ENZIM

Nama Kelompok :Alfindah RustantiElprida PratiwiArdhanareswari WidaninggarReza FebrianAsep Angga saputra

Kelompok VI

Sejarah Enzim

Tahun 1752 Reamur yaitu dengan memberi makan burung elang dengan potongan-potongan daging yang dimasukan kedalam bola besi kecil, yang kemudian bola besi tersebut diberikan tali, kemudian bola besi tersebut dikeluarkan dengan hati-hati dan ternyata daging tersebut telah larut semua.

Awal abad 18 yakni studi mengenai sistem pencernaan (pengubahan pati menjadi gula oleh air liur dan berbagai ekstrak tumbuhan).

Tahun 1850 Louis Pasteur mengenai fermentasi gula oleh ragi, diketahui bahwa pengubahan gula menjadi alkohol dikatalisis oleh suatu zat yang dinamakan ferment.

Pada tahun 1926, James Sumner berhasil mengisolasi enzim pertama dalam bentuk kristal yakni enzim urease yang ternyata merupakan molekul protein. Enzim urease berfungsi mengkatalisis pengubahan urea menjadi CO2 dan NH3.

Pengertian enzim

Enzim : protein fungsional yang dapat mengkatalisis reaksi kimia di dalam sel/makhluk hidup. Enzim didalamnya terdapat koenzim.

Koenzim adalah kofaktor yang dapat berupa ion-ion anorganik, atau senyawa organik yang dibutuhkan dalam aktifitas enzim tertentu.

gugus prostetik merupakan kofaktor yang terikat kuat atau terikat secara permanen dalam molekul enzim. Enzim yang strukturnya sempurna dan bersifat aktif yang mengandung koenzim atau gugus ionik lainnya disebut holoenzim, sedangkan bagian protein enzim yang relatif tidak stabil dan terdenaturasi oleh pemanasan disebut apoenzim.

Enzim sebagai biokatalisator sejati

Kegunaan enzim sebagai biokatalisator ini, akan menghasilkan kompleks baru (ES) yang memiliki energi aktivasi yang jauh lebih rendah dalam keadaan transisi jika dibandingkan dengan keadaan transisi A pada reaksi yang tidak dikatalisis enzim.

Sifat Enzim

EnzimDapat bekerja

spesifik

Enzim mempunyai bagian tertentu yang disebut dengan sisi aktif enzim (active site), yang merupakan bagian tempat pengikatan substrat.

Reaksi enzimatik sederhana dapat dituliskan sebagai berikut:

dimana [E] adalah konsentrasi enzim, [S] substrat, [ES] kompleks enzim–substrat, [EP] kompleks enzim-produk, [P] produk yang dihasilkan.

Sifat-sifat enzim

Enzim sebagai biokatalisator suatu reaksi

Enzim bekerja secara spesifik atau khusus

Enzim sebagai ProteinEnzim dapat bekerja secara bolak

balik (reversibel)Bekerja cepat

SuhuDerajat Keasaman (pH)Konsentrasi SubstratAktifator dan inhibitor

Faktor-faktor yang mempengaruhi enzim

SuhuPada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Karena enzim itu tersusun oleh suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Enzim pada umumnya stabil pada temperatur 45-55°C.

Derajat Keasaman (pH)Perubahan pH dapat mempengaruhi perubahan asam amino kunci pada sisi aktif enzim, sehingga menghalangi sisi aktif bergabung dengan substratnya. Setiap enzim dapat bekerja baik pada pH optimum.

Konsentrasi SubstratPeningkatan konsentransi substrat dapat meningkatkan kecepatan reaksi bila jumlah enzim tetap.

Aktifator dan inhibitorAktivator merupakan molekul yang mempermudah ikatan antara enzim. Inhibitor  merupakan suatu molekul yang menghambat ikatan enzim dengan substratnya. Inhibitor akan berikatan dengan enzim membentuk kompleks enzim-inhibitor.

Klasifikasi enzimNomor Kelas Kelas Jenis reaksi yang dikatalisis

EC 1 Oksidoreduktase Pemindahan electron

EC 2 Transferase Reaksi pemindahan gugus fungsionil

EC 3 Hidrolase Reaksi hidrolisis (pemindahan gugus

fungsional ke air)

EC 4 Liase Penambahan gugus ke ikatan ganda atau

sebaliknya

EC 5 Isomerase Pemindahan gugus ke dalam molekul,

menghasilkan bentuk isomer

EC 6 Ligase Pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O, dan C-N

oleh reaksi kondensasi yang berkaitan

dengan penguraian ATP

Penamaan enzim

Sistem penamaan enzim menurut IUB berdasarkan 4 kaidah pokok, yaitu:

1. Enzim dibagi menjadi enam kelas, berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisisnya, masing-masing di bagi lagi menjadi 4-13 subklas.

