4

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroba Endofit

Mikroba endofit merupakan mikroorganisme hidup dalam jaringan vaskuler

tumbuhan (xylem dan phloem) yang memiliki ukuran mikroskopis yang terdapat

pada akar, batang, daun dan buah. Mikroba endofit memiliki peranan, seperti

meningkatkan pengambilan nutrien tumbuhan (Chanway, 1996 ; Suciatmih,

2015), meningkatkan pertumbuhan dan vigor tumbuhan (Ting et al., 2008 ;

Suciatmih, 2015), memberikan resistensi tumbuhan melawan infeksi patogen

(Ting et al., 2008 ; Suciatmih, 2015) dan sumber metabolit sekunder (Strobel dan

Deasy, 2003 ; Suciatmih, 2015).

Mikroba endofit memiliki potensi menghasilkan metabolit sekunder yang

memiliki daya antimikroba, antimalaria, antikanker, dan sebagainya. Metabolit

sekunder yang hidup pada biotop yang spesifikakan lebih aktif dan spesifik jika

diisolasi dari mikroba. Mikroba endofit yang hidup dalam lingkungan spesifik

ataupun lingkungan ekstrim sering ditemukan sumber penemuan senyawa

bioaktif baru.Habitat mikroba endofit mempengaruhi metabolit sekunder yang

dihasilkan. Beberapa tumbuhan dapat menurunkan senyawa bioaktif kepada

mikroba endofit yang hidup di inangnya, seperti contoh senyawa taxol yang

ditemukan pada tahun 1993 yang dihasilkan dari fungi yang tumbuh di tanaman

Taxomyces andreanae yang memiliki peranan sebagai antikanker (Strobel, 2003;

Prihatiningtias, 2003). Contoh lainnya yaitu senyawa Oleandrinmemiliki

kemampuan sebagai senyawa antikanker yang juga dihasilkan oleh fungi endofit

yang berhasil diisolasi dari daun Nerium indicum (Prihatiningtias, 2003).

5

2.2 Mangrove Sonneratia alba

Mangrove adalah vegetasi hutan yang tumbuh diantara garis pasang surut,

tumbuhan yang hidup diantara laut dan daratan. Kata mangrove mempunyai dua

arti, pertama sebagai komunitas, yaitu komunitas atau tumbuhan yang

tahanterhadap kadar garam/salinitas (pasang surut air laut) dan kedua sebagai

individu spesies (Supriharyono, 2000). Beberapa spesies mangrove yang

menyusun komunitas hutan mangrove salah satunya spesies Sonneratia alba

(family Lythraceae, genus Sonneratia). Sonneratia alba merupakan jenis

mangrove yang menempati bagian pantai paling depan di sisi laut. Tumbuhan

mangrove Sonneratia alba (pidada) telah digunakan oleh masyarakat tradisional

Indonesia untuk pengobatan luka, diare dan demam (Noor et al., 2006; Harizon

et al., 2014).

Pohon mangrove pidada (Sonneratia alba) memiliki ciri pohon yang selalu

hijau, tangkai dan ranting cenderung melebar, tinggi 3-20 m, memiliki akar nafas

yang tebal berbentuk kabel di bawah tanah dan muncul ke permukaan berbentuk

kerucut tumpul dan tingginya mencapai 25 cm (pneumaofor). Karakterstik daun

dari mangrove ini meliputi, jumlahnya tunggal, tidak bersisik, memiliki bentuk

yang seragam, tidak ada kelenjar minyak, tidak berduri, bentuk simetris, tidak

terbelah, halus atau rata, kulit daun tidak berlilin, berukuran 5-12,5 x 3-9 cm

(Giesen, 1993).Mangrove pidada tumbuh di pesisir pantai yang berkarang dan

tersebar secara vegetatif. Habitatnya di tanah berpasir dan berlumpur. Kulit

batangnya memiliki warna abu-abu atau kecoklatan, permukaannya kasar serta

retak-retak. Pada pohon muda, kulit batangnya dilapisi semacam lapisan lilin

untuk mengurangi penguapan air dari jaringannya. Bila dipangkas rantingnya

mudah beregenerasi (Noor et al., 1999).

6

.

Tumbuhan mangrove dapat hidup di daerah tropis dan subtropis dengan

menyediakan niches (relung ekologi) yang dibutuhkan flora, fauna dan mikroba.

