukan beberapa modifikasi, kemampuan alamiah
Agrobacterium mentransfer sebagian DNA-nya dapat dimanfaatkan untuk
memindahkan gen tertentu ke dalam tanaman.
T-DNA merupakan bagian dari megaplasmid yang ada dalam
Agrobacterium yaitu Ti-(tumor inducing) plasmid pada A. tumefaciens atau Ri-
(root inducing) plasmid pada A. rhizogenes (Winans 1992). Ti-plasmid yang
terdapat pada semua isolat virulen A. tumefaciens akan stabil selama
Agrobacterium tumbuh pada temperatur di bawah 30oC. Ti-plasmid dapat
dibedakan berdasarkan tipe opine yang dihasilkan yaitu nopaline atau oktopine,
sedangkan Ri-plasmid dibedakan menjadi kelompok manopine atau agropine
(Armitage et al. 1987). Senyawa-senyawa tersebut merupakan sumber C dan N
bagi Agrobacterium yang tidak dihasilkan oleh tanaman normal.
Terdapat dua spesies Agrobacterium yang bersifat patogen bagi jaringan
tanaman dikotil yang mengalami pelukaan yaitu Agrobacterium tumefaciens yang
dapat menginduksi pembentukan tumor pada leher batang (crow gall) dan
Agrobacterium rhizogenes yang dapat menginduksi pembentukan akar berambut
(hairy root) (Zambryski et al. 1989).
Tumor dan akar rambut dapat tumbuh terus walaupun Agrobacterium telah
mati. Selain itu, jaringan tersebut dapat tumbuh secara in vitro dalam medium
tanpa zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin yang biasanya diperlukan untuk
memacu pertumbuhan jaringan tanaman. Induksi tumor dan akar ini disebabkan
oleh ditransferkannya sebagian DNA (T-DNA) dari Agrobacterium ke dalam inti
sel tanaman.
Transfer gen pada genom tanaman dengan bantuan Agrobacterium
Dapat dikatakan bahwa lahirnya rekayasa genetikaa modern didasarkan
pada penemuan dari kemampuan rekayasa alamiah bakteri Agrobacterium.
Bakteri tipe onkogenik mengandung kopi tunggal plasmid Ti. T-DNA adalah
bagian dari plasmid Ti yang dipindahkan ke dalam genom tanaman (Binns 1990;
Day dan Lichtenstein 1990).
Plasmid Ti terlibat sebagai parasitisme secara genetikaa, infeksi
menyebabkan pengambilalihan sumber metabolit tanaman (opin) yang hanya
dapat dimetabolisasi oleh produk bakteri yang dikode oleh plasmid Ti.
Perkembangan tanaman yang terinfeksi akan semakin meningkatkan jumlah opin
yang tersedia (Gelvin 1990).
Ada tiga komponen genetika yang dimiliki Agrobacterium yang sangat
dibutuhkan untuk dapat melakukan transfer T-DNA ke sel tanaman, yaitu (1) T-
DNA itu sendiri sebagai elemen DNA aktif yang ditransfer ke tanaman,
merupakan sekuen DNA yang dapat dimanipulasi dengan cara menyisipkan suatu
sekuen DNA asing (transgen) yang kita kehendaki. Walaupun T-DNA telah
tersisipi DNA asing, transfer gen ke dalam genom tanaman tetap dapat
berlangsung dengan baik. Dalam penelitian ini T.DNA disisipi dengan sekuen gen
marker, gen reporter gus dan gen P5CS; (2) Gen virulensi (vir) yaitu gen penyandi
protein yang mengatur transfer T-DNA dari bacteri ke tanaman; dan (3) Gen-gen
penghasil protein yang terdapat pada kromosom Agrobacterium (Winans 1992).
III DAMPAK CEKAMAN KEKERINGAN TERHADAP PERTUMBUHAN, HASIL DAN KANDUNGAN TOTAL
PROLINA DAUN CABAI (Capsicum annuum L)1
Abstrak
Penelitian bertujuan untuk menentukan pengaruh cekaman kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif terhadap pertumbuhan dan hasil cabai, serta mengevaluasi toleransi dan kandungan prolina daun dari lima varietas cabai dalam kondisi stres tersebut. Cabai ditumbuhkan dalam pot plastik dan diberi perlakuan stres kekeringan pada umur 21 – 54 hari sesudah tanam, dengan penyiraman setiap 5 hari sekali. Tanaman yang disiram setiap hari dari saat tanam digunakan sebagai non-stres. Kandungan prolina ditentukan pada umur 27 dan 37 hari setelah tanam. Hasil percobaan menunjukkan stres kekeringan yang diberikan pada tanaman cabai menurunkan tinggi tanaman, panjang akar, bobot akar. Bobot tajuk, bobot biomassa dan produksi. Indeks sensivitas yang dihitung berdasarkan kandungan prolina daun menunjukkan varietas Tit Super dan Hot Chili dikategorikan peka sedangkan Jatilaba, Prabu dan Laris dikategorikan toleran terhadap stres kekeringan baik pada fase vegetatif maupun generatif.
Kata kunci: Cekaman Kekeringan, Cabai Merah, Indeks Sensitivitas
1 Bagian dari disertasi ini telah dipublikasikan di Jurnal Ilmiah Agrista vol. 12 no 1, hal
19-27, April 2008
III DROUGHT STRESS EFFECT ON GROWTH, YIELD AND TOTAL LEAF PROLINE CONTENT OF
HOT PEPPER (Capsicum annuum L)∗
Abstract
The objectives of this experiments were to evaluate effects of drought stress at vegetative stage on growth, yield and leaf proline content of hot pepper. Drought stress was conditioned by watering plants every five days during the period of 21 – 54 days after planting (DAP). Results of the experiment indicated that drought stress reduced plant height, branch numbers, stem diameter, root length, shoot, root and biomass dry weight and fruit yield. Sensivity index calculated based on biomass of five hot pepper cultivars showed that Prabu was the only tolerance cultivar while those based on proline concentration showed that Prabu, Laris dan Jati Laba were the medium tolerance to drought stress. There was no drought tolerance cultivar if the sensitivity index was calculated based on fruit yield.
Keyword: Dehydration stress, hot pepper, drought sensitivity index ∗ Bagian dari disertasi ini telah dipublikasikan di Jurnal Ilmiah AGRISTA vol.12 no.1, hal 19-27, April 2008
PENDAHULUAN
Cabai merah di Indonesia merupakan tanaman sayuran penting. Namun
demikian produktivitas cabai yang ditanam petani relatif masih rendah akibat
gangguan hama dan penyakit serta kondisi cekaman lingkungan seperti
kekeringan.
Cekaman kekeringan merupakan satu kendala dalam budidaya cabai
merah. Pada berbagai tanaman cekaman kekeringan berpengaruhi negatif
terhadap pertumbuhan dan produksi. Kramer (1993) menyebutkan terjadinya
cekaman kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif menurunkan indeks luas
daun, perkembangan tunas baru, dan nisbah tajuk-akar. Pada kedelai, cekaman
kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif menurunkan tinggi tanaman, jumlah
nodus, panjang akar, bobot kering akar dan tajuk (Sunaryo 2002). Ridwan dan
Sudarsono (2004) melaporkan cekaman kekeringan pada kacang tanah
menurunkan tinggi tanaman, bobot kering tajuk dan hasil.
Cekaman kekeringan dapat mempengaruhi berbagai mekanisme seluler,
biokimia dan fisiologi tanaman. Pada tingkat seluler kekeringan mengakibatkan
kehilangan air protoplasmik sehingga konsentrasi ion meningkat, menghambat
fungsi-fungsi metabolik, dan meningkatkan kemungkinan terjadinya interaksi
antar molekul yang dapat menyebabkan denaturasi protein dan fusi membran
(Mundree et al. 2002). Pengaruh negatif cekaman kekeringan terhadap tanaman
ditentukan oleh tingkat cekaman dan fase pertumbuhan tanaman saat mengalami
cekaman. Pengaruh negatif cekaman kekeringan terhadap tanaman ditentukan
oleh tingkat cekaman dan fase pertumbuhan tanaman saat mengalami cekaman.
Menurut Mitra (2001) mekanisme respon terhadap kekeringan dapat
dibedakan menjadi tiga, yaitu mekanisme escape (pembebasan), avoidance
(penghindaran) dan tolerance (toleransi). Pembebasan merupakan kemampuan
tanaman untuk menyelesaikan siklus hidupnya sebelum terjadi cekaman
kekeringan sehingga tidak mengalamai cekaman. Penghindaran adalah
kemampuan tanaman untuk mempertahankan potensial air jaringan yang relatif
tinggi pada saat mengalami kekeringan. Toleransi adalah kemampuan tanaman
untuk bertahan hidup dengan potensial air jaringan yang rendah.
Salah satu mekanisme adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan
dilakukan dengan mengatur potensial osmotik sel tanaman (Levitt 1980; Blum
1996). Cekaman kekeringan meningkatkan konsentrasi prolina daun. Senyawa
prolina dapat menurunkan potensial osmotik sel tanpa menghambat fungsi enzim
dan tidak mengurangi turgor sel, serta berperanan penting dalam menjaga turgor
sel dan pertumbuhan akar pada kondisi potensial air yang rendah (Ober dan Sharp
1994; Mullet dan Whilsitt 1996). Sudarsono et al. (2006) melaporkan kacang
tanah yang ditanam dalam kondisi cekaman kekeringan meningkatkan senyawa
prolinanya sebagai respon terhadap cekaman.
Informasi tentang respon tanaman cabai terhadap perlakuan cekaman
kekeringan pada fase pertumbuhan vegetatif dan generatif dapat digunakan untuk
menapis sifat toleransi cabai terhadap cekaman kekeringan. Percobaan ini
bertujuan untuk (1) menentukan pengaruh cekaman kekeringan yang terjadi sejak
fase pertumbuhan vegetatif sampai generatif terhadap pertumbuhan tanaman serta
jumlah dan bobot buah per tanaman cabai merah, (2) mengevaluasi toleransi lima
varietas cabai terhadap cekaman kekeringan dan (3) mengevaluasi kandungan
prolina total dari lima varietas cabai yang ditanam dalam cekaman kekeringan.
BAHAN DAN METODE
Bahan Tanaman dan Penanaman. Penelitian dilakukan di Laboratorium
Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Faperta
IPB, Bogor dari bulan Maret hingga September 2007. Kultivar cabai yang
digunakan merupakan yang umum ditanam di Indonesia, yaitu cabai cv. Tit
Super, Hot Chili, Laris, Prabu, dan Jati Laba. Benih cabai dikecambahkan dalam
bak pengecambahan dan, bibit dipindahkan ke dalam pot plastik (Φ 45 cm) berisi
media tanam campuran tanah:kompos (1:1) sebanyak 10 kg setelah umur satu
bulan.
Cekaman Kekeringan dan Pertumbuhan Cabai. Percobaan dilakukan
untuk mengetahui pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan vegetatif
dan awal pertumbuhan generatif. Percobaan disusun dengan rancangan
lingkungan acak kelompok dan rancangan perlakuan faktorial yang terdiri atas
kondisi lingkungan (optimal dan cekaman kekeringan) dan varietas cabai cv.Tit
Super, Hot Chili, Laris, Prabu, dan Jati Laba. Unit percobaan terdiri dari atas satu
pot plastik yang ditanami satu tanaman. Setiap kombinasi perlakuan diulang 5
kali.
Tanaman dalam kondisi lingkungan optimum diberi air sampai dengan
kapasitas lapang hingga umur 110 hari sesudah tanam (HST). Tanaman dalam
kondisi cekaman kekeringan dipelihara dalam kondisi optimal hingga 21 HST,
perlakuan cekaman kekeringan diberikan setelah muncul gejala layu pada 70%
daun dari masing-masing tanaman pada umur 21 HST hingga 54 HST, dan
dipelihara dalam kondisi optimal hingga berumur 110 HST.
Pengamatan dilakukan terhadap tinggi tanaman, jumlah cabang primer,
diameter batang, panjang dan bobot kering akar, bobot kering tajuk, biomasa,
kandungan prolina, jumlah buah dan bobot buah.
Indeks Sensitivitas terhadap Cekaman. Toleransi cabai terhadap
cekaman kekeringan dinilai dengan indeks kepekaan terhadap cekaman (S)
(Fischer dan Maurer 1978; Riduan et al 2005) dengan rumus: S = (1-Y/Yp)/(1-
X/Xp) , Y = nilai pengamatan untuk satu varietas pada kondisi cekaman
kekeringan, Yp = nilai pengamatan untuk satu varietas pada kondisi optimal, X =
nilai pengamatan untuk semua varietas dalam kondisi cekaman kekeringan, Xp =
nilai pengamatan untuk semua varieras dalam kondisi optimal. Cabai
dikelompokkan menjadi toleran jika S ≤ 0.5; medium jika 0.5 < ISK ≤ 1.00, dan
peka terhadap cekaman kekeringan jika S>1.00.
Kandungan Prolina Total Daun. Kadar prolina daun dianalisis
berdasarkan metode Bates et al. (1973); Sudarsono et al. (2006). Daun (0.2 g)
digerus dan dihomogenasi dengan 10 ml asam sulfosalisilat (3% b/v). Setelah
disentrigugasi dengan kecepatan 5000xg selama 15 menit menggunakan
Eppendorf table top centrifuge, 2 ml supernatan yang didapat direaksikan dengan
2 ml larutan asam ninhidrin 0.14 M (dengan komposisi ninhidrin 1.25 g, asam
asetat glacial serta dipanaskan di atas penangas air hingga suhu 100°C selama 60
menit. Reaksi diakhiri dengan mendinginkan larutan dalam es selama 5 menit.
Hasil reaksi diekstraksi dengan 4 ml toluene (99.5%) sehingga terbentuk
kromoform dan absorbansi kromoformnya diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 520 nm. Sebagai standar digunakan DL-Proline (Sigma)
yang dilarutkan dalam asam sulfosalisilat (3% b/v).
HASIL
Cekaman Kekeringan dan Pertumbuhan Tanaman. Cekaman
kekeringan secara umum berdampak negatif terhadap pertumbuhan cabai. Akibat
pengurangan pemberian air menyebabkan komponen pertumbuhan vegetatif
seperti tinggi tanaman, panjang akar, bobot kering akar, dan bobot kering
tanaman, dan pertumbuhan generatif (jumlah buah dan bobot buah) cabai
menurun dibandingkan pertumbuhan tanaman pada kondisi optimum.
Masing-masing varietas cabai memberikan tanggapan yang berbeda-beda
terhadap kondisi cekaman kekeringan. Penurunan tinggi tanaman yang terbesar
akibat cekaman kekeringan terjadi pada cabai cv. Laris 25.47%, tetapi untuk
tinggi tanaman terjadi pengecualian dimana cabai cv. Tit Super dan Jati Laba
terjadi peningkatan tinggi tanaman masing-masing 1.31% dan 18.49%, untuk
jumlah cabang penurunan yang terbesar terjadi pada cabai cv. Tit Super 23.33%,
pengecualian terjadi pada cabai cv. Laris terjadi peningkatan jumlah cabang
5.50%, panjang akar terjadi penurunan yang terbesar akibat cekaman kekeringan
pada cabai cv. Jati Laba yakni 28.63%, sebaliknya pada cabai cv. Tit Super terjadi
peningkatan panjang akar sebesar 36.99% (Tabel 1).
Tabel 1 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah tanam terhadap tinggi tanaman, jumlah cabang, diameter batang, dan panjang akar beberapa genotipe cabai
Lingkungan Peubah dan
Varietas Cabai Optimum* Cekaman
Persentase
Penurunan (%)**
Tinggi Tanaman (cm)
Tit Super 32.00 a 32.42 a -1.31
Hot Chili 30.64 a 28.66 a 6.46
Prabu 29.60 a 25.55 a 13.68
Laris 28.77 a 21.44 a 25.47
Jati Laba 26.33 a 31.20 a -18.49
Jumlah Cabang (buah)
Tit Super 2.70 a 2.07 a 23.33
Hot Chili 2.21 a 2.20 a 0.45
Prabu 2.00 a 2.00 a 0.00
Laris 2.00 a 2.11 a -5.50
Jati Laba 2.13 a 2.00 a 6.10
Diamater Batang (cm)
Tit Super 6.68 a 8.23 a -23.20
Hot Chili 9.06 a 8.77 a 3.20
Prabu 6.59 a 7.46 a -13.20
Laris 7.04 a 6.95 a 1.27
Jati Laba 7.83 a 6.49 a 17.11
Panjang Akar (cm)
Tit Super 26.38 a 36.14 a -36.99
Hot Chili 45.89 a 42.76 a 6.82
Prabu 40.61 a 32.41 a 20.19
Laris 39.58 a 28.71 a 27.46
Jati Laba 48.50 a 34.61 a 28.63
* Untuk masing-masing peubah, huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 0.05. ** Penurunan=[ (Opt-Cekaman)/Opt] x 100%. Opt=tanaman dalam kondisi optimum, dan Cekaman=tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.
Perlakuan cekaman kekeringan juga berpengaruh negatif terhadap bobot
kering batang dan bobot biomasa total. Bobot kering batang, penurunan yang
terbesar akibat cekaman kekeringan berturut-turut cabai cv. Tit Super 42.57% dan
cabai cv. Jati laba 20.75%. Perlakuan cekaman kekeringan juga berpengaruh
negatif terhadap bobot kering batang dan akar, serta bobot biomasa, juga jumlah
dan bobot buah cabai. Penurunan bobot biomasa masing-masing varietas cabai
berkisar antara 3.71% hingga 44.59%. (Tabel 2).
Tabel 2 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari setelah tanam terhadap berat kering batang dan biomasa total beberapa genotipe cabai
Lingkungan Peubah dan
Varietas Cabai Optimum* Cekaman Persentase Penurunan (%)**
Bobot Kering Batang (g)
Tit Super 20.93 a 12.02 b 42.57
Hot Chili 34.17 a 29.20 b 14.54
Prabu 25.25 a 22.32 b 11.60
Laris 32.35 a 28.26 b 12.64
Jati Laba 19.56 a 15.50 b 20.75
Bobot Kering Akar (g)
Tit Super 2.14 a 2.75 b -28.03
Hot Chili 5.58 a 4.48 b 19.71
Prabu 4.63 a 3.56 b 23.11
Laris 6.03 a 3.51 b 41.79
Jati Laba 4.77 a 4.08 b 14.46
Bobot Biomassa Total (g)
Tit Super 15.34 a 14.77 b 3.71
Hot Chili 39.75 a 33.68 b 15.27
Prabu 22.35 a 21.06 b 5.77
Laris 31.55 a 25.06 b 20.57
Jati Laba 24.33 a 13.48 b 44.59
* Untuk masing-masing peubah, huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 0.05. ** Penurunan=[ (Opt-Cekaman)/Opt] x 100%. Opt = tanaman dalam kondisi optimum, dan Cekaman = tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.
Cekaman Kekeringan dan Hasil. Untuk jumlah buah dan bobot buah
per tanaman, penurunannya berkisar antara 27.02% hingga 51.38% dan 25.33%
hingga 52.63%. Penurunan jumlah dan bobot cabai yang terjadi akibat cekaman
kekeringan berbeda nyata dengan kondisi optimum (Tabel 3).
Tabel 3 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 21 – 54 hari sesudah tanam terhadap bobot biomassa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai
Lingkungan Peubah dan
Varietas Cabai Optimum* Cekaman
Persentase
Penurunan (%)**
Jumlah Buah per Tanaman (Butir)
Tit Super 12.50 a 8.85 b 29.20
Hot Chili 10.14 a 7.40 b 27.02
Prabu 14.40 a 7.00 b 51.38
Laris 14.33 a 7.00 b 51.15
Jati Laba 10.13 a 8.60 b 15.10
Bobot Buah per Tanaman (g)
Tit Super 83.90 a 62.64 b 25.33
Hot Chili 79.28 a 58.87 b 25.74
Prabu 83.57 a 41.09 b 50.83
Laris 66.55 a 31.52 b 52.63
Jati Laba 90.36 a 47.24 b 47.72
* Untuk masing-masing peubah, huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α = 0.05. **Penurunan=[ (OPT-CEKAMAN)/OPT] x 100%. OPT=tanaman dalam kondisi optimum, dan Cekaman = tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.
Respon Genotipe terhadap Cekaman. Indeks kepekaan terhadap
cekaman (S) yang dihitung berdasarkan biomassa total mengindikasikan di
antara lima varietas cabai yang telah diuji bahwa cabai cv. Prabu tergolong
toleran terhadap cekaman kekeringan, sedangkan cabai cv. Tit Super dan Jati
Laba tergolong peka, sebaliknya cabai cv. Hot Chili dan Laris tergolong ke dalam
kelompok medium. Jika indeks kepekaan terhadap cekaman (S) didasarkan pada
jumlah dan bobot buah cabai maka lima varietas cabai yang diuji tidak ada yang
termasuk ke dalam kelompok toleran terhadap cekaman kekeringan hanya
termasuk ke dalam kelompok peka dan medium (Tabel 4).
Tabel 4 Indeks kepekaan terhadap cekaman (S) yang dihitung berdasarkan biomasa total, jumlah dan bobot buah per tanaman beberapa genotipe cabai
Peubah untuk
menghitung nilai S Titi Super Jati Laba Hot Chili Laris Prabu
Biomassa Total 1.17(P)* 1.76(P) 0.88(M) 0.82(M) 0.46 (T)
Jumlah Buah 0.82(M) 0.51(M) 0.69(M) 1.44(P) 1.42 (P)
Bobot Buah 0.70(M) 1.26(P) 0.61(M) 1.27(P) 1.38 (P)
S=nilai indeks kepekaan terhadap cekaman kekeringan.*Huruf dalam kurung menunjukkan pengelompokan toleransi ke dalam toleran (T) jika S≤0.5, medium (M) jika 0.5<S≤ 1, atau peka (P) terhadap cekaman kekeringan jika S > 1
Kandungan Prolina Total Daun. Pada kondisi penyiraman hingga
kapasitas lapang (kondisi non-cekaman) selama penyiraman di rumah kaca
menunjukkan kandungan prolina daun cabai yang lebih rendah dibandingkan
kandungan prolina pada kondisi cekaman. Presentase peningkatan kandungan
prolina daun setelah 6 periode cekaman kekeringan nyata lebih tinggi
dibandingkan daun tanaman dalam kondisi lingkungan optimum (Tabel 5). Cabai
cv. Tit Super dalam kondisi lingkungan cekaman kekeringan mempunyai
presentase peningkatan kandungan prolina daun paling tinggi 646.31%, kemudian
diikuti oleh cabai cv. Hot Chili dan Prabu, masing-masing 436.28% dan 305.06%,
sedangkan presentase peningkatan kandungan prolina daun cabai yang terkecil
ádalah cabai cv. Laris dan Jati Laba masing-masing yaitu 53.89% dan 12.62%
(Tabel 5).