2. Nama enzim terdiri atas 2 bagian. bagian pertama menunjukkan substrat, sedangkan bagian kedua menunjukkan tipe reaksi yang dikatalisisnya, ditambah akhiran –ase.

3. Untuk menjelaskan reaksi, dapat dituliskan dalam tanda kurung pada bagian akhir. Sebagai contoh misalnya, enzim yang mengatalisis reaksi L-malat + NAD+ ® piruvat + CO2 + NADH + H+ diberi nama 1.1.1.37 L-malat: NAD+ oksidoreduktase (dekarboksilasi).

4. Setiap enzim mempunyai nomor kode (EC) yang terdiri dari 4 nomor. Nomor pertama menunjukkan klas enzim yang bersangkutan (digit pertama), subklas (digit kedua), dan subsubklas (digit ketiga). Digit keempat adalah untuk enzim spesifik.

Mekanisme Reaksi Enzim Substrat

1. Teori Gembok Kunci

Berikut adalah persamaan reaksi enzimatis sederhana:

2. Teori Ketepatan Induksi (Induced Fit Theory)

Efisiensi katalik asamLetak dan orientasi (enzim yang berikatan dengan

substrat tidak hanya terletak berdekatan dengan gugus katalitik, tetapi harus memiliki orientasi yang tepat yang memungkinkan substrat membentuk kompleks ES yang stabil).

Tegangan dan perubahan (pengikatan substrat mendorong perubahan konformasi yang menimbulkan tegangan pada struktur sisi aktif enzim dan membantu kompleks ES menuju keadaan transisi).

Katalisator umum asam-basa (Gugus R dari asam amino spesifik enzim dapat bertindak sebagai donor atau akseptor proton yang baik).

Katalisator kovalen (interaksi kovalen enzim-substrat membentuk kompleks ES yang sangat stabil).

Kinetika Enzim

Dengan meningkatnya konsentrasi substrat [S] maka kecepatan reaksi akan semakin meningkat sampai pada keadaan enzim telah jenuh oleh substrat. Batas ini yang disebut kecepatan maksimum (Vmaks), ketika enzim telah jenuh oleh substrat maka tidak dapat berfungsi lebih cepat.

Mekanisme penghambatan aktivitas enzim (Inhibitor)

Inhibitor merupakan suatu senyawa yang dapat menurunkan atau menghambat laju rekasi yang dikatalisis enzim. Ada dua macam inhibitor, yaitu:

inhibitor irreversible Inhibitor irreversible merupakan inhibitor yang tidak dapat balik. Artinya, setelah berikatan dengan enzim, inhibitor ini tidak dapat dipisahkan lagi dari enzim.

Inhibitor reversible Inhibitor reversible adalah inhibitor yang dapat balik. Artinya, setelah berikatan dengan enzim, inhibitor ini masih dapat dipisahkan lagi. Ada 2 macam jenis inhibitor reversible, yaitu inhibitor yang bekerja secara kompetitif dan non kompetitif.

Inhibitor

Inhibitor irreversibleInhibitor irreversible merupakan inhibitor yang tidak dapat balik.

Inhibitor reversible Inhibitor reversible adalah inhibitor yang dapat balik. Ada 2 macam jenis inhibitor reversible, yaitu inhibitor yang bekerja secara kompetitif dan non kompetitif

Inhibitor kompetitifInhibitor kompetitif memiliki ciri utama adalah inhibitor

ini biasanya menyerupai substrat normal pada konformasi tiga dimensinya sehingga penghambatan ini dapat ditanggulangi hanya dengan meningkatkan konsentrasi substrat.

Inhibitor non KompetitifInhibitor non Kompetitif, inhibitor berikatan pada

bagian lain dari molekul enzim selainsisi aktif enzim dan mengakibatkan perubahan konformasi molekul enzim sehingga mengakibatkan inaktifasi enzim secara reversible.

Inhibitor

Pengaruh inhibitor

Gambar a Gambar B

Gambar a : Pengaruh inhibitor kompetitif Gambar b : Pengaruh inhibitor non kompetitif

Mekanisme Reaksi enzim multisubstrat

Banyak reaksi enzimatik dalam proses metabolism sebenarnya melibatkan lebih dari satu molekul substrat yang berbeda. Contohnya yaitu reaksi fosforilasi glukosa oleh enzim heksokinase yang melibatkan molekul glukosa dan ATP sebagai substrat.

ATP + Glukosa ADP + glukosa 6-fosfat

Kecepatan reaksi enzim multisubstrat dianalisis dengan pendekatan Michaelis Menten, dimana enzim heksokinase memiliki 2 nilai KM yang khas bagi tiap-tiap substrat.

Dalam reaksi enzimatik dengan dua substrat biasanya melibatkan pemindahan suatu atom atau gugus fungsional dari satu substrat ke substrat yang lain. Dalam reaksi ini, reaksi berlangsung dalam dua jenis lintas yang berbeda yaitu :

Gambar (a) : Reaksi berganti Tunggal dan (b): Reaksi berganti Ganda ( ping-

pong reaction)

Pengendalian Reaksi atau aktivitas Enzim

Enzim regulatori (enzim pengatur) adalah enzim yang aktifitas katalitiknya diatur melalui berbagai jenis isyarat molekuler. Terdapat dua golongan utama enzim pengatur yaitu enzim alosterik dan enzim pengatur kovalen.Enzim alosterik

Enzim alosterik ialah enzim yang aktivitasnya diatur oleh senyawa yang berikatan secara reversible pada bagian yang bukan sisi aktif enzim.

Enzim ini memiliki dua sisi pengikatan yang terdiri dari satu sisi katalitik (tempat pengikatan substrat) dan sisi pengatur (tempat pengikatan molekul pengatur atau modulator). Modulator dapat menghambat atau mempercepat aktifitas katalitik enzim.

Macam-macam modulator : Modulator positif yang akan meningkatkan

aktifitas enzim dan modulator negatif yang akan menurunkan aktifitas enzim.

Modulator pengaktif golongan enzim alosterik sering sekali merupakan molekul substratnya sendiri sehingga sering disebut homotropik (modulator dan substrat identik), sedangkan jika modulator yang terikat merupakan senyawa yang lain yang tidak identik maka disebut heterotropik.

Dalam homotropik akan menghasilkan interaksi kooperatif positif sedangkan heterotropik akan menghasilkan interaksi kooperatif negatif.

Enzim pengatur kovalenEnzim pengatur kovalen adalah enzim pengatur

yang aktivitasnya diatur melalui interkonversi bentuk aktif dan tidak aktifnya oleh modifikasi kovalen molekul enzim.

Penghambatan balik

pengubahan L-treonin menjadi

L-isoleusin

Pemurnian Enzim

Pemurnian enzim bertujuan untuk memisahkan enzim yang dikehendaki dari enzim lain yang tidak diinginkan.

Adapun macam-macam pemurnian enzim sebagai berikut:

1. Pengendapan dengan Amonium Sulfat

2. Dialisis

 

Dialisis merupakan metode yang paling dikenal untuk menghilangkan molekul pengganggu, seperti garam atau ion-ion lain yang berukuran kecil

3. Kromatografi penukar ionKromatografi penukar ion merupakan metode pemisahan berdasar-kan muatan molekul di bawah kondisi pH dan kekuatan ion tertentu. interaksi elektrostatik dari berbagai jenis ligan bermuatan pada matriks dengan gugus yang dapat berionisasi pada protein akan menimbulkan mekanisme pemisahan.

4. Kromatografi interaksi hidrofobik

 

Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan berdasarkan perbedaan hidrofobisitas pada permukaan protein. Hal ini bergantung pada interaksi hidrofobik antara permukaan protein dengan gugus hidrofobik yang terikat secara kovalen pada matriks

5. kromatografi filtrasi gel Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro molekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul. Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu dekstran (polimer gula yang larut dalam air) dan mengalami reaksi ikatan silang (cross linkage) sehingga dekstran menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat menyerap molekul air dalam molekulnya

PENGEMBANGAN TEKNIK IMMOBILISASI ENZIM GLUCOSE OXIDASE PADA MEMBRAN

KOMPOSIT BERBASIS KITOSAN DAN UJI APLIKASINYA UNTUK PEMBUATAN

BIOSENSOR GLUKOSA

Abstrak  Tingginya prevalensi penyakit Diabetes mellitus (DM) di Indonesia dan mahalnya harga biosensor sebagai alat diagnosa, memotivasi pelaksanaan penelitian untuk pembuatan biosensor. Immobilisasi enzim yang menghasilkan stabilitas tinggi merupakan kunci sukses dalam pembuatan biosensor. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan teknik immobilisasi enzim yang dapat menghasilkan stabilitas tinggi dan penerapannya untuk pembuatan biosensor.

Pendahuluan

Diabetes mellitus (DM) merupakan salah satu penyakit kelainan metabolisme ini diakibatkan oleh penurunan kadar insulin dengan ditandai dengan kadar glukosa yang kurang dari rentang 80-120 mg/dl (4,4-6,6 mM). Untuk menekan tingginya prevalensi Diabetes mellitus di Indonesia, tindakan pencegahan dan diagnosa dini, namun hal ini terkendala dengan tingginya harga kit diagnostik yang merupakan produk impor. Sampai saat ini ada tiga generasi biosensor glukosa yang dapat dijadikan model pengembangan. Generasi pertama adalah biosensor yang mendasarkan pada konsumsi oksigen atau pembentukan hidrogen peroksida (Wang, 2008). Biosensor generasi kedua telah diusulkan dimana fungsi oksigen dalam reaksi digantikan oleh mediator transfer elektron (Wang, 2008). Biosensor generasi ketiga muncul untuk mengeliminasi penggunaan mediator transfer elektron, dengan menggunakan elektroda dari garam organik konduktif.

Metode Penelitian

Pembuatan dan Karakterisasi Membran Kitosan dan Membran Komposit Berbasis Kitosan

Immobilisasi Enzim dan Studi Pengaruh Aktivasi, pH dan Konsentrasi Larutan Enzim terhadap Kapasitas Pengikatan Enzim

Studi Stabilitas Immobiliasi EnzimPengamatan terhadap Difusi Glukosa pada

Membran Komposit dan Studi Kinetika Reaksi Enzimatik

Pembuatan elektroda kerja dan pabrikasi biosensor

Pengamatan Perilaku Elektrokimia Biosensor

Pembahasan Pembuatan dan Karakterisasi Membran

Kitosan dan Membran Komposit Berbasis Kitosan

menunjukan hubungan antara konsentrasi kitosan (2 dan 2,5 % (w/v)) terhadap permeabilitas membran, dimana permeabilitas membran dengan konsentrasi 2 % (w/v) lebih besar dibandingkan membran dengan konsentrasi 2,5 % (w/v), dimana masing-masing permeabilitasnya adalah 113 ml/jam.cm2.bar dan 95 ml/jam.cm2.bar.

Immobilisasi enzim dan Studi pengaruh aktivasi, pH dan Konsentrasi Larutan Enzim terhadap Kapasitas Pengikatan Enzim

Studi Stabilitas Immobilisasi Enzim

Hal ini dikarenakan membran kitosan yang teraktivasi dengan glutaraldehyde memungkinkan terjadinya ikatan kovalen dengan enzim. Ikatan kovalen ini mempunyai kekuatan yang lebih besar dibandingkan dengan tanpa aktivasi yang hanya menghasilkan immobilisasi secara fisik saja.

Pengamatan terhadap Difusi Glukosa pada Membran Komposit dan Studi Kinetika Reaksi Enzimatik

Pembuatan Elektroda Kerja dan Pabrikasi Biosensor

Pengamatan Perilaku Elektrokimia Biosensor

Voltammetri merupakan salah satu metode elektroanalisis skala mikro yang mengkaji perilaku elektrokimia tentang analit berdasar pengukuran arus (I) sebagai fungsi potensial (V) pada kondisi dimana elektroda indikator atau elektroda kerja mengalami polarisasi.

Arus ini mencerminkan konsentrasi glukosa yang terukur. Reaksi (3), (4) dan (5) memperlihat reaksi redoks yang terjadi pada saat biosensor glukosa bekerja (Wang, 2008).

Perbandingan Tiga Konfigurasi

Puncak oksidasi pada konfigurasi 1 terjadi pada potensial 1,8 V (1,3 mA). Sedangkan untuk konfigurasi 2 dan 3 masing-masing mempunyai puncak oksidasi pada potensial 1,7 V (1,3 mA) dan 1,95 V (2,3 mA). Puncak reduksi tidak terlihat untuk semua konfigurasi. Konfigurasi 1 dan 2 relatif menghasilkan tinggi puncak oksidasi yang sama yang menghasilkan besar arus sebesar 1,3 mA. Konfigurasi yang ketiga menghasilkan puncak oksidasi yang lebih besar dengan arus sebesar 2,3 mA hal ini dikarenakan carbon nano tube (CNT) meningkatkan sensitivitas dan kecepatan transfer produk ke elektroda karena sifat CNT yang dapat meningkatkan aktivitas elektronik.

Kesimpulan

Membran kitosan terbaik dibuat dengan kombinasi EIPS dan NIPS dimana pelarut yang digunakan adalah asam asetat 1% (v/v), konsentrasi kitosan 2 % (w/v) dan lama perendaman NaOH 2 hari.

Enzim GOx yang diimmobilisasi pada membran teraktivasi memberikan konsentrasi enzim terikat lebih besar dan kestabilan yang lebih lama dibandingkan tanpa aktivasi.

pH optimum untuk Immobilisasi GOx didapat pada pH 5. Konsentrasi larutan enzim berpengaruh terhadap konsentrasi enzim yang terikat.

Didapat Km dan Vmaks masing-masing sebesar 0,36 mM dan 102 mM/menit.

Konfigurasi 3 (E-M-K&CNT-Ez) menghasilkan puncak oksidasi terbesar dengan arus sebesar 2,3 mA.