Mikroba endofit merupakan salah satu mikroba yang ditemukan hampir semua

keluarga tumbuhan, termasuk tumbuhan mangrove. Komunitas mikroba endofit

memilikiperanan yang sangat penting dari suatu ekosistem hutan dan

berkontribusi nyata pada keanekaragaman dan struktur tumbuhan (Giordano et

al., 2009 ; Suciatmih, 2015).

2.3 Enzim

Enzim merupakan biokatalisator atau senyawa yang dapat mempercepat

jalannya suatu reaksi tanpa habis bereaksi. Keberadaan enzim akan

mempercepat perubahan substrat menjadi molekul lain yang disebut produk.

(Smith, 1997; Grisham dan Reginald, 1999). Enzim merupakan biomolekul

protein berbentuk globular yang memiliki satu rantai polipeptida atau lebih

(Wirahadikusuma, 1989). Enzim dapat mempercepat reaksisekitar 108 sampai

1011 kali lebih cepat dibandingkan dengan reaksi yang tidak dikatalisis (Poedjiadi,

1994).

Gambar 1. Mangrove Sonneratia alba. (A). Batang mangrove, (B). Daun Mangrove, dan (C). Akar Mangrove (Susmalinda, 2013).

7

Keunggulan enzim sebagai biokatalisator antara lain memiliki spesifitas

tinggi, mempercepat reaksi kimia tanpa pembentukan produk samping,

prduktivitas tinggi dan dapat menghasilkan produk akhir yang tidak

terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi dan efek kerusakan

lingkungan (Chaplin dan Bucke, 1990).

Dalam mengkatalisis suatu reaksi, enzim bekerja sangat spesifik hanya

pada substrat tertentu dan bentuk reaksi tertentu (Girindra, 1986). Adanya

gugus-gugus polar atau non-polar dalam struktur enzim inilah yang

menyebabkan kespesifikan kerja enzim (Fessenden, 1992). Enzim memiliki

peranan khusus, diantaranya enzim dapat menurunkan energi aktivasi,

mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan tetap tanpa mengubah besarnya

tetapan seimbangnya dan mengendalikan reaksi (Page, 1997).

Manfaat enzim telah digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi, dan

industri kimia. Enzim digunakan dalam bidang pangan misalnya amilase,

glukosa-isomerase, papain dan bromelin. Sedangkan dalam bidang kesehatan

contohnya amilase, lipase dan protease. Aplikasi enzim di bidang bioteknologi

seperti selulase digunakan dalam proses sakarifikasi bahan berselulosa,

deterjen, industri makanan, dan pengolahan limbah pabrik kertas (Busto et al.,

1995 ; Akiba et al., 1995). Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan

mikroorganisme (Crueger et al, 1982). Namun, secara umum kebanyakan enzim

diisolasi dari mikroorganimse karena pertumbuhan mikroorganisme relatif cepat

sehingga menghasilkan enzim yang lebih banyak.

2.3.1 Klasifikasi Enzim

Menurut Lehninger (1982), Enzim dapat diklasifikasikan berdasarkan reaksi

kimia yang dikatalisis, yaitu :

8

1. Oksidoreduktase : Mengkatalisis reaksi oksidasi/reduksi yang umumnya

melibatkan transfer elektron. Contoh ; Oksidase dan dehidrogenase

2. Transferase : Mentrasnfer gugus fungsional (metil atau gugus fosfat). Contoh ;

transglikosidase, transmetilase, dan transasetilase

3. Hidrolase : Mengkatalis reaksi hidrolisis dari berbagai ikatan yang umumnya

melibatkan perpindahan air (H2O), Contoh : esterase, nuklease, deaminase,

amidase, dan protease.

4. Lyase : Memotong berbagai ikatan kimia selain hidrolisis dan oksidasi. Contoh

: desmolase.

5. Isomerase : Mengkatalisis isomerase pada molekul yang mengakibatkan

perubahan struktur molekul

6. Ligase : Menggabungkan dua molekul menjadi ikatan kovalen.

2.3.2 Sifat Katalitik Enzim

Menurut Page (1989) sifat-sifat katalitik dari enzim ialah sebagai berikut :

a. Enzim mampu meningkatkan laju rekasi pada kondisi biasa (fisiologik)

dari tekanan, suhu dan pH.

b. Enzim memiliki sifat selektifitas yang tinggi terhadap substrat yang akan

dikatalisis.

c. Enzim memberikan peningkatan laju reaksi yang tinggi dibanding dengan

katalis biasa.