Tabel 5 Kandungan Prolina daun beberapa genotipe cabai pada umur 37 HST pada kondisi tanam optimum dan cekaman kekeringan
Prolina (ug/g daun)
Genotipe Optimum Cekaman Kekeringan
Persentase Peningkatan Prolina (%)
Tit Super 116.43 b* 868.92 a 646.31
Hot Chili 138.57 b 743.12 a 436.28
Prabu 198.06 b 802.28 a 305.06
Laris 180.42 b 277.67 a 53.89
Jati Laba 122.67 b 138.14 a 12.62
* Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji LSD pada α = 0.05
PEMBAHASAN
Cekaman kekeringan yang dialami beberapa varietas cabai menyebabkan
komponen pertumbuhan vegetatif seperti tinggi tanaman, panjang akar, bobot
kering akar, dan bobot kering tanaman menurun dibandingkan pertumbuhan
tanaman pada kondisi optimum, kecuali cabai cv. Tit Super dan Jati Laba panjang
akar akibat cekaman kekeringan mengalami pertambahan. Penelitian sebelumnya
mengungkapkan bahwa peningkatan volume dan panjang akar merupakan salah
satu mekanisme tanaman untuk mengatasi cekaman kekeringan (Jones 1981).
Luasnya respons tanaman terhadap cekaman kekeringan, memperlihatkan
bahwa toleransi terhadap cekaman kekeringan dikendalikan secara poligenik dan
terekspresi secara fenotipik melalui adaptasi morfologis dan fisik (Gupta 1997).
Berbagai respons tanaman terhadap cekaman kekeringan seringkali kontradiktif,
sulit diintegrasikan, dan tidak praktis untuk program pemuliaan. Hal tersebut
memperkuat dugaan bahwa karena respon tanaman terhadap cekaman kekeringan
merupakan fenomena kompleks.
Cekaman kekeringan yang dimulai dari fase vegetatif juga berpengaruh
negatif terhadap pertumbuhan generatif (jumlah dan bobot buah) cabai. Cekaman
kekeringan yang dimulai sejak fase vegetatif menghasilkan jumlah dan bobot
buah yang lebih sedikit dibandingkan dengan tanaman cabai yang ditanam dalam
kondisi normal.
Titik kritis pengaruh cekaman kekeringan adalah kelayuan, yaitu suatu
gejala defisit yang terjadi jika besarnya transpirasi melampaui laju penyerapan air
yang dilakukan akar, sehingga dapat mengganggu berbagai proses fisiologi
tanaman. Menurut Bray (1997), tanaman mengalami kelayuan sebagai respons
terhadap defisit air. Besarnya pengaruh kelayuan terhadap pertumbuhan tanaman
sangat tergantung pada jumlah air yang hilang, laju dan lamanya kondisi cekaman.
Air merupakan komponen vital bagi pertumbuhan tanaman karena
berperan langsung dalam proses fisiologi seperti serapan hara, transportasi,
fotosintesis, reaksi biokimia dan tekanan turgor sel (Mundree et al. 2002),
sehingga penurunan jumlah masukan air mengakibatkan terhambatnya
pertumbuhan dan produksi tanaman.
Cekaman kekeringan yang terjadi pada fase vegetatif menghambat
pertumbuhan tanaman dan menurunkan pembelahan dan perpanjangan sel.
Cekaman kekeringan juga menyebabkan terhambatnya aktifitas fotosintesis dan
translokasi fotosintat (Yakushiji et al. 1998; Savin dan Nicolas 1996).
Salah satu mekanisme adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan
dilakukan dengan mengatur potensial osmotik sel tanamannya (Levitt 1980), yaitu
dengan peningkatan dan akumulasi senyawa organik yang dapat menurunkan
potensial air sel (Sharp 1994). Toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan
juga melibatkan akumulasi senyawa yang dapat melindungi sel dari kerusakan
yang terjadi pada saat potensial air rendah (Jensen et al. 1996). Prolin memegang
peranan penting untuk toleransi terhadap cekaman kekeringan (Kim dan Janick
1991; Pruvot et al. 1996; Nambara et al. 1998; Hanson et al. 1979).
Kandungan prolina daun pada berbagai tanaman tidak berbeda nyata
dalam keadaan optimum. Hal yang sama juga didapatkan pada tanaman cabai.
Hasil analisis kandungan prolina daun cabai cv. Laris dan Jati Laba menunjukkan
bahwa kandungan prolina saat cekaman dan kondisi optimum tidak jauh berbeda.
Parameter kandungan prolina daun cabai ini membuktikan bahwa prolina
merupakan senyawa yang dihasilkan tanaman untuk bisa bertahan dalam kondisi
cekaman kekeringan. Tanaman yang toleran terhadap cekaman kekeringan telah
dilaporkan lebih mampu meningkatkan kandungan prolina daun sebagai salah satu
respons terhadap cekaman kekeringan dibandingkan dengan tanaman yang peka
(Jones et al. 1981; Yoshida et al. 1997). Sudarsono et al. (2006) melaporkan
enam kultivar kacang tanah di Indonesia yang diuji juga menunjukkan
peningkatan akumulasi senyawa prolina sebagai respon terhadap cekaman
kekeringan.
Pada fase pertumbuhan vegetatif, ketersediaan air berpengaruh pada
beberapa aspek fisiologi serta morfologi, antara lain: menurunnya kecepatan
fotosintesis dan luas daun. Jika tanaman terkena cekaman kekeringan, potensial
air daun akan menurun, pembentukan klorofil daun akan terganggu dan struktur
kloroplas akan mengalami disintegrasi (Alberte et al. 1977). Kramer (1983)
menjelaskan lebih lanjut bahwa pengaruh cekaman kekeringan pada pertumbuhan
vegetatif terutama pada perluasan area daun dan pertumbuhan tunas baru dan
nisbah akar-tajuk. Sedangkan pada pertumbuhan reproduktif mengakibatkan
ketidaknormalan pembungaan, aborsi embrio, ketidaknormalan perkembangan biji
dan buah. Tanaman cabai yang mengalami cekaman kekeringan juga
mengakibatkan sebagian besar bunganya berguguran sehingga yang berhasil
membentuk buah sedikit Ditambahkan oleh Sloane et al. (1990) bahwa tanaman
pada fase perkembangan reproduktif sangat peka terhadap cekaman kekeringan.
Kondisi cekaman kekeringan dapat menyebabkan gugurnya bunga, polong dan
biji yang telah terbentuk. Hal ini berhubungan dengan penurunan kecepatan
fotosintesis akibat keterbatasan ketersediaan air. Pada kedelai, cekaman
kekeringan menyebabkan gugurnya bunga dan polong dan menurunkan hasil biji
(Sloane et al. 1990). Pada tanaman cabai kondisi ini juga terjadi sehingga
cekaman kekeringan menurunkan jumlah buah pertanaman sampai 51.38% dan
51.15% masing-masing untuk cabai cv. Prabu dan Laris.
Berdasarkan indeks kepekaan terhadap cekaman menggunakan jumlah
buah pertanaman disimpulkan toleransi cabai varietas Tit Super, Jati Laba dan Hot
Chili tergolong Medium, sedangkan Prabu dan Laris tergolong peka terhadap
cekaman kekeringan pada fase vegetatif sampai generatif. Hasil penelitian ini
sejalan dengan hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa nilai S
berdasarkan bobot kering biji memberikan hasil yang lebih akurat untuk menduga
toleransi tanaman kacang tanah terhadap cekaman kekeringan (Riduan dan
Sudarsono 2004).
SIMPULAN
Dari hasil penelitian yang dilakukan dapat ditarik beberapa simpulan sebagai
berikut:
1. Perlakuan cekaman kekeringan pada fase vegetatif dan generatif beberapa
varietas cabai dapat menurunkan hasil cabai (Tit Super 25.33%, Jati laba
47.72%, Hot Chili 25.74%, Laris 52.63%, dan Prabu 50.83% )
2. Dari kelima varietas cabai yang diuji berdasarkan kandungan prolina daun
dan tanggap tanaman di rumah kaca didapatkan tiga varietas yang toleran
yaitu Prabu, Jati Laba dan Laris, dan dua varietas cabai yang tergolong peka
terhadap kekeringan yaitu Tit Super dan Hot Chili.
IV STUDI REGENERASI BEBERAPA GENOTIPE CABAI (Capsicum annuum L.) SECARA IN VITRO
Abstrak
Perbanyakan cabai secara in vitro dengan menggunakan daun muda telah
dilakukan terhadap 13 varietas cabai. Eksplan dikulturkan pada media induksi kalus yaitu media dasar MS dengan vitamin L2 yang ditambahkan BAP 4 ppm dan IAA 0.5 ppm. Media yang digunakan untuk regenerasi dan perpanjangan sel media MS yang ditambah vitamin L2 , BAP 1 ppm, GA3 2 ppm, Calsium Pantotenat 2 ppm dan AgNO3 5 ppm. Hasil percobaan menunjukkan bahwa pada semua kondisi yang diuji, semua genotipe mampu membentuk kalus, tetapi tidak semua kalus bisa berdifrensiasi membentuk tunas. Diantara 13 varietas cabai yang diuji genotipe yang paling respon terhadap media difrensiasi dan perpanjangan tunas adalah varietas Tit Super. Kata kunci: Capsicum annuum in-vitro, BAP (6-benzylaminopurine), IAA
(indole-3-acetic acid), Calsium Pantotenat, AgNO3
IV REGENERATION STUDY OF SOME HOT CHILLI (Capsicu annum L.) CULTIVAR BY IN VITRO
Abstract
The objective of experiment was to obtain hot chilli that was easily regenerated through in vitro technique. 13 hot chilli varieties were evaluated. In this experiment in vitro bud regeneration of hot chilli was conducted using young leaf. The Explant cultured at induce callus medium of base MS medium enriched with vitamin of L2 enhanced by BAP 4 ppm and IAA 0.5 ppm. Medium for regeneration and elongation of cell was MS medium that added with vitamin L2 , BAP 1 ppm, GA3 2 ppm, Calsium Pantotenat 2 ppm and AgNO3 5 ppm. The result showed that all of the varieties were able to form callus, but not all of callus differentiated new bud. Amongst of 13 hot chilli varieties evaluated, the most responsive to differentiation and bud elongation was Tit Super variety.
Keyword: Capsicum annuum in-vitro, BAP (6-benzylaminopurine), IAA (indole-3-acetic acid), Calsium Pantotenat, AgNO3, direct shoot regeneration
PENDAHULUAN
Studi mengenai prosedur regenerasi in vitro tanaman cabai merah masih
sangat sedikit. Kebanyakan publikasi yang ada umumnya berhubungan dengan
metode regenerasi cabai manis (paperika). Regenerasi pada tanaman cabai
bersifat kultivar spesifik, sehingga metode yang ada pada satu kultivar belum
tentu dapat digunakan untuk kultivar lainnya.
Penelitian perbanyakan secara in vitro pada jenis tanaman cabai manis
telah banyak dilakukan dan dipublikasikan antara lain oleh Fari dan Czako (1981);
Agrawal et al. (1989); Ebida dan Hu (1993); Kato at al. (1996); Hyde dan Phillips
(1996) dan hasilnya dapat dijadikan sebagai acuan. Tiga bagian kecambah
tanaman cabai, yaitu kotiledon, hipokotil dan daun muda umumnya dapat
dijadikan sebagai sumber eksplan oleh para peneliti tersebut.
Di dalam aplikasi bioteknologi atau transformasi genetika untuk program
perbaikan tanaman, kultur sel atau jaringan dan sistem regenerasinya memegang
peranan yang sangat penting. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai
sistem regenerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter penting yang
spesifik pada tanaman (Parrot et al. 1992). Oleh karena itu, sebelum dilakukan
transformasi genetik untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan terhadap
kondisi kekeringan diperlukan adanya sistem regenerasi yang efisien dan stabil.
Genotipe cabai yang responsif untuk diregerasikan menjadi tanaman yang
lengkap akan diperoleh pada penelitian ini sehingga dapat digunakan untuk
trasnformasi genetik tanaman. Dengan diperolehnya sistem regerasi tanaman
cabai yang efisien maka akan sangat membantu di dalam program perbaikan
tanaman melalui transformasi genetik.
Rekayasa genetika akan memberikan perbaikan dari karakter-karakter
penting pada tanaman. Sifat ketahanan tanaman terhadap beberapa cekaman
biotik seperti gulma, virus, serangga dan mikroorganisme telah dapat diperbaiki
dengan pendekatan ini. Demikian pula terhadap cekaman abiotik dan modifikasi
kualitas dan kuntitas produk tanaman (Bennet 1993). Suatu gen yang tidak
terdapat pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh
dari organisme lain seperti bakteri, virus, binatang dan tanaman lain (Herman
1996).
Teknik penyisipan gen (transformasi gen) akan menghasilkan tanaman
transgenik yang kemudian dapat dimanfaatkan sebagai sumber plasma nutfah atau
langsung diseleksi menjadi galur harapan. Transformasi gen secara in vitro
dengan menggunakan vektor Agrobacterium akan berhasil dan bermanfaat apabila
sudah diperoleh protokol regenerasi tanaman yang efisien dan stabil. Kompetensi
untuk beregenerasi yaitu kemampuan membentuk tanaman lengkap (mempunyai
tunas dan akar) dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci
penting penentu keberhasilan program transformasi genetik.
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari sistem regenerasi beberapa
genotipe cabai secara in vitro yang akan digunakan di dalam program transformasi
genetika untuk memperoleh tanaman cabai tahan kekeringan.
BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman
(PMB) Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan bulan Juli 2006 sampai Desember
2006.
Pada percobaan ini digunakan benih dari tiga belas genotipe cabai (cabai
besar Sudra, cabai keriting North Redstyar, cabai rawit Salmon, cabai besar Jati
Laba, Cabai keriting Taro, cabai besar Nenggala, cabai besar Prabu, cabai keriting
Tepon, cabai besar Chili 409, hot pepper Cayane, Tit Super, New Zaland, galur
375, galur 535).
Perkecambahan benih in vitro. Benih cabai disterilkan permukaannya
dalam laminar dengan merendam pada 20% (v/v) larutan Clorox (R) tiga kali
berturut-turut selama 10 menit. Benih dibilas tiga kali dengan air steril dan
direndam 12 jam untuk merangsang perkecambahan. Benih dikecambahkan
secara in vitro pada medium MS (Murashige dan Skoog, 1962), sukrosa (3%), dan
agar (0.8 %) tanpa zat pengatur tumbuh.
Induksi kalus dari eksplan potongan daun. Kecambah berumur 21
hari dikeluarkan dari botol dan diambil daunnya, kemudian dipotong ujung dan
pangkal daun dengan meninggalkan sedikit petiolenya. Eksplan daun muda
tersebut ditanam pada medium induksi kalus [MS + Vit L2 (Thiamin-HCL dan
Pyrodoxine) + BAP 4 mg/L + IAA 0.5 mg/L + Sukrosa 3 g/L dan pH 5.8].
Potongan daun dikulturkan selama 2 minggu pada suhu 22ºC sehingga
membentuk kalus.
Regenerasi tunas. Setelah 2 minggu pada media induksi kalus, eksplan
daun muda yang telah berkalus dipindahkan ke medium regenerasi (MS + Vit L2
+ BAP 1 mg/l + AgNO3 5 mg/L + GA3 2 mg/L dan Kalsium pantotenat 2 mg/L)
dengan permukaan atas menghadap ke atas. Semua kultur dipindahkan ke
medium regenerasi yang baru setiap 2 minggu. Setelah dua minggu kultur berada
pada media regenerasi, kalus dengan warna hijau, kompak dapat dipindahkan ke
medium regenerasi yang baru. Kalus-kalus dengan primordia tunas akan mulai
tumbuh setelah 2 minggu dan segera dipotong menjadi potongan kecil dan
dipindahkan ke media regenerasi yang baru pada botol untuk pemanjangan tunas.
Perakaran tunas. Apabila batang dari tunas berukuran 2-4 cm, tunas
dipisahkan dari kalus dan dipindahkan ke media perakaran (MS + Vit L2 + IAA
0.1 mg/L) pada botol kultur. Potongan kalus dari dasar batang tunas sebisa
mungkin tidak diikutsertakan karena akan mengganggu pembentukan akar.
Tunas-tunas akan membentuk akar dan berkembang selama 2 minggu setelah
dipindahkan ke medium perakaran. Jika tidak berakar, potong kembali tunas dan
dipindahkan ke media perakaran yang baru, kemudian tunas tersebut akan
berakar. Planlet yang terbentuk berukuran sekitar 5 cm siap dipindahkan ke tanah
(aklimatisasi).
Pengamatan dilakukan terhadap masing-masing varietas tanaman cabai
dengan beberapa parameter, yaitu: jumlah eksplan yang membentuk kalus, berat
kalus, diamater kalus,dan jumlah eksplan yang membentuk tunas. Data-data
yang telah diperoleh kemudian dibandingkan untuk setiap varietas untuk melihat
respon regenerasi dari masing-masing varietas dan dapat ditentukan varietas yang
paling responsif untuk regenerasi.
HASIL Pada studi sebelumnya telah diketahui bahwa penggunaan daun muda dari
kecambah cabai yang berumur 21-23 hari merupakan jenis eksplan yang paling
responsif untuk menginduksi kalus dan organogenesis tunas dibandingkan jenis
eksplan yang lain seperti hipokotil dan batang. Mengacu pada penelitian
sebelumnya, pada penelitian ini juga digunakan eksplan daun muda dari
kecambah cabai yang berumur 21 hari setelah tanam yang ditumbuhkan secara in
vitro (Gambar 5). Dari kecambah umur 21 hari tersebut, kemudian daun mudanya
dipotong bagian ujung dan pangkalnya dengan mengikutkan petiole untuk
selanjutnya di tanam pada media induksi kalus.
Gambar 5 a) Bibit cabai umur 21 hari yang ditanam secara in vitro b) Daun muda cabai yang ditanam pada media induksi kalus
Kalus-kalus akan terbentuk pada bagian bekas potongan pada eksplan
setelah berada pada media induksi kalus selama 1 minggu (Gambar 5). Semua
eksplan daun muda dari beberapa genotipes cabai yang digunakan mempunyai
kemampuan membentuk kalus 100%, tapi tidak semua kalus berkembang
membentuk tunas (Tabel 6).
a b
Tabel 6 Persentase pembentukan kalus dan tunas serta persentase tunas yang terbentuk dari beberapa genotipe cabai secara in vitro
No Genotipe Kalus Yang Terbentuk (%)
Tunas Yang terbentuk (%)
1 Cabe besar Sudra 100% 0.49
2 Cabe Keriting (North Redstar) 100% 0.22
3 Rawit Salmon 100% 0.25
4 Cabe besar Jati Laba 100% 0.59
5 Cabe keriting Taro 100% 0.47
6 Cabe besar Prabu 100% 0.39
7 Cabe keriting Topon 100% 0.45
8 Chili 409 100% 0.25
9 535 100% 0.64
10 375 100% 0.22
11 398 100% 0.39
12 NZ 100% 0.15
13 Tit Super 100% 0.90
Sudra North Redstar Rawit Salmon
Jati Laba Topon Chili 409
535 75 NZ
398 TS Jati laba
Gambar 6 Kalus-kalus yang terbentuk dari beberapa varietas dan galur cabai secara in vitro
0
2
4
6
8
10
12
14
Genotipe Sudra NorthRedstar
Rawit Jati laba Taro Prabu Topon Chili 409 535 375 398 NZ
Beberapa Varietas cabai
Har
i Ter
bent
uk K
alus
Tit Super
Gambar 7 Waktu yang diperlukan beberapa varietas cabai untuk membentuk
kalus
Beberapa genotipe yang mempunyai kemampuan membentuk tunas yang
tinggi (Cabai besar Jati Laba, Tit Super, Cabai besar Sudra dan Chili 409), dipilih
untuk penelitian selanjutnya. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap berat
kalus, diameter kalus serta panjang tunas yang terbentuk. Disini terlihat bahwa
kalus yang terbentuk tidak semuanya yang berkembang membentuk tunas karena
tidak semua kalus tersebut bersifat organogenik.
Tabel 7 Rata-rata berat kalus, diameter kalus, jumlah tunas dan panjang tunas dari beberapa genotipe cabai yang diinduksi secara in vitro
No Genotipe Rata-rata
Berat Kalus (mg)
Rata-rata Diameter Kalus
(mm)
Jumlah Tunas (buah)
Rata-rata Panjang Tunas
(mm) 1 Jati laba 300 30
2 9.5
2 Tit Super 300 30 8
23
3 Sudra 81 27 5
20.6
4 Chili 409 56 15 0
0
Tabel 7 menunjukkan bahwa kalus dari genotipe Chili 409 paling ringan
sekali, kalus yang terbentuk persentase menghasilkan tunasnya juga sangat kecil
sekali. Untuk kalus-kalus yang organogenik dia mempunyai berat yang lebih besar
dari pada kalus yang non organogenik sebagian besar kalus dari genotipe Chili
409 adalah non organogenik. Semua kalus yang terbentuk hampir sama besar,
karena umur sumber eksplan yang digunakan adalah sama.
y = 17.449x + 118.82R2 = 0.2076
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10
Jumlah Tunas
Ber
at K
alus
(mg)
Gambar 8 Hubungan antara berat kalus dengan jumlah tunas yang terbentuk
pada beberapa varietas cabai Berat kalus tidak mempunyai hubungan yang nyata dengan jumlah tunas
yang terbentuk (Gambar 8). Karena tidak semua kalus yang terbentuk bisa
berkembang membentuk tunas. Kalus-kalus yang remah yang bisa berdiferensiasi
membentuk tunas. Kalus-kalus yang berwarna kecoklatan (Gambar 9b) tidak
dapat berkembang membentuk tunas, kalus yang berwarna putih kehijauan
(Gambar 9A) yang bisa berkembang membentuk tunas.
Gambar 9 Kalus yang terbentuk dari daun muda setelah 14 hari induksi
(9A) kalus yang berwarna putih yang akan berubah menjadi kehijauan dalam beberapa hari dan kalus ini merupakan kalus organogenik (organogenic callus) (OC)
(9B) kalus yang berwarna coklat merupakan kalus yang tidak dapat diregenerasikan (non-regenerable callus) (NRC)
Ada 2 tipe kalus yang diamati pada penelitian ini, kalus yang berwarna
coklat merupakan kalus yang tidak dapat diregenerasikan (non-regenerable
callus) (NRC) dan kalus yang berwarna putih yang akan berubah menjadi
kehijauan dalam beberapa hari dan kalus ini merupakan kalus organogenik
(organogenic callus) (OC). Kalus organogenik ini akan menghasilkan atau
membentuk primordial-primordia tunas sekitas 15-21 hari (Gambar 9). Untuk
mempercepat pembentukan primordia tunas maka merupakan hal penting untuk
melakukan subkultur kalus-kalus tersebut pada media baru sehingga akan tersedia
nutrisi yang cukup bagi kalus-kalus untuk membentuk primordial tunas.
Gambar 10 Tahapan perkembangan kalus cabai organogenik mulai dari tahap
globular sampai membentuk tunas, (A) – (E) tahapan globular sampai cotiledonary, (F) terbentuknya tunas
9A 9B
9B
A B
D E F
C
Pengamatan dari tahap perkembangan kalus organogenik mulai dari tahap
kalus globular sampai berbentuk kotiledonary dan akhirnya membentuk tunas
dapat dilihat pada Gambar 10.
