BAB I

PENDAHULUAN

Pencarian sumber senyawa bioaktif terus menerus dilakukan seiring

dengan makin banyaknya penyakit-penyakit baru yang bermunculan, mulai dari

penyakit infeksi, kanker, dan beberapa penyakit berbahaya lainnya. Senyawa

bioaktif dapat diperoleh dari

beberapa sumber, diantaranya dari tumbuhan, hewan, mikroba dan organisme laut.

Salah satu sumber senyawa bioaktif yang berasal dari mikroba adalah mikroba

endofit. Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang

sangat potensial untuk dikembangkan menjadi obat. Mikroba endofit memiliki

potensi yang besar dalam pencarian sumber-sumber obat baru. Hal ini karena

mikroba merupakan organisme yang mudah ditumbuhkan, memiliki siklus hidup

yang pendek dan dapat menghasilkan jumlah senyawa bioaktif dalam jumlah

besar dengan metode fermentasi.

Mikroba endofit merupakan mikroorganisme yang tumbuh dalam jaringan

tumbuhan dan dapat dijumpai pada bagian akar, daun serta batang tumbuhan.

Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang dapat

berperan sebagai antimikrobia, anti malaria, antikanker, dan juga dapat digunakan

dalam dunia pertanian dan industri. Mikroba endofit memiliki prospek yang baik

dalam penemuan sumber-sumber senyawa bioaktif yang dalam perkembangan

lebih lanjut dapat dijadikan sebagai sumber penemuan obat untuk berbagai macam

penyakit.

Beberapa metabolit endofit menunjukkan aktivitas antibakteri, antifungi,

hormon pertumbuhan tanaman, insektisida, imunosupresan dan lain-lain. Aktivitas

antimikroba metabolit endofit dihasilkan sebagai mekanisme pertahanan diri

terhadap serangan bakteri dan jamur patogen bagi inangnya.

1

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

I. MIKROBA ENDOFIT

I.1 DEFINISI MIKROBA ENDOFIT

Mikroba endofit dapat ditemukan hampir di semua tumbuhan di muka

bumi ini, dan merupakan mikroba yang tumbuh di dalam jaringan

tumbuhan. Mikroba endofit dapat diisolasi dari akar, batang dan daun suatu

tumbuhan. Bakteri dan fungi adalah jenis mikroba yang umum ditemukan

sebagai mikroba endofit, akan tetapi yang banyak diisolasi adalah golongan

fungi.

Hubungan antara mikroba endofit dan inangnya dapat berbentuk

simbiosis mutualisma sampai hubungan yang patogenik. Hubungan

simbiosis mutualisme ditandai dengan hubungan yang saling

menguntungkan antara mikroba endofit dan tumbuhan inangnya. Mikroba

endofit dapat melindungi tumbuhan inang dari serangan patogen dengan

senyawa yang dikeluarkan oleh mikroba endofit. Senyawa yang dikeluarkan

mikroba endofit berupa senyawa metabolit sekunder yang merupakan

senyawa bioaktif dan dapat berfungsi untuk membunuh patogen. Tumbuhan

inang menyediakan nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba endofit untuk

melengkapi siklus hidupnya.

2

Gambar. Isolat Fungi Endofit

Menurut Worang (2003), Asosiasi Jamur endofit dengan tumbuhan

inangnya dapat digolongkan dalam dua kelompok, yaitu mutualisme

konstitutif dan induktif. Mutualisme konstitutif merupakan asosiasi yang

erat antara Jamur dengan tumbuhan terutama rumput-rumputan. Pada

kelompok ini Jamur endofit menginfeksi ovula (benih) inang, dan

penyebarannya melalui benih serta organ penyerbukan inang. Mutualisme

induktif adalah asosiasi antara Jamur dengan tumbuhan inang, yang

penyebarannya terjadi secara bebas melalui air dan udara. Ditinjau dari sisi

taksonomi dan ekologi, Jamur ini merupakan organisme yang sangat

heterogen.

Purwanto (2000), menambahkan bahwasannya mikroorganisme endofit

akan mengeluarkan suatu metabolit sekunder yang merupakan senyawa

antibiotik itu sendiri. Metabolit sekunder merupakan senyawa yang

disintesis oleh suatu mikroba, tidak untuk memenuhi kebutuhan primernya

(tumbuh dan berkembang) melainkan untuk mempertahankan eksistensinya

dalam berinteraksi dengan lingkungannya. Metabolit sekunder yang

dihasilkan oleh mikroorganisme endofit merupakan senyawa antibiotik yang

mampu melindungi tanaman dari serangan hama insekta, mikroba patogen,

atau hewan pemangsanya, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai agen

biokontrol.

Metabolit sekunder yang dihasilkanakan lebih aktif dan spesifik jika

diisolasi dari mikroba yang hidup pada biotop yang spesifik. Mikroba

endofit terutama yang hidup di lingkungan yang spesifik atau bahkan di

lingkungan yang tidak umum sering digunakan sebagai sumber penemuan

senyawa bioaktif baru. Beberapa tumbuhan dapat menurunkan senyawa

bioaktif yang dikandungnya kepada mikroba endofit yang tumbuh dalam

jaringannya, sehingga mikroba endofit tersebut dapat menghasilkan

senyawa yang sama dengan inangnya. Sebagai contoh adalah senyawa taxol,

sebagai senyawaantikanker yang dihasilkan oleh tumbuhan Taxus brevifolia.

Pada tahun 1993, senyawa ini ternyata dapat diisolasi dari Taxomyces

3

andreanae, fungi endofit yang tumbuh pada tumbuhan T. brevifolia. Contoh

lain adalah senyawa Oleandrin sebagai senyawa antikanker, selain

dihasilkan oleh tanaman Nerium indicum, ternyata juga dihasilkan oleh

fungi endofit yang diisolasi dari daun Nerium indicum (Prihatiningtias,

unpublished). Menurut Tan & Zou (2000), mikrobaendofit memang dapat

menghasilkan senyawa bioaktif yang karakternya mirip atau sama dengan

inangnya. Hal ini disebabkan adanya pertukaran genetik yang terjadi antara

inang dan mikroba endofit secara evolusioner.