2.3.3 Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah sebagai berikut :

a. Suhu

Enzim berfungsi sebagai biokatalisator atau mempercepat jalannya suatu

reaksi pada suatu sel hidup pada batas suhu tertentu, kecepatan reaksi yang

dikatalisis enzim akan meningkat seiring dengan naiknya suhu. Reaksi terjadi

9

paling cepat pada suhu optimum (Rodwell,1987). Sedangakan jika suhu terlalu

tinggi, menyebabkan enzim terdenaturasi (Poedjiadi, 1994). Pada suhu 0oC,

enzim menjadi tidak aktif dan dapat kembali aktif pada suhu normal (lay dan

Sugyo, 1992). Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu ditunjukkan dalam

Gambar 2.

Gambar 2.Hubungan aktivitas enzim dengan suhu (Rodwell, 1987)

Enzim memiliki suhu optimal antara 35oC-50oC, yaitu suhu tubuh. Aktivitas

enzim dipengaruhi oleh suhu. Jika suhu di atas dan di bawah optimalnya, maka

aktivitas enzim berkurang. Diatas suhu 50oC, secara bertahap enzim akan

menjadi inaktif karena terdenaturasinya protein. Pada suhu 100oC semua enzim

rusak. Pada suhu yang sangat rendah, enzim tidak benar-benar rusak tetapi

aktivitasnya sangat banyak berkurang (Gaman dan Sherrington, 1994).

b. pH

Sifat yang dimiliki enzim yaitu amfolitik dimana enzim mempunyai gugus

terminal karboksil dan gugus terminal asam amino serta memiliki konstanta

disosiasi pada gugus basa maupun gugus asamnya. Perubahan pH lingkungan

mempengaruhi kereaktifan enzim (Winarno, 1989). Hubungan kecepatan reaksi

dengn pH ditunjukkan pada Gambar 3.

Aktivitas

Enzim

Suhu

10

Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH (Winarno, 1989)

Enzim memiliki pH optimal sekitar pH7 (netral) dan jika medium menjadi

sangat asam atau sangat alkalis, maka enzim akan mengalami inaktivasi. Akan

tetapi beberapa enzim hanya aktif dalam keadaan asam atau alkalis. Contohnya

enzim pepsin yang bekerja pada lambung jika kondisi optimal pada pH 2 (Gaman

dan Sherrington, 1994).

Enzim memiliki konstanta disosiasi pada gugus asam ataupun gugus basa

terutama pada residu terminal karboksil dan asam aminonya. Tetapi jika enzim

bekerja pada pH yang terlalu asam ataupun terlalu basa akan menyebabkan

penurunan kecepatan reaksi dengan terjadinya denaturasi. pH optimum enzim

sekitar 4,5 sampai 8, dimana enzim mempunyai kemampuan kestabilan yang

tinggi (Williamson dan Fieser, 1992).

c. Konsentrasi Enzim

Pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim yaitu, semakin tinggi

konsentrasi enzim maka akan mempercepat reaksi pada batas konsentrasi

tertentu. Namun, hasil hidrolisis substrat akan konstan dengan naiknya

konsentrasi enzim. Hal ini disebabkan karena penambahan enzim sudah tidak

efektif lagi (Reed, 1975). Hubungan antara laju reaksi enzim dengan konsentrasi

enzim ditunjukkan dalam Gambar 4.

pH

Kecepatan

reaksi

11

Gambar 4.Hubungan laju reaksi dengan konsentrasi enzim (Reed, 1975)

d. Konsentrasi Substrat

Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi

substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat jika konsentrasi substrat meningkat.

Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga tercapai suatu titik

batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya akan sedikit

meningkatkan kecepatan reaksi (Lehninger, 1982).

e. Aktivator dan Inhibitor

Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator

merupakan senyawa atau ion yang dapat meningkatkan terjadinya reaksi

enzimatis. Komponen kimia yang membentuk ion-ion anorganik seperti Zn, Fe,

Ca, Mn, Cu, Mg atau dapat pula sebagai molekul organik kompleks yang disebut

koenzim (Martoharsono, 2006).

Menururt Wirahadikusuma (1989), inhibitor adalah zat kimia tertentu yang

menghambat aktivitas enzim. Pada umumnya cara kerja inhibitor adalah dengan

menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak dapat berikatan dengan

substrat sehingga fungsi katalitiknya terganggu (Winarno, 1989).