Persentase jumlah eksplan berkalus yang dapat beregenerasi ditampilkan
pada Tabel 6. Dari Tabel 6 terlihat bahwa kemampuan eksplan membentuk
primordia tunas yang tinggi ditunjukkan oleh genotipe Tit Super, dibandingkan
genotipe-genotipe lain. Eksplan yang berasal dari daun muda dari semua genotipe
cabai yang digunakan mempunyai kemampuan untuk membentuk kalus 100%
setelah ditumbuhkan pada media induksi kalus (Tabel 6). Bahkan diantara
eksplan-eksplan yang berkalus tersebut terdapat eksplan yang telah berinisiasi
membentuk primordia tunas. Primordia tunas ditandai dengan munculnya
jaringan seperti daun yang berukuran kecil dan akan berkembang menjadi tunas
kecil. Selanjutnya kalus-kalus dengan primordial tunas ini dipindahkan ke media
regenerasi untuk mendorong kalus berkembang dan membentuk tunas yang lebih
besar.
Setelah di media induksi kalus selama 2 minggu kemudian disubkultur,
eksplan yang berkalus dan membentuk primordial tunas dipindahkan ke media
regenerasi sehingga primordial tunas dapat berkembang menjadi tunas. Setelah
beberapa hari dalam media regenerasi maka primordial akan terlihat membesar
dan berkembang membentuk tunas dengan bagian daun yang lengkap.
Gambar 11 Tunas yang berkembang dalam media perpanjangan tunas (A) tunas
yang abnormal, dimana tidak menghasilkan batang, (B) tunas yang normal yang dapat berkembang membentuk batang (C) tunas dalam media perakaran
Respon dari genotipe cabai untuk beregenerasi ditandai dengan
kemampuan eksplan dari genotipe tersebut untuk membentuk tunas dengan bagian
BA C
Batang
daun dan batang. Ada dua jenis tunas yang dapat diamati pada media regenerasi,
yaitu; (1) tunas yang mempunyai daun dan batang, dan (2) tunas yang hanya
punya daun saja tanpa batang (rosset daun). Tunas yang dapat dipindahkan ke
media perakaran adalah tunas yang mempunyai bagian daun dan batang
sedangkan tunas yang abnormal dimana tunas tersebut bagian batangnya tidak
berkembang dengan baik tidak bisa dipindahkan ke media perakaran, sebab bila
dipindahkan ke media perakaran akan sulit membentuk akar bahkan tidak bisa
membentuk akar sama sekali. Untuk menginduksi terbentuknya akar maka tunas-
tunas yang terbentuk pada media regenerasi kemudian dipisahkan dari
kalus/eksplan dan kemudian dipindahkan ke media perakaran (Gambar 11 C).
PEMBAHASAN
Berdasarkan serangkaian percobaan di atas tiga bagian kecambah cabai,
yaitu hipokotil, kotiledon dan daun muda yang umumnya digunakan sebagai
sumber eksplan oleh para peneliti, ternyata induksi tunas dari beberapa genotipe
cabai di atas dapat dikatakan bahwa eksplan daun muda mempunyai potensi yang
besar dalam membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan respon eksplan terutama
disebabkan karena perbedaan genotipe.
Teori totipotensi yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann
merupakan dasar dari kultur jaringan. Teori tersebut menyatakan bahwa setiap sel
tanaman memiliki informasi genetika lengkap sehingga mampu beregenerasi
membentuk tanaman lengkap bila ditumbuhkan dalam lingkungan yang sesuai
(Pierik 1987). George dan Sherington (1984) menyatakan bahwa keberhasilan
perbanyakan tanaman dengan metode kultur jaringan dipengaruhi banyak faktor
antara lain: sifat genetika tanaman, pemilihan bagian tanaman yang digunakan
sebagai sumber eksplan, umur eksplan, komposisi media tumbuh, zat pengatur
tumbuh, dan lingkungan kultur (Watimena 1992).
Terbatasnya informasi tentang regenerasi langsung atau organogenesis
tanaman cabai merah merupakan salah satu indikasi sulitnya tanaman ini untuk
diregenerasikan secara in vitro. Informasi yang ada umumnya merupakan hasil
penelitian terhadap cabai manis atau paperika (sweet papper), sehingga penelitian
yang dilakukan terhadap cabai merah banyak mengacu kepada hasil penelitian
regenerasi tanaman cabai manis.
Kultur in vitro pada cabai dapat digunakan untuk aplikasi bioteknologi
yang berbeda seperti misalnya propagasi klonal, produksi tanaman bebas virus.
Pada penelitian ini dapat diamati bahwa semua varietas dan galur cabai yang
digunakan mempunyai kemampuan untuk membentuk kalus pada media induksi
kalus (Tabel 6 dan Gambar 6), kalus yang terbentuk tidak semuanya yang
organogenik. Di sini terdapat adanya perbedaan yang nyata di dalam kemampuan
regenerasi di antara 13 genotipe cabai yang digunakan, yang ditandai dengan
adanya perbedaan dalam jumlah eksplan yang membentuk primordia tunas,
eksplan yang beregenerasi membentuk tunas dan jumlah tunas per eksplan.
Kalus-kalus yang organogenik akan mengalami beberapa fase
perkembangan sampai menghasilkan tunas. Fase tersebut dimulai dari kondisi
kalus dalam bentuk globular, kemudian heart, torpedo, sampai pada fase akhir
kotiledonary dan akhirnya baru membentuk tunas (Gambar 10). Sementara kalus-
kalus yang bukan organogenik akan selalu dalam fase globular.
Waktu yang diperlukan untuk membentuk kalus untuk semua varietas
hampir sama dalam jangka 7 sampai 12 hari setelah induksi (Gambar 7). Waktu
bukan faktor yang menentukan dalam pembentukan kalus, tapi faktor yang sangat
menentukan dalam permbentukan kalus adalah genotipe, tipe eksplan dan
komposisi media, seperti yang telah dilaporkan sebelumnya, bahwa paling tidak
ada tiga faktor penting yang sangat berpengaruh di dalam sistem regenerasi
tanaman secara in vitro. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tipe eksplan dan
komposisi media (Moghaieb et al, 1999; Gubis et al. 2003).
Kalus-kalus yang terbentuk tidak semuanya berkembang membentuk
tunas, karena tanggapan masing-masing genetik tanaman tidak sama terhadap
media yang sama untuk membentuk tunas. Hal ini sama seperti yang dilaporkan
sebelumnya bahwa eksplan daun muda dan hipokotil mempunyai potensi yang
sama dalam kapasitasnya untuk membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan
respon terutama disebabkan oleh perbedaan genotip tanaman (Mahmood et al.,
1996).
Respon dari genotipe cabai untuk beregenerasi ditandai dengan
kemampuan eksplan dari genotipe tersebut untuk membentuk tunas dengan bagian
daun dan batang. Ada dua jenis tunas yang dapat diamati pada media regenerasi,
yaitu (1) tunas yang mempunyai daun dan batang, dan (2) tunas yang hanya punya
daun saja tanpa batang (rosset daun). Tunas yang dapat dipindahkan ke media
perakaran adalah tunas yang mempunyai bagian daun dan batang sedangkan
tunas yang abnormal dimana tunas tersebut bagian batangnya tidak berkembang
dengan baik tidak bisa dipindahkan ke media perakaran, sebab bila dipindahkan
ke media perakaran akan sulit membentuk akar (Gambar 11).
Genotipe Tit Super yang digunakan sebagai kontrol pada penelitian ini
menunjukkan respon yang paling tinggi. Dengan demikian, untuk tujuan rekayasa
genetika atau transformasi genetika cabai dimana salah satunya untuk merakit
tanaman cabai transgenik tahan kekeringan, maka Tit Super dapat digunakan
untuk tujuan tersebut.
SIMPULAN
Dari tiga belas genotipe cabai yang beradaptasi di Indonesia, Tit Super
mempunyai respon yang terbaik di dalam regenerasi tanaman cabai secara in vitro
bila dibandingkan dengan genotipe lanilla.
Untuk tujuan rekayasa genetika, Tit Super dapat digunakan sebagai
materi/eksplan untuk transformasi genetika cabai dengan menggunakan daun
mudanya.
V INTRODUKSI GEN P5CS KE DALAM GENOM CABAI DENGAN BANTUAN AGROBACTERIUM DAN
EKSPRESINYA TERHADAP CEKAMAN AKIBAT PEMBERIAN PEG
Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah: (1) meregenerasikan cabai cv. Tit Super transgenik yang mengintegrasikan gen kimera P5CS dengan bantuan Agrobacterium, (2) menganalisis integrasi gen kimera P5CS pada genom cabai Tit Super transgenik P5CS menggunakan teknik total nucleic acid PCR, (3) menganalisis akumulasi prolina pada daun cabai transgenik P5CS. Hasil percobaan menunjukkan, transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium berhasil mengintroduksikan gen kimera P5CS ke dalam genom cabai. Transformasi dengan bantuan Agrobacterium berhasil meregenerasi-kan 67 nomor calon cabai transgenik P5CS generasi R0 yang resisten terhadap antibiotika kanamisin. Pengujian ekspresi gen P5CS pada cabai transgenik Tit Super dengan perendaman dalam larutan PEG 15% menunjukkan peningkatan prolina total daun yang tinggi di bandingkan dengan tanaman kontrol.
Kata kunci: Transformasi dengan Agrobacterium, total nucleic acid PCR,
akumulasi prolina, polyethylene glycol (PEG)
V INTRODUCTION OF P5CS GENE BY AGROBACTERIUM AND TOLERANCE OF TRANSGENIC HOT CHILI
EXPRESSING P5CS GENE AGAINST STRESS DUE TO POLYETHYLENE GLYKOL (PEG)
Abstract
The objectives of this experiment were to (1) regenerate of transgenic chilli cv. Tit Super constitutively expressing P5CS transgene through Agrobacterium, (2) analyze integration of P5CS transgene in the genome of transgenic chilli by total nucleic acid PCR, (3) analyze proline accumulation in leaf tissues of the transgenic chilli. There were 67 transgenic line but only 5 transgenic line were positive based on total nucleic acid PCR testing. The transgenic line also accumulate higher proline than control plant under drought stress which induced by Poly Ethylene Glicol (PEG) 15%. Keyword: Transgenic, Agrobacterium-mediated transformation, P5CS transgene,
proline content, Polyethylene Glycol
PENDAHULUAN
Rekayasa genetika tanaman cabai merah (Capsicum annuum L.) sampai
sekarang masih relatif sulit dilakukan. Hal ini terbukti dari sedikitnya publikasi
tentang rekayasa genetika tanaman cabai merah (Hot pepper) di berbagai jurnal.
Hal ini berkorelasi dengan belum tersedianya metode yang efisien untuk
regenerasi tunas secara in vitro, dan sulitnya meregenerasikan eksplan hasil
inokulasi Agrobacterium.
Rekayasa genetika merupakan salah satu alternatif metode untuk
perbaikan genetika tanaman. Pemanfaatan rekayasa genetika untuk perbaikan
beberapa sifat tertentu telah dilakukan hingga tahapan komersialisasi dan
produknya dinyatakan aman terhadap lingkungan dan aman sebagai bahan pangan
(Conner 1997).
Salah satu program pemuliaan cabai adalah mendapatkan tanaman cabai
toleran kekeringan. Rekayasa genetika cabai untuk sifat tahan terhadap
kekeringan dapat dilakukan dengan menstransfer gen P5CS melalui
Agrobacterium tumefaciens. Kavi Kishor et al. (1995) melaporkan bahwa gen
yang diperoleh dari tanaman Vigna aconitifolia, terbukti dapat meningkatkan
ekspresi ketahanan terhadap kekeringan dan salinitas tinggi pada tanaman
tembakau.
Penggunaan seleksi in vitro untuk mendapatkan plasma nutfah cabai yang
toleran cekaman kekeringan memerlukan tersedianya teknik kutur jaringan yang
efektif untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak. Selain itu, selective
agent yang dapat menapis sel/jaringan dengan sifat toleran diantara sel/jaringan
yang peka cekaman perlu tersedia. Manitol, sorbitol, garam, dan polietilena glikol
(PEG) telah digunakan sebagai bahan penyeleksi dalam seleksi in vitro untuk
toleransi terhadap cekaman kekeringan (Dami dan Huges 1997).
Senyawa PEG merupakan senyawa yang dapat menurunkan potensial
osmotik larutan melalui aktivitas matrik sub-unit etilena oksida yang mampu
mengikat molekul air dengan ikatan hidrogen. Penyiraman larutan PEG ke dalam
media tanam diharapkan dapat menciptakan kondisi cekaman karena ketersediaan
air bagi tanaman menjadi berkurang.
Kekeringan mengakibatkan cekaman osmotik pada tanaman yaitu
mengurangi aktivitas air dan menyebabkan hilangnya turgor sel. Tanaman
mempertahankan turgor sel dengan menjaga keseimbangan antara besaran laju
transpirasi oleh daun dan penyerapan air oleh akar. Pada kondisi stres kekeringan,
laju transpirasi lebih besar dari laju penyerapan air sehingga terjadi defisit
kandungan air pada jaringan tanaman. Hal tersebut dapat memicu berbagai
respon fisiologi dan biokimia untuk mengatasi stres (Yamaguchi-Shinozaki dan
Shinozaki 1994).
Stres kekeringan pada tanaman mempengaruhi mekanisme biokimia dan
fisiologi antara lain menurunkan kecepatan fiksasi dan akumulasi N (Masyudi dan
Peterson 1991), transfortasi fotosintat dan transpirasi (Pookpadi et al. 1990; Vieira
et al. 1992), dan kecepatan fotosintesis (Loggini et al. 1999). Sebelumnya
Yancey et al. (1982) menyatakan bahwa terjadinya peningkatan akumulasi
senyawa organik yang mudah larut dalam air (senyawa osmolit atau
osmoprotektan) merupakan salah satu bentuk respons fisiologi tanaman akibat
stres kekeringan. Akumulasi senyawa yang berfungsi sebagai osmoprotektan
dalam kondisi stres kekeringan melindungi berbagai proses fisiologi dan struktur
seluler melalui mekanisme osmotic adjustment (pengaturan tekanan osmotik)
yang berfungsi menstabilkan struktur makromolekul dan mekanisme
osmoprotektan (perlindungan osmotik) yang berfungsi menjaga integritas
membran sel dalam kondisi stres kekeringan (Yancey et al. 1982; Crowe et al.
1987; Potts 1994). Senyawa prolina merupakan salah satu senyawa asam amino
yang berfungsi dalam mekanisme osmotic adjustment (Yancey et al. 1982;
Mc.Cue dan Hanson 1990).
Prolina yang terakumulasi di dalam sitoplasma berperan memelihara
keseimbangan air antara vakuola, sitoplasma dengan lingkungannya (Yang dan
Kao 1999). Sebelumnya Levitt (1980) menyatakan peranan prolina tidak hanya
terbatas pada penyesuaian osmotik yang terkait dengan status air, tetapi juga
mempunyai peranan lain seperti menetralisir pengaruh toksik NH3 hasil hidrolisis
protein, sebagai sumber energi dan sumber N bagi pemulihan proses fisiologis
tanaman pasca stres kekeringan.
Pada tanaman tingkat tinggi, prolina disintesis melalui lintasan asam
glutamin dan ornitin. Lintasan dari glutamin merupakan rute primer untuk
biosintesis prolina dalam kondisi stres kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et
al. 1997). Prolina disintesis dari glutamin melalui dua senyawa intermediet yaitu
glutamin semialdehyde (GSA) dan Pyrroline-5-carboxylate (P5C). Ada dua
enzim yang berperan dalam biosintesis prolina yaitu P5C synthetase (P5CS) pada
step awal dan P5C reductase (P5CR) pada step kedua.
Biosentesis prolina melalui jalur glutamat pada tanaman dikatalisis oleh
enzim penentu P5CS. Analisis fungsional ekspresi gen P5CS dan evaluasi
akumulasi prolina pada jaringan tanaman dapat dilakukan dengan
mengintegrasikan gen P5CS ke dalam genom tanaman dan meregenerasikan
tanaman transgenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tembakau transgenik
yang mengintegrasikan dan mengekspresikan gen kimera P5CS (terdiri dari
promoter konstitutif yang berasal dari gen CaMV 35S serta unit transkripsi dan
terminator yang berasal dari gen P5CS meningkatkan akumulasi prolina pada
jaringannya (Kavi Kishor et al. 1995).
Secara umum, percobaan ini bertujuan untuk meregenerasikan cabai
transgenik yang mengintegrasikan gen kimera P5CS dan menguji ekspresi
transgene dengan mengevaluasi peningkatan kandungan prolina daun. Secara
khusus, tujuan penelitian ini adalah: (1) meregenerasikan cabai varietas Tit Super
transgenik yang mengintegrasikan gen kimera P5CS dengan bantuan
Agrobacterium, (2) menganalisis integrasi gen kimera P5CS pada genom cabai Tit
Super transgenik menggunakan teknik total nuclei acid PCR, (3) menganalisis
akumulasi prolina pada daun cabai transgenik.
BAHAN DAN METODE
Berdasarkan pada penelitian sebelumnya yaitu studi regenerasi beberapa
varietas cabai secara in vitro, maka ditetapkan varietas cabai Tit Super yang
digunakan untuk penelitian introduksi gen P5CS ke dalam genom cabai guna
mendapatkan calon tanaman transgenik yang tahan untuk kondisi cekaman
kekeringan.
Penyiapan kultur Agrobacterium dan eksplan cabai. Keberadaan
plasmid pBI-P5CS dalam sel Agrobacterium dianalisis dengan polymerase chain
reaction (PCR). Plasmid pBI-P5CS diisolasi dari sel Agrobacterium
menggunakan metode yang dikembangkan oleh Hoykaas (1988). Plasmid pBI-
P5CS yang didapat juga digunakan sebagai templat untuk PCR menggunakan
sepasang primer spesifik P5CS (primer forward: 5’-cgggggttcatgaaggacg-3’ dan
primer reverse: 5’-gaatcgttaaacattgtggacc-3’). Komponen reagensia untuk reaksi
PCR terdiri atas 2.5 μl bufer PCR 10x, 0.5 μl dNTP 10 mM, 1 μl masing-masing
pasangan primer forward dan reverse 50 ng/μl, 0.2 μl ensim Taq polimerase 2
U/μl, dan 9.8 μl ddH2O. Reaksi PCR dilakukan selama 35 siklus dan masing-
masing siklus dengan tahapan sebagai berikut: denaturasi DNA pada suhu 94oC
selama 1 menit, primer annealing pada suhu 55oC selama 1 menit, dan ekstensi
primer pada suhu 72oC selama 3 menit. Hasil PCR dipisahkan menggunakan
elektroforesis gel agarosa dalam 0.5x larutan penyangga tris-EDTA (TBE) dan
tegangan 50V selama 1 jam. Setelah diwarnai dengan etidum bromida, gel agarosa
difoto dan didokumentasikan.
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang telah terbukti positif
membawa plasmid biner pBI-P5CS disegarkan dalam medium Luria Broth (LB)
dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l, rifampicin 20 mg/l, dan
agar-agar 8 g/l. Kultur bakteri ditumbuhkan dalam ruang tumbuh bersuhu 28oC
selama dua hari. Koloni tunggal yang didapat selanjutnya diinokulasikan ke dalam
medium LB cair (100 ml) dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l
dan rifampicin 20 mg/l, dikocok menggunakan shaker berkecepatan 100 rpm
selama 24 jam, dan suspensi bakteri dipanen dengan sentrifugasi. Endapan bakteri
dicuci dua kali dengan medium MS (Murashige dan Skoog, 1962) tanpa
penambahan agar-agar (MS cair) dan diresuspensikan dalam medium MS cair
dengan penambahan antibiotika rifampicin 20 mg/l. Kerapatan bakteri di ukur
dengan spektrofotometer dan kerapatan yang diinginkan diperoleh dengan
pengenceran suspensi stok hingga mencapai nilai OD=1 (setara dengan kerapatan
bakteri 109 sel/ml) menggunakan medium MS0 cair.
Gambar 12 Peta konstruksi plasmid biner pBI-P5CS yang membawa gen kimera P5CS, gen marker NPTII, dan gen marker GUS pada struktur T-DNA. Lokasi situs pemotongan oleh ensim restriksi pada T-DNA ditunjukkan dengan angka dan identitas ensimnya (Kavi Kishor et al. 1995).
Eksplan daun cabai disiapkan secara in vitro dengan mengecambahkan
benih cabai var.Tit Super yang telah disterilkan tiga kali berturut-turut dalam
Clorox (20% v/v) selama 10 menit dan dibilas tiga kali dengan air steril untuk
menghilangkan larutan sterilan. Benih steril direndam dalam air steril selama 12
jam. Bibit cabai ditumbuhkan dalam medium MS0 selama 21 hari dan daun muda
yang telah membuka sempurna digunakan sebagai sumber eksplan.
pBI-P5CS
T-DNA
Ori
Vir region
Media dasar yang digunakan untuk mengkulturkan eksplan tersusun dari
garam makro, mikro dan senyawa organik sesuai dengan media MS, vitamin L2 (1
mg/l), glukosa (3%), agar-agar (8 g/l). Media diatur pH-nya sehingga mencapai
5.8 dan disterilkan dalam otoklaf dengan pemanasan 121 °C dan tekanan 121 psi
selama 18 menit.
Untuk media regenerasi I (media MSR-I), ke dalam media dasar
ditambahkan BAP (4 mg/l) dan IAA (0.25 mg/l). Media MSR-I digunakan dalam
perlakuan pre-kultur, kokultivasi, dan dalam proses induksi pembentukan tunas
dari eksplan. Jika telah terinduksi membentuk tunas pada media MSR-I,
selanjutnya eksplan disubkultur dalam media pemanjangan tunas (MSR-II) yang
tersusun dari media dasar dengan penambahan BAP (1 mg/l), GA3 (2 mg/l),
AgNO3 (5 mg/l), dan kalsium pantotenat (2 mg/l).
Kokultivasi dan Pemeliharaan Kultur. Eksplan daun muda diperoleh
dengan memotong kedua ujungnya (dibuang), dan lembaran daun kemudian
dipotong dua secara transversal. Pada percobaan pre-kultur eksplan daun muda
ditanam dalam media MSR-I selama sembilan hari.
Introduksi gen kimera P5CS ke dalam genom cabai Tit Super dilakukan
dengan cara merendam eksplan di dalam suspensi Agrobacterium selama 15
menit. Kemudian eksplan dikokultivasi dengan cara menanam eksplan dan
bakterinya tanpa antibiotik selama 24 jam. Selanjutnya eksplan dicuci dengan
aqua steril dan dibilas dengan MSO cair yang diberi antibiotik cefotaxime [500
mg/l]. Eksplan ditiriskan di atas tisue steril, kemudian ditanam dalam media
MSR-I yang telah ditambahkan antibiotik cefotaxime sampai tunas berukuran 1
cm. Selanjutnya eksplan disubkultur ke dalam media seleksi (media MSR-II
dengan penambahan antibiotik kanamycin [50 mg/l] dan cefotaxime [500 mg/l].
Antibiotik kanamaycin ditambahkan untuk menekan pertumbuhan sel tanaman
asal sehingga sel transgenik dapat tumbuh dan dibedakan dari sel yang lain.
Dalam hal ini sel tanaman asal akan mati (peka terhadap kanamaycin = KanS),
sedangkan sel transgenik akan tetap hidup (tahan kanamyacin = KanR ).
Antibiotik cefotaxime ditambahkan untuk membunuh isolat Agrobacterium.
Eksplan disubkultur ke dalam media seleksi yang masih segar setiap 14 hari
sekali. Setiap eksplan yang berhasil membentuk tunas dalam media MSR-II
kemudian dipindahkan ke dalam media perkaran yang terdiri dari MSO ditambah
IAA 0.1 mg/l.
Semua kultur in vitro diinkubasi dalam ruang kultur dengan intensitas
penyinaran 1000-1500 lux selama 24 jam. Suhu ruangan diatur sehingga berkisar
antara 20-28°C.
Analisis total nucleic acid PCR untuk gen P5CS. Keberadaan gen P5CS
pada genom masing-masing calon cabai transgenik R0 hasil transformasi genetika
dianalisis menggunakan total nucleic acid PCR dengan primer spesifik untuk gen
nptII. Total genom tanaman cabai diisolasi dari daun menggunakan metode CTAB
yang dikembangkan oleh Graham et al. (1994) dan digunakan sebagai templat
untuk PCR. Komponen reagensia dan tahapan PCR yang dilakukan sebagaimana
yang telah disebutkan sebelumnya. Amplifikasi PCR dengan primer spesifik nptII
menghasilkan produk amplifikasi berupa potongan DNA berukuran 250 bp.
Reaksi PCR menggunakan plasmid pBI-P5CS digunakan sebagai kontrol (+),
sedangkan reaksi PCR dengan genom tanaman non-transgenik sebagai templat
dan reaksi PCR tanpa templat DNA masing-masing digunakan sebagai dua
kontrol (-). Hasil total nucleic acid PCR dipisahkan menggunakan elektroforesis
gel agarosa sebagaimana dijelaskan di bagian sebelumnya.
Toleransi cabai transgenik yang mengekspresikan gen P5CS terhadap
cekaman kekeringan dengan pemberian PEG. Planlet cabai transgenik yang
telah lulus seleksi media yang mengandung kanamisin dan yang menunjukkan
hasil positif dari hasil analisis PCR dengan gen nptII serta tanaman kontrol,
ditanam dalam media MS cair dengan penambahan BAP (1 mg/l), GA3 (2 mg/l),
AgNO3 (5 mg/l), dan kalsium pantotenat (2 mg/l) serta PEG 0 dan 15% setara
dengan potensil osmotik 0 dan -0.41 MPa (Michel dan Kaufmann 1973). Setelah
10 hari perlakuan perendaman dalam larutan PEG tersebut kemudian dilakukan
pengukuran kandungan prolina total daun. Kandungan prolina daun dianalisis
berdasarkan metode Bates et al. (1973); Sudarsono et al. (2006) Daun (0.2g)
digerus dan dihomogenasi dengan 10 ml asam sulfosalisilat (3% b/v). Setelah
disentrigugasi dengan kecepatan 5000xg selama 15 menit menggunakan
Eppendorf table top centrifuge, 2 ml supernatan yang didapat direaksikan dengan
2 ml larutan asam ninhidrin 0.14 M (dengan komposisi ninhidrin 1.25 g, asam
asetat glacial serta dipanaskan di atas penangas air hingga suhu 100°C selama 60
menit. Reaksi diakhiri dengan mendinginkan larutan dalam es selama 5 menit.
Hasil reaksi diekstraksi dengan 4 ml toluene (99.5%) sehingga terbentuk
kromoform dan absorbansi kromoformnya diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 520 nm. Sebagai standar digunakan DL-Proline (Sigma)
yang dilarutkan dalam asam sulfosalisilat (3% b/v).
HASIL
Transformasi gen P5CS dan regenerasi tanaman cabai transgenik.
Introduksi gen P5CS ke genom cabai melalui transformasi genetika dengan
bantuan Agrobacteriun terpilih telah dilakukan tiga kali. Dua dari tiga kali
transformasi genetika yang dilakukan tidak menghasilkan tunas yang KanR.
Tunas tersebut gagal membentuk planlet karena kontaminasi atau mati pada media
seleksi Kanamaycin [100 mg/l]. Transformasi genetika yang ke-3 (Tabel 8)
berhasil diperoleh 145 tunas yang KanR. Dari 145 tunas yang didapat berhasil
diperoleh 67 planlet. A. tumefaciens yang digunakan dalam transformasi genetika
telah diuji positif membawa plasmid pBI-P5CS berdasarkan hasil PCR.
Amplifikasi bagian dari gen kimera P5CS dengan teknik PCR menggunakan
primer spesifik untuk gen nptII menghasilkan potongan DNA hasil amplifikasi
dengan ukuran 250 bp (Gambar 13)
Gambar 13 Hasil total nucleic acid PCR untuk mendeteksi integrasi gen P5CS: dalam genom cabai transgenik dengan marker nptII Keterangan: 1 = cv. Tit Super kontrol, 2 sampai 30 = cv.Tit Super transforman. Tabel 8 Perkembangan jaringan daun cabai var. Tit Super dalam berbagai
tahapan transformasi genetika dengan bantuan Agrobacterium hingga menjadi tanaman transgenik. Transformasi genetika untuk mengintroduksikan gen P5CS dengan bantuan Agrobacterium dilakukan sebanyak empat eksperimen.
Hasil transformasi dengan Agrobacterium: No. exp. Jumlah
eksplan Tunas Planlet Tanaman Tanaman
berbiji 1. 200 - - *) - - 2. 300 - - - - 3. 250 145 67 - -
Total 750
P** - 58% 26.8% - - Keterangan: *[-] Terkontaminasi dan tidak lolos seleksi kanamaycin [100mg/l)
sehingga tidak dapat diperoleh tunas dan planlet. **P adalah persentase terhadap total jumlah eksplan, dihitung dengan rumus P=(jumlah respons/jumlah eksplan)x100%.
Produk PCR NptII 250 bp
Produk PCR NptII 250 bp
Gambar 14 Perkembangan eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam tahapan transformasi dengan bantuan Agrobacterium (A1) Prekultur eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam media MSR-I, (A2) Kokultivasi eksplan daun muda cabai var Tit Super dalam mdia MSR-I, (B1dan B2) Respon tunas cabai var Tit Super yang resisten dan sensitif terhadap kanamaycin dalam media MSR-II, (C1 dan C2) Planlet cabai var. Tit Super transgenik dalam media perakaran.
A1 A2
B1 B2
C1 C2
Ekspresi gen P5CS pada planlet cabai. Ekspresi gen P5CS pada
tanaman cabai transgenik diketahui berdasarkan analisa kandungan prolina total
daun. Kandungan prolina total daun cabai baik kontrol maupun cabai transgenik
setelah perendaman dengan larutan PEG 15% selama 10 hari dapat dilihat seperti
yang terdapat pada Gambar 15 dan Tabel 9, terlihat bahwa tanaman cabai
transgenik yang diduga mengandung gen P5CS setelah perendaman dengan PEG
selama 10 hari menunjukkan peningkatan kandungan prolina total daun yang
sangat tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol. Tanaman kontrol yang
direndam dalam PEG 15% selama 10 hari menyebabkan organ daunnya mati
hampir seluruh sel-sel pada lamina (helaian daunnya) mati, sehingga kandungan
prolina daunnya mengalami penurunan dibandingan dengan kandungan prolina
dengan perendaman PEG 0%, sedangkan daun tanaman cabai transgenik yang
direndam dalam larutan PEG 15% selama 10 hari masih tetap hijau dan segar,
jaringan daun cuma mengalami kematian sel-selnya di pangkal petiolus saja
(Gambar 15). Cabai transgenik P5CS dapat bertahan hidup pada kondisi cekaman
kekeringan dengan adanya over produksi prolina yang merupakan salah satu
senyawa yang bersifat osmopektan yang berguna untuk mejaga turgor sel tetap
dalam keadaan yang normal, sedangkan tanaman cabai yang non transgenic
daunnya mengalami kematian dalam kondisi cekaman kekeringan yang diberi
perlakuan PEG, karena senyawa prolina yang dimilikinya secara alami tidak bisa
menjaga turgor selnya akibat cekaman kekeringan tersebut, sehingga
menyebabkan air akan tertarik ke luar dari sel daun, akhirnya sel-sel daun akan
mati.
Gambar 15 Penampilan daun regeneran cabai cv Tit Super yang direndam dalam larutan PEG 15% selama 10 hari secara in vitro (A) Kontrol dan (B) Transgenik P5CS
A B
02000400060008000
1000012000140001600018000
K (PEG0%)
TS 32(PEG0%)
TS 11(PEG0%)
TS 29(PEG0%)
K(PEG15%)
TS 29(PEG15%)
TS 20(PEG15%)
TS 11(PEG15%)
TS 9(PEG15%)
GENOTIPE CABAI
PRO
LINA
DA
UN
Gambar 16 Pengaruh perendaman PEG 0 dan 15% selama periode 10 hari secara in vitro terhadap kandungan prolina total daun tanaman cabai kontrol dan transgenik R0. Keterangan : K = tanaman cabai Tit Super non transgenic, TS = tanaman cabai Tit Super transgenik
0
500
1000
1500
2000
2500
K ( PEG 0%) TS 32 (PEG0%)
TS 11 (PEG0%)
TS 29 (PEG0%)
GENOTIPE CABAI
PRO
LINA D
AUN
02000400060008000
1000012000140001600018000
K (PEG15%)
TS 29 (PEG15%)
TS 20 (PEG15%)
TS 11 (PEG15%)
TS 9 (PEG15%)
GENOTIPE CABAI
PR
OLI
NA
DA
UN
Gambar 17 (A) Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan
non transgenik dalam kondisi optimum, (B) Distribuís kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan non tansgenik dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari. Keterangan : K = tanaman cabai Tit Super non transgenic, TS = tanaman cabai Tit Super transgenik
Kontrol
PEG 15%
A
B
02000400060008000
1000012000140001600018000
K TS 11 TS 29
GENOTIPE CABAI
PR
OLI
NA
DA
UN
OPT PEG 15%
Gambar 18 Distribusi kandungan prolina total daun cabai transgenik R0 dan non transgenik dalam kondisi optimum dan dalam kondisi cekaman dengan perendaman PEG 15% selama 10 hari pada genotype yang sama
Tabel 9 Kandungan prolina daun cabai transgenik dan non transgenik pada
kondisi optimum dan dengan perendaman dalam larutan PEG 15% selama 10 hari
Prolina (ug/g daun)
Genotipe Cabai Optimum Cekaman Kekeringan
Persentase Peningkatan
/Penurunan Prolina (%)*
Kontrol 2169,28 280,70 -87 Trasgenik No 11 440,69 10991,92 2394 Transgenik No 29 384,58 16598,49 4215
*Penurunan=[ (OPT-CEKAMAN)/OPT] x 100%. OPT=tanaman dalam kondisi optimum, dan CEKAMAN=tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan.
PEMBAHASAN
Berdasarkan hasil penelitian eksplan daun muda tanaman cabai sangat
peka terhadap infeksi Agrobacterium. Hal ini dapat dilihat dari banyaknya
eksplan yang mati setelah dilakukan proses kokultivasi. Cara seleksi sel
transforman juga dapat mempengaruhi regenerasi tunas transgenik. Gen neomycin
phosphotransferase (nptII) atau gen marker selektif lainnya yang ditransfer ke sel
tanaman agar dapat menseleksi sel yang ditransformasi dengan menambahkan
antibiotik kanamisin pada medium kultur. Jaringan yang tidak ditansformasi akan
memucat dan mati, dan hanya sel yang mengekspresikan gen nptII yang tetap
hidup. Walaupun sel mengekspresikan neomysin phosphotansferase, kanamisin
seringkali dilaporkan menghambat regenerasi tunas transforman (Everett et al.
1987; Graham dan McNicol et al. 1990). Hal ini disebabkan matinya sel-sel pada
jaringan yang mengelilingi sel transforman.
Penundaan penambahan kanamisin pada medium dapat meningkatkan
regenerasi sel transforman. Sel lain itu sel akan membelah sehingga dapat
menghasilkan sejumlah neomysin phosphotransferase yang cukup (Chabaud et al.
1988; Boulter et al. 1990). Beberapa peneliti melaporkan bahwa penggunaan
agen selektif lainnya, seperti hygromysin memberikan hasil yang lebih baik
dibandingkan seleksi dengan kanamisin (Lusdorf et al. 1991; Puonti-Kaerlas et al.
1990). Namun hasil yang berlawan juga dijumpai, seperti yang dilaporkan oleh
D’Halluin et al. (1990).
Setelah inokulasi kalus cabai dengan Agrobacterium dan dikulturkan
pada media seleksi yang mengandung kanamisin 50 mg/l, terjadi inisiasi kalus
baru dan terus berkembang sampai umur empat minggu. Kalus yang terseleksi
dan membentuk tunas kemudian dipindahkan ke dalam media perpanjang tunas
yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/l sampai tinggi shootlet 5 cm.
Kemudian shootlet-shootlet yang terbentuk dipindahkan ke media perakaran.
Kalus maupun tunas yang dapat tumbuh di dalam media seleksi yang mengandung
kanamisin tersebut dapat dipastikan telah memiliki gen ketahanan terhadap
kanamisin (nptII). Sehingga bisa dipastikan bahwa proses transformasi
Agrobacterium yang membawa plasmid pBI-P5CS telah berhasil.
Regeneran yang diduga membawa gen P5CS menunjukkan morfologi
daun yang lebih besar dibandingkan dengan tunas tanaman kontrol. Hal ini
diduga karena gen P5CS akan mendorong terbentuknya senyawa prolina yang
merupakan salah satu senyawa osmolit yang berfungsi menjaga homeostasi
osmotik agar sel tetap turgor. Homeostasi atau keseimbangan ionik bertujuan
juga untuk mempertahankan konsentrasi ion di tingkat seluler, jaringan dan organ
tanaman.
Gambar 19 Penampilan daun regeneran cabai cv Tit Super secara in vitro (A) Kontrol dan (B) Transgenik
Hasil PCR menunjukkan adanya pita pada ukuran 250 bp baik pada
plasmid maupun pada sel tanaman cabai yang tahan terhadap kanamisin (Gambar
13). Tampak bahwa gen nptII telah positif berada dalam genom tanaman cabai.
Gen nptII yang merupakan gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin
diamplifikasi menggunakan primer spesifik nptII.
Ekspresi gen P5CS pada tanaman cabai transgenik bisa diketahui
berdasarkan kandungan prolinanya. Prolina akan terakumulasi di dalam jaringan
tanaman apabila tanaman tersebut mengalami cekaman kekeringan atau pada
keadaan cekaman salinitas tinggi. Widyasari dan Sugiyarta (1997) menyatakan
dalam keadaan normal, prolina yang dihasilkan bersifat umpan balik dan karena
kehadiran air, prolina akan dioksidasi kembali menjadi asam glutamat (Gambar
20). Oleh karena itu dalam kondisi normal konsentrasi prolina akan selalu rendah.
Pada kondisi cekaman kekeringan oksidasi prolina akan dihambat sehingga
produksi prolina akan bertambah dan dengan adanya gen P5CS produksi prolina
semakin meningkat karena enzim P5CS memicu katalisis glutamat menjadi
prolina. Oleh karena itu adanya akumulasi prolina dapat menjadi indikator
tanaman yang toleran terhadap kekeringan.
Hasil analisis kandungan prolina pada cabai transgenik dan non transgenik
menunjukkan adanya variasi yang cukup tinggi (Gambar 17). Kadar prolina yang
bervariasi ini kemungkinan disebabkan masuknya transgen P5CS ke dalam genom
A B
tanaman terjadi pada intensitas dan posisi yang berbeda. Hal ini menyebabkan
ekspresi transgen P5CS dari masing-masing planlet cabai transgenik berbeda pula.
Gambar 20 Rangkaian reaksi oksidasi prolina
SIMPULAN
Introduksi gen P5CS telah berhasil dilakukan pada genom cabai cv. Tit
Super, dibuktikan dengan didapatkannya 67 planlet yang tahan kanamisin dan
diperkuat dengan hasil PCR. Morfologi tunas yang diduga mengandung gen
P5CS lebih besar dibandingkan dengan morfologi daun tanaman cabai kontrol.
Ekspresi gen P5CS pada genom tanaman cabai terbukti dapat meningkat
kandungan prolina total daun yang mengalami cekaman kekeringan akibat
perendaman dengan PEG.
VI TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP CEKAMAN KEKERINGAN AKIBAT PENGURANGAN
PEMBERIAN AIR
ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah pada kondisi cekaman kekeringan dari umur 15 – 78 HST akibat pengurangan pemberian air pada tembakau transgenik R2 terjadi ekspresi gen P5CS, apakah umur/developmental tanaman berpengaruh pada over ekspresi gen P5CS tersebut. Toleransi kekeringan dari tanaman tembakau tansgenik di analisa melalui pengukuran kandungan prolina daun. Tanaman tembakau transgenik R2 dari generasi R2 nomor GS1, GS2, GS3, GS4, dan GS5 serta tembakau GS non-transgenik dipelihara dalam kondisi kapasitas lapang hingga 14 HST, kemudian diberi perlakuan cekamans kekeringan dari umur 15 HST hingga umur 35 HST, 55 HST dan 78 HST. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi penurunan pertumbuhan pada tembakau akibat pengurangan pemberian air baik pada tanaman tembakau non transgenik maupun tembakau transgenik, namun penurunan pertumbuhan pada tanaman tembakau non transgenik lebih besar dibandingkan dengan tembakau transgenik. Umur tanaman mempengaruhi jumlah prolina yang dihasilkan.
Kata kunci: Akumulasi prolina, fase pertumbuhan
VI TOLERANCE OF TRANSGENIC TOBACCO EXPRESSING GENE P5CS OF R2 GENERATION
AGAINST DROUGHT STRESS DUE TO REDUCTION OF GIVING WATER
Abstract
The objectives of this experiment were (i) to determine the effects of
drought stress during the period of 15 – 78 days after planting (DAP) on growth of R2 plants derived from transgenic GS tobacco carrying P5CS transgene, (ii) to evaluate their tolerance against drought stress, and (iii) to determine their leaf proline content. One group of the evaluated plants were grown in plastic pots and subjected to stress condition during the period of 15 – 78 DAP. The other group was grown optimally in plastic pot up to harvest period. All tobacco plants were harvested at 78 DAP. Leaf proline content was determined at 35 and 78 DAP (after six periods of stress). The results indicated that drought stress reduced plant height, shoot diameter, leaf number, leaf dry weight and leaf area of all tobacco plants. Higher leaf proline content under drought stress was observed in all R2 plants derived from P5CS transgenic tobacco than that of non-transgenic GS tobacco. Increased in leaf proline content due to over-expression of P5CS gene under drought stress correlated with drought tolerance phenotype in transgenic GS tobacco.
Keywords: Proline biosynthesis, proline accumulation, cekamans, biomass yield
PENDAHULUAN
Ketersediaan air yang terbatas atau kekeringan merupakan faktor pembatas
utama terhadap produksi tanaman. Hasil panen di lahan kering relatif rendah
akibat cekaman kekeringan yang dapat terjadi pada setiap tahap perkembangan
tanaman, khususnya tahap pembungaan sampai terbentuknya biji (Mitra 2001).
Pertumbuhan vegetatif tanaman dan hasil polong kacang tanah diamati pada
kondisi optimum dan kondisi cekaman kekeringan. Hasil analisis keragaman
menunjukkan bahwa cekaman kekeringan nyata menurunkan pertumbuhan
vegetatif tanaman dan hasil polong.
Kemampuan atau strategi yang dilakukan tanaman dalam merespons
cekaman kekeringan sangat menentukan kamampuan tanaman untuk menghindari
kondisi kekeringan tersebut. Tanaman yang toleran/tahan terhadap kekeringan
secara fisiologis mempunyai kemampuan menjaga keseimbangan osmotik dalam
sel-selnya dengan meningkatkan penyerapan air dan menurunkan kehilangan air.
Kemampuan meningkatkan penyerapan air ditunjukkan oleh adanya perakaran
yang besar atau adanya osmolit yang menurunkan potensial air dalam sel
(Mundree 2002). Dalam proses pertumbuhan tanaman, penyerapan air oleh akar
sangat ditentukan oleh besarnya gradien osmotik (Steudle dan Frensch 1996).
Penyerapan air dilakukan melalui jalur simplastik. Perkiraan ini didukung dengan
ditemukannya protein integral membran (aquaporin) yang berperan senagai
channel spesifik air (Chrispeel dan Maurel 1994; Magio dan Joly 1995).
Pertumbuhan akar yang ekstensif akan menguntungkan dalam pemeliharaan
potensial air yang tinggi di bawah kondisi cekaman kekeringan.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ketahanan tanaman terhadap
cekaman kekeringan berhubungan dengan peningkatan kandungan prolina yang
berperan sebagai osmotic adjustment maupun osmoprotektan (Irigoyen et al.
1992). Akumulasi prolina pada tanaman yang mengalami cekaman kekeringan
disebabkan oleh aktivitas biosintesis prolina dan inaktivasi degradasi prolina.
Pada tanaman tingkat tinggi, prolina disentesis melalui lintasan asam glutamin dan
ornitin. Lintasan dari glutamin merupakan rute primer untuk biosintesis prolina
dalam kondisi cekaman kekeringan (Madan et al. 1995; Yoshiba et al. 1997).
Transformasi gen P5CS (phyrroline-5-carboxylate synthetase) yang merupakan
penyandi enzim dalam biosintesis prolina ke tanaman tembakau di bawah kendali
promoter kontitutif CaMV 35S, secara nyata terbukti meningkatkan produksi
prolina dan meningkatkan pula toleransi tanaman transgenik tersebut terhadap
cekaman kekeringan (Kavi Kishor et al. 1995).
Percobaan ini secara umum bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh
cekaman kekeringan melalui pengurangan air terhadap pertumbuhan tanaman R2
zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R2. Secara khusus, percobaan
bertujuan untuk: (1) menguji pengaruh pengurangan air terhadap pertumbuhan
dan hasil tanaman, (2) menganalisis akumulasi prolina daun tanaman R2 zuriat
dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R2 kondisi cekaman dan non-
cekaman, serta (3) menganalisis hubungan antara akumulasi prolina daun pada
kondisi cekaman kekeringan dengan pertumbuhan dan hasil tanaman.
BAHAN DAN METODE
Bibit tembakau transgenik. Benih R2 dari tanaman tembakau tembakau
cv. Gombel Shili (GS) transgenik R1 (tembakau transgenik R2 no GS-1, GS-2,
GS-3, GS-4, GS-5) ditanam dalam medium MS (Murashige dan Skoog 1962)
dengan penambahan kanamisin 100 mg/l. Jumlah bibit yang mampu tumbuh dari
benih dan yang mati dalam medium dengan penambahan kanamisin diamati dan
digunakan untuk menentukan jumlah transgen yang terintegrasi dalam genom
masing-masing tanaman transgenik R2. Hanya bibit tembakau yang tumbuh
dalam medium yang mengandung kanamisin yang digunakan dalam percobaan.
Penyiapan bibit tembakau. Bibit R2 zuriat dari tembaku GS transgenik
P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik ditanam dalam pot plastik
(250 ml) berisi medium campuran tanah:pasir:pupuk kandang (2:1:1) dan
diaklimatisasi dalam ruangan yang terkontrol kelembabannya (100%) dan
penyinaran (1000 lux) selama 2 minggu. Setelah periode aklimatisasi, tanaman
tembakau dipindah ke dalam pot plastik (30x30x30 cm3) yang berisi medium
campuran tanah:pasir: pupuk kandang (2:1:1) dan dipelihara di rumah kaca
sampai umur 2 minggu (14 hari). Pemeliharaan dilakukan meliputi penyiraman
hingga kapasitas lapang setiap pagi dan sore.
Pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan hasil.
Setelah berumur 15 HST, bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik
P5CS generasi R1 yang resisten terhadap kanamisin sebagian dipelihara dengan
penyiraman setiap hari hingga mencapai kondisi lapang hingga 78 HST dan
digunakan sebagai perlakuan non-cekaman. Sedangkan kelompok tanaman yang
lain, diberi perlakuan cekaman kekeringan dari umur 15 HST hingga panen (78
HST) dengan membiarkan tanaman tidak disiram sampai menunjukkan gejala
layu 70% dari seluruh jumlah daun pertanaman, kemudian disiram kembali dan
setelah itu diberi perlakuan cekaman kekeringan kembali dan seterusnya.
Unit percobaan terdiri dari 5 bibit tembaku R2 untuk setiap perlakuan
diulang 3 kali. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan perlakuan faktorial
dan rancangan lingkungan acak kelompok. Pengamatan dilakukan terhadap tinggi
tanaman, jumlah dan luas daun, diamater batang, dan bobot daun kering.
Analisis Kandungan prolina. Bibit tanaman R2 dari tembakau GS
transgenik P5CS generasi R1 yang ditanam dalam pot plastik dengan perlakuan
cekaman dan non-cekaman dipanen contoh daunnya pada umur 35 dan 78 HST
dan dianalisis kandungan prolinanya. Analisis kandungan prolina daun dilakukan
dengan menggunakan metode yang dikembangkan oleh Bates et al. (1973);
Sudarsono et al. (2006) Kandungan prolina contoh daun tanaman tembakau GS
non-transgenik yang ditanam dengan perlakuan cekaman dan non-cekaman
digunakan sebagai kontrol.
Indeks sensitifitas terhadap cekaman. Indeks sensitivitas terhadap
cekaman (S) dihitung dengan rumus yang dikembangkan oleh Fischer dan
Maurer (1978), yaitu : S = (1-[Y/Yp])/(1[X/Xp]); Y dan Yp: masing-masing
adalah nilai rataan pengamatan untuk satu genotipe tertentu pada kondisi cekaman
kekeringan dan dalam kondisi non cekaman, sedangkan X dan Xp adalah nilai
rataan pengamatan untuk semua genotipe dalam kondisi cekaman kekeringan dan
kondisi non-cekaman. Indeks S dihitung dengan menggunakan semua peubah
pengamatan yang dikumpulkan. Berdasarkan indesk S yang di dapat, tanaman
tembakau transgenik yang diuji dikategorikan sebagai toleran jika S < 0.5,
medium toleran jika 0.5 < S < 1, dan peka jika S > 1.
HASIL
Pengaruh cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan hasil.
Cekaman kekeringan pada umumnya dapat menurunkan pertumbuhan
tanaman tembakau, baik tanaman non-transgenik maupun transgenik P5CS.
Perlakuan cekaman kekeringan nyata menurunkan tinggi tanaman, panjang buku,
diameter batang, bobot daun kering, jumlah dan luas daun pada semua tanaman
tembakau yang diuji (Tabel 11, Tabel 12, Tabel 13, Tabel 14 dan Tabel 15), tetapi
terjadi pengecualian (Tabel 10) dimana pada pengamatan panjang akar tanaman
tembakau transgenik GS-1 dan GS-4 terjadi penambahan panjang akar pada
kondisi cekaman, begitu pula untuk berat akar tembakau transgenik GS-4 pada
kondisi cekaman kekeringan berat kering akarnya bertambah.
Penurunan pertumbuhan tanaman tembakau GS non-transgenik akibat
cekaman kekeringan cenderung lebih besar dibandingkan tanaman R2 zuriat dari
tembakau GS transgenik P5CS generasi R1.
Gambar 21 Tanaman tembakau transgenik R2 dalam media kanamisin (A dan B), tembakau R2 kontrol (non transgenik (C) , K(S) = kanamisin sensitif, K(R) = kanamisin resisten
A B C
K ® K ®
K (s) K (s)
Tabel 10 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanam (HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.
Lingkungan Peubah dan Geno-
tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan
Tinggi tanaman (cm) Non-transgenik GS-0 29.7 a 10.8 b 63.8Transgenik GS-1 20.3 a 10.3 b 49.6Transgenik GS-2 32.7 a 14.8 b 54.8Transgenik GS-3 32.3 a 15.2 b 53.1Transgenik GS-4 23.3 a 12.2 b 47.9Transgenik GS-5 31.0 a 17.7 b 43.0
Panjang Akar (cm) Non-transgenik GS-0 50.7 a 46.0 a 9.2Transgenik GS-1 37.0 a 40.0 a -8.1Transgenik GS-2 54.3 a 42.0 a 22.7Transgenik GS-3 59.0 a 49.7 a 15.8Transgenik GS-4 34.3 a 48.0 a -39.8Transgenik GS-5 51.7 a 51.0 a 1.3
Berat Kering Akar (g) Non-transgenik GS-0 0.8 a 0.8 b 6.3Transgenik GS-1 0.6 a 0.6 b 5.2Transgenik GS-2 1.8 a 0.9 b 50.9Transgenik GS-3 1.6 a 1.2 b 25.5Transgenik GS-4 0.6 a 0.8 b -31.6Transgenik GS-5 1.3 a 1.1 b 12.9
Diameter batang (cm) Non-transgenik GS-0 1.0 a 0.9 b 15Transgenik GS-1 0.9 a 0.9 b 8.9Transgenik GS-2 1.1 a 0.9 b 15.6Transgenik GS-3 0.9 a 0.9 b 3.5Transgenik GS-4 0.8 a 0.7 b 12.5Transgenik GS-5 0.9 a 0.9 b 10.3
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
Tabel 11 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 35 hari sesudah tanaman (HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.
Lingkungan Peubah dan Geno-
tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan
Berat daun kering (g) Non-transgenik GS-0 4.4 a 1.8 b 59.9Transgenik GS-1 2.3 a 1.3 b 43.5Transgenik GS-2 4.3 a 1.8 b 58.9Transgenik GS-3 3.9 a 2.1 b 47.4Transgenik GS-4 2.3 a 1.4 b 36.8Transgenik GS-5 4.2 a 2.2 b 47.2
Luas daun (cm2) Non-transgenik GS-0 303.7 a 166.5 b 45.2Transgenik GS-1 232.7 a 139.0 b 40.3Transgenik GS-2 372.0 a 199.5 b 46.4Transgenik GS-3 364.2 a 214.2 b 41.2Transgenik GS-4 243.3 a 133.3 b 45.2Transgenik GS-5 371.2 a 184.8 b 50.2
Jumlah daun (lembar) Non-transgenik GS-0 13.0 a 10.5 b 19.4Transgenik GS-1 9.0 a 9.0 b 11.1Transgenik GS-2 11.3 a 8.5 b 13.9Transgenik GS-3 11.7 a 8.3 b 17.6Transgenik GS-4 9.7 a 7.3 b 13.3Transgenik GS-5 11.7 a 8.3 b 22.2
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
Tabel 12 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 55 hari sesudah tanam (HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.
Lingkungan Peubah dan Geno-
tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan
Tinggi tanaman (cm) Non-transgenik GS-0 49.0 a 34.0 b 30.6Transgenik GS-1 58.0 a 42.0 b 27.6Transgenik GS-2 62.0 a 43.5 b 29.8Transgenik GS-3 60.0 a 47.0 b 21.7Transgenik GS-4 48.5 a 28.5 b 41.2Transgenik GS-5 61.0 a 43.0 b 29.5
Diameter batang (mm) Non-transgenik GS-0 1.1 a 0.9 b 13.6Transgenik GS-1 1.1 a 0.8 b 27.3Transgenik GS-2 1.2 a 0.9 b 21.8Transgenik GS-3 1.1 a 1.0 b 9.1Transgenik GS-4 1.1 a 0.8 b 23.8Transgenik GS-5 1.1 a 1.0 b 9.1
Panjang Akar (cm) Non-transgenik GS-0 63.50 a 53.5 b 15.7Transgenik GS-1 61.00 a 54.0 b 11.5Transgenik GS-2 73.50 a 48.5 b 34.0Transgenik GS-3 60.00 a 47.0 b 21.7Transgenik GS-4 75.50 a 41.0 b 45.7Transgenik GS-5 67.00 a 61.0 b 8.9
Berat Kering Akar (g) Non-transgenik GS-0 14.45 a 9.05 b 37.4Transgenik GS-1 12.70 a 8.40 b 33.9Transgenik GS-2 16.60 a 9.90 b 40.4Transgenik GS-3 12,90 a 13.20 b 99.8Transgenik GS-4 13.60 a 5.50 b 59.6Transgenik GS-5 20.50 a 11.40 b 44.4
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
Tabel 13 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 55 hari sesudah tanaman (HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.
Lingkungan Peubah dan Geno-
tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan
Bobot daun kering (g) Non-transgenik GS-0 7.7 a 5.0 b 35.1Transgenik GS-1 6.6 a 3.5 b 46.9Transgenik GS-2 9.1 a 4.1 b 54.6Transgenik GS-3 4.7 a 7.4 b -57.4Transgenik GS-4 6.2 a 2.4 b 61.3Transgenik GS-5 9.6 a 5.9 b 38.5
Luas daun (cm2) Non-transgenik GS-0 452.5 a 274.5 b 39.3Transgenik GS-1 427.0 a 377.0 b 11.7Transgenik GS-2 467.8 a 394.9 b 15.6Transgenik GS-3 411.8 a 254.4 b 38.2Transgenik GS-4 359.0 b 409.0 a -13.9Transgenik GS-5 544.0 a 351.0 b 35.5
Jumlah daun (lembar) Non-transgenik GS-0 18.0 a 14.5 b 19.4Transgenik GS-1 18.0 a 16.0 b 11.1Transgenik GS-2 18.0 a 15.5 b 13.9Transgenik GS-3 17.0 a 14.0 b 17.6Transgenik GS-4 15.0 a 13.0 b 13.3Transgenik GS-5 18.0 a 14.0 b 22.2
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
Tabel 14 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 78 hari sesudah tanam (HST) terhadap tinggi tanaman, panjang buku dan diameter batang tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.
Lingkungan Peubah dan Geno-
tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan
Tinggi tanaman (cm) Non-transgenik GS-0 185.0 a 85.0 b 54.1 Transgenik GS-1 191.7 a 88.3 b 53.9 Transgenik GS-2 173.0 a 103.3 b 40.3 Transgenik GS-3 183.3 a 111.7 b 39.1 Transgenik GS-4 88.7 a 90.0 b -1.5 Transgenik GS-5 175.0 a 118.3 b 32.4
Panjang buku (cm) Non-transgenik GS-0 4.4 a 2.8 b 35.7 Transgenik GS-1 4.5 a 2.6 b 43.3 Transgenik GS-2 5.3 a 2.9 b 45.6 Transgenik GS-3 4.9 a 2.7 b 45.6 Transgenik GS-4 3.5 a 2.5 b 28.6 Transgenik GS-5 4.5 a 3.2 b 28.2
Diameter batang (cm) Non-transgenik GS-0 1.4 a 1.1 b 19.5 Transgenik GS-1 1.5 a 1.3 b 17.4 Transgenik GS-2 1.6 a 1.2 b 25 Transgenik GS-3 1.6 a 1.1 b 29.2 Transgenik GS-4 1.5 a 1.2 b 23.3 Transgenik GS-5 1.6 a 1.2 b 23.4
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
Tabel 15 Pengaruh cekaman kekeringan pada periode 78 hari sesudah tanaman (HST) terhadap berat kering daun, luas daun dan jumlah daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik.
Lingkungan Peubah dan Geno-
tipe Tembakau Non-cekaman Cekaman Persentase Penurunan
Bobot daun kering (g) Non-transgenik GS-0 20.0 a 12.0 b 40.0Transgenik GS-1 20.0 a 13.3 b 33.4Transgenik GS-2 18.7 a 11.3 b 39.3Transgenik GS-3 19.3 a 12.0 b 37.9Transgenik GS-4 5.0 a 12.0 b -140.0Transgenik GS-5 20.7 a 12.0 b 41.9
Luas daun (cm2) Non-transgenik GS-0 440.3 a 263.0 b 40.3Transgenik GS-1 426.2 a 343.6 b 19.4Transgenik GS-2 415.8 a 347.6 b 16.4Transgenik GS-3 397.3 a 338.9 b 14.7Transgenik GS-4 296.7 a 290.0 b 2.3Transgenik GS-5 517.0 a 340.4 b 34.2
Jumlah daun (lembar) Non-transgenik GS-0 28.0 a 26.7 b 4.8Transgenik GS-1 31.0 a 22.3 b 27.9Transgenik GS-2 31.3 a 24.3 b 22.3Transgenik GS-3 30.0 a 23.3 b 22.2Transgenik GS-4 29.3 a 28.0 b 4.5Transgenik GS-5 30.0 a 22.0 b 26.7
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
A1 B1 A2 B2 A3 B3
A4 B4 A5 B5 A6 B6 Gambar 22 Tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1
dan tembakau GS non-transgenik pada kondisi optimum dan cekaman kekeringan, A1 = Tanaman tembakau non transgenik yang mendapat perlakuan cekaman kekeringan, B1= Tanaman tembakau non transgenik yang tidak mendapat perlakuan cekaman kekeringan, A2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B2= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A3= Tanaman tembakau transgenik GS-2 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B3= Tanaman tembakau transgenik GS-1 yang mendapat perlakuan cekaman, A4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang tidak mendapat perlakuan cekaman, B4= Tanaman tembakau transgenik GS-3 yang mendapat perlakuan cekaman, A5= Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B5=Tanaman tembakau transgenik GS-4 yang mendapat perlakuan cekaman,A6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang tidak mendapat perlakuan cekaman,B6= Tanaman tembakau transgenik GS-5 yang mendapat perlakuan cekaman
0100200300400500600700800900
T0S0 T1S0 T2S1 T3S1 T4S1 T5S1
Galur Tembakau
Pro
lina
u g/
g B
B D
aun
35 HST Stres78 HST Stres
Gambar 23 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi cekaman
kekeringan umur 35 dan 78 HST
0
100
200
300
400
500
600
700
800
T0S0 T1S0 T2S1 T3S1 T4S1 T5S1
Galur Tembakau
Pro
lina
u g/
g B
B D
aun
35 Normal78 Normal
Gambar 24 Kandungan prolina beberapa galur tembakau pada kondisi optimum umur 35 dan 78 HST
Tabel 16 Pengaruh perlakuan cekaman kekeringan pada periode 15-78 hari sesudah tanam (HST) terhadap kandungan prolina daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik. Contoh daun diambil 78 HST
Prolina daun (ug/g bobot basah) Genotipe tembakau
Non-cekaman Cekaman Persentase
Peningkatan Non-transgenik GS-0 404.1 a 790.6 b 95.6
Transgenik GS-1 175.3 a 764.8 b 336.3Transgenik GS-2 692.3 a 778.1 b 12.4Transgenik GS-3 182.9 a 794.9 b 334.6Transgenik GS-4 257.9 a 436.1 b 69.1Transgenik GS-5 580.9 a 782.9 b 34.8
Keterangan: Data rataan pada baris dengan huruf kecil yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
y = 0.1823x - 42.509R2 = 0.1266
0
20
40
60
80
100
120
140
160
700.00 750.00 800.00 850.00 900.00Prolina daun (ug/g BB)
Ting
gi ta
nam
an (c
m)
y = 0.0103x + 4.0548R2 = 0.0477
0
2
4
68
10
12
14
16
720.00 740.00 760.00 780.00 800.00 820.00 840.00 860.00
Prolina daun (ug/g BB)
Ber
at K
erin
g D
aun
(g)
Gambar 25 Regresi antara kandungan prolina daun dari tembakau GS non-
transgenik dan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik R 1, dengan tinggi tanaman dan bobot kering daun per tanaman Kandungan prolina daun ditentukan umur 78 hari sesudah tanam (hst) sedangkan tinggi tanaman dan berat kering daun ditentukan 110 hari setelah tanam (hst). (Δ) tembakau GS-non transgenik, (♦) tembakau GS transgenik P5CS
Analisis regresi antara kandungan prolina dengan tinggi tanaman dan bobot
kering daun per tanaman mengindikasikan adanya kecenderungan meningkatnya
tinggi tanaman dan bobot kering daun sejalan dengan meningkatnya kandungan
prolina daun (Gambar 24). Nilai R2 dari hasil analisis regresi yang dilakukan
sebesar R2 = 0.1266 untuk regresi antara kandungan prolina daun dan tinggi
tanaman serta R2 = 0.048 untuk regresi antara kandungan prolina daun dan bobot
daun kering per tanaman (Gambar 24). Akumulasi prolina dalam jumlah banyak
pada jaringan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS di duga dapat
membuat penyerapan unsur hara dan air oleh akar menjadi lebih efektif sehingga
menyebabkan peningkatan pertumbuhan tanaman R2 yang dievaluasi. Hasil
penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa peningkatan kandungan prolina
sangat berperan dalam osmotic adjustment untuk menjaga agar potensial osmotic
(PO) akar selalu dalam kondisi lebih negatife dari PO air tanah, sehingga air atau
unsur hara tetap dapat mengalir kearah jaringan akar dan tanaman (Bao et al.
1991; Jerez et al. 1991; Martinez dan Moreno 1992; Patil dan Patil 1993; Serraj
dan Sinclair 2002, Riduan et al. 2007)
Indeks sensitivitas terhadap cekaman. Indeks sensitivitas (S) yang
dihitung berdasarkan tinggi tanaman tembakau menunjukkan bahwa tanaman
tembakau non-transgenik di katagorikan peka, sedangkan tanaman R2 zuriat dari
tembakau transgenik P5CS generasi R1 bersegregasi untuk kategori peka, medium
dan toleran Gambar 25, indeks sensitivitas yang dihitung berdasarkan panjang
akar, tanaman tembakau non transgenik termasuk ke dalam kategori medium,
sedangkan tanaman tembakau tansgenik P5CS tergolong ke dalam kelompok
medium dan peka terhadap cekaman kekeringan.
Dari keterkaitan antara nilai indeks sensitivitas dengan tinggi tanaman
tembakau, terlihat bahwa semakin rendah nilai indeks sensitivitas tanaman atau
semakin toleran tanaman terhadap cekaman kekeringan maka semakin tinggi
tanaman yang dimiliki (Gambar 25). Begitu juga dengan panjang akar semakin
rendah indeks sensitivitas tanaman tembakau, semakin toleran tanaman tembakau
terhadap cekaman kekering dan semakin panjang akar yang dimiliki oleh
tembakau, baik tembakau non-transgenik maupun tanaman tembakau transgenic
P5CS.
y = -15.313x + 115.31R2 = 0.1907
0
20
40
60
80
100
120
140
160
-0.5 0 0.5 1 1.5 2
Indeks sensitivitas terhadap stres kekeringan
Ting
gi ta
nam
an (c
m)
y = -16.719x + 62.418R2 = 0.5351
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Indeks sensitivitas terhadap cekaman kekeringan
Pan
jang
aka
r (cm
)
Gambar 26 Keterkaitan antara indeks sensitivitas terhadap cekaman kekeringan
yang dihitung menggunakan data tinggi tanaman dan panjang akar dari tembakau GS non-transgenik (♦) dan transgenic (Ο,♦■). Nilai indeks sensitivitas ≤ 0.5 dikategorikan toleran, diantara 0,5 dan 1 dikategorikan medium, dan >1 dikategorikan peka.
PEMBAHASAN
Pengujian ekspresi gen P5CS sebagai penyandi enzim kunci biosintesis
prolina serta fungsinya dalam mengatasi cekaman kekeringan telah dilakukan
pada tanaman tembakau transgenik yang mengandung gen P5CS generasi kedua.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa cekaman kekeringan yang diberikan pada
periode 15 sampai 78 HST dapat menghambat pertumbuhan semua tanaman yang
diuji. Perlakuan cekaman kekeringan dapat dikategorikan cekaman berat, karena
tanaman dibiarkan tidak didisiram sampai menunjukkan gejala layu hampir 70%
dari setiap populasi tanaman.
Tanaman yang mengalami cekaman kekeringan secara umum mengalami
penurunan bobot kering akar dan tajuk. Keadaan ini mencerminkan adanya
hambatan pertumbuhan akibat cekaman kekeringan. Tanaman yang menghadapi
cekaman kekeringan diduga akan mengecilkan ukuran lubang stomata untuk
mengurangi hilangnya air melalui evaporasi. Akan tetapi, mengecilnya lubang
stomata diduga juga mengurangi masuknya karbon dioksida dan menurunkan
produksi fotosintat sehingga memperlambat pertumbuhan tanaman.
Respon tanaman terhadap cekaman kekeringan juga dengan meningkatkan
kandungan osmolit dalam sel, antara lain dengan mengakumulasi senyawa prolina
(Mundree et al. 2002). Enam kultivar kacang tanah Indonesia yang diuji juga
menunjukkan peningkatan akumulasi senyawa prolina sebagai respon terhadap
cekaman kekeringan (Sudarsono et al. 2004).
Hasil analisa kandungan prolina daun menunjukkan bahwa kandungan
prolina daun tanaman tembakau semakin meningkat dengan semakin
bertambahnya umur tanaman tanaman, baik itu tanaman tembakau transgenik
maupun non transgenik. Kandungan prolina daun tembakau umur 35 HST jauh
lebih rendah dibandingkan tembakau umur 78 HST. Ini menunjukkan bahwa
ekspresi dari pada gen P5CS dipengaruhi juga umur dari tanaman. Kandungan
prolinanya hampir dua kali lebih banyak jika dibandingkan pada umur 35 dan 78
HST.
Hasil pengamatan terhadap kandungan prolina daun tembakau transgenik
generasi R2 ini menunjukkan tingkat perbedaan yang bervariasi antara tanaman
transgenik yang satu dengan yang lainnya, diduga disebabkan oleh segregasi
genetik dari gen P5CS di dalam genom tembakau dan juga konstitusi genetik
dalam kondisi heterozigot atau homozigot serta adanya interaksi dengan faktor
lingkungan sehingga menimbulkan perbedaan tingkat akumulasi prolinanya.
Dari hasil analisis kandungan prolina daun tembakau tanaman R2 zuriat
adanya tanaman tembakau transgenik yang kandungan prolina daunnya lebih
rendah dari tembakau transgenik pada kondisi lingkungan tercekam hal ini diduga
karena adanya feedback inhibition pada gen P5CS dari sel tanaman tembakau
transgenik yaitu terjadinya penghambatan aktivitas enzim P5CS penyandi
biosintesis prolina oleh produk prolina itu sendiri, untuk mengatur akumulasi
prolina di dalam tanaman agar tetap dalam level tertentu. Menurut Hong et al.
(2000), sintesis prolina pada tanaman dalam kondisi cekaman tidak hanya diatur
oleh aktivitas transkripsi gen P5CS, tetapi juga oleh regulasi feedback melalui
produk akhirnya (prolina). Dari hasil penelitian Zhang (1989), menunjukkan
bahwa hasil uji kinetik pada enzim P5CS Vigna aconotifolia di dapat adanya
penghambatan aktivitas P5CS oleh 6 mM Prolina.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, kemampuan tanaman tembakau
transgenik P5CS R2 zuriat dalam mengatasi cekaman kekeringan, diduga masih
sangat berhubungan dengan peningkatan kandungan prolina akibat over-ekspresi
dari gen P5CS penyandi enzim kunci biosintesis prolina.
Pendugaan peranan prolina terhadap peningkatan biomasa tanaman
tembakau transgenik P5CS diperkuat dengan adanya kecenderungan peningkatan
tinggi tanaman dan bobot kering daun dengan meningkatnya kandungan prolina
daun. Hal ini membuktikan bahwa over-ekspresi gen P5CS dalam meningkatkan
kandungan prolina daun, mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman tembakau
melalui peningkatan pertumbuhan akar dan biomasa tanaman.
SIMPULAN
Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat ditarik simpulan, bahwa
cekaman kekeringan dapat meningkatkan kandungan prolina daun baik pada
tanaman tembakau transgenik P5CS R2 zuriat maupun non transgenik, tetapi
peningkatan pada tanaman transgenik jauh lebih tinggi dibandingkan tanaman
tembakau non transgenik. Umur tanaman mempengaruhi kandungan prolina daun
semakin bertambah umur tanaman maka kandungan prolina daunnya juga
semakin meningkat.
VII TOLERANSI TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI R2 YANG MENGEKSPRESIKAN GEN P5CS TERHADAP
CEKAMAN AKIBAT PENYIRAMAN POLIETILEN GLIKOL (PEG)
Abstrak
Percobaan yang dilakukan bertujuan untuk (i) menentukan pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) selama fase pertumbuhan vegetatif (15-60 hari sesudah tanam [hst]) terhadap pertumbuhan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS, (ii) mengevaluasi toleransi lima tembakau GS transgenik terhadap cekaman akibat perlakuan PEG, dan (iii) menentukan kandungan prolina daun lima tembakau GS transgenik dalam kondisi non-cekaman dan cekaman dengan penyiraman larutan PEG dan hubungan antara akumulasi prolina dengan respons tembakau transgenik terhadap cekaman PEG. Bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R0 ditumbuhkan dalam pot plastik (500 ml) yang berisi medium campuran arang sekam:coco pit (1:1). Setelah 15 hari sesudah tanam (HST), bibit diberi perlakuan cekaman dengan penyiraman larutan PEG 6000 pada konsentrasi 0%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5% dan 15% selama periode antara 15 - 60 HST dan tanaman dipanen umur 55 dan 65 HST. Contoh daun untuk analisis kandungan prolina dipanen pada umur 78 HST. Hasil penelitian menunjukkan cekaman dengan penyiraman larutan PEG, dapat menurunkan tinggi tanaman, jumlah daun, luas daun, bobot kering daun, tajuk, biomasa dan akar tembakau GS non-transgenik maupun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R0. Kata kunci : Cekaman kekeringan, biosintesis dan akumulasi prolina, indeks
sensitivitas terhadap cekaman PEG
VII TOLERANCE OF TRANSGENIC TOBACCO EXPRESSING GENE P5CS OF R2 GENERATION AGAINST
STRESS DUE TO POLYETHYLENE GLYCOL (PEG)
Abstract
The objectives of this experiment were (i) to determine the effects of sress due to polyethylene glycol (PEG) treatment during the period of 15 - 78 days after planting (DAP) on growth of R2 plants derived from transgenic GS tobacco carrying P5CS transgene, (ii) to evaluate tolerance of R2 plants derived from five line of transgenic GS tobacco against drought stress, and (iii) to determine their leaf proline content under optimum and under PEG induced stress conditions and their correlation to stress responses. The R2 seedlings derived from five transgenic GS tobacco P5CS were grown individually in plastic pot (500 ml) containing a mixture of rice hull: coco pit medium (1:1). After 15 DAP, seedlings were subjected to stress conditions by drenching them with solution of PEG 6000 at 0%, 2.5%,5%, 7.5%, 10%, 12.5% or 15% concentration for the period of 15 - 78 DAP. The plants were harvested at 78 DAP. Leaf samples for proline content analysis were collected at 78 DAP. Results of the experiment indicated stress due to PEG treatment reduced plant height, leaf number, total leaf width, leaf, shoot, biomass, and root dry weight of all tobacco plants. The R2 plants derived from P5CS transgenic GS tobacco showed better growth and higher plant height, leaf, biomass and root dry weight than that of non-transgenic under stress or non-stress condition. Increased leaf proline content after drought stress was observed in all tobacco transgenic, while less was observed in tobacco non-transgenic.
Keywords: Dehydration cekamans, Proline biosynthesis and accumulation,
sensitivity index against PEG induced stres
PENDAHULUAN
Ketersediaan air merupakan faktor pembatas utama dalam budi daya
tanaman. Pada genotipe tanaman yang toleran terhadap cekaman kekeringan,
penurunan daya hasil akibat cekaman tidak sebesar yang terjadi pada genotipe
peka sehingga penggunaan genotipe yang toleran mempunyai arti penting dalam
budidaya tanaman di lahan kering.
Kondisi cekaman kekeringan dengan potensial air jaringan tanaman
rendah mempengaruhi pertumbuhan tanaman terutama pada kenampakan
morfologi dan perkembangan tanaman, perkembangan sel, fisiologi dan biokimia
(Yoshiba et al. 1997). Pengurangan pemberian air menyebabkan perubahan pola
perkembangan daun bunga matahari. Pada keadaan defisit air menyebabkan luas
daun berkurang dibanding kondisi optimum. Pengurangan luas daun ini
dipengaruhi oleh pengurangan kecepatan pembelahan dan luas areal sel sampai 40
% dibanding tanaman kontrol. Cekaman air menyebabkan pengurangan biomasa
daun dan polong kering kacang tanah (Collino et al. 2000) dan penurunan bobot
kering polong diduga disebabkan oleh proses terhambatnya inisiasi dan
pemanjangan ginofor (Chapman et al. 1993). Pada tanaman kedelai, defisit air
menurunkan luas area dan kandungan klorofil daun (Shimada et al. 1992),
menurunkan ukuran polong, biji, dan bobot kering polong (Pookpadi et al. 1990),
dan menurunkan kualitas biji (Franca-Neto et al. 1993). Cekaman kekeringan
mempengaruhi pula sistem reproduksi tanaman. Herrero dan Johnson (1981)
mempelajari pengaruh cekaman kekeringan pada sistem reproduksi tanaman
jagung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemanjangan rambut jagung (silk)
terhenti pertumbuhan pada potensial air daun kira-kira -9 bar. Gejala morfologi
yang biasa nampak pada tanaman kekurangan air adalah tanaman layu, daun
menggulung, dan kerdil.
Karakter toleransi / ketahanan terhadap kekeringan pada prinsipnya berkait
dengan upaya tanaman untuk menjaga keseimbangan osmotik dengan
meningkatkan penyerapan air dan menurunkan kehilangan air. Penurunan luas
daun merupakan salah satu cara adaptasi tanaman untuk menekan kehilangan air
melalui proses transpirasi (White dan Singh, 1993) dan merupakan salah satu
bentuk respons tanaman menghadapi cekaman kekeringan. Penurunan luas daun
dapat berpengaruh negatif terhadap area fotosintesis sehingga tidak
menguntungkan tanaman. Lebih lanjut, cekaman kekeringan dapat menyebabkan
menurunnya bobot daun segar hingga 12% (Popova et al. 1996).
Pengembangan ketahanan potensial osmotik sel daun dan akar serta
penurunan densitas stomata per luasan permukaan daun merupakan adaptasi
terhadap cekaman kekeringan yang paling menguntungkan (Blum 2004). Dengan
membatasi kehilangan air melalui transpirasi dan menjaga tekanan turgor sel
melalui pengaturan potensial osmotik jaringan, tanaman tetap mampu menyerap
air dalam kondisi cekaman kekeringan dan mampu menjaga pertumbuhan dan
perkembangannya (Gupta 1997).
Cekaman kekeringan menyebabkan respons biokimia atau metabolik pada
tanaman. Karakter metabolik berupa akumulasi prolin pada jaringan tanaman
merupakan karakter untuk toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan.
Peningkatan kandungan prolina yang berfungsi sebagai solut dalam osmotic
adjustment dilaporkan mempunyai peranan penting dalam respons tanaman
terhadap cekaman kekeringan (Slee et al. 1990; Bao et al. 1991). Dengan osmotic
adjustment, tanaman dapat menjaga potensial air daun dan akar yang lebih rendah
dan mempertahankan turgor sel dalam kondisi cekaman kekeringan. Kedua
kemampuan tersebut merupakan indikator sifat tanaman yang toleran terhadap
cekaman kekeringan (Cellier et al. 1998). Berdasarkan hal tersebut, peningkatan
kandungan prolina daun dalam kondisi cekaman kekeringan dapat digunakan
sebagai penduga toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan (Gupta 1997).
Senyawa polietilena glikol (PEG) merupakan senyawa yang dapat
menurunkan potensial osmotik larutan melalui aktivitas matriks sub-unit etilena
oksida yang mampu mengikat molekul air dengan ikatan hidrogen. Penyiraman
larutan PEG ke dalam media tanam diharapkan dapat menciptakan kondisi
cekaman karena ketersediaan air bagi tanaman menjadi berkurang.
Senyawa osmotikum polietilena glikol (PEG) dapat menurunkan potensial
air medium dan penyiraman PEG dalam medium tanam dapat mensimulasikan
kondisi cekaman kekeringan (Saint-Clair 1976). Penggunaan PEG dilaporkan
efektif untuk menapis respons plasma nutfah tanaman terhadap cekaman
kekeringan (Asay dan Johnson 1983). PEG juga telah digunakan untuk menapis
respon tanaman anggur, kacang tanah, kedelai, kubis-kubisan, padi dan sorghum
terhadap cekaman kekeringan (Duncan et al. 1995; Adkins et al. 1995; Dami dan
Hughes 1995; Sunaryo et al. 2002; Adisyahputra 2006). Hasil penelitian
menunjukkan adanya korelasi positif antara toleransi tanaman terhadap cekaman
akibat perlakuan PEG dengan toleransi terhadap cekaman kekeringan (Sunaryo et
al. 2002; Adisyahputra 2006).
Percobaan ini secara umum bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh
cekaman kekeringan terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman R2 zuriat
dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1. Secara khusus, percobaan ini
bertujuan untuk: (1) menguji pengaruh penyiraman PEG terhadap pertumbuhan
dan hasil tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1, (2)
menganalisis akumulasi prolina dalam daun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS
transgenik P5CS generasi R1 pada kondisi cekaman dengan penyiraman larutan
PEG 6000, dan (3) menganalisis hubungan antara akumulasi prolina daun dengan
pertumbuhan dan hasil tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS
generasi R1.
BAHAN DAN METODE
Bibit tembakau transgenik. Benih dari lima nomor tembakau transgenik
P5CS generasi R1 dipanen dari masing-masing nomor tembakau transgenik P5CS
generasi R0 (GS-1, GS-2, GS-3, GS-4, dan GS-5) ditanam dalam medium MS
(Murashige dan Skoog, 1962) dengan penambahan kanamisin 100 mg/l. Jumlah
bibit yang mampu tumbuh dari benih dan yang mati dalam medium dengan
penambahan kanamisin diamati dan digunakan untuk menentukan jumlah
transgen yang terintegrasi dalam genom masing-masing tanaman transgenik R0.
Hanya bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1
yang tumbuh dalam medium yang mengandung kanamisin yang digunakan dalam
percobaan.
Penyiapan bibit tembakau. Bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS
transgenik P5CS generasi R1 dan tembakau GS non-transgenik ditanam dalam pot
plastik (250 ml) berisi medium campuran tanah:pasir:pupuk kandang (2:1:1) dan
diaklimatisasi dalam ruangan yang terkontrol kelembaban (100%) dan
penyinarannya (1000 lux) selama satu minggu. Setelah periode aklimatisasi,
tanaman tembakau dipindah kedalam pot plastik (500 ml) yang berisi medium
campuran arang sekam:coco peat (1:1) dan dipelihara di rumah kaca sampai umur
2 minggu (14 hari). Pemeliharaan yang dilakukan meliputi penyiraman hingga
jenuh setiap pagi dan sore hari.
Pengaruh cekaman PEG terhadap pertumbuhan dan hasil. Setelah
bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 yang
resisten terhadap kanamisin dan bibit tembakau GS non-transgenik disiram
dengan larutan PEG 2.5%,5%, 7.5%, 10%, 12,5% atau 15% hingga 60 HST.
Larutan PEG disiramkan setiap dua hari sekali sebanyak 20 ml per tanaman.
Sebagian tanaman transgenik R2 yang lain disiram setiap hari dengan air (PEG
0%) hingga saat panen dan dijadikan sebagai kontrol.
Unit percobaan terdiri atas 5 bibit tembakau dan untuk setiap perlakuan
diulang 3 kali. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan perlakuan faktorial
dan rancangan lingkungan acak kelompok. Pengamatan dilakukan terhadap tinggi
tanaman, jumlah dan luas daun, rataan panjang buku, bobot daun, bobot tajuk,
bobot akar, dan bobot biomasa kering, serta panjang akar.
Analisis kandungan prolina. Bibit tanaman R2 zuriat dari tembakau GS
transgenik P5CS generasi R1 dengan atau tanpa penyiraman PEG dipanen
daunnya pada umur 78 HST dan dianalisis kandungan prolinanya. Analisis
kandungan prolina daun dilakukan dengan menggunakan metode yang
dikembangkan oleh Bates et al, (1973). Kandungan prolina daun tanaman
tembakau GS non-transgenik dengan atau tanpa penyiraman PEG digunakan
sebagai kontrol.
HASIL
Bibit tembakau transgenik. Populasi tanaman R2 yang diuji dalam
percobaan ini dikecambahkan dari benih R1 yang dipanen dari tanaman
transgenik R0 setelah ditumbuhkan pada medium selektif MS0 yang mengandung
antibiotik kanamisin 100 mg/l. Setelah ditumbuhkan pada medium MS0 selektif
selama 3 minggu, hanya bibit tembakau yang tahan terhadap antibiotik kanamisin
yang digunakan dalam percobaan ini. Hasil analisis segregasi antara bibit yang
resisten dan rentan terhadap kanamisin mengindikasikan bahwa tanaman
transgenik R0 yang didapat mengintrograsikan paling tidak satu lokus nptII
fungsional didalam genomnya (Tabel 17).
Pengaruh cekaman PEG terhadap pertumbuhan dan hasil. Semua
tanaman tembakau yang diuji mampu tumbuh normal pada media coco piet dan
arang sekam. Terdapat beberapa tanaman yang mati, namun kematian tanaman ini
bukan disebabkan oleh kondisi media tumbuh maupun perlakuan PEG, tetapi
lebih disebabkan proses adaptasi tanaman yang kurang maksimal pada tahapan
aklimatisasi dari ruang kultur ke kondisi iklim rumah kaca.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa penyiraman larutan PEG pada
konsentrasi 2.5%,5%, 7.5%. 10%, 12.5% atau 15% sudah memberikan kondisi
cekaman pada tanaman tembakau yang diuji. Penyiraman PEG 2.5%,5%, 7.5%.
10%, 12.5% atau 15% secara umum menurunkan pertumbuhan tanaman tembakau
non-transgenik maupun tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS.
Tabel 17 Segregasi fenotipe bibit R2 yang ditanam dalam medium MS selektif dengan penambahan antibiotika kanamisin 100 mg/l, hasil analisis χ2, dan pendugaan jumlah lokus nptII fungsional yang terintegrasi dalam genom tembakau transgenik.
Segregasi fenotipe bibit R2 dalam MS selektif:
Probabilitas χ2, untuk model segregasi: Nomor genotipe
KanR KanS 3 : 1 13 : 3
Lokus nptII
Transgenik GS-1 128 30 3.376 0.001 1 Transgenik GS-2 119 27 3.653 0.034 1 Transgenik GS-3 136 49 0.146 6.769 1 Transgenik GS-4 96 40 1.186 9.46 1 Transgenik GS-5 91 43 3.223 14.788 1
Keterangan: Penghitungan χ2, dilakukan dengan menggunakan koreksi Yates dan pada α = 0.05.
020406080
100120140160
2.5 7.5 15
% PEG
Kan
dung
an P
rolin
a
AkarDaun
Gambar 27 Menunjukkan bahwa ekspresi pembentukan senyawa prolina lebih banyak di daun daripada di akar tanamn.
Tabel 18 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi 0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 35 HST terhadap tinggi tanaman,bobot akar kering, bobot kering daun,dan panjang akar dari tanaman R1 zuriat tembakau GS transgenik P5CS generasi R2 dan tembakau GS non-transgenik.
Nilai peubah pada konsentrasi penyiraman PEG: Peubah dan genotipe
yang diuji 0% 2.5% 5% 7.5% 10% 12.5% 15% Tinggi Tanaman (cm):
Nontransgenik GS-0 9.83 A 3.00 ED 2.16DEF 2.33 EF 2.20DEF 2.33DEF Transgenik GS-1 8.33 B 2.16DEF 2.06DEF 1.90DEF 1.33DEF 1.80 EF 1.93 EF Transgenik GS-2 8.00ABC 1.63 EF 1.86DEF 1.46DEF 1.73DEF 1.83 EF 1.85 EF Transgenik GS-3 7.33BC 2.33DEF 1.13 EF 1.73DEF 1.50DEF 1.16DEF 1.100DEF Transgenik GS-4 6.33 C 1.06DEF 1.16 EF 0.66 F 0.60 F - 0.85 EF Transgenik GS-5 3.16D 1.83 EF 1.83DEF 1.73DEF 1.16DEF - 1.750DEF
Bobot akar kering (g): Nontransgenik GS-0 0.43ABCDE 0.30ABCDE 0.10E 0.20BCDE 0.15DE 0.15DE 0.15DE Transgenik GS-1 0.46ABCD 0.20BCDE 0.08 E 0.10 E 0.10 E 0.08 E 0.08 E Transgenik GS-2 0.43ABCDE 0.12 E 0.10 E 0.05 E 0.05 E Transgenik GS-3 0.43ABCDE 0.70 ABCD 0.72
ABC 0.06 E 0.41ABCD
E 0.12 E 0.06 E
Transgenik GS-4 0.33 ABCDE 0.21 BCDE 0.81 A 0.09 E 0.49ABCDE 0.06 E
Transgenik GS-5 0.20BCDE 0.05 E 0.18 CDE
0.13 E 0.23BCDE 0.02E
Bobot kering daun (g): Nontransgenik GS-0 0.60 BC 0.43 BC 0.08 C 0.02 C 0.05 C 0.04C 0.08 C Transgenik GS-1 0.50 BC 0.27 C 0.06 C 0.01 C 0.05 C 0.07C 0.10 C Transgenik GS-2 0.50 BC 0.58 BC 0.06C 3.01A 0.08 C 0.09C 0.72 BC Transgenik GS-3 0.40 BC 0.08 C 0.03 C 0.008C 0.05 C 0.03C 0.08 C Transgenik GS-4 0.37 BC 0.09 C 0.013 C 0.001 C 0.001 C 2.00AB 0.705 BC Transgenik GS-5 0.400 BC 0.103 C 0.107 C 0.009 C 0.034 C 0.062 C
Panjang akar (cm): Nontransgenik GS-0 21.667
ABCD 22.667 ABCD
27.333 AB
23.000 ABCD
22.000 ABCD
25.833 AB
18.33 ABCD
Transgenik GS-1 21.333 ABCD
27.667 AB
23.667 ABCD
26.333 AB
15.333 ABCD
26.000 AB
20.00 ABCD
Transgenik GS-2 26.000 AB
19.333 ABCD
24.33 ABC
21.33 ABCD
24.0 ABC
28.0AB 16.33 ABCD
Transgenik GS-3 9.667 ABCD
20.670 ABCD
15.000 ABCDE
18.000 ABCD
26.330 AB
22.000 ABCD
9.250 CDE
Transgenik GS-4 21.330 ABCD
16.000 ABCD
13.330 BCE
8.333 DE
20.330 ABCD
1.000 E
16.670 ABCD
Transgenik GS-5 19.333 ABCD
22.670 ABCD
29.67A 19.33ABD
14.33ABCDE 16.000 ABCD
Keterangan: Data rataan pada kolom dengan huruf kapital yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
Tabel 19 Pengaruh penyiraman polietilena glikol (PEG) dengan konsentrasi 0%,2.5%, 5%,7.5%, 10%,12.5% dan 15% pada umur 55 HST terhadap tinggi tanaman, bobot akar kering, jumlah daun, berat kering daun,dan panjang akar dari tanaman R2 zuriat tembakau GS transgenik P5CS R2 dan tembakau GS non-transgenik.
Nilai peubah pada konsentrasi penyiraman PEG: Peubah dan genotipe
yang diuji 0% 2.5% 5% 7.5% 10% 12.5% 15% Tinggi Tanaman (cm):
Nontransgenik GS-0 12.16 B 1.73 C 2.90 C 3.00 C 2.66 C 1.73 C 2.23 C Transgenik GS-1 13.33 AB 1.60 C 1.50 C 1.50 C 2.27 C 2.17 C 2.50 C Transgenik GS-2 15.50 A 2.13 C 1.63 C 2.50 C 1.63 C 1.70 C 2.03 C Transgenik GS-3 13.33 AB 2.83 C 1.33 C 1.07 C 1.73 C 1.00 C 1.07 C Transgenik GS-4 13.50 AB 1.10 C 1.53 C 1.10 C 1.23 C 1.20 C 1.10 C Transgenik GS-5 14.75 AB 3.50 C 2.13 C 2.00 C 1.90 C 1.77 C
Bobot akar kering (g): Nontransgenik GS-0 0.60 BC 0.04 E 0.12 DE 0.09 DE 0.06DE 0.08 DE 0.12 DE Transgenik GS-1 1.07 A 0.04 E 0.05 DE 0.06 DE 0.05DE 0.10 DE 0.01 E Transgenik GS-2 0.83 AB 0.09 DE 0.06 DE 0.03 E 0.03E 0.04 E 0.12 DE Transgenik GS-3 0.80 AB 0.03 E 0.03 E 0.03 E 0.08DE 0.06 D 0.06 DE Transgenik GS-4 0.40 CD 0.03 E 0.02 E 0.02 E 0.04E 0.02 E Transgenik GS-5 0.65 BC 0.15 DE 0.11 DE 0.08 DE 0.07DE 0.08 DE
Jumlah Daun (lembar): Nontransgenik GS-0 10.66 ABC 8.00DEF 7.00DEF 7.66 DEF 7.33DEF 7.66DEF 7.00EF Transgenik GS-1 10.00 AB 8.33CDE 8.33CDE 7.33 DEF 7.33DEF 8.33CDE 7.00DEF Transgenik GS-2 11.67 A 7.67DEF 7.67DEF 7.33 DEF 7.33DEF 8.00CDEF 7.00DEF Transgenik GS-3 10.67 ABC 7.33DEF 7.00DEF 7.00 DEF 7.33DEF 7.33DEF 7.67DEF Transgenik GS-4 6.67 DEF 5.17F 6.33DEF 7.17 DEF 6.00EF 12.50A 6.33DEF Transgenik GS-5 11.00 AB 9.00BCD 7.33DEF 8.00CDEF 6.67DEF 7.67DEF
Berat Kering Daun (g): Nontransgenik GS-0 1.96 BC 0.16EF 0.300EF 0.23 EF 0.13 EF 0.26EF 0.26EF Transgenik GS-1 2.47 AB 0.13EF 0.133EF 0.17 EF 0.10 EF 0.27EF 0.10EF Transgenik GS-2 3.00 A 0.27EF 0.133EF 0.10 EF 0.17 EF 0.13EF 0.23EF Transgenik GS-3 2.07 BC 0.13EF 0.100EF 0.10 EF 0.20 EF 0.13EF 0.10F Transgenik GS-4 1.33 CD 1.07DE 0.100F 0.43 EF 0.13 EF 2.00BC 0.10F Transgenik GS-5 1.95 BC 0.35EF 0.300EF 0.25 EF 0.20 EF 0.20EF
Panjang Akar cm): Nontransgenik GS-0 26.00
ABCDE 19.00 ABCDEF
26.67 ABCD
24.33 ABCDEF
20.33 ABCDEF1
28.33 ABCD
34.33AB
Transgenik GS-1 31.667 ABC
22.33 ABCDEF
21.00 ABCDEF
20.67 ABCDEF
19.83 ABCDEF
24.00 ABCDEF
17.67 ABCDEF
Transgenik GS-2 33.000 AB
24.00 ABCDEF
16.667 BCDEFG
24.33 ABCDEF
36.67 CDEFG
16.667 BCDEFG
27.67 ABCD
Transgenik GS-3 30.667 ABC
24.67 ABCDEF
20.333 ABCDEF
20.00 ABCDEF
32.00 ABC
21.000 ABCDEF
19.67 ABCDEF
Transgenik GS-4 21.333 ABCDEF
65.00 FG
81.67EFG 10.00 DEFG
10.33 DEFG
10.00G 20.33 ABCDEF
Transgenik GS-5 36.500 A 29.00ABC
36.67CD EFG
22.50 ABCDEF
28.33 ABCD
31.67 ABC
Keterangan: Data rataan pada kolom dengan huruf kapital yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan pada α =0.05.
PEMBAHASAN
Adanya perbedaan respon terhadap penyiraman PEG antara tanaman
tembakau transgenik P5CS R2 zuriat dengan tanaman tembakau non transgenik.
Tanaman tembakau transgenik P5CS cenderung menunjukkan pertumbuhan yang
lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman tembakau non transgenik akibat
perlakuan penyiraman PEG.
Kemampuan untuk menjaga pertumbuhan vegetatif dalam kondisi
cekaman kekeringan juga dikaitkan dengan kemampuan tanaman untuk menjaga
turgor pucuk selama terjadinya cekaman melalui akumulasi senyawa osmolit
tertentu seperti prolina.
Terdapat tanaman tembakau transgenik yang pertumbuhannya lebih
terhambat dibandingkan dengan tanaman tembakau non transgenik akibat
penyiraman dengan PEG, hal ini diduga karena adanya feedback inhibition pada
gen P5CS dari sel tanaman tembakau transgenik.
Perlakuan cekaman kekeringan secara terkontrol pada tanaman dapat
dilakukan dengan penyiraman PEG, karena di dalam air, PEG dapat larut dan
dapat menyebabkan penurunan potensial air secara homogen sehingga dapat
menimbulkan cekaman kekeringan bagi tanaman.
Salah satu respon tanaman terhadap cekaman kekeringan adalah
meningkatkan kandungan osmolit dalam sel, antara lain dengan mengakumulasi
senyawa prolina (Mundree et al. 2002). Ekspresi pembentukan prolina antara
masing-masing organ tanaman berbeda-beda. Hasil pengamatan menunjukkan
bahwa ekspresi pembentukan prolina pertama terjadi di akar, dimana konsentrasi
prolina yang terbentuk di akar lebih tinggi dibandingkan di daun akibat
penyiraman PEG 2.5%, dengan semakin meningkatnya konsentrasi PEG yang
diberikan sampai 15% terjadi ekspresi pembentukan prolina yang lebih tinggi
pada daun ( Gambar 27). Hal ini di duga sampai pemberian PEG 7.5% akar masih
mampu menjaga agar potensial osmotik jaringan tetap berada pada batas-batas
optimum, dengan memproduksi senyawa prolina yang lebih tinggi di bandingkan
prolina yang terbentuk di daun. Kondisi ini menunjukkan bahwa untuk menjaga
keseimbangan osmotik dalam jangka panjang maka tanaman harus mampu
menurunkan laju transpirasi dengan mereduksi biomassa tajuk dan
memakasimalkan penyerapan air melalui peningkatan pertumbuhan akar (Blum
et al. 1997).
Akumulasi prolina bersama senyawa osmolit yang lain dalam sel tanaman
dilaporkan dapat menurunkan potensial osmotik sel ketika tanaman mengalami
cekaman kekeringan (Blum 1996). Dengan demikian tanaman dapat tetap
mempertahankan tekanan turgor sel, penyerapan air dan kelangsungan berbagai
proses fisiologis dalam sel. Akumulasi senyawa osmolit dilaporkan merupakan
respon adaptif terhadap cekaman kekeringan pada berbagai jenis tanaman dan
diyakini berperan dalam proses adaptasi pada lingkungan yang tercekam
kekeringan (Serraj dan Sinclair 2002).
Tanaman tembakau transgenik lebih mampu mempertahankan
pertumbuhannya pada kondisi cekaman kekeringan sampai umur 55 HST, juga
berhubungan dengan panjang akar.
SIMPULAN
Dari hasil pengamatan dan uraian di atas dapat ditarik simpulannya
sebagai berikut:
1. Cekaman kekeringan yang diberikan dengan penyiraman larutan PEG
dapat menghambat pertumbuhan tanaman R2 zuriat dari tembakau GS
transgenik P5CS maupun tembakau non transgenik.
2. Pembentukan senyawa prolina yang tertinggi terjadi di organ daun
tanaman tembakau
VIII PEMBAHASAN UMUM
Perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman cabai dan tembakau,
dilakukan dengan cara pengurangan air yaitu dengan membiarkan tanaman tidak
disiram dalam kurun waktu tertentu sampai menunjukkan gejala layu sementara
70% dari populasi tanaman atau daun/tanaman yang diuji. Dengan munculnya
gejala layu pada daun, maka tanaman tersebut dianggap telah mengalami cekaman
kekeringan dan diharapkan akan mengekspresikan semua kemampuannya secara
genetik untuk mengatasi dampak negatif dari cekaman kekeringan yang terjadi.
Tanaman yang mengalami cekaman kekeringan akan memberikan respon
yang berbeda dalam mengurangi dampak negatif yang ditimbulkan melalui
mekanisme pertahanan yang dimiliki oleh tanaman itu sendiri. Menurut Jones dan
Corlett (1992) mekanisme ketahanan tanaman terhadap cekaman kekeringan
adalah (1) penghindaran terhadap defisit air yang meliputi: a) melepaskan diri dari
cekaman misalnya dengan memperpendek siklus pertumbuhan dan
memperpanjang periode dorman, b) konservasi air pada tanaman yang
diwujudkan dalam bentuk ukuran daun yang kecil, penutupan stomata dan
penyerapan radiasi matahari yang terbatas, c) penyerapan air yang efektif,
diwujudkan dalam bentuk morfologi akar yang memanjang dan tebal, (2) toleran
terhadap defisit air yaitu dengan cara : a) memelihara tekanan turgor, b)
mengaktifkan larutan-larutan pelindung untuk aktivasi enzim-enzim yang toleran
kekeringan, dan (3) mekanisme efisiensi yaitu penggunaan air yang tersedia
secara efisien dan memaksimalkan indeks panen.
Umumnya, respon morfologis tanaman cabai terhadap cekaman
kekeringan yaitu dengan menurunkan BK tajuk, meningkatkan panjang akar dan
mempertahankan BK akar, sedangkan respon fisiologis yaitu dengan
meningkatkan kandungan prolina. Peranan prolina dalam mengatasi dampak
cekaman kekeringan pada cabai, terlihat jelas dengan adanya akumulasi prolina
yang jauh lebih tinggi pada varietas-varietas cabai yang lebih toleran.
Dari percobaan cekaman kekeringan pada fase vegetatif pada lima varietas
unggul nasional cabai (BAB III), cabai var. Tit Super dan Hot Chili digolongkan
ke dalam kelompok peka terhadap cekaman kekeringan memiliki peningkatan
kandungan prolina 646.31 dan 436.28%, sedangkan var. Prabu, Laris dan Jati
Laba yang dikategorikan ke dalam kelompok toleran, hanya memiliki peningkatan
kandungan prolina 305.06, 53.89 dan 12.62% akibat cekaman kekeringan.
Cekaman kekeringan pada fase vegetatif dan generatif pada lima varietas
cabai yang diuji (var.Tit Super, Hot Chili, Prabu. Laris, dan Jati Laba), tidak
didapat satupun varietas yang toleran terhadap kekeringan jika dihitung
berdasarkan indeks sensitivitas berdasarkan bobot dan jumlah buah. Sehingga
program pemuliaan tanaman dalam merakit tanaman cabai yang toleran cekaman
kekeringan terutama pada varietas unggul nasional masih perlu dijadikan
perioritas dalam kegiatan pemuliaan tanaman cabai.
Sifat toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan pada umumnya
dikendalikan secara genetik dengan melibatkan banyak gen (bersifat kuantitatif),
karena tanaman akan menginduksi beberapa gen yang berhubungan dengan
cekaman kekeringan untuk mengantisipasi dampak yang ditimbulkan akibat
cekaman tersebut. Toleransi tanaman terhadap kekeringan, telah terbukti sangat
erat hubungannya dengan peningkatan kandungan asam amino prolina. Gen
tunggal P5CS - penyandi ensim kunci biosintesis prolina sudah dapat diisolasi dan
digunakan pada tanaman contohnya: tanaman tembakau (sebagai tanaman model)
(Kavi Kishor et al., 1995). Melalui rekayasa genetika, gen tunggal P5CS
dimungkinkan dapat ditransformasi ke genom tanaman menggunakan
Agrobacterium.
Teknik penyisipan gen (transformasi gen) akan menghasilkan tanaman
transgenik yang kemudian dapat dimanfaatkan sebagai sumber plasma nutfah atau
langsung diseleksi menjadi galur harapan. Transformasi gen secara in vitro
dengan menggunakan vektor agrobacterium akan berhasil dan bermanfaat apabila
sudah diperoleh protokol regenerasi tanaman yang efisien dan stabil. Kompetensi
untuk beregenerasi yaitu kemampuan membentuk tanaman lengkap (mempunyai
tunas dan akar dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci penting
penentu keberhasilan program transformasi genetik tanaman.
Kultur sel atau jaringan dan sistem regenerasinya memegang peranan yang
sangat penting di dalam aplikasi bioteknologi atau transformasi genetika untuk
program perbaikan tanaman. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai
sistem regerasi yang efisien adalah dengan menentukan parameter penting yang
spesifik pada tanaman (Parrot et al. 1992). Oleh karena itu, sebelum dilakukan
transformasi genetik untuk memperoleh tanaman cabai yang tahan terhadap
kondisi kekeringan diperlukan adanya sistem regenerasi yang efisien dan stabil.
Pada BAB IV telah dilakukan studi regenerasi beberapa genotipe cabai
secara in vitro. Dari tiga belas genotipe cabai yang diregenerasikan secara in vitro,
genotipe yang paling respon untuk perbanyakan secara in vitro adalah Tit Super.
Eksplan daun muda dan hipokotil mempunyai potensi yang sama dalam
kapasitasnya untuk membentuk tunas secara in vitro. Perbedaan respon terutama
disebabkan oleh perbedaan genotipe tanaman (Mahmood et al. 1996). Menurut
hasil penelitiannya, Christopher dan Rajam (1996) melaporkan bahwa eksplan
daun lebih konsisten untuk membentuk tunas dibandingkan dengan eksplan
hipokotil dan kotiledon. Efisiensi tunas tergantung kepada eksplan yang
digunakan (Fari dan Zcako 1980; Zhu et al. 1998).
Di dalam sistem regenerasi tanaman secara in vitro paling tidak tiga faktor
penting yang sangat berpengaruh. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tipe
eksplan dan komposisi media (Moghaieb 1999; Gubis et al. 2003). Media dasar
yang paling banyak digunakan adalah media dasar MS (Murashige dan Skoog
1962).
Berdasarkan hasil penelitian pada BAB IV, kemudian genotipe cabai yang
respon perbanyakan secara in vitro digunakan sebagai sumber eksplan untuk
introduksi gen P5CS ke dalam genom cabai guna mendapatkan galur cabai yang
tahan terhadap cekaman kekeringan.
Introduksi gen P5CS ke genom tanaman cabai, telah berhasil dilakukan
dan diperoleh 67 (enam puluh tujuh) nomor tanaman transgenik P5CS generasi
T0. Hasil PCR menunjukkan adanya pita pada ukuran 250 KB baik pada plasmid
maupun pada sel tanaman cabai yang tahan terhadap kanamisin. Tampak bahwa
gen nptII telah positif berada dalam genom tanaman cabai. Gen nptII yang
merupakan gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin diamplifikasi
menggunakan primer spesifik nptII.
Regeneran yang diperoleh setelah introduksi gen P5CS ke dalam genom
cabai cv. Tit Super memperlihatkan morfologi daun yang lebih besar
dibandingkan dengan daun dari tanaman cabai kontrol, ini diduga karena gen
P5CS merupakan enzim kunci dalam pembentukan senyawa prolina, diketahui
bahwa senyawa prolina merupakan salah satu senyawa yang bersifat osmolit di
dalam sel, dimana salah satu fungsinya sebagai homeostasi atau keseimbangan
ionik yang bertujuan untuk mempertahankan konsentrasi ion di tingkat seluler,
jaringan dan organ tanaman.
Ekspresi gen P5CS pada tanaman cabai transgenik diketahui dapat
meningkatkan kandungan prolinanya. Prolina akan terakumulasi di dalam
jaringan tanaman apabila tanaman tersebut mengalami cekaman kekeringan atau
pada keadaan cekaman salinitas tinggi. Widyasari dan Sugiyarta (1997)
menyatakan dalam keadaan normal, prolina yang dihasilkan bersifat umpan balik
dan karena kehadiran air, prolin akan dioksidasi kembali menjadi asam glutamat.
Oleh karena itu dalam kondisi normal konsentrasi prolina akan selalu rendah.
Pada kondisi cekaman kekeringan oksidasi prolina akan dihambat sehingga
produksi prolina akan bertambah dan dengan adanya gen P5CS produksi prolina
semakin meningkat karena enzim P5CS memicu katalisis glutamat menjadi
prolina. Oleh karena itu adanya akumulasi prolina dapat menjadi indikator
tanaman yang toleran terhadap kekeringan ..
Hasil analisis kandungan prolina pada cabai transgenik dan non transgenik
menunjukkan adanya variasi yang cukup tinggi. Kadar prolina yang bervariasi ini
kemungkinan disebabkan masuknya transgen P5CS ke dalam genom tanaman
terjadi pada intensitas dan posisi yang berbeda. Hal ini menyebabkan ekspresi
transgen P5CS dari masing-masing planlet cabai transgenik berbeda pula.
Dari hasil percobaan terhadap pengamatan pertumbuhan dalam kondisi
media tumbuh non-cekaman (BAB V), tembakau GS transgenik P5CS
menunjukkan pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan tanaman tembakau GS
non-transgenik. Ini membuktikan bahwa over-ekspresi gen P5CS mampu
meningkatkan pertumbuhan tanaman melalui peningkatan kandungan prolina
yang berperan sebagai osmoregulasi dan osmoprotektan. Prolina dapat berperan
dalam menjaga potensial osmotik (PO) akar agar tetap dalam kondisi yang lebih
negatif dari PO media tumbuh, sehingga diduga kondisi ini dapat meningkatkan
daya serap akar terhadap molekul air maupun unsur hara dan menyebabkan
peningkatan produksi biomasa tanaman.
Perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman R2 zuriat dari tembakau GS
transgenik P5CS generasi R1 dengan pengurangan air (BAB V) menunjukkan
bahwa semua tanaman tembakau yang diuji (tembakau transgenik P5CS dan non-
transgenik) mengalami penghambatan pertumbuhan yang nyata akibat cekaman
kekeringan pada periode umur 15 s/d 90 HST. Namun tanaman R1 zuriat dari
tembakau GS transgenik P5CS generasi R0 pada kondisi cekaman kekeringan
tersebut masih menunjukkan keragaan yang lebih baik dibandingkan tembakau
GS non-transgenik. Peningkatan kandungan prolina yang tinggi juga terlihat pada
tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R0, hal ini
membuktikan bahwa peningkatan akumulasi prolina akibat over-ekspresi gen
P5CS mampu mengurangi dampak negatif akibat cekaman kekeringan pada
tanaman. Hasil perhitungan indeks sensitivitas terhadap cekaman kekeringan,
tanaman R2 zuriat dari tembakau transgenik P5CS generasi R1.
Tanaman R2 zuriat dari tembakau GS transgenik P5CS generasi R1 yang
telah diuji cekaman kekeringan dengan cara pengurangan air, perlu diuji kembali
dengan cekaman kekeringan secara lebih terkontrol melalui pemberian berbagai
konsentrasi larutan PEG (BAB VI). Semakin berat tanaman tembakau mengalami
cekaman kekeringan, maka semakin besar pula kandungan prolina yang
terakumulasi pada tanaman.
IX SIMPULAN DAN SARAN UMUM
A. Simpulan Umum
1. Cekaman kekeringan mempengaruhi pertumbuhan tanaman cabai, baik
vegetatif maupun generatif.
2. Penurunan produksi cabai akibat perlakuan cekaman kekeringan ( cv.Tit Super 25.33%, Jati Laba 47.72%, Hot Chili 25.74%, Laris 52.63% dan Prabu 50.83%)
3. Varietas cabai Tit Super adalah varietas yang respon untuk perbanyakan
secara in vitro, dengan didapatkan varietas cabai yang respon perbanyakan secara in vitro ini dimungkinkan dilakukan rekayasa genetika untuk cabai.
4. Introduksikan gen P5CS dengan bantuan Agrobacteriun telah berhasil
dilakukan ke dalam genom cabai, dibuktikan dengan hasil PCR primer spesifik nptII 250 bp.
5 Pengujian tanaman model tembakau yang telah mengandung gen P5CS
terhadap cekaman kekeringan di rumah kaca menunjukkan bahwa tanaman transgenik lebih tahan terhadap cekaman kekeringan dengan mengakumulasikan pembentukan prolina yang lebih tinggi dibandingkan tanaman non transgenik.
6. Umur tanaman yang bertambah juga meningkatkan pembentukan senyawa
prolinanya. 7. Senyawa prolina yang terbentuk di setiap organ tanaman tidak sama,
dimana pembentukannya yang banyak terjadi di daun. B. Saran Umum
1. Rekayasa genetika cabai dapat dilakukan dengan menggunakan cabai cv. Tit Super, karena varietas ini respon untuk perbanyakan secara in vitro, dengan menggunakan eksplan daun muda.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk tahap aklimatisasi planlet
cabai.
DAFTAR PUSTAKA
Adisyahputra. 2006. Karakterisasi Dan Pewarisan Sifat Toleransi Terhadap
Cekaman Kekeringan Pada Kacang Tanah (Arachis Hypogaea L.). Disertasi S3. Prog. Studi Agronomi. Fak. Pertanian. IPB. Bogor
Adkins SW, Kunanuvatchaidah. R, dan Godwin. ID. 1995. Somaclonal variation in rice-drought tolerance and other agronomi characters. Aust.J.Bot. 43:201-209
Alberte RS, Thornber JP, Fiscus EL. 1977. Water stress effects on the content and organization of chlorophyl and bundle sheath chloroplast of maize. Plant Physiol. 59:351-352.
Agrawal SN, Chandra, Kotahri DL. 1989. Plant regeneration in tissue cultures of pepper (Capsicum annum L. cv. Mathania). Plant Cell Tissue Organ Culture, 16;47-55
Arroyo R, Reville A. 1991. In vitro plant regeneration from hypocotil and cotyledon segments in two bell pepper cultivars. Plant Cell Rep. 10:414-416
Asay KH, Johnson DA. 1983. Breeding for drought resistance in range grass. Iowa State J. of Research. 57(4) : 441-455
Bates LS, Waldren RP, Teare ID. 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and Soil 39: 205-207.
Bao JS, Yang CS, Xue JQ, Hao YC. 1991. The effect of water stress during Different growth periods of maize on its physiological characteristics. Acta Agronomica Sinica, 17 (4) : 261-266.
Blum. A. 1996. Crop responses to drought and the interpretation of adaptation Plant Growth Reg. 20:135-148.
Blum A. 2004. Drought stress and its impact. www.fao.org/ag/agp/agpc/doc/services /pbn/pbn
Bennet J. 1993. Genes for crop improvements. Genet. Eng. 16:93-113
Berke TG. 2002a. Hybrid Seed Production in Capsicum Di dalam: Basra AS, editor. Hybrid Seed Production in Vegetable: Rationale and Methods in Selected Crops. New York: Food Products Press. Hlm.49-67
Berke TG. 2002b. The Asian Vegetable Research and Development Center Pepper Project. Di dalam Proceeding of The 16th International Pepper Conference; Tampico, Tamaulipas, 10 – 12 Nov. 2002. www.world-pepper.org/ipc2002/proceedings/the asian research.pdf. [1 Sep. 2005]
Binns AN. 1990. Agrobacterium-mediated gene delivery and biology of host limitations. Physiologia Plantarum. 79:135-139
Boulter ME, McDonnel, Wright RC, Carnes, Shirsat MG. 1990. Transformation of Brassica napus L. (oilseed rape) using Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes; a comparison. Pant Science. 70:91-99
Boslan PW. 1994. Chiles: history, cultivation, and uses. P.347-366. In: G. Charalambous (ed.), Spices, herbs, and edible fungi. Elsevier Publ., New York.
Bosland PW, Votata EJ. 2000. Peppers: vegetables and spice Capsicums. Cabi Publishing. New York.
Bray EA. 1997. Plant responses to water defisit. Trend in Plant Science 2(2):48-54
Cellier FG, Conejero JC, Breitler, Casse F. 1998. Molecular and physiological Responses to water deficit in drought-tolerant and drought-sensitive lines of Sunflower. J. Plant Physiol. 116 : 319-328.
Chabaud, Passiatore M, Canon JE, Buchanan-Wollaston V. 1988. Parameters affecting the frequency of kanamycin resistan alfalfa obtained by Agrobacterium tumafaciens mediated transformation. Plant Cell Report 7:512-516
Chapman SC, Ludlow MM, Blamey FPC, Fischer. KS. 1993. Effect of drought pod filling on utilization of water and growth of cultivars of groundnut (Arachis hypogaea L.). Field Crops Research Vol. 32 (3-4). p. 243-255.
Chrispeels MJ, Maurel C. 1994. Aquaporins: The molecular basis of facilitated water movement through living plant cells. Plant Physiol. 105: 9-13
Christopher T, Rajam MV. 1996. Effect of genotype, explant and medium on in vitro regeneration of red pepper. Plant Cell Tissue Culture. 46:245-250.
Collino DJ, Dardanelli JL, Sereno R, Racca RW. 2000. Physiological responses of argentine peanut varieties to water stress. Water uptake and water use efficiency. Field Crop Res 68:133-142
Conner AJ. 1997. Genetically engineered crops, enviromental dan food safety issue. The Royal Society of New Zealand, Wellington. 34p.
Crowe JJ, Crowe LM, Carpenter JF, Aurell CW. 1987. Stabilization of dry phospholipid bilayers and proteins by sugar.Biochem. J. 242: 1-10.
Dami I, Hughes HG. 1997. Effect of PEG-induced water stress on in vitro hardening of ‘valliant’ grape. Plant Cell Tiss Org Cult 47:97-101.
Day AG, Lichtenstein CP. 1990. Plant Genetic Transformation. In: Fowler MW, Warren GS, Mooyoun M, (eds.). Plants Biotechnology. Pergamon Press. Tokyo. 152-177
Delauney AJ, Verma DPS. 1993. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant J 4:215-233.
Departemen Pertanian, Dirjen Produksi Hortikultura dan Aneka Tanaman. 2000. Informasi Hortikultura dan Aneka Tanaman Indonesia. Jakarta. DEPTAN. Jakarta. 56 hal.
D’Hallluin K, Botterman J, De Greef W. 1990. Engineering of herbicide resistant alfalfa and evaluation under field conditions. Crop Sci. 30:866-871
Dingkuhn M, Cruz RT, O'Toole JC, Turner NC Doerffling K. 1991. Responses of seven diverse rice cultivars to water deficits. Accumulation of abscisic acid and proline in relation to leaf water-potential and osmotic adjustment. Field Crops Res. 27:103-117.
Direktorat Jendral Bina Produksi Hortikultura. 2001. Produksi Tanaman Sayuran, Buah-buahan, Hias, dan Obat di Indonesia Tahun 2000. Dirjen Bina Produksi Hortikultura. Jakarta. 94 hal.
_____________________________________. 2007. Perkembangan luas panen sayuran tahun 1996-2005. [terhubung berkala]. http://www.deptan.go.id. [14 Desember 2007]
Duncan RR, Waskom RM, Nabors MW. 1995. In vitro sreening and field evaluation of tissue-culture-regenerated sorghum (Shorhum bicolor (L.) Moench.) for soil stress tolerance. Euphytica 85:373 – 380.
Duriat AS. 1996. Cabai Merah: Komoditas, Prospek dan Andalan. Di dalam Duriat AS, Hadisoeganda AWW, Soetiassa TA, Prabaningrum L, editor. Teknologi Produksi Cabai Merah. Lembang:Balitsa. Hal. 20-27
Ebida AI, Hu CY. 1983. In vitro morphogenetic responses and plant regeneration from pepper (Capsicum annuum L. cv. Early California Wonder) seedling explanlts. Plant Cell Rep. 13:107-110.
Everett, Robinson NP, Robinson KEP, Mascarenhas D. 1987. Genetic engeneering of sunflower (Helianthus anuus L.). Biotechnology. 5:1201-1204
Fari M, Zcako M. 1981. Relationship between position of morphogenetic response and regeneration of muskmelon plants. Plant Cell Rep. 9:160-164.
Fischer RA, Maurer R. 1978. Drought resistance in spring wheat cultivars: I. Grain yield responses. Aust J Agric Res 29: 897-912.
Franca-Netto JB, Kryzanowsky FC, Henning AA, West SH, Miranda LC. 1993. Soybean seed quality as affected by shriveling due to heat and drought stress. Environ Exp Bot 43:227-237
George EF, Sherington P. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegenic Pub. Ltd. Englan. 709 p.
Gelvin SB. 1990. Crown gall disease and hairy root disease. A. Sledgehammer and A. Tackhammer. Plan Physiol. 92:281-285
Girousse C, Bournoville R, Bonnemain JL. 1996. Water deficit-induced changes in concentrations in proline and some other amino acids in the phloem sap alfafa. Plant Physiol 111: 109-113.
Graham J, McNicol RJ, Kumar A. 1990. Use of the GUSO-gene as seletable marker of Agrobacterium mediated transformation of Rubus. Plant Cell. Rep. 8:274-277
Greenleaf WH. 1986. Pepper breeding. Di dalam Basset M.J., Editor. Breeding Vegetable Crops. The AVI Publishing Co. Westport, Connecticut: hlm 67-134.
Green SK. 1996. Viruses of pepper other than leaf curl virus. Protocol of Screening Virus Resistance on Pepper. AVRDC. 20 hal.
Greenberg BM, Glick. 1993. The use of recombinant DNA technology to produce genetically modified plants. Pp: 1-10. In D. Gierson (Ed.) Methods in plant molecular biology and biotechnology. CRC Press, Inc. New York.
Gresshoff PM, Doy CH. 1972. Development and differentitation of haploid Lycopersicon esculentum (tomato). Planta 107: 161-170.
Gubis J, Laichova, Farago J, Jurekova S. 2003. Effect of genotype and eksplant type on shoot regeneration in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Biologia Bratislava 59/3: 405 - 408
Gunawan LW. 1987. Teknik kultur Jaringan. Lab Kultur jaringan tanaman. PAU Bioteknologi IPB. Bogor. 244 hal.
Gunay AL, Rao PS. 1978. In vitro plant regeneration from hypocotil and cotyledon explants of red pepper (Capsicum). Plant Sci. Lett. 11:365-372
Gupta, US. 1997. Crop Improvement Stress Tolerance.Vol. 2. Science Publisher, Inc. USA.
Handa S, Hamada AK, Hasewaga PM, Bressan RA. 1986. Proline accumulation and adaptation of cultured plant cells to water stress. Plant Physiol. 80:938-945.
Hanson AD, Nelsen CE, Pedersen AR, Everson EH. 1979. Capacity for proline accumulation during water stress in barley and its implications for breeding for drought resistance. Crop Sci 19:489-493.
Herman M. 1996. Rekayasa genetika untuk perbaikan tanaman. Bul. Agrobio 1(1):24-34
Hyde CL, Phillips GC. 1996. Silver nitrate promotes shoot development and plant regeneration of pepper (Capsicum annuum L.) via organogenesis. In Vitro Cell Dev. Bio. 32:172-180
Hooker TS, Thorpe TA. 1997. Effect of water deficit stress on the developmental growth of excised tomato roots cultured in vitro. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant 33:245-251.
Hong ZL, Zhang LK, Ming Z, Verma DPS, Hong ZL, Zhang ZM. 2000. Removal of feedback inhibition of delta 1 pyrrolyne 5 carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress. Plant Physiol. 122:1129-1136
Hoykaas. PJJ. 1988. Agrobacterium moleculer genetics. Plant Mol.Biol.Manual A4:1-13.
Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS. 1992. A bifunctional enzyme (delta1-pyrroline- carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants. PNAS 89: 9354-9358
Hu H. 1985. Use of haploid in crop improvement. In Biotechnology in International Agriculture Research. Proceeding of The Inter-Center seminar on International Agriculture Reseacrh Centers (IARCs) and Biotechnology, IRRI, Philippines, 23-27 April 1985. IRRI. Manila Philippines, pp. 75-84.
Hu H, Zeng JZ. 1984. Development of new varietas via anter culture. Dalam: Ammirato PV, Evans DA, Sharp WR, Yamada Y editor. Handbook of plant cell culture. Volume 3. Macmillan Publishing company. New york. P 65-85.
[IISR] India Institute og Spices Research. 2006. Chillipeppers Database Varities. http://www.iisr.org/spices/chilli.php (2 Feb 2006).
Ingram. J, dan Bartels. 1996. The molecular basis of dehydration tolerance in plant. Ann. Rev. Physiol. Mol. Biol. 47.,377-403.
Irigoyen JJ, Emerich DW, Sanchez_Diaz M. 1992. Water stress induced changes in concentrations of praline and total soluble sugars in nodulated alfalfa (Medicago sativa L.) plants. Physiol Plant 84:55-60
Jensen AB, Busk PK, Figueras M, Alba MM, Peraccia G, Messeguer R, Goday A, Pages M. 1996. Drought signal tranduction in plant. Plant Growth Reg. 20: 105–110.
Jerez E, Torres W, Del’Amico J, Morales D. 1991. Physiological and Biochemical indicators in potato crops in response to water stress. Cultivos
Jones HG. 1981. Plants and Microclimate. A Quantitative approach to Enviromental Plant Physiology. Second edition. Cambrige University Press. 265-295.
Jones HG, Corlett JE. 1992. Current topics in drought physiology. J. of Agric. Sci. 49: 291-296
Kato R, Matsumoto M, Shimoda Y, Yamasaki S, Shimamura F. 1996. Effect of culture conditions on in vitro induction of adventitious bud from leaf Agric. Okayama University. 85:39-44
Kavi Kishor. PB, Hong Z, Miao GH, Hu, CA, Verma DPS. 1995. Overexpression of delta- pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol. 108: 1387-1394
Kim YH, Janick J. 1991. Absisic acid and proline improve desiccation tolerance and increase fatty acid content of cerely somatic embryos. Plant Cell Tiss Org Cult 24: 83-89. Kirkham MB. 1990. Plant responses to water deficits. Pp. 323-342. In B.A.
Stewart and D. R. Nielsen (ed.) Irrigation of Agricultural Crops. Madison, Wisconsin USA.
Kramer PJ. 1983. Water relations of plants. Academic Press, Inc.
Kuznetsov VV, Shevyakova NI. 1997. Stress responses of tobacco cells to hight temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides. Physiol Plant. 100:320-326.
Levitt. J. 1980. Responses of plants to enviromental stresses: Water, radiation, salt, and other stresses. Vol. II. Academic Press. New York-London-
Toronto-Sydney-San Francisco.
Loggini B, Scartazza A, Brugnoli E, Navari-izzo F. 1999. Antioxidative defense system, pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected to drought. Plant Physiol 119:1091-1100.
Lusdorf MM, Rempel H, Jackson JA, Baliski DS, Hobbs SLA. 1991. Optimizing the production of transformed pea (Pisum sativum L.) callus using disarmed Agrobacterium tumefaciens strain. Plant Cell. Rep. 9:479-483
Madan S, Nainawatee HS, Jain RK, Chowdhury JB. 1995. Proline and proline metabolising enzymes in vitro selected NaCl-tolerant Brassica juncea L. under salt stress. Annals of Botany 76: 51-57.
Maestri M, Da Matta FM, Regazzi AJ, Barros RS. 1995. Accumulation of proline and queternary ammonium compounds in mature leaves of water stressed coffee plants (Coffea arabica and C. canephora). J. Hort. Sci. 70(2):229-233.
Mahmood M, Atan Z, Kow CW. 1995. Studies on tissue culture of different chilli cultivar ( Capsicum annuum L.). Asia Pasifik J. Molec. Biol. Biotech. 3:96-105
Mali PC, Mehta SL. 1977. Effect of drought on enzymes and free proline in rice varieties. Phytochemistry 16: 1355-1357.
Martinez CA, Moreno U. 1992. Physiological expressions of drought resistence In potato cultivsars subjected to water stress under field conditions. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 4 (1) : 33-38.
Masyhudi MF, Petterson RP. 1990. The effect of water stress on nitrogen absorption of soybean. Ind J Crop Sci 42:43-63
Mc Cue KF, Hanson AD. 1990. Drought and salt tolerance: towards understanding and application. Trends Biotechnol. 8: 358-362.
Michel BE, Kaufmann MR. 1973. The osmotic potential of Polyethylene glycol 6000. Plant Physiol. 57 : 914-916.
Mitra J. 2001. Genetics and genetic improvement of drought resistance in crop plants. Current Sci. 80:758-763.
Mullet JE, Whitsitt MS. 1996. Plant celluler responses to water deficit. Plant Growth Reg. 20:119-124.
Mundree SG et al. 2002. Physiolocal and molecular insight into drought tolerance. African J Biotechnol 1(2):28 – 38
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15:473-497
Murashige, T, Eriksson T. 1998. A revised medium for rapid growth and biossay with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15:473-497.
Messiaen CM. 1992. The Tropical Vegetable Garden. ICTA Macmillan. Hal: 234-245.
Moghaieb REA, Saneoka H, Fujita K. 1999. Plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explant of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Soil Sci Plant Nutr 45: 639-646
Nambara E, Kawaide H, Kamiya Y, Naito S. 1998. Characterization of Arabidopsis thaliana mutans has a defect in ABA accumulation : ABA-dependent and ABA-independent accumulation of free amino acid during dehydration. Plant Cell Physiol. 39:853–958.
Naiola P, Syarief F. 1996. Analisa tata air pada dua spesies gulma babadotan (Ageratum conyzoydes L.) dan nampong (Clibadium surinamense L.) dalam hubungannya dengan daya adaptasi terhadap stres air dan salinitas. Hlm. 49-54. Dalam Prosiding Konperensi XIII HIGI, 5-7 November 1996, Bandar Lampung.
Nguyen HT, Babu R, Blum A. 1997. Breeding for drought resistance in rice: Physiology and molecular genetics considerations. Crop Sci. 37:1426-1434.
Notle KD, Hanson AD, Gage DA. 1997. Proline accumulation and methylation to proline betaine in citrus: Implication for genetic engineering of stress resistance. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 122(1):8-13.
Ober ES, Sharp RE. 1994, Proline accumulation in mazie (Zea mays L.) primary roots at low water potentials. Plant Physiol 105:981-987.
Ochoa-Alejo N, Garcia BMAR. 1992. Morphogenetic responses in vitro of hypocotyls tissue of chili pepper (Capsicum annuum L.) to growt regulators. Turrialba. 40:311-318
Patil NA, Patil TM. 1993. Physiological responses of groundnut genotypes to water stress. Legume Research, 16 (1-2) : 23-30.
Parrot WA, Bailey MA, Durham RE, Mathews HV. 1992. Tissue culture and genotype independent. Di dalam: Moss JP (Ed.) Biotehnology and Crop Improvement in Asia. International Crops. Research Institute for Semi-Arid Tropics. Patancheru, Andhra Pradesh 502 324, India. hal 115-148
Perez-Molphe-Balch EM et al. 1996. Effects of water stress on plant growth and root proteins in three cultivars of rice (Oryza sativa) with different levels of drought tolerance. Physiol Plant 96: 284–290.
Pierik RLM. 1987. Culture of Higher Plants. Boston. Dordrecht, Lancaster: Martinus Nijhoff Publishers. 344 hal.
Philips GC, Hubstenberger F. 1985. Organogenesis in pepper tissue culture. Plant Cell Tissue Organ Culture. 4:261-269.
Phillips GC, Collin GB. 1979. In vitro tissue culture of selected legumes and plant regeneration from callus cultures of red clover. Crop Sci. 19:59-64
Pookpadi A, Thiravirojana K, Saeradee I, Chaikaew S. 1992. Response of new soybean accessions to water stress during reproductive phase. Kasetsart J Nat Sci 24:378-387
Potts M. 1994. Desiccation tolerance in prokaryotes. Microbiol. Rev. 58: 755-805.
Popova LP, Tsonev TD, Lazova GN, Stoinova ZG. 1996. Drought and ABA-induced change in photosynthesis of barley plants. Physiologia Plantarum 96 : 623-629.
Puonti-Kaerlas J, Stabel P, Eriksson T. 1989. Transformation of pea (Pisum sativum L.) by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 8:321-324
Prasad PVD, Potluri SDF. 1996. Influence of proline and hydroxyproline on salt-stresses axillary bud cultures of two varieties of potato (Solanum tuberosum). In Vitro Cell Dev Biol Plant 32: 47 – 50.
Pruvot G, Massimino J, Peltier G, Rey P. 1996. Effect of low temperatur, high salinity and exogenous ABA on the synthesis of two chloroplastic drought-induced protein in Solanum tuberosum L . Physiol. Plantarum 97: 123–131
Riduan A, Sudarsono. 2004. Toleransi kultivar kacang tanah terhadap stres kekeringan pada fase vegetatif serta kandungan prolin dan gula total daun, di dalam: Sudarsono, Aswidinnoor H, Widodo (ed) Rekayasa genetika dan seleksi in vitro untuk mendapatkan plasma nutfah kacang tanah dengan novel characters – toleran stres kekeringan dan resisten penyakit busuk batang Sclerotium. Hlm 190-191.
Riduan A, Santoso J, Utomo SD, Sudarsono. 2007. Hubungan antara ekspresi gen P5CS dengan pertumbuhan dan hasil biomasa tembakau transgenik dalam kondisi non-stres. Agrotropika 12: 1-9
Rubatzky VE, Yamaguchi M. 1997. Word Vegetable, Principles, Production and Nutritive Value. Ed. Ke-2. London: Chapman and Hall.
Rukmana R, 1996. Usaha Tani Cabe Hibrida Sistem Mulsa Plastik. Yogyakarta. Kanisius. 91 hal.
Saint-Clair PM. 1976. Germination of Shorgum bicolor under polyethylene glycol induced stress. Can. J. Plant Sci. 56:21-24.
Sarkar RK. 1993. Effect of water stress on proline accumulation and its association with certain biochemical characters in soybean. Indian Journal of Plant Physiology 36: 184-186.
Savin R, Nicolas ME. 1996. Effect of short periods of drought and high temperature on grain growth and starch accumulation of two malting barley cultivas. Aust. J. Plant Physiol. 23:201-210.
Sharp, RE. 1994. Comparative sensitivity of root and shoot growth and physiology to low water potentials. Monogaph British Soc. Plant Growth Reg. 21:13-27.
Shimada S, Kokobun M, Shibada H, Matsui S. 1992. ffect of water supply and defoliation on photosynthesis, transpiration and yield of soybean. Japanese J Crop Sci 61:264-270
Slee NJD, Bryant JA, Smirnoff N, Smith BG. 1990. The effect of water deficit and ABA on protein synthasis in sunflower (Helianthus annuus) . Monograph British Society for Plant Growth Regulation, 21 : 332-333.
Sloane RJ, Patterson RP, Carter TE. 1990. Field drought tolerance of a soybean plant introduction. Crop Sci. 30: 118-123.
Steudle E, Frensch J. 1996. Water transport in plants: Role of the apoplast. Plant Soil 187: 67-79
Sudarsono, Aswidinnoor H, dan Widodo. 2006. Rekayasa genetika dan seleksi in vitro untuk mendapatkan plasma nutfah kacang tanah dengan novel characters – toleran stres kekeringan dan resisten penyakit busuk batang Sclerotium. Laporan Hibah Pasca Angkatan I. Direktorat Penelitian Dan Pengabdian Pada Masyarakat.Dirjen. Dikti. Departemen Pendidikan Nasional.
Sunaryo W. 2002. Regenerasi dan evaluasi variasi somaklonal kedelai (Glycine max (L) Merr.) hasil kultur jaringan serta seleksi terhadap cekaman kekeringan menggunakan simulasi polyethilene glycol (PEG). [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Setiadi. 2004. Bertanam cabai. Penebar Swadaya. Jakarta. 183 hal
Siregar, EBM. 1999. Transformasi Genetika dan Regenerasi Tanaman Cabai Transgenik (Capsicum annuum L.). Disertasi. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 105 hal.
Serraj R, Sinclair TR. 2002. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? Plant Cell Environ 25:333-342.
Taychasinpitak T, Taywiya P. 2003. Specific Combining Ability of Ornamental Pepper (Capsicum annuum L.). Kasetsart J 37:123-128.
Valera-Montero LL, Ochoa-Alejo N. 1992. A. Novel aproach for cilli pepper (Capsicum annuum L.) plant regeneration : shoot induction in rooted hypocotyls. Plant Sci. 84:215-219
Vallejo, P.R. dan J.D. Kelly. 1998. Traits related to drought resistance in common bean. Euphytica 99:127-137
Vieira RD, Tekrony DM, Eglia DB. 1992. Effect of drought and defoliation stress in the field on soybean seed germination and vigor. Crop Sci 32:471-475
Walton EF, Podivinsky E, Wu RM, Reynolds PHS, Young LW. 1998. Regulation of proline biosynthesis on kiwifruit buds with and without hydrogen cyanamide treatment. Physiol Plant. 102:171-178.
Wang Z, Quebedeaux B, Stutte GW. 1995. Osmotic adjustment : effect of water stress on carbohidrates in leaves, steams and roots of apple. Aust. J.Plant Physiol. 22:747-754.
Watimena, GA. 1992. Bioteknologi Tanaman. Pusat Antar Universitas. Institut Pertanian Bogor.
White JW, Singh SP. 1993. Breeding to adaptation to drought. In Schoonhover, A.V. dan O.Vogsest (eds), Common Beans :Reseanch for Crops Improvement Centro Intematioanl de Agricultura Tropical Columbia.
Widyasari WB, Sugiyarta E. 1997. Akumulasi prolin dalam jeringan daun t varietas tebu tahan kering. Majalah Penelitian Gula. XXXIII (1), 1-10
Winans SC. 1992. Two-way chemical signaling in Agrobacterium plant interaction. Microbiol. Rev. 56(1):12-13.
Winarso PA. 1992. Evaluasi musim kemarau dan antisipasi musim kemarau 1992 wilayah musim Indonesia. Lokakarya Kiat menghadapi kemungkinan musim kemarau panjang 1992 untuk budidaya perkebunan. AP3I, Perhimpi dan BMG, 19-20 Februari 1992, Bandung.
Yakushiji,H., Morinaga K, Nonami H. 1998. Sugar accumulation and partitioning in Satsuma Mandarin tree tissue and fruit in response to drought stress. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123(4):719-726.
Yamaguchi-Shinozaki, K. dan K. Shinozaki. 1994. A novel cis-acting element in an arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low temprature, or hight salt stress. The Plant Cell, 6 : 251-264.
Yancey PH, Clark ME, Hand SC, Bowlus PD, Somero GN. 1982. Living with water stress – Evolution of osmolyte systems. Science 217: 1214-1217.
Yang CW, Kao CH. 1999. Importance of ornithine-δ-transferase to prolin accumulation coused by water stress in detached rice leaves. Plant Growth Reg. 27: l89-192.
Yoshiba Y, Kiyoue T, Nakashima K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1997. Regulation of levels of proline as an osmolyte in plants under water stress. Plant Cell Physiol 38: 1095-1102.
Xuefeng L. 1999. Evaluation of Sweet and Hot Peppers in Kamphaen Saen. www.acr-avrdc.org/pdf files/Lix)17-N).pdf [1 Des 2005]
Zambryski P, Tempe J, Schell J. 1989. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ti- and Ri-plasmid in plants. J. Mol. Biol. 56:193-201.
Zhu B, Su Jin M. Chang M,Verma DPS, Fan YL,Wu R. 1998. Overexpression of a Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water- and salt-stress in transgenic rice. Plant Science 139:41-48.
Zhang ZH. 1989. The practicability of anther culture breeding in rice. In A Mujeeb-Kazi, LA Stich (eds). Review of Advances in Plant Biotechnology, 1985-88. Intternasional Maize and Wheat Improvement Center-International Rice Research Institute. Pp. 31-42