II.1.2 ISOLASI MIKROBA ENDOFIT

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan suatu mikroorganisme dari

lingkungannya, sehingga diperoleh biakan yang sudah tidak tercampur

dengan biakan lain atau disebut biakan murni. Sebelum dilakukan isolasi,

diperlukan perlakuan-perlakuan awal (pretreatments) untuk keberhasilan

proses isolasi tersebut. Pretreatments yang dilakukan tergantung dari

karakteristik substrat atau inang tempat kapang endofit berada. Metode

surface sterilization digunakan sebagai perlakuan awal (pretreatment) untuk

mengisolasi kapang endofit yang berasal dari organ tumbuhan yang masih

dalam keadaan segar.

Metode tersebut bertujuan menghilangkan mikroorganisme epifit yang

berada di permukaan tumbuhan, sehingga koloni yang diperoleh merupakan

koloni endofit yang berasal dari dalam jaringan. Disinfektan adalah senyawa

kimia yang digunakan dalam proses disinfeksi, yaitu proses mengurangi

mikroorganisme kapang untuk mengetahui identitas dari kapang tersebut.

Pengamatan karakter morfologi dilakukan secara mikroskopik dan

makroskopik.

Pada umumnya jamur endofit diisolasi dari organ tumbuhan yang

masih segar dan telah disterilkan permukaannya. Untuk sterilisasi

permukaan organ tumbuhan yang umum digunakan adalah dengan cara

merendamnya dalam alkohol (70%-95%). Namun, kemampuan alkohol

untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan tersebut memiliki spektrum

4

yang sempit dan sangat terbatas, sehingga perlu dikombinasikan dengan

bahan kimia lainnya. Bahan kimia yang sering dikombinasikan biasanya

adalah natrium hipoklorit (NaOCl). Medium tumbuh untuk proses isolasi

jamur akan berpengaruh terhadap jumlah dan jenis jamur yang akan

diisolasi. Agusta et al (2006), telah mengisolasi jamur endofit dari tanaman

teh dengan menggunakan medium corn meal malt agar (CMMA) dengan

antibiotik kloramfenikol dan telah dilaporkan terdapat 6 jenis jamur endofit

yang diperoleh. Sedangkan pada proses isolasi dengan menggunakan

medium agar dan tanpa penambahan antibiotik diperoleh 2 jenis jamur yang

berbeda. Pada medium agar, khamir atau yeast juga memperlihatkan

pertumbuhan yang sangat lambat sehingga dapat digunakan untuk purifikasi

isolat jamur yang tercampur dengan khamir.

Berikut ini merupakan contoh tahapan isolasi jamur endofit yang dilakukan

oleh Agusta et al,( 2006) dari ranting muda tanaman teh :

1. Organ tumbuhan tertentu (ranting) dicuci bersih dengan air dan

kemudian dipotong-potong dengan ukuran panjang tertentu.

2. Dilakukan sterilisasi terhadap ranting yang telah dipotong dengan

merendamnya dalam etanol 75% selama 1 menit, dalam larutan natrium

hipoklorit selama 0.5 menit dan direndam kembali dengan etanol 75%

selama 0.5 menit.

3. Ranting yang telah disterilisasikan selanjutnya dibelah dengan

menggunakan pemotong steril.

4. Potongan ranting kemudian diletakan diatas medium CMMA yang

mengandung kloramfenikol (0.5 mg/ ml)

5. Koloni-koloni yang telah tumbuh selanjutnya dipisahkan dengan

menginokulasikannya ke dalam medium PDA (Potato Dextro Agar).

Ada beberapa ketentuan untuk dapat mengisolasi mikroba endofit yang

mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang potensial, diantaranya yaitu:

5

1. Tumbuhan inang fungi endofit merupakan tumbuhan yang tumbuh pada

lingkungan yang khas.

2. Tumbuhan tersebut memiliki sejarah ethnobotani yang berhubungan erat

3. dengan penggunaan spesifik tumbuhan tersebut oleh penduduk asli suatu

daerah.

4. Tumbuhan inang merupakan tumbuhan endemik pada suatu daerah.

Tumbuhan inang fungi endofit tumbuh pada daerah yang memiliki

biodiversitas yang tinggi. Dengan demikian, usaha penemuan mikroba

endofit yang spesifik sebagai penghasil antibiotik tidak dapat dilakukan

secara random. Tumbuhan sebagai inang fungi endofit harus memiliki

proses seleksi tertentu berdasarkan pengaruh lingkungannya, umur dan

sejarah tumbuhan inang, serta berdasarkan penggunaan tumbuhan inang

secara etnobotani.

II. SISTEM IMMUNITAS

Imunitas adalah perlindungan terhadap penyakit, dan lebih spesifik

lagi perlindungan terhadap infeksi. Sel dan molekul yang bertanggung

jawab atas imunitas disebut sistem imun dan respon komponennya secara

bersama dan terkordinasi disebut respon imun (Kresno, 2001). Pengertian

lain dari imunitas yaitu resistensi penyakit terutama penyakit infeksi.

Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan dalam resistensi

terhadap infeksi disebut sistem imun dan reaksi yang dikordinasi sel-sel dan

molekul-molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya disebut respon imun.

Sistem imun diperlukan tubuh untuk mempertahankan keutuhannya

terhadap bahaya yang dapat ditimbulkan berbagai bahan dalam lingkungan

hidup (Baratawidjaja, 2004).

Sistem imun dirancang untuk melindungi inang (host) dari patogen-

patogen penginvasi dan untuk menghilangkan penyakit. Perlindungan dari

infeksi dan penyakit diberikan oleh dua komponen utama yaitu sistem imun

bawaan dan sistem imun adaptif (Katzung, 2004). Sistem imun alamiah 6

dikenal juga dengan sistem imun non spesifik dan sistem imun adaptif

dikenal juga dengan sitem imun spesifik. Disebut pertahanan non spesifik

karena mekanismenya tidak menunjukan spesifitas terhadap bahan asing

dan mampu melindungi tubuh terhadap banyak patogen potensial dan

jumlahnya dapat ditingkatkan oleh infeksi (Baratawidjaya, 2004).

Pertahanan non spesifik meliputi kulit dan membran mukosa, sel-sel fagosit,

komplemen, lisozim, interferon, semua mekanisme pertahanan ini

merupakan bawaan (innate), berperan sebagai garis pertahanan pertama dan

menghambat kebanyakan patogen potensial sebelum menjadi infeksi

(Wahab, 2002).

Mekanisme pertahanan spesifik meliputi sistem produksi antibodi oleh

sel B dan sistem imunitas seluler oleh sel T. Sistem pertahanan ini bersifat

adaptif atau didapat yaitu menghasilkan reaksi spesifik pada setiap agen

infeksi yang dikenali karena telah terjadi pemajanan terhadap mikroba atau

determinan antigenik tersebut sebelumnya. Sistem pertahanan ini sangat

efektif dalam memberantas infeksi serta, mengingat agen infeksi tertentu

sehingga dapat mencegah terjadinya penyakit dikemudian hari (Wahab,

2002). Sistem imun spesifik mempunyai memampuan untuk mengenal

benda yang dianggap asing bagi dirinya. Disebut spesifik karena sistem

pertahanan ini hanya dapat menyingkirkan benda asing yang sudah dikenal

sebelumnya (Baratawidjaya, 2004).

Respon imun sangat bergantung pada kemampuan sistem imun untuk

mengenali molekul asing (antigen) yang terdapat pada patogen potensial dan

kemudian membangkitkan reaksi yang tepat untuk menyingkirkan sumber

antigen bersangkutan. Proses pengenalan antigen dilakukan oleh unsur

utama sistem imun yaitu limfosit yang kemudian diikuti oleh fase efektor

yang melibatkan berbagai jenis sel (Kresno, 2001). Respon imun ditengahi

oleh berbagai sel dan molekul larut yang diseksresi oleh sel-sel tersebut.

Sel-sel utama yang terlibat dalan reaksi imun adalah limfosit (Sel B, sel T,

sel NK), fagosit (neutrofi, eosinofil, monosit, dan makrofag), sel asesori

(basofil, sel mast, dan trombosit), sel-sel jaringan, dan lin-lain. Bahan larut

7

yang disekresi dapat berupa antibodi, komplemen, mediator radang, dan

sitokin (Wahab, 2002).

Fagositosis dan Makrofag

Fagositosis merupakan salah satu pertahanan seluler non spesifik,

berfungsi untuk menangkap dan menghancurkan mikroorganisme dan benda

asing lain yang menginvansi tubuh sedangkan antibodi termasuk komponen

imun humoral spesifik (Baratawidjaja, 2004). Proses fagositosis adalah

bagiasn dari proses imun non spesifik dan memainkan peran pada

pertemuan pertama hospes dengan benda asing. Fagisitosis yaitu suatu

proses ingesti partikel oleh sel, fagositosis yang berperan dalam proses

penelanan dan makan partikel-partikel atau cairan dari lingkungannya dan

kelompok-kelompok sel khusus yang melaksanakan fungsi-fungsi tersebut

disebut disebut sebagai sel fagositik. Proses fagositosis merupakan prinsip

dari mekanisme penghancuran bakteri ekstraseluler yang patogen.

Fagositosis berarti proses penangkapan substansi yang masuk kedalam

tubuh dan dianggap asing oleh oleh sel-sel fagosit (Sunaryo,2006).

Sel mononuclear (makrofag) berasal dari promosit sumsum tulang

yang berdiferensiasi menjadi monosit darah dan tinggal di jaringan menjadi

makrofag yang matang. Fungsi makrofag dalam sel fagositosis meliputi

aktivitas membunuh, menghancurkan dan mengeliminasi antigen dari tubuh,

makrofag berfungsi pula sebagai Antigen Precenting Cell (APC) yang

menghancurkan antigen dan komponen antigen yang dihancurkan akan

berinteraksi dengan sistem imun spesifik. Makrofag dapat hidup lama,

mempunyai beberapa granul dan melepas berbagai bahan diantaranya

lisozim, komplemen, interferon, dan sitokin yang semuanya memberikan

kontribusi dalam pertahanan non spesifik dan spesifik. Makrofag sangat

dikhususkan untuk melaksanakan fungsi penelanan dan penghancuran

semua benda-benda berupa partikel dengan proses endositosis. Proses

fagositosis kadang-kadang dipermudah oleh antibodi karena partikel-

partikel yang diselimuti antibodi ditelan secara lebih efisien, komplemen

8

suatu seri protein serum dalam reaksi berurutan dapat juga terlibat sebagai

penguat fagositosis (Sunaryo,2006).

Gambar. Proses fagositosis (Roitt, 1994).

III. IMMUNOSUPRESANT

II.1 DEFINISI IMMUNOSUPRESANT

Imunosupresan adalah kelompok obat yang digunakan untuk menekan

respon imun seperti pencegah penolakan transpalansi, mengatasi penyakit

autoimun dan mencegah hemolisis rhesus dan neonatus. Sebagain dari

kelompok ini bersifat sitotokis dan digunakan sebagai antikanker.

Respon imun pada mahkluk tingkat tinggi seperti hewan vertebrata dan

manusia, terdapat dua sistem pertahanan (imunitas), yaitu imunitas

nonsepesifik (innate immunity) dan imunitas spesifik (adaptive imunity).

1. Imunitas nonspesifik

9

Merupakan mekanisme pertahanan terdepan yang meliputi komponen

fisik berupa keutuhan kulit dan mukosa; komponen biokimiawi seperti

asam lambung, lisozim, komploment ; dan komponen seluler nonspesifik

seperti netrofil dan makrofag. Netrofil dan makrofag melakukan

fagositosis terhadap benda asing dan memproduksi berbagai mediator

untuk menarik sel-sel inflamasi lain di daerah infeksi. Selanjutnya benda

asing akan dihancurkan dengan mekanisme inflamasi

2. Imunitas spesifik

Memiliki karakterisasi khusus antara lain kemampuannya untuk

bereaksi secara spesifik dengan antigen tertentu; kemampuan

membedakan antigen asing dengan antigen sendiri (nonself terhadap

self); dan kemampuan untuk bereaksi lebih cepat dan lebih efesien

terhadap antigen yang sudah dikenal sebelumnya. Respon imun spesifik

ini terdiri dari dua sistem imun , yaitu imunitas seluler dan imunitas

humoral. Imunitas seluer melibatkan sel limposit T, sedangkan imunitas

humoral melibatkan limposit B dan sel plasma yang berfungsi

memproduksi antibodi.

Aktivitas sistem imun spesifik memerlukan partisipasi kelompok

sel yang disebut sebagai antigen presenting sel.

Indikasi imunosupresan :

Imunosupresan digunakan untuk tiga indikasi utama yaitu, transplanatasi

organ, penyakit autoimun, dan pencegahan hemolisis Rhesus pada neonatus.

Prinsip umum terapi imunosupresan

Prinsip umum penggunaan imunosupresan untuk mencapai hasil terapi yang

optimal adalah sebagai berikut:

1. Respon imun primer lebih mudah dikendalikan dan ditekan dibandingkan

dengan respon imun sekunder. Tahap awal respon primer mencakup:

pengolahan antigen oleh APC, sintesis limfokin, proliferasi dan

10

diferensiasi sel-sel imun. Tahap ini merupakan yang paling sensitif

terhadap obat imunosupresan. Sebaliknya, begitu terbentuk sel memori,

maka efektifitas obat imunosupresan akan jauh berkurang.

2. Obat imunosupresan memberikan efek yang berbeda terhadap antigen

yang berbeda. Dosis yang dibutuhkan untuk menekan respon imun

terhadap suatu antigen berbeda dengan dosis untuk antigen lain.

3. Penghambatan respon imun lebih berhasil bila obat imunosupresan

diberikan sebelum paparan terhadap antigen. Sayangnya, hampir semua

penyakit autoimun baru bisa dikenal setelah autoimuitas berkembang,

sehingga relatif sulit di atasi.

II.2. JAMUR ENDOFIT SEBAGAI IMMUNOSUPRESANT

Obat-obatan immunosupresif merupakan obat yang digunakan untuk

pasien yang akan dilakukan tindakan transplantasi organ. Selain itu juga

dapat digunakan untuk mengatasi penyakit autoimun seperti rematoid atritis

dan insulin dependent diabetes. Senyawa subglutinol A dan B yang

dihasilkan oleh endofit Fusarium subglutinant yang diisolasi dari tanaman

T. wilfordii, merupakan senyawa immunosupresif yang sangat poten.

II.2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Jamur Fusarium sp

Jamur Fusarium sp. merupakan jamur yang tersebar luas baik pada

tanaman maupun dalam tanah. Beberapa spesies dari jamur ini dapat

memproduksi mycotoxin dalam biji-bijian yang dapat mempengaruhi

kesehatan manusia dan hewan jika memasuki rantai makanan. Toksin utama

yang diproduksi oleh jamur ini adalah fumonisin dan trichothecenes). Jamur

Fusarium ini juga dapat menyebabkan penyakit pada tanaman, yang disebut

sebagai penyakit layu fusarium. Penyakit layu fusarium adalah penyakit

sistemik yang menyerang tanaman mulai dari perakaran sampai titik

tumbuh.

Ciri-ciri dari Fusarium sp memiliki konidia hyaline yang terdiri dari

dua jenis yaitu makrokonidia berbentuk sabit, umumnya bersekat tiga,

11

berukuran 30 – 40 x 4,5–5,5 μm, mikrokonidia bercel-1, berbentuk bulat

telur atau lonjong, terbentuk secara tunggal atau berangkai-rangkai,

membentuk massa yang berwarna putih atau merah jambu, seperti yang

terlihat pada gambar 2.5 dibawah ini:

Gambar: Foto Mikroskopis Jamur Fusarium oxysporum; A-B foto mikroskopis

makrokonidia; C-D foto mikroskopis mikrokonidia, skala garis 25 μm; EF mikrokonidia

pada miselium, skala garis 50 μm. (Sumber: Leslie and Summerell, 2006)

Klasifikasi

Menurut Anaf (2009), klasifikasi dari cendawan ini adalah sebagai berikut:

Kindom : Fungi

Divisi : Eumycota

SubDivisi : Deuteromycotina

Kelas : Hypomycetes

Ordo : Moniliales

Famili : Tuberculariaceae

Genus : Fusarium

Spesies : Fusarium spp

II.2.2 Metabolit Sekunder dari Fungi Endofit

12

Fungi secara umum melakukan metabolisme primer dan metabolisme

sekunder. Metabolisme primer terdiri dari proses anabolisme dan

katabolisme, memanfaatkan nutrien yang berasal dari lingkungannya untuk

menghasilkan metabolit primer yang dibutuhkan bagi pertumbuhan fungi.

Sebaliknya, senyawa metabolit sekunder yang berasal dari metabolisme

sekunder merupakan senyawa tidak dibutuhkan untuk pertumbuhan

(Kavanagh 2005: 115). Metabolisme sekunder pada fungi secara umum

terjadi pada saat fase pertumbuhan akan segera berakhir dan mulai

memasuki fase stasioner. Metabolisme sekunder pada fungi juga

diasosiasikan dengan proses diferensiasi dan sporulasi. Fase terjadinya

metabolisme sekunder dikenal dengan istilah idiofase (Carlile 2001:516),

sehingga metabolit sekunder disebut juga dengan idiolite (Lengeler dkk.

1999: 627). Menurut Devaraju dan Satish (2011:75), metabolit sekunder

disekresikan oleh fungi secara ekstraselular.

Jalur pembentukan (biosynthesis pathways) metabolit sekunder sangat

beragam, tergantung dari golongan senyawa yang dihasilkan. Terdapat tiga

prekursor utama dalam pembentukan metabolit sekunder, yaitu asam

shikimat, asam amino, dan asetil-CoA. Asam shikimat merupakan prekursor

dari pembentukan berbagai senyawa aromatik, seperti asam amino aromatik,

asam sinamat, dan berbagai polifenol. Asam amino merupakan prekursor

pembentukan senyawa-senyawa alkaloid, dan beberapa antibiotik seperti

penisilin dan sefalosporin. Asetil-CoA merupakan prekursor dari

pembentukan poliasetilen, prostaglandin, antibiotik makrosiklik, polifenol,

dan isoprenoid (terpene, steroid, dan karotenoid) (Mann 1995: 7).

Jalur pembentukan metabolit sekunder pada fungi yang paling umum

ditemukan adalah jalur pembentukan poliketida. Jalur pembentukan

poliketida melibatkan asetil-CoA (asetat) sebagai prekursor. Pada jalur

pembentukan tersebut, asetil-CoA sebagai prekursor mengalami

karboksilasi dan membentuk malonil-CoA, selanjutnya tiga atau lebih

molekul malonil-CoA berkondensasi dengan asetil-CoA dan membentuk

rantai. Rantai tersebut kemudian membentuk struktur cincin (siklik) dan

13

selanjutnya termodifikasi menjadi berbagai produk metabolit sekunder

seperti antibiotik (griseofulvin dari Penicillium griseofulvum), aflatoksin

(dari Aspergillus flavus dan A. parasiticus), dan mikotoksin (patulin dari

Penicillium patulum). Jalur pembentukan lainnya adalah jalur pembentukan

isoprenoid. Jalur pembentukan isoprenoid merupakan jalur biosintesis sterol

yang juga melibatkan asetil-CoA sebagai prekursor. Tiga molekul asetil-

CoA berkondensasi membentuk asam mevalonat. Asam mevalonat

kemudian terkonversi menjadi unit isoprene yang selanjutnya terkondensasi

membentuk rantai. Rantai tersebut mengalami serangkaian proses dan

modifikasi menghasilkan metabolit sekunder, salah satunya adalah

mikotoksin yang dihasilkan oleh Fusarium spp. (Deacon 2006: 133--136).

Senyawa-senyawa metabolit sekunder yang berasal dari golongan

alkaloid, flavonoid, terpenoid, anthrakuinon, alifatik, dan senyawa bioaktif

lainnya telah diisolasi dan dikarakterisasi dari fungi endofit (Agusta 2009:

34). Berbagai potensi metabolit sekunder yang dihasilkan oleh fungi dapat

dimanfaatkan pada berbagai bidang, di antaranya bidang kedokteran dan

farmasi (Strobel dan Daisy 2003: 493). Sebagai contoh adalah senyawa

antimikroba, yang sangat berpotensi untuk dikembangkan menjadi bahan

baku obat dari berbagai penyakit (Radji 2005: 114). Hingga saat ini,

pencarian akan senyawa antimikroba baru masih terus dilakukan. Salah satu

penyebabnya adalah berkurangnya efek dari batobatan (antibiotik) yang

telah ada, seiring dengan terus berkembangnya resistensi dari

mikroorganisme penginfeksi (Strobel dan Daisy 2003: 491)

Berbagai penelitian mengenai kapang endofit yang memiliki aktivitas

antimikroba telah dilaporkan. Simarmata dkk. (2007: 90) melaporkan bahwa

beberapa isolat kapang endofit dari tanaman sambung nyawa (Gynura

procumbens) mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme, yaitu

khamir C. albicans, serta bakteri E. coli dan B. subtilis. Rubini dkk. (2005:

27) melaporkan bahwa kapang endofit Gliocladium catenulatum Gilman &

Abbott dari tumbuhan Theobroma cacao L. berperan sebagai agen antifungi

terhadap fungi patogen Crinipellis perniciosa (Stabel) Singer. Kapang

14

endofit juga mampu menghasilkan berbagai metabolit sekunder yang

bersifat bioaktif, antara lain senyawa imunosupresif, senyawa antivirus, dan

senyawa antikanker. Kapang endofit Taxomyces andreanae Strobel, A.

Stierle, D.

Stierle & W.M. Hess dari tumbuhan Taxus brevifolia Nutt, mampu

menghasilkan senyawa paclitaxel, suatu senyawa antikanker. Kapang

endofit Fusarium subglutinans (Wollenw. & Reinking) P.E. Nelson,

Toussoun & Marasas dari tumbuhan Tripterigium wilfordii mampu

menghasilkan senyawa imunosupresif subglutinol A. Senyawa

imunosupresif berpotensi dalam pengobatan penyakitpenyakit autoimun

seperti reumathoid arthritis dan insulin-dependent diabetes (Strobel dan

Daisy 2003: 498, 500). Kapang endofit Cytonaema sp. Mampu

menghasilkan senyawa antivirus cytonic acid A dan B. Senyawa tersebut

merupakan protease inhibitor dan dapat menghambat cytomegalovirus (Guo

dkk. 2000, lihat Radji 2005: 119).

III.2.3 Isolasi Jamur Endofit

Sampel dibersihkan di bawah air mengalir untuk menghilangkan berpegang

tanah ke akar dan kemudian dikeringkan. Daun, batang dan akar yang

dipisahkan dan sebelum sterilisasi, akar dibersihkan dipotong sepanjang 5

cm. Permukaan akar disterilkan dengan 4% sodium hipoklorit selama 5

menit, etanol 70% selama 1 menit dan air suling steril selama 1 menit

sampai 2-3 kali. Potongan akar yang sudah disterilkan dipindahkan dan

dimaserasi dengan alkohol secara terpisah ke dalam suspensi menggunakan

air suling dan pengenceran serial dibuat. Aliquots yang diencerkan

dipindahkan pada medium cawan steril potato dextrose-agar (PDA). Setelah

inkubasi pada 30 oC selama 7-14 hari, isolat dominan jamur diambil dan

dimurnikan. Kemurnian budaya ditentukan dari koloni morfologi.

15

IV. IMMUNOMODULATOR

IV.1 DEFINISI IMMUNOMODULATOR

Imunomodulator berasal dari kata Imuno yang berarti kekebalan dan

Modulator yang berarti pembawa. Imunomodulator adalah suatu agen atau zat

yang dapat mempengaruhi atau menjaga sistem pertahanan tubuh.

Imunomodulator merupakan obat yang bekerja dengan cara melakukan

modulasi pada sistem imun. Pada individu dengan defisiensi sistem imun

imunomodulator bekerja dengan cara merangsang (stimulan), sedangkan pada

individu dengan reaksi imun berlebih, maka imunomodulator bekerja dengan

cara menekan atau mengoptimalkan pertahanan tubuh maka secara tidak

langsung telah mengatasi atau mengurangi berbagai keadaan patologis atau

gangguan kesehatan lainnya akibat tidak optimalnya sistem pertahan tubuh,

diantaranya penyakit infeksi, alergi, kanker, neoplasma jinak atau ganas

(kanker) (Sunaryo dkk, 2007)

Imunomodulator bekerja menurut tiga cara, yaitu:

a. Imunorestorasi ialah suatu cara untuk mengembalikan fungsi sistem imun

yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistem imun

seperti imunoglobulin, plasma, transplantasi sumsum tulang, hati.

b. Imunostimulasi yang juga disebut imunopotensiasi adalah cara

memperbaiki fungsi sistem imun dengan menggunakan bahan yang

merangsang sistem tersebut. Dengan efek meningkatkan respons imun.

c. Imunosupresan merupakan tindakan untuk memperbaiki fungsi sistem

pertahanan tubuh dengan cara menekan respon imun. Kegunaan di klinik

ternyata pada transplantasi dalam mencegah reaksi penolakan dan pada

berbagai penyakit inflamasi yang menimbulkan kerusakan atau gejala

sistemik, seperti autoimun atau auto-inflamasi. (Baratawidjaya,2004).

Menurut WHO, imunomodulator haruslah memenuhi persyaratan berikut:

16

1. Secara kimiawi murni atau dapat didefinisikan secara kimia.

2. Secara biologik dapat diuraikan dengan cepat.

3. Tidak bersifat karsinogenik atau ko-karsinogenik.

4. Baik secara akut maupun kronis tidak toksik dan tidak mempunyai efek

samping farmakologik yang merugikan.

5. Tidak menyebabkan stimulasi yang terlalu kecil ataupun terlalu besar.

IV.2 ENDOFIT SEBAGAI IMMUNOMODULATOR

Ocimum sanctum Linn. telah digunakan selama ribuan tahun di Ayurveda

karena sifat penyembuhan yang beragam. Ditandai dengan aroma yang kuat

dan rasa astringent, itu dianggap dalam Ayurveda sebagai semacam "obat

mujarab kehidupan" dan diyakini untuk mempromosikan umur panjang. Tulsi

telah diklaim dalam teks-teks klasik untuk memiliki antioksidan, antiasthmatic

dan antitusif, antimalaria, antipiretik, anti-inflamasi, antidiabetes,

antiasthmatic, efek nematicidal, dan merupakan agen imunomodulator yang

baik dengan banyak sifat-sifat lainnya. Penelitian terbaru membuktikan khasiat

tanaman untuk antidiabetes, hipoglikemik, dan antioksidan, hepatoprotektif ,

kardioprotektif, antistress penyembuhan luka, anti ansietas kegiatan. Beberapa

metabolit sekunder yang penting dilaporkan dari Tulsi adalah asam oleanolic,

asam Urosolic, asam Rosmarinic, Eugenol, Carvacrol, linalol dan β-

caryophyllene, Ocimumosides A & B dan Ocimarin. Oleh karena itu

berdasarkan literatur sebelumnya, endofitik dari tanaman obat merupakan

sumber potensial untuk metabolit sekunder dan memiliki aktivitas biologis

yang sama, hal itu dianggap berharga untuk mengisolasi jamur endofit dari

akar Ocimum sanctum Linn. dan mengetahui efek untuk imunomodulator

secara in vitro dan aktivitas terhadap radikal bebas.

Bahan tanaman

Akar Ocimum sanctum Linn. dikumpulkan dari dalam dan di sekitar kawasan

Dharwad, Karnataka, India dan dikonfirmasi oleh Dr GR hegde, Karnatak

17

University, Dharwad (India). Sebuah spesimen voucher telah disimpan di

herbarium departemen pharmacognosy (SETCPD/Ph.cog/herb/19/07/2010).

Isolasi jamur endofit

Sampel dibersihkan di bawah air mengalir untuk menghilangkan berpegang

tanah ke akar dan kemudian dikeringkan. Daun, batang dan akar yang

dipisahkan dan sebelum sterilisasi, akar dibersihkan dipotong sepanjang 5 cm.

Permukaan akar disterilkan dengan 4% sodium hipoklorit selama 5 menit,

etanol 70% selama 1 menit dan air suling steril selama 1 menit sampai 2-3 kali.

Potongan akar yang sudah disterilkan dipindahkan dan dimaserasi dengan

alkohol secara terpisah ke dalam suspensi menggunakan air suling dan

pengenceran serial dibuat. Aliquots yang diencerkan dipindahkan pada medium

cawan steril potato dextrose-agar (PDA). Setelah inkubasi pada 30 oC selama

7-14 hari, isolat dominan jamur diambil dan dimurnikan. Kemurnian budaya

ditentukan dari koloni morfologi.

Aktivitas imunomodulator in vitro

Nitroblue Tetrazolium (NBT) uji

Suspensi leukosit (5x106 / mL) disiapkan di 0.5ml dari PBS (buffer fosfat

salin) plasma diaktifkan. Standar ini telah ditambahkan ke tabung 1 dan ke

tabung lain ada ditambahkan 0,1 mL berbeda konsentrasi (5, 10, 25, 50 dan

100 mg / mL) dari sampel uji; 0,2 mL baru disiapkan larutan NBT 0,15%

ditambahkan ke masing-masing tabung dan diinkubasi pada suhu 37 º C selama

20 menit. Selanjutnya mereka disentrifugasi pada 400 gram selama 3-4 menit

untuk membuang supernatan. Sel-sel tersebut disuspensi dalam volume kecil

larutan PBS. Sebuah film tipis dibuat dengan tetesan pada slide, kering, tetap

dengan pemanasan, kontra diwarnai dengan encer carbol-fuchsin selama 15

detik. Slide dicuci di bawah air keran, dikeringkan dan diamati di bawah

mikroskop dengan pembesaran 100x dengan bantuan minyak imersi; 200

neutrofil dihitung untuk % sel positif NBT yang mengandung butiran biru /

benjolan.

18

Fagositosis membunuh Candida albicans

Persiapan Candida albicans suspensi

The Candida albicans budaya diinkubasi dalam Sabouraud kaldu semalam

dan kemudian disentrifugasi untuk membentuk dasar sel dan supernatan

dibuang. Sel dicuci dengan steril Hank Seimbang Salt Solution (HBSS) dan

disentrifugasi lagi. Ini diulangi 3-4 kali. Tombol Sel akhir dicampur dengan

campuran steril HBSS dan serum manusia dalam proporsi 4:1. Suspensi sel

akhir konsentrasi 1 x108 digunakan untuk percobaan.

Slide Preparation

Darah manusia (0,2 mL) diperoleh dengan metode tusukan jari pada slide

kaca steril dan diinkubasi pada suhu 37 º C selama 25 menit untuk

memungkinkan pembekuan. Bekuan darah telah dihapus dengan sangat

lembut dan geser terkuras perlahan-lahan dengan steril saline normal,

mengurus untuk tidak mencuci neutrofil ditaati \ (Tak terlihat). Slide terdiri

dari neutrofil polimorfonuklear (PMN) adalah banjir dengan konsentrasi

sampel uji dan diinkubasi pada suhu 37 º C selama 15 min. Para PMN

ditutupi dengan Candida albicans suspensi dan

diinkubasi pada suhu 37 º C selama 1 jam. Slide dikeringkan, tetap dengan

metanol dan diwarnai dengan Giemsa stain.

Evaluasi fagositosis

Jumlah rata-rata sel Candida phagocytosed oleh PMN pada slide ditentukan

secara mikroskopis untuk 100 granulosit menggunakan kriteria morfologi.

Jumlah ini diambil sebagai Indeks fagositosis (PI) dan dibandingkan dengan

PI basal kontrol. Prosedur ini diulang untuk konsentrasi yang berbeda (5, 10,

25, 50 dan 100 mg / mL) dari sampel uji. Imunostimulasi dalam% dihitung

19

dengan menggunakan persamaan berikut. Stimulasi (%) = PI (test) - PI

(kontrol) x 100/PI (kontrol)

Assay Candidacidal

Suspensi leukosit (7 × 106/mL) disiapkan dalam 0,25 mL larutan Hank dalam

7 tabung. Sebuah volume 0,25 mL larutan Hank (kontrol) dan 0,25 mL

dikumpulkan serum (standar) ditambahkan ke 1 dan tabung 2 masing-masing,

dan yang lain 5 tabung ditambahkan 0,25 mL berbeda konsentrasi (5, 10, 20,

40, 50, 100 mg / mL) dari sampel uji. 0,25 mL Candida albicans suspensi

ditambahkan ke masing-masing tabung dan diinkubasi pada suhu 37 ° C

dalam penangas air selama 60 menit dengan gemetar setiap 15 menit. Setelah

30 menit, 0,1 mL larutan diambil pada slide kaca dari masing-masing tabung

ke membuat film tipis. Slide diwarnai dengan Giemsa stain dan diamati pada

mikroskop dengan pembesaran 100x. Ini harus menunjukkan bahwa sebagian

besar organisme Candida telah ditelan oleh leukosit. Pada akhir satu jam

inkubasi, 0,25 mL dari 2,5% natrium deoksikolat ditambahkan ke masing-

masing tabung dan dicampur.

Pergerakan Neutrofil dan kemotaksis tes

Suspensi sel neutrofil disiapkan dalam larutan buffer fosfat saline (PBS) pada

sekitar 106 sel / mL. Kompartemen yang lebih rendah dari kemo ruang taktik

untuk pH 7,2 misalnya ruang solusi 1-PBS (kontrol); ruang 2-casin 1 mg / L

(standar); dan ruang 3, 4, 5, 6, 7 dengan konsentrasi yang berbeda (5, 10, 25,

50 dan 100 mg / mL) dari sampel uji. Kompartemen atas (1mL jarum suntik)

diisi dengan suspensi sel neutrofil dan filter basah (Millipore) 3mm ukuran

pori itu tetap di bagian bawah kompartemen atas. Kompartemen atas

ditempatkan ke dalam kompartemen yang lebih rendah dan diinkubasi pada

suhu 37 º C selama 180 menit. Kompartemen atas telah dihapus dan terbalik

untuk mengosongkan cairan. Permukaan bawah filter tetap dengan etanol

70% selama 2 menit dan kemudian diwarnai dengan pewarna Hematoksilin

20

selama 5 menit. Filter tetap diamati di bawah mikroskop menggunakan lensa

100 X dan jumlah sel neutrofil yang mencapai permukaan yang lebih rendah

dihitung.

Hasil dan Diskusi

Dalam akar Ocimum santum Linn. ditemukan berbagai jamur. Empat isolat

jamur murni diperoleh dari akar Ocimum santum Linn. dan ditunjuk-TRF 1,

TRF-2 TRF-3 dan TRF-6. Hasil etil asetat ekstrak jamur mentah TRF-3 dan

TRF-6 ditemukan menjadi 85 mg dan 75 mg per liter medium fermentasi.

Dalam kegiatan imunomodulator vitro Dalam kasus nitroblue tetrazolium

assay, TRF-3 dan TRF-6 telah meningkat secara signifikan pengurangan

interacellular dari NBT pewarna untuk formazan oleh neutrofil yang

tergantung pada metabolisme dorong dihasilkan melalui heksosa monofosfat

shunt aktivasi, yang diperlukan untuk aktivitas anti mikroba. Dosis penurunan

tergantung pada neutrofil diamati dengan penurunan maksimum 89,78%

untuk TRF-3 dan 74,75% untuk TRF-6 masing-masing di NBT assay (Tabel

I).

Fraksi endofit TRF-3 dan TRF-6 telah merangsang fagositosis dan

membunuh Candida albicans. Kedua fraksi jamur merangsang fagositosis

pada 10, 25, 50 dan 100 mg / mL masing-masing. Angka-angka partikel rata-

rata (MPN) yang ditemukan 4, 4-5, dan 7-8 untuk TRF-3 pada konsentrasi 25

21

mg / mL, 50 mg / mL dan 100 mg / mL, sedangkan untuk TRF-6 MPN

ditemukan menjadi 4, 4-5, dan 7-8 untuk 5 pada konsentrasi 10 mg / mL, 25

mg / mL 50 mg / mL dan 100 mg / mL masing-masing bila dibandingkan

dengan standar (pooled serum-4 , 4-5, 4, 5-6, 6) pada konsentrasi belajar.

Hasilnya ditunjukkan pada Tabel II.

Dalam kasus Candidacidal assay, TRF-3 dan TRF-6 telah secara signifikan

menunjukkan peningkatan sel-sel mati, yang, ketika diobati dengan metilen

biru, menyerap warna biru maka bertanggung jawab untuk aktivitas

imunostimulan. Fraksi endofit TRF-3 dan TRF-6 telah menunjukkan aktivitas

candidacidal signifikan terhadap tingkat 38,25% dan 43.00.00% pada 100 mg

/ mL masing-masing dibandingkan dengan standar (31,5%) dan kontrol

normal (18,05%) pada 100 mg / mL (Tabel III).

22

Dalam kasus neutrofil dan kemotaksis assay, fraksi endofit TRF-3 dan TRF-6

telah menunjukkan aktivitas chemotactic sangat signifikan pada semua

konsentrasi. Rata-rata jumlah neutrofil per lapangan untuk TRF-3 dan TRF-6

pada 100 mg / mL ditemukan menjadi 2,57 dan 2,35 masing-masing bila

dibandingkan dengan Casein (2,35). Hasilnya ditunjukkan pada Tabel IV.

Kegiatan imunomodulasi mengacu pada efek biologis atau farmakologis dari

senyawa pada aspek hormonall atau seluler respon imun. Respon kekebalan

tubuh manusia adalah sistem yang sangat kompleks dan luar biasa canggih

yang melibatkan kedua mekanisme bawaan dan adaptif [28]. Modulasi respon

imun melalui stimulasi atau penekanan dapat membantu dalam

mempertahankan keadaan bebas penyakit. Agen yang mengaktifkan

mekanisme pertahanan sel induk di hadapan sebuah respon kekebalan yang

rusak dapat memberikan terapi suportif terhadap kemoterapi konvensional

[41]. Jamur endofit merupakan sumber yang kaya senyawa organik dengan

aktivitas biologis yang menarik dan tingkat keanekaragaman hayati yang

tinggi. Mereka mewakili sumber ekologi yang relatif belum diselidiki, dan

metabolisme sekunder mereka sangat aktif karena interaksi metabolisme

mereka dengan sel inang mereka [15]. Sebuah usaha telah dilakukan dalam

penelitian ini untuk mengevaluasi radikal bebas dan in vitro aktivitas

imunomodulator dari fraksi jamur endofit (TRF-3 dan TRF-6) dari akar

Ocimum sanctum Linn.

23

Penyelidikan fitokimia awal TRF-3 dan TRF-6 mengungkapkan adanya

glikosida, flavonoid, tanin sebagai metabolit sekunder yang penting. Dalam

penelitian ini, fraksi-fraksi dari TRF-3 dan TRF-6 secara signifikan

meningkatkan fungsi fagositik neutrofil manusia, bila dibandingkan dengan

kontrol menunjukkan kemungkinan efek imunostimulan. Fraksi dari TRF-3

dan TRF-6 telah meningkat secara signifikan gerakan neutrofil chemotactic

yang ditunjukkan dengan peningkatan jumlah sel mencapai permukaan yang

lebih rendah.

Kehadiran senyawa imunostimulan pada tumbuhan tingkat tinggi telah

banyak terakhir ini, tetapi hanya jumlah terbatas produk imunosupresif yang

berasal dari tumbuhan sedikit yang dilaporkan. Produk tersebut, jika

ditoleransi dengan baik oleh pasien, mungkin akan dikembangkan menjadi

coadjuvants alternatif dalam pengobatan gangguan yang disebabkan oleh

respon imun berlebihan atau tidak diinginkan, seperti pada penyakit

autoimun, alergi, glomerulonefritis, hepatitis kronis, dll.

.

24

DAFTAR PUSTAKA

1. Widyati Prihatiningtias, Mae Sri Hartati Wahyuningsih. Prospek Mikroba

Endofit sebagai Sumber Senyawa Bioaktif Prospect Of Endophyre as A

Bioactive Compound Source. Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta

2. Agusta, A. 2009. Biologi dan kimia jamur endofit. Penerbit ITB, Bandung: vii

+110 hlm.

3. Ando, K., C. Nakashima, J.Y. Park, & M. Otoguro. 2003. Workshop on isolation methods of microbes. Research and Development Center for Biotechnology Indonesia Institute of Science: 44 hlm.

4. Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2003. Biologi Jilid 2. Terj. Dari Biology; oleh Manalu, W. Erlangga, Jakarta: xxii + 404 hlm.

5. Deacon, J.W. 2006. Fungal biology. Blackwell publishing, Cornwall: iv + 371 hlm.

6. Gandjar, I., R.A. Samson, K. van den Tweel-Vermeulen, A. Oetari, & I. Santoso. 1999. Pengenalan kapang tropik umum. Yayasan Obor Indonesia. Jakarta: xiii + 136 hlm.

7. Gandjar, I., W. Sjamsuridzal, A. Oetari. 2006. Mikologi dasar dan terapan. Yayasan Obor Indonesia, Jakarta: xi + 236 hlm.

8. Hanson, J.R. 2008. The chemistry of fungi. RSC Publishing, Cambridge: xi + 221 hlm.

9. Hogg, S. 2005. Essential microbiology. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex: x + 468 hlm.

10. Kavanagh, K. 2005. Fungi,biology and applications. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex: xi + 267 hlm.

11. Muliana, D. 2007. Penapisan isolat kapang dari serasah penghasil senyawa antimikroba terhadap bakteri dan fungi uji. Skripsi S1 Departemen Biologi FMIPA UI, Depok: vii + 107 hlm.

12. Radji, M. 2005. Peranan bioteknologi dan mikroba endofit dalam pengembangan obat herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian 2(3): 113--126.

25

13. Rubini, M.R., R.T. Silva-Ribeiro, A.W.V. Pomella, C.S. Maki, W.L. Araujo, D.R. dos Santos, & J.L. Azevedo. 2005. Diversity of endophytic fungal community of cacao (Theobroma cacao L.) and biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of Witches’ Broom Disease. Int. J.Bio. Sci. 1: 24—33.

14. Strobel, G. & B. Daisy. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. American Society of Microbiology 67(4): 491--502.

15. Strobel, G. & B. Daisy. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. American Society of Microbiology 67(4): 491--502.

16. Strobel, G., R.V. Miller, C. Miller, M. Condron, D.B. Teplow, & W.M. Hess. 1999. Cryptocandin, a potent antimycotic from endophytic fungus Cryptosporipsis quercina. Microbiology 145: 1919—1926

17. Suryanarayanan, T.S., N. Thirunavukkarasu, M.B. Govindarajulu, F. Sasse, R. Jansen, & T.S. Murali. 2009. Fungal Endophytes and Bioprospecting: An appeal for a concerted effort. Fungal Biology Reviews 23 (1--2): 9--19.

18. Tan, R.X. & W.X. Zou. 2001. Endophyte: a rich source of functional metabolites. Nat. Prod. Rep 18: 448--459.

19. Webster, J. & R.W.S. Weber. 2007. Introduction to fungi. 3rd ed. Cambridge University Press, New York: xix + 841 hlm.

20. Yu, H., L. Zhang, L. Li, C. Zheng, L. Guo, W. Li, P. Sun, & L. Qin. 2010. Recent development and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes. Microbiol. Res. 165(6): 437--449.

26

27