Kecepatan

reaksi

Konsentrasi Enzim

12

2.3.4 Teori Pembentukan Kompleks Enzim Substrat

Teori pembentukan kompleks enzim susbtrat sering disebut teori lock and

key dan teori induced-fit (Shahib, 2005) yang dapat diilustrasikan pada Gambar

5.

a. Teori lock and key (Gembok dan kunci)

Teori ini menerangkan bahwa substrat yang spesifik akan terikat pada daerah

spesifik di molekul enzim yang disebut sisi aktif. Substrat memiliki daerah

polar dan non polar pada sisi aktif yang baik bentuk maupun muatannya

merupakan pasangan substrat. Hal ini terjadi karena adanya rantai peptida

yang mengandung rantai residu yang menuntun substrat untuk berinteraksi

dengan residu katalitik. Ketika katalisis berlangsung, produk masih terikat

pada molekul enzim. Sehingga produk akan bebas dari sisi aktif dengan

terbebasnya enzim.

b. Teori induced-fit (Ketepatan induksi)

Teori ini menerangkan bahwa enzim bersifat fleksibel, dimana sebelumnya

bentuk sisi aktif tidak sesuai dengan bentuk substrat, tetapi setelah substrat

menempel pada sisi aktif, maka enzim akan terinduksi dan menyesuaikan

dengan bentuk substrat.

Gambar 5.Teori kunci gembok dan teori Induksi (Shahib, 2005).

Enzim

Substrat enzim (Active site)

substrat Enzim

Substrat enzim (Active site)

substrat

Teori Kunci Gembok Sisi Aktif Cenderung kaku

Teori Kecocokan Induksi Sisi Aktif lebih fleksibel

13

2.4 Enzim L-Asparaginase

L-asparaginase (L-asparagineamidohydrolase; E.C. 3.5.1.1.) merupakan

enzim yang dapat mengkatalis proses hidrolisis L-asparagin menjadi L- aspartat

dan amonia (Hegazy dan Moharam, 2010; Soniyamby et al., 2011). Keduanya

baik substrat maupun produk dan reaksi tersebut memegang peranan penting

dari sejumlah proses metabolisme dalam semua organisme, dari bakteri sampai

mamalia. L-asaparagin yang berlebihan pada tanaman akan disimpan dan pada

transport nitrogen digunakan untuk biosintesis protein. L-aspartat dalam tubuh

manusia berperan penting sebagai prekursor ornitin dalam siklus urea dan dalam

reaksi transaminasi membentuk oksaloasetat di jalur glukoneogenik

menghasilkan glukosa (Borek dan Jaskolski, 2001).

Gambar 6.Rekasi Enzim L-asparaginase (Borek dan Jaskolski, 2001).

2.4.1 Sejarah Enzim L-asparaginase

Awal mula ditemukannya enzim L-asparaginase sebagai agen kemoterapi

pada tahun 1953 oleh Kidd, yang pertama kali menemukan adanya aktivitas

antikanker (antilimfoma) pada serum darah marmut (serum pig). Selanjutnya,

hasil penemuan Kidd tersebut dikonfirmasi oleh Neuman dan McCoy (1956) yang

mendemonstrasikan perbedaan metabolisme serta pertumbuhan sel normal dan

sel kanker sebagai respon tidak adanya L-asparagin secara in vitro. Broome

(1961) menyimpulkan kedua penemuan tersebut, bahwa kemampuan antikanker

serum marmut yang dilaporkan oleh Kidd tersebut terjadi karena kadar L-

L-asparaginase

+ H2O

NH4-

L-aspartate L-asparagine

14

asparagin yang esensial untuk pertumbuhan sel kanker berkurang karena

aktivitas hidrolitik L-asaparaginase.

Aplikasi enzim L-asparaginase sebagai kemoterapi memiliki masalah.

Permasalahannya yaitu penggunaan marmut (guinea pig) sebagai satu-satunya

sumber L-asparaginase pada tahun 1960-an bersifat terbatas (Nagarethinam,

2012). Pada tahun 1964, Mashburn dan Wriston menemukan bahwa bakteri

E.coli mampu menghasilkan enzim L-asparaginase dalam jumah besar. E.coli

menghasilkan ensim L-asparaginase dalam jumlah yang banyak. E.coli

menghasilkan dua jenis enzim L-asparaginase yakni EC-1 yang ditemukan pada

sitoplasma sel dan EC-2 yang ditemukan pada perisplasmik. Diantara kedua

jenis enzim L-asparaginase tersebut, enzim L-asparaginase periplasmik lah yang

memiliki aktivitas antikanker. Penemuan tersebut mendorong penggunaan L-

asparaginase sebagai agen kemoterapi kanker. Pada tahun 1978, FDA

mengkonfirmasi efikasi klinis enzim L-asparaginase melalui serangkaian uji klinis

pada pasien (Nagarethinam, 2012).

2.4.2 Klasifikasi Enzim L-Asparaginase

Secara umum menurut Borek dan Jaskolski (2001), enzim L-asparaginase

diklasifikasikan menjadi tiga tipe berdasarkan sekuen asam aminonya yaitu tipe

asparaginase bakteri, tipe asparaginase tanaman, dan asparaginase Rhizobium

etil. Enzim L-asaparaginase dari bakteri dapat dibedakan menjadi dua jenis yaitu

L-asparaginase tipe I dan L-asaparaginase tipe II (Roth et al., 2009). Perbedaan

utama antara enzim L-asaparginase tipe I dan enzim L-asparaginase tipe II

adalah bentuk konformasi dan afinitasnya.

Enzim L-asparaginase tipe I memiliki konformasi dimer dan memiliki

afinitas yang rendah terhadap substrat L-asparagin (Km= 10-3 M) serta bersifat

konstitutif. Enzim L-asparaginase tipe II memiliki konformasi tetramer dengan

15

empat sisi aktif dimana setiap sisi aktif dibentuk oleh asam amino dari satu

monomer serta memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat L-asparagin (Km=

10-5 M). Enzim L-asparaginase tipe II disekresikan sebagai respon terhadap

kekurangan nitrogen selain itu ekspresi gen penyandi L-asparaginase II juga

dipengaruhi oleh perubahan aerasi, sumber karbon, dan variasi dari asam amino

(Ghasemi et al., 2008).

Enzim L-asparaginase tipe I dan tipe II juga dibedakan berdasarkan lokasi

di dalam sel, solubilitas di dalam ammonium sulfat, sensitivitas terhadap

inaktivasi suhu dan kondisi untuk ekspresi (Yano et al., 2008). Enzim L-

asparaginase tipe I merupakan enzim sitoplasmik, sedangkan enzim L-

asparaginas tipe II bersifat periplasmik (Ghasemi et al., 2008). Aktivitas enzim L-

asparaginase tipe I optimal pada pH 6.98, sedangkan enzim L-asparaginase tipe

II pada pH 7.5-9 (Youssef dan Al-Qomar, 2008).

Lebih dari 30 tahun L-asparaginase tipe II dalam dunia medis digunakan

untuk treatment acute lymphoblastic leukimia. L-asparaginase tipe II dapat

diisolasi dari E.coli dan Erwinia sp. (Roth et al., 2009). Gen yang menyandi L-

asparaginase tipe II dari Escherichia coli adalah EcAll,sedangkan L-

asparaginase tipe I adalah Ecal (Borek dan Jaskolski, 2001).

2.4.3 Sumber L-asparaginase

L-asparaginase terdapat pada banyak jaringan hewan, mikroba, tumbuhan

dan dalam serum hewan pengerat tertentu (El-Besscoumy et al., 2004; Jain et

al., 2012). L-asparaginase yang diproduksi dari mikroba memperlihatkan biaya

yang efektif dan ramah lingkungan. Mikroorganisme yang digunakan seperti

filamens dari jamur, khamir dan bakteri merupakan sumber yang bermanfaat

untuk produksi enzim L-asparaginase (Soniyamby et al., 2011).

16

Mikroba yang dapat menghasilkan enzim L-asparaginase diantaranya

adalah Escherichia coli (Ghasemi et al., 2008; Onishi et al., 2011), Bacillus

subtilis (Shukla dan Mandai, 2012), Bacillus circulans (Prakasham et al., 2010),

Serratia marcescens (Vanil et al., 2009), Pseudomonas aerogenes (Yasser et al.,

2002), Pseudomonas florescens (Al-Mazini, 2007), Streptomyces nourseii

(Dharmaraj, 2011), Aspergillus tamari (Basha et al., 2009), Asperigillus oryzae

(Olempska-Beer, 2007; Basha et al., 2009), , Aspergillus terreus (Baskar dan

renganathan, 2009), Asperigillus niger (Olempska-Beer, 2007), Erwinia aroideae

dan Proteus vulgaris (Al- Mazini, 2007), dan Fusarium egulseti (Hosamani dan

Kaliwal, 2011).

2.4.4 Aplikasi Enzim L-Asparaginase

1. Bidang Industri Farmