FERMENTASI ETANOL ANAEROBIK SECARA BATCHLAPORAN PRAKTIKUM BIOPROSES Disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Bioproses Disusun Oleh : Ambar Suci Lestarie Anantha Buriyan Anditania Sari Dwi Putri Ari Novanto Rahman Kelompok Kelas Program Studi Dosen Pembimbing :1 : 2A : D3 Teknik Kimia : Ir. Bintang Iwhan Moehadi, MT. 101411001 101411002 101411003 101411004

Tanggal Penyerahan Laporan

: 11 Januari 2012

POLITEKNIK NEGERI BANDUNG 2011

FERMENTASI ETANOL ANAEROBIK SECARA BATCHI. TUJUAN1. Memahami proses fermentasi etanol secara anaeorobik yang dijalankan secara batch 2. Menguasai teknik pembuatan inokulum dan persiapan untuk proses fermentasi anaerobik 3. Menentukan kurva kalibrasi untuk konsentrasi etanol dan konsentrasi sukrosa terhadap indeks bias 4. Menentukan kurva perubahan konsentrasi sel, konsentrasi etanol, dan konsentrasi substrat sisa terhadap waktu 5. Menentukan konstanta Michaelles Menten untuk proses fermentasi etanol

II.

DASAR TEORIFERMENTASI Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam keadaan anaerobic (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk respirasi anaerobik, akan tetapi, terdapat definisi yang lebih jelas yang mendefinisikan fermentasi sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa akseptor elektron eksternal. Anaerobik adalah kata teknis yang secara harfiah berarti "tanpa udara" (dimana "udara" biasanya berarti oksigen). Anaerob obligat akan mati bila terdapat oksigen karena tidak adanya enzim superoksida dismutase dan katalase yang dapat mengubah superoksida berbahaya yang timbul dalam selnya karena adanya oksigen. Organisme anaerobik fakultatif adalah organisme, biasanya bakteri, yang menghasilkan ATP secara respirasi aerobik jika terdapat oksigen tetapi juga mampu melakukan fermentasi. Beberapa contoh bakteri anaerobik fakultatif adalah Staphylococci (Gram positif),Corynebac terium (Gram positif), dan Listeria (Gram positif). Organisme dalam KerajaanFungi (jamur) dapat juga tergolong anaerobik fakultatif, contohnya ragi. Faktor-faktor yang mempengaruhi perpindahan metabolisme dalam anaerobic fakultatif adalah konsentrasi oksigen dan materi fermentasi di lingkungan. Gula adalah bahan yang umum dalam fermentasi. Beberapa contoh hasil fermentasi adalah etanol, asam laktat, dan hidrogen. Akan tetapi beberapa komponen lain dapat juga dihasilkan dari fermentasi seperti asam butirat dan aseton. Ragi dikenal sebagai bahan yang umum digunakan dalam fermentasi untuk menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan

minuman beralkohol lainnya. Respirasi anaerobik dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor elektron eksternal), dapat dikategorikan sebagai bentuk fermentasi. ETANOL Etanol disebut juga etil alkohol, alkohol murni, alkohol absolut, atau alkohol saja, adalah sejenis cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna, dan merupakan alkohol yang paling sering digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Senyawa ini merupakan obat psikoaktif dan dapat ditemukan pada minuman beralkohol dan termometer modern. Etanol termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia C 2H5OH dan rumus empiris C2H6O. Ia merupakan isomer konstitusional dari dimetil eter. Etanol sering disingkat menjadi EtOH, dengan "Et" merupakan singkatan dari gugus etil (C2H5). Etanol atau etil alkohol (C2H5OH) merupakan bahan kimia organik yang mengandung oksigen yang paling eksotik karena kombinasi sifat-sifat uniknya yang dapat digunakan sebagai pelarut, germisida, minuman, bahan anti beku, bahan bakar, bahan depressant dan khususnya karena kemampuannya sebagai bahan kimia intermediet untuk menghasilkan bahan kimia yang lain. Etanol merupakan nama IUPAC dari bahan kimia ini. Selain itu, nama etil alkohol juga lazim digunakan. Nama alkohol nama umum yang berasal dari bahasa arab dan merupakan gabungan dari dua kata yaitu al dan kohl yang didefinisikan sebagai debu lembut yang digunakan oleh wanita Asia untuk menggelapkan alis mata. Pada kondisi standar/atmosferik, etanol merupakan cairan volatil yang mudah terbakar, jernih dan tidak berwarna, aromanya menyegarkan, mudah dikenali dan berkarakter khas. Cairan ini juga mudah larut dalam air. Sifat fisik dan kimia etanol tergantung pada gugus hidroksilnya. Gugus ini menyebabkan polaritas molekul dan menyebabkan ikatan hidrogen antarmolekul. Kedua sifat tersebut menyebabkan perbedaan sifat fisik alkohol berat molekul rendah dengan senyawa hidrokarbon yang mempunyai berat molekul ekuivalen. Spektrografi infra merah menunjukkan bahwa dalam keadaan cair ikatan hidrogen terbentuk karena tarikmenarik antara atom hidrogen pada gugus hidroksil molekul satu dengan atom hidrogen pada gugus hidroksil molekul yang kedua. Sifat tersebut dapat dianalogikan seperti sifat air, walaupun ikatan pada air lebih kuat sehingga membentuk gugusan yang lebih dari dua molekul. Ikatan hidrogen pada etanol terjadi etanol terjadi pada fase cair, sedang pada fase gas senyawa ini bersifat monomerik. Secara detail, sifat-sifat fisik etanol dapat dilihat dalam Tabel

Tabel 1. Sifat Fisik Etanol

Nama lain Etil alkohol; hidroksietana; alkohol; etil hidrat; alkohol absolut Sifat Rumus molekul Massa molar Penampilan Densitas Titik leleh Titik didih Keasaman (pKa) Viskositas Momen dipol Klasifikasi EU Titik nyala Senyawa terkait C2H5OH 46,07 g/mol cairan tak berwarna 0,789 g/cm3 114,3 78,4 15,9 1,200 cP (20 C) 1,69 D (gas) Bahaya Mudah terbakar (F) 13 C (55.4 F) Senyawa terkait metanol, propanol

Kelarutan dalam air tercampur penuh

Sifat Medis Etanol Etanol telah banyak dibukti menyebabkan kelainan pada metabolisme lipoprotein, sintesis kolesterol dan penurunan sintesis asam empedu, asam kolat, fosfolipid, serta penurunan aktivitas enzim 12 alpha-hydroxylase. Penggunaan Etanol Etanol banyak digunakan sebagai pelarut berbagai bahan-bahan kimia yang ditujukan untuk konsumsi dan kegunaan manusia. Contohnya adalah pada parfum, perasa, pewarna

makanan, dan obat-obatan. Dalam kimia, etanol adalah pelarut yang penting sekaligus sebagai stok umpan untuk sintesis senyawa kimia lainnya. Dalam sejarahnya etanol telah lama digunakan sebagai bahan bakar.

Saccharomyces cerivisiae Saccharomyces merupakan mikroorganisme yang sangat dikenal masyarakat luas sebagai ragi roti (bakers yeast). Ragi roti ini selain digunakan dalam pembuatan makanan dan minuman, juga digunakan dalam industri etanol (Umbreit, 1959). Saccharomyces cerevisiae adalah mikroorganisme bersel tunggal dengan ukuran antara 5 sampai 20 mikron dan berbentuk bola atau telur. Saccharomyces cerevisae tidak bergerak karena tidak memiliki struktur tambahan di bagian luarnya seperti flagella (Prescott, 1959). Saccharomyces cerevisiae mempunyai lapisan dinding luar yang terdiri dari polisakarida kompleks dan di bawahnya terletak membran sel. Sitoplasma mengandung suatu inti yang bebas (discrete nucleus) dan bagian yang berisi sejumlah besar cairan yang disebut vakuola (Buckle, 1987). Saccharomyces cerevisiae dapat tumbuh dalam media cair dan padat. Pembelahan sel terjadi secara aseksual dengan pembentukan tunas, suatu bahan proses yang merupakan sifat khas dari khamir. Mula-mula timbul suatu gelembung kecil dari permukaan sel induk. Gelembung ini secara bertahap membesar, dan setelah mencapai ukuran yang sama dengan induknya terjadi pengerutan yang melepaskan tunas dari induknya. Sel yang baru terbentuk selanjutnya akan memasuki tahap pertunasan kembali. Tunas pada Saccharomyces serevisae dapat berkembang dari setiap bagian permukaan sel induk (pertunasan multipolar). Saccharomyces cerevisiae dapat berkembangbiak secara seksual dan umumnya melibatkan proses perkawinan yang diikuti dengan produksi spora seksual yang disebut akrospora dan spora-spora tersebut berada dalam bentuk kantung yang disebut askus.

Biasanya khamir berkembang secara aseksual dan hanya pada kondisi lingkungan tertentu saja akan terjadi perkembangbiakan secara seksual (Buckle,1987).

Fermentasi AInteraksi Saccharomyces dengan factor lingkungan Pada kondisi di alam, pengaruh factor-faktor lingkungan tidak dapat dipisahkan satu dengan lainnya, tetapi berpengaruh secara simultan saling mempengaruhi. Interaksi ini berlangsung secara dinamis dan berubah berdasar tempat dan waktu. Interaksi antara suhu, aktivitas air, pH, garam, gula, dan adanya bahan pengawet sering dipelajari dalam upaya menghambat pertumbuhan khamir pada makanan atau digunakan untuk mengoptimalkan pemanfaatan khamir dalam produksi alcohol. Kombinasi dua factor sering digunakan dalam penelitian-penelitian. Namun demikian, jika beberapa factor penghambat terlibat di dalamnya maka evalusi dua factor ini menjadi sulit. Produk beralkohol sangatlah beragam mulai dari pangan hingga energi. Produk pangan yang paling lama dikenal adalah wine dan bir. Mikroorganisme yang terlibat terutama adalah khamir dari genus Saccharomyces sp. Saccharomyces yang paling banyak digunakan adalah S. cerevisiae dan S. carlbergensis. Khamir ini akan mengubah gula pada substrat menjadi alkohol pada kondisi aerob. Jika khamir ini ditumbuhkan pada suasan aerob maka akan dihasilkan sel lebih banyak daripada metabolitnya dan ini dimanfaatkan untuk produksi ragi roti. Ragi dikenal sebagai bahan yang umum digunakan dalam fermentasi untuk menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan minuman beralkohol lainnya. Respirasi anaerobik

dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor elektron eksternal), dapat dikategorikan sebagai bentuk fermentasi. Reaksi Jalur biokimia yang terjadi, sebenarnya bervariasi tergantung jenis gula yang terlibat, tetapi umumnya melibatkan jalur glikolisis, yang merupakan bagian dari tahap awal respirasi aerobik pada sebagian besar organisme. Jalur terakhir akan bervariasi tergantung produk akhir yang dihasilkan. FERMENTASI ETANOL Salah satu metode pembuatan etanol yang paling terkenal adalah fermentasi. Bahan baku untuk proses fermentasi berupa bahan mentah seperti mono/disakarida (gula tebu, tetes tebu), bahan berpati (padi, jagung, umbi, dll), dan bahan selulosa (kayu, limbah pertanian). Ragi yang dapat digunakan dalam proses fermentasi etanol adalah Saccharomyces cerivisiae, Saccharomyces uvarum (tadinya Saccharomyces carlsbergensis), Candida utilis, Saccharomyces anamensis, Schizosccharomyces pombe. Proses fermentasi dapat dijalankan secara batch maupun kontinyu. Fermentasi secara batch membutuhkan waktu sekitar 50 jam, pH awal 4,5 dan suhu 20-30oC untuk menghasilkan yield etanol 90% dari nilai gula teoritis. Hasil akhir etanol sekitar 10-16%v/v Proses fermentasi, secara konvensional dijalankan dengan proses batch. Pada proses batch, substrat, nutrien seta mikroba dicampurkan kemudian diinkubasikan selama waktu tertentu. Pada proses ini tidak dilakukan penambahan apapun baik substrat maupun nutrien. Oleh karena itu semakin lama waktu produktivitasa etanol semakin berkurang akibat berkurangnya nutrien, substrat serta adanya akumulasi produk etanol yang dapat mengganggu pertunbuhan mikroba. Pada percobaan batch tidak dilakukan penambahan nutrien selama fermentasi. Oleh karena itu, pertumbuhan eksponensial hanya berlangsung selama beberapa generasi. Dengan sistem kontinyu populasi mikroba dapat dipertahankan dalam keadaan pertumbuhan eksponensial dalam waktu lama. Setelah pertumbuhan dimulai, medium segera dialirkan ke dalam tabung fermentasi secara perlahan-lahan, dimana volume dipertahankan konstan dengan dengan cara mengalirkan keluar kelebihan volume dari tabung fermentasi. Jika medium segar dialirkan dengan kecepatan konstan ke dalam tabung fermentasi, maka setelah periode penyesuaian beberapa waktu tertentu densitas mikroba di dalam tabung fermentasi juga konstan

Fermentasi dilakukan dalam fermentor yang dapat berbentuk tangki berpengaduk secara sinambung atau menara. Proses fermentasi dilakukan dengan metode curah atau sinambung. Fermentasi pembuatan etanol merupakan proses metabolisme anaerob. Reaksi yang terjadi secara keseluruhan pada kondisi anaerob mengikuti persamaan GayLussac berikut ini: C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + energi Etanol untuk kegunaan konsumsi manusia (seperti minuman beralkohol) dan kegunaan bahan bakar diproduksi dengan cara fermentasi. Spesies ragi tertentu (misalnya Saccharomyces cerevisiae) mencerna gula dan menghasilkan etanol dan karbon dioksida Konsentrasi etanol yang tinggi akan beracun bagi ragi. Pada jenis ragi yang paling toleran terhadap etanol, ragi tersebut hanya dapat bertahan pada lingkungan 15% etanol berdasarkan volume. Untuk menghasilkan etanol dari bahan-bahan pati, misalnya serealia, pati tersebut haruslah diubah terlebih dahulu menjadi gula. Dalam pembuatan bir, ini dapat dilakukan dengan merendam biji gandum dalam air dan membiarkannya berkecambah. Biji gandum yang beru berkecambah tersebut akan menghasilkan enzim amilase. Biji kecambah gandum ditumbuk, dan amilase yang ada akan mengubah pati menjadi gula. Untuk etanol bahan bakar, hidrolisis pati menjadi glukosa dapat dilakukan dengan lebih cepat menggunakan asam sulfat encer, menambahkan fungi penghasil amilase, atapun kombinasi dua cara tersebut. Reaksi dalam fermentasi berbeda-beda tergantung pada jenis gula yang digunakan dan produk yang dihasilkan. Secara singkat, glukosa (C6H12O6) yang merupakan gula paling sederhana , melalui fermentasi akan menghasilkan etanol (2C2H5OH). Reaksi fermentasi ini dilakukan oleh ragi, dan digunakan pada produksi makanan. Persamaan Reaksi Kimia C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP (Energi yang dilepaskan:118 kJ per mol) Dijabarkan sebagai: Gula (glukosa, fruktosa, atau sukrosa) Alkohol (etanol) + Karbon dioksida + Energi (ATP) Pada beberapa mikroba peristiwa pembebasan energi terlaksana karena asam piruvat diubah menjadi asam asetat + CO2 selanjutaya asam asetat diabah menjadi alkohol.

Dalam fermentasi alkohol, satu molekul glukosa hanya dapat menghasilkan 2 molekul ATP, bandingkan dengan respirasi aerob, satu molekul glukosa mampu menghasilkan 38 molekul ATP. Reaksinya : 1. Gula (C6H12O6) > asam piruvat (glikolisis) 2. Dekarbeksilasi asam piruvat. Asampiruvat > asetaldehid + CO2 3. Asetaldehid oleh alkohol dihidrogenase diubah menjadi alcohol (etanol). 2 CH3CHO + 2 NADH2 > 2 C2H5OH + 2 NAD. Ringkasan reaksi : C6H12O6 > 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 NADH2 + Energi Untuk menghasilkan tiap-tiap produk fermentasi di atas dibutuhkan kondisi fermentasi yang berbeda-beda dan jenis mikroba yang bervariasi juga karakteristiknya. Oleh karena itu, diperlukan keadaan lingkungan, substrat (media), serta perlakuan (treatment) yang sesuai sehingga produk yang dihasilkan optimal. Salah satu masalah yang dihadapi dalam proses produksi etanol secara fermentasi adalah terjadinya inhibisi produk etanol ke dalam sel yeast. Etanol adalah bahan kimia yang dapat memperlambat atau menghentikan pertumbuhan mikroorganisme atau disebut bakteriostatik. Pertumbuhan bakteri akan berjalan kembali jika bahan bakteriostatik tersebut diambil. Ada juga bahan kimia yang disebut bahan bakterisid, yaitu bahan yang dapat meniadakan kemampuan hidup mikroorganisme. Efek-efek tersebut tergantung pada konsentrasi bahan (Schlegel, 1994). Produk etanol yang terakumulasi dalam fermentor akan berpengaruh terhadap pertumbuhan yeast, misalnya etanol akan merusak membran plasma, denaturasi protein, dan terjadinya perubahan profil suhu pertumbuhan. Hal-hal tersebut dapat menghambat pertumbuhan atau mematikan mikroba sehingga akan menurunkan produktivitas. Pada konsentrasi alkohol 15% mikroba tidak dapat tumbuh (Bulawayo, 1996). Hal tersebut mendasari penggunaan teknologi untuk pengambilan etanol dari sistem fermentasi agar tidak mengganggu pertumbuhan ragi. Pada percobaan ini digunakan ragi Saccharomycess cereviceae, yang bersifat fakulktatif anaerobik. Pada kondisi aerobik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik adalah oksigen. Pemanfaatan pada keadaan ini menghasilkan penambahan biomassa sel dengan persamaan reaksi sebagai berikut:

C6H12O6

CO2 + H2O + biomassa sel

Pada kondisi anaerobik, Saccharomycess cereviceae menggunakan senyawa organik sebagai akseptor elektron terakhir pada jalur reaksi bioenergetik. Dalam hal ini yang digunakan adalah glukosa dari substrat dengan hasil akhir perombakan berupa alkohol (etanol), aldehid, asam organik, dan fussel oil. Reaksi yang berlangsung dalam keadaan anaerobik tersebut adalah sebagai berikut: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + produk samping Glukosa sebagai substrat utama. Hal ini disebabakan struktur model glikosa yang sederhana sehingga mudah digunakan oleh Saccharomycess cereviceae. Glukosa digunakan sebagai sumber energi dan sumber karbon yang digunakan untuk membentuk material penyusun sel baru. Glukosa disebut juga reducing sugar sehingga pemanfaatannya oleh Saccharomycess cereviceae dilakukan dengan mengoksidasi glukosa yaitu dengan cara pemutusan ikatan rangkap pada gugus karbonil glukosa. Media yang digunakan di dalam fermentasi harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel Saccharomycess cereviceae mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel Saccharomycess cereviceae tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam penggunaan substrat. Oleh karena itu, selain glukosa, ke dalam medium fermentasi juga ditambahkan zat-zat lain yang berfungsi sebagai sumber makronutrien dan mikronutrien serta growth factor. Dalam percobaan ini, proses fermentasi ragi tersebut melalui 4 tahapan: 1. tahap persiapan medium fermentor 2. tahap sterilisasi 3. tahap pembuatan inokulum dan pengembangan starter 4. tahap pelaksanaan fermentasi Tahap Persiapan Medium Fermentasi Medium yang digunakan adalah medium cair yang terdiri dari 2 macam larutan. Larutan pertama berisi garam-garam nutrisi untuk pertumbuhan ragi, sedangkan larutan kedua adalah substrat yang umumnya berupa latutan glukosa dalam air. Nutrisi yang diperlukan dalam medium petumbuhan ragi antara lain unsur N, S, O, H, Mg, K, Ca. Glukosa berfungsi sebagai sumber karbon dan sumber energi. Kadar senyawa-senyawa yang

diperlukan supaya medium dapat mendukung pertumbuhan ragi secara optimal harus ditentukan berdasarkan komposisi masing-masing unsur dalam sel ragi yang telah banyak diteliti dan dibukukan. Adapun komponen dari media yang digunakan adalah sebagai berikut: a. Substrat utama Sebagai substrat utama digunakan larutan glukosa. Karena glukosa adalah substrat utama, maka pertumbuhan biomassa sel Saccharomycess cereviceae merupakan fungsi dari konsentrasi glukosa. Hasil perombakan glukosa oleh sel adalah berupa CO2 dan H2O. b. Sumber makronutrien, mikronutrien, dan growth factor. Menggunakan zat-zat sebagai berikut:1. (NH4)2SO4 sebagai sumber nitrogen yang berguna bagi pembentukan asam nukleat

dan asam-asam amino.2. K2SO4 sebagai sumber K+ yang merupakan kofaktor enzim 3. Na2HPO4.2H2O sebagai sumber Na dan P. Na berfungsi sebagai kofaktor dan P

berguna untuk sintesis asam nukleat, ATP, fosfolipid, dan senyawa yang mengandung fosfor lainnya.4. MgSO4 sebagi sumber Mg yang berperan di dalam stabilisasi ribosom, stabilisasi

membran dan dinding sel, serta berfungsi sebagai kofaktor enzim.5. CaCl2 sebagai sumber Ca untuk stabilisasi dinding sel. 6. ZnSO4 sebagai sumber Zn yang berfungsi sebagai regulator enzim 7. Fe(NH4)(SO4) sebagai sumber Fe, makronutrien pembentuk sitokrom pembawa

elektron dalam jalur transportasi elektron.8. CuSO4 sebagai sumber Cu yang berperan penting dalam reaksi redoksmetabolisme.

9. yeast extract sebagai penyedia asam-asam amino tunggal, growth factor dan berbagai vitamin yang dibutuhkan sel 10. aqua , sebagai media pelarut dan pengaduk dalam transportasi senyawa. Setelah medium substrat dan medium nutrisi dicampurkan, diusahakan Ph tetap 4-5 yang merupakan pH optimal pertumbuhan sel ragi. Tahap Sterilisasi Sterilisasi dilakukan terhadap bahan dan alat sehingga terbebas dari kontaminasi mikroorganisme lain. Sterilisasi perlu dilakukan karena kontaminasi mikroba lain akan memberikan dampak yang tidak menguntungkan sebagai berikut:

1. 2. 3.

kontaminan meningkatkan persaingan di dalam mengkonsumsi substrat sehingga akan mengurangi perolehan kontaminan dapat menghambat proses metabolisme sel sehingga akan mengurangi perolehan kontaminan meningkatkan turbiditas sehingga dapat mengacaukan pengukuran terhadap jumlah sel setiap saat. Pada percobaan ini proses sterilisasi dilakukan di laboratorium dengan menggunakan

autoclave. Autoclave melakukan sterilisasi dengan menggunakan panas lembab. Keuntungan penggunaan panas lembab dalam proses sterilisasi adalah kelembaban mempermudah proses denaturasi protein sel kontaminan. Autoclave dioperasikan pada tekanan 15 psia dan temperatur 121oC selama 15 menit. Pada saat sterilisasi beberapa lubang pada fermentor ditutup dengan kapas. Tujuannya adalah untuk mengalirkan udara panas dari dalam fermentor sehingga tidak terjadi tekanan yang terlalu tinggi di dalam fermentor selama sterilisasi. Sedangkan tujuan lain penggunaan kapas adalah agar kehilangan uap air selama sterilisasi minimal. Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi tidak boleh disterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses karamelisasi. Karamelisasi disebut juga proses reduksi Maillard. Proses ini terjadi karena gugus karbonil pada glukosa bereaksi dengan gugus amonium atau protein dari medium sehingga membentuk nitrogen hitam. Senyawa ini tidak dapat dioksidasi mikroba dan disebut unfermented substrate. Akibat reaksi ini glukosa tidak dapat diuraikan oleh sel ragi, bahkan menjadi inhibitor terhadap sel ragi tersebut. Reaksi karamelisasi glukosa ini berlangsung sebagai berikut: R-COH + NH2-R R-COH-NH2 + produk lain Karena itu, proses sterilisasi dilakukan terpisah. Larutan nutrisi dimasukkan dalam fermentor dan disterilisasi sekaligus bersama fermentornya. Larutan glukosa disterilisasi sendiri dalam erlenmeyer. Setelah fermentor dan medium steril dingin, larutan glukosa steril dimasukkan secara aseptik ke dalam fermentor. Kemudian pH diatur sampai 4,5 dengan menambahkan HCH steril 1 N. Nilai 4,5 adalah pH optimum pertumbuhan ragi. Tahap Penyiapan Inokulum Setelah seluruh alat dan bahan steril, dilakukan inokulasi Saccharomycess cereviceae dari biakan murni. Yang digunakan sebagai inokulum adalah biakan ragi pada agar miring. Komposisi medium starter adalah sama dengan komposisi media fermentasi dengan penambahan growth factor. Inokulum tersebut dimasukkan dalam campuran larutan nutrisi

dan substrat yang diambil sebagian dari fermentor dan dimasukkan dalam labu erlenmeyer 150 mL. Tujuan dibiakkannya ragi dalam starter adalah mengadaptasikan sel terhadap media fermentasi. Dengan adanya adaptasi pada starter ini diharapkan lag phase sebagai tahap awal fermentasi dilewati. Biakan diusahakan tepat berada pada akhir fasa logaritmik. Dengan demikian pertumbuhan sel ragi akan maksimum dalam waktu yang relatif singkat. InokulasiSacchromycess cereviceae dilakukan secara aseptis untuk menjaga kemurnian biakan. Setelah dimasukkan dalam medium, inokulum tersebut diletakkan dalam alat shaker selama, paling cepat, 16 jam. Fungsi shaker adalah mempermudah difusi oksigen ke dalam medium sehingga kontak antara dan inokulum makin banyak dan homogen. Hal ini penting dilakukan untuk menjaga kondisi biakan tetap aerobik. Jika difusi oksigen dalam medium lancar, kadar DO (oksigen terlarut) dalam medium akan cukup mendukung pertumbuhan sel secara aerobik. Jika sel hidup secara aerobik, biomassa baru akan lebih banyak terbentuk daripada etanol. Dengan demikian pada akhir masa inkubasi shaker ini diharapkan juga sel sudah berada pada akhir fasa logaritmik. Tahap Pelaksanaan Fermentasi Tahap ini dimulai saat inokulum yang telah beradaptasi dalam medium dimasukkan dalam medium di fermentor. Pada praktikum ini fermentor yang dipakai bervolume 5 liter. Fermentor adalah suatu reaktor yang dipersiapkan untuk melakukan reaksi fermentasi yang dilengkapi dengan pengaduk, saluran aerasi, dan perlengkapan lainnya. Pelaksanaan fermentasi dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1. Nutrisi, substrat, dan inokulan dimasukkan ke dalam fermentor yang dilakukan secara aseptis. Nutrisi dimasukkan ke dalam fermentor sebelum disterilisasi dalam autoclave. Substrat dan inokulan dimasukkan dengan cara memanaskan mulut inlet dengan kapas yang dibakar kemudian medium dan inokulum dimasukkan ke dalam fermentor. 2. Kemudian dilakukan kecepatan aerasi dan agitasi. Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel ragi dalam bentuk gelembung gas. Aerasi diatur pada kecepatan skala 9. Laju oksigen yang disuplai ke dalam fermentor dijaga stabil. Fluktuasi laju alir oksigen ini dapat menurunkan unjuk kerja fermentor karena laju transfer O2 tidak tetap sehingga metabolisme sel ragi terganggu karena kadar DO yang tidak stabil. Agitasi berfungsi sebagai alat penghomogen larutan fermentasi. Agitasi dilakukan pada kecepatan 600 rpm. Pengadukan dilakukan oleh impeller yang berjumlah 3 buah. Semakin banyak impeller di dalam fermentor semakin homogen larutan tersebut. Laju alir udara dan pengadukan saling terkait satu sama lain. Pengaliran udara berfungsi untuk

menjaga suplai oksigen agar tetap sedangkan pengadukan akan meningkatkan laju dispersi oksigen ke dalam larutan dan meratakan kadar oksigen di seluruh medium fermentasi. Di pinggiran fermentor juga terdapat baffle yang berfungsi mencegah terjadinya vortex (pusaran air) sehingga dapat meningkatkan efisiensi aerator. Pengaturan udara keluar dan masuk fermentor dilakukan sedemikian rupa sehingga kontaminasi dapat diminimalkan, yaitu dengan cara menggunakan filter mikroba kapas pada aliran masuk dan menggunakan larutan CuSO4 yang bersifat oligodinamik dan mampu membunuh mikroba kontaminan.Pencampuran inokulum ke dalam medium fermentor dilakukan secara aseptik dengan menyalakan api di sekitar tempat pemasukan inokulum. Sebaiknya, sebelum proses fermentasi dimulai, ke dalam medium fermentor ditambahkan zat antifoam yang berfungsi mencegah terjadinya foaming. Zat antifoam yang banyak digunakan di industri adalah silicon. Foaming terjadi karena protein terdenaturasi dalam medium fermentasi. Selain menggunakan zat kimia, foaming juga dapat dicegah secara mekanik dengan mengatur putaran agitator. Hal ini lebih sering dilakukan karena zat kimia yang terlalu banyak ditambahkan ke dalam medium dapat menjadi inhibitor bagi pertumbuhan mikroba. Pada awal fermentasi diusakan pH medium adalah 4,5 yang optimal bagi pertumbuhan ragi. Selama fermentasi pH medium sangat mungkin mengalami penurunan karena terbentuknya asam organik sebagai produk samping fermentasi. Karena itu pH medium harus dipantau, jangan sampai terlalu drop yang akan mengakibatkan sel ragi mati. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PROSES FERMENTASI Faktor-faktor yang mempengaruhi proses fermentasi untuk menghasilkan etanol adalah: sumber karbon, gas karbondioksida, pH substrat, nutrien, temperatur, dan oksigen. Untuk pertumbuhannya, yeast memerlukan enersi yang berasal dari karbon. Gula adalah substrat yang lebih disukai. Oleh karenanya konsentrasi gula sangat mempengaruhi kuantitas alkohol yang dihasilkan. Kandungan gas karbondioksida sebesar 15 gram per liter (kira-kira 7,2 atm) akan menyebabkan terhentinya pertumbuhan yeast, tetapi tidak menghentikan fermentasi alkohol. Pada tekanan lebih besar dari 30 atm, fermentasi alkohol baru terhenti sama sekali. pH pH dari media sangat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme. Setiap

mikroorganisme mempunyai pH minimal, maksimal, dan optimal untuk pertumbuhannya.

Untuk yeast, pH optimal untuk pertumbuhannya ialah berkisar antara 4,0 sampai 4,5. Pada pH 3,0 atau lebih rendah lagi fermentasi alkohol akan berjalan dengan lambat (Volk, 1993). Nutrien Dalam pertumbuhannya mikroba memerlukan nutrient. Nutrien yang dibutuhkan digolongkan menjadi dua yaitu nutrien makro dan nutrien mikro. Nutrien makro meliputi unsur C, N, P, K. Unsur C didapat dari substrat yang mengandung karbohidrat, unsur N didapat dari penambahan urea, sedang unsur P dan K dari pupuk NPK (Halimatuddahliana, 2003). Unsur mikro meliputi vitamin dan mineral-mineral lain yang disebut trace element seperti Ca, Mg, Na, S, Cl, Fe, Mn, Cu, Co, Bo, Zn, Mo, dan Al (Jutono, 1972). Temperatur Mikroorganisme mempunyai temperatur maksimal, optimal, dan minimal untuk pertumbuhannya. Temperatur optimal untuk yeast berkisar antara 25-30oC dan temperatur maksimal antara 35-47oC. Beberapa jenis yeast dapat hidup pada suhu 0oC. Temperatur selama fermentasi perlu mendapatkan perhatian, karena di samping temperatur mempunyai efek yang langsung terhadap pertumbuhan yeast juga mempengaruhi komposisi produk akhir. Pada temperatur yang terlalu tinggi akan menonaktifkan yeast. Pada temperatur yang terlalu rendah yeast akan menjadi tidak aktif. Selama proses fermentasi akan terjadi pembebasan panas sehingga akan lebih baik apabila pada tangki fermentasi dilengkapi dengan unit pendingin (Fardias, 1988). Oksigen Berdasarkan kemampuannya untuk mempergunakan oksigen bebas, mikroorganisme dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu: aerob apabila untuk pertumbuhannya mikroorganisme memerlukan oksigen, anaerob apabila mikroorganisme akan tumbuh dengan baik pada keadaan tanpa oksigen, dan fakultatif apabila dapat tumbuh dengan baik pada keadaan ada oksigen bebas maupun tidak ada oksigen bebas. Sebagian besar yeast merupakan mikroorganisme aerob. Yeast dari kultur yang memakai aerob akan menghasilkan alkohol dalam jumlah yang lebih besar apabila dibandingkan dengan yeast kultur yang tanpa aerasi. Akan tetapi efek ini tergantung yeast yang dipergunakan (Fardias, 1988)

III.

ALAT DAN BAHANBahan yang digunakan ; Biakan Saccharomyces cerevisiae

Alkohol Media aktivasi dalam 100 mL :

Glukosa 6 gr (NH4)2SO4 : 0,2 gr KH2PO4 : 0,5 gr Diinkubasi anaerob selama 1 hari T 300C

Media Fermentasi 1 L :

Glukosa 150 gram MgSO4.7H2O 0,4 gram KH2PO4 5 gr Ekstrak anggur 1 L Diinkubasi pada T 370C selama 15 hari

Alat yang digunakan : Fermentor Beker glass water batch Hot plate Tabung reaksi steril Termometer Mikroskop Counting chamber Kaca preparat + cover glass 5 buah Pipet tetes Pipet ukur 10 mL steril

IV.1.

PROSEDUR KERJAPembuatan kurva kalibrasi

2.

Percobaan fermentasi anaerobik secara batch

V.

Data Pengamatan dan Pengolahan Data1. Data Pengamatan Memakai tambahan fermipan t(jam) 0.0 3,5 18,83(22,33) 8,167(30,497) senin 09.40 15.00(5,67) selasa 08.45 15.57(7,2) rabu 09.30 15.30(6) Penentuan Kurva Baku Larutan etanol dalam larutan sukrosa 10% Konsentrasi 0% 2% 4% 5% 7% 8% 9% 10% Indeks bias 1.332 1.336 1.339 1.342 1.344 1.345 1.347 1.352 Indeks Bias 1.333 1.334 1.349 1,353 1.453 1,459 1,465 1,469 1,475 1,477 Brix 13.0 13.0 12,9 12.5 10.3 10,0 10,0 9,8 9,5 9,4

Larutan gula dalam larutan etanol 5% Konsentrasi 3 5 7 9 11 13 15 Indeks Bias 1.354 1.347 1.342 1.341 1.338 1.336 1.334 Brix 2 4 5 7,2 9 11 12

2. Pengolahan Data A. Perhitungan Kadar Etanol dan Gula dalam Reaktor Fermentasi Penentuan konsentrasi etanol Persamaan kurva y = 0,1786x + 1,3321 Penentuan konsentrasi sukrosa Persamaan kurva y = 0,8571x - 0,5429 Memakai tambahan Fermipan t (jam) 0 3,5 22,33 30,497 246,497 252,167 269,917 277,117 294,622 300,622 Indeks Bias 1.333 1.334 1.349 1,353 1.453 1,459 1,465 1,469 1,475 1,477 Brix 13.0 13.0 12,9 12.5 10.3 10,0 10,0 9,8 9,5 9,4 Konsentrasi etanol 1,5702 1,5704 1,573 1,5737 1,5916 1,5927 1,5937 1,5945 1,5955 1,5959 Konsentrasi sukrosa 11,685 11,685 11,599 11,257 9,371 9,1139 9,1139 8,9425 8,6854 8,5996

B. Kurva Konsentrasi Sukrosa terhadap Waktu Memakai tambahan Fermipan

C. Kurva Konsentrasi Etanol terhadap Waktu Memakai tambahan Fermipan

D. Perhitungan max dan Tetapan Kejenuhan (Ks)

Waktu (jam) 0 3,5 22,33 30,497 246,497 252,167 269,917 277,117 294,622 300,622

S 11,685 11,685 11,599 11,257 9,371 9,1139 9,1139 8,9425 8,6854 8,5996

S0-S 0 0 0,086 0,428 2,314 2,5711 2,5711 2,7425 2,9996 3,0854

P 1,5702 1,5704 1,573 1,5737 1,5916 1,5927 1,5937 1,5945 1,5955 1,5959

P-P0 0 0,0002 0,0028 0,0035 0,0214 0,0225 0,0235 0,0243 0,0253 0,0257

Yield Etanol = tg = slope = 0,0085

Penentuan Konstanta Michaellis Menten = = Laju pembentukan Produk

max = Laju pembentukan Produk maksimum Km S =k = konsentrasi substrat

Persamaan grafik : y = 9x10-5 + 1,5706 slope = 9x10-5 max = slope= 9x10-5 jam-1 = x max = x 9x10-5 = 0,000045 jam-1 =

0,000045 = Km = 11,685 gr/mL

VI.

PembahasanFermentasi etanol merupakan salah satu jenis fermentasi anaerob atau tanpa menggunakan oksigen pada prosesnya. Pada fermentasi ini digunakan bakteri Saccharomyces cereviciae yang dapat hidup dengan atau tanpa oksigen. Saccharomyces cereviciae disebut juga khamir yang mempunyai ukuran lebih besar dari bakteri dan mempunyai miselium (benang-benang hifa) seperti jamur. Fermentasi etanol akan terjadi pada kondisi anaerob oleh khamir. Substrat yang digunakan adalah gula pasir. Adapun reaksi yang terjadi pada fermentasi adalah sebagai berikut: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP Dari reaksi yang ada, menunjukkan bahwa fermentasi etanol akan menghasilkan produk samping berupa gas CO2 dan energi berupa panas. Pada praktikum ini, proses fermentasi dilakukan dengan menggunakan reaktor erlenmeyer berleher angsa dengan larutan asam sulfat di tubenya. Ini berfungsi untuk menghindari udara yang tidak steril masuk kedalam medium, sehingga kontaminasi dengan udara luar dapat dihindari. Indeks bias yang terukur pada sampling awal sampai terakhir menunjukkan kenaikan yang kecil atau tidak signifikan, dan brix yang terukur menunjukkan penurunan yang kecil. Hal ini menunjukkan bahwa fermentasi etanol tidak berjalan optimal. Pada praktikum ini, dilakukan penambahan fermipan pada inokulum yang berisi media produksi dan Saccharomyces cerevisiae. Penambahan fermipan ini bertujuan untuk memperbanyak jumlah sel yang hidup dan mempercepat fasa lag atau fasa adaptasi karena Saccaromices cerevisiae memiliki fasa lag atau fasa adaptasi yang panjang Adapun media pertumbuhan khamir yang berusia 2 minggu dimasukkan kedalam bioreaktor yang sudah berisi media fermentasi. Proses fermentasi selalu melibatkan kinetika pertumbuhan biomassa, penggunaan substrat, dan pembentukan produk. Media pertumbuhan yang dimasukkan tidak diketahui laju pertumbuhan maksimumnya. Kemungkinan terjadi adalah khamir masih dalam proses adaptasi atau

masih pada fasa log. Walaupun fungsi media inokulum adalah untuk mempercepat fasa adaptasi. Sehingga, proses fermentasi tidak berjalan dengan optimal. Faktor mikroba adalah penyebab utama tidak optimumnya proses fermentasi. Ini bisa dibuktikan dengan penambahan fermipan kedalam bioreaktor. Media fermentasi dalam hitungan jam sudah berhasil diproses menjadi etanol dengan terdapat gelembung yang keluar, yang menandakan dihasilkannya gas CO2. Sebab lain adalah tidak dilakukannya pengadukan selama proses fermentasi berlangsung, pengadukan hanya dilakukan pada saat pengambilan sampel (sampling). Oleh karena itu ditemukan menggumpal membentuk bulatan putih pada bioreaktor karena khamir mempunyai hifa seperti jamur. Akibatnya, proses fermentasi tidak berjalan dengan merata dan menyeluruh di semua permukaan media fermentasi. Suhu dan pH sudah dalam kondisi optimum, yaitu pada suhu 30 oC dengan pH netral. Sehingga, kecil kemungkinan suhu dan pH menjadi penyebab terhambatnya proses fermentasi. Sedangkan kontaminasi pun tidak terjadi pada media fermentasi. Larutan substrat bersih, tidak terdapat jenis mikroba lain yang tumbuh. Kurva kalibrasi dibuat untuk mengetahui kadar etanol dan gula berdasarkan indeks bias yang terukur saat sampling. Jadi, persen etanol yang terbentuk pada proses fermentasi dapat diketahui melalui indeks bias terukur. Laju pembentukan produk atau disebut juga laju pengurangan konsentrasi substrat, mengikuti persamaan Michaellis Mentten. Konsentrasi etanol berbanding lurus dengan nilai indeks bias dan berbanding terbalik dengan nilai brix. Sedangkan konsentrasi gula (sukrosa) berbanding lurus dengan nilai brix dan berbanding terbalik dengan nilai indeks bias. Jadi semakin banyak produk yang dihasilkan atau semakin besar konsentrasi etanol, maka nilai indeks biasnya akan semakin meningkat dan nilai brixnya akan semakin menurun karena konsentrasi gula (sukrosa) semakin menurun. Konsentrasi gula (sukrosa) semakin menurun karena gula (sukrosa) sebagai substrat sudah terkonversi berubah menjadi produk yang berupa etanol. Berdasarkan perhitungan pada pengolahan data didapatkan = 9x10-5/jam, max = 0.000045/jam, dan Km = 11,685 g/L. . Dalam percobaan ini, terdapat beberapa pengaruh dalam proses fermentasi etanol yaitu, konsentrasi glukosa, konsentrasi etanol, temperatur, pH , waktu dan jenis mikroba yang digunakan.

VII.

KesimpulanBerdasarkan praktikum yang telah kami lakukan, dapat disimpulkan beberapa hal, diantaranya sebagai berikut: 1. Produk etanol memiliki : Kadar etanol sebesar

Memakai fermipan

: 1,5959 %

Kadar sukrosa

Memakai fermipan

: 8,5996 %

2. max pada proses fermentasi adalah 9x10-5 jam-1 3.

Km adalah 11,685 g/L

DAFTAR PUSTAKABailey, James E dan David F Ollis. 1986. Biochemical Engineering Fundamentals. 2nd. Singapore : McGraw-Hill Book Co. http://mettiawesome.blogspot.com/2011/04/fermentasi-etanol-oleh-mikroba-anaerob.html http://g1f007045.wordpress.com/fermentasi-alkohol/ http://eprints.undip.ac.id/13474/4/Halaman_Angka.pdf TIM, Jobsheet Praktikum Bioproses, 2011 Perry, J.H. (ed.). 1988, Chemical Enginers Hand book. 6th edition. Singapore. McGraw-Hill Book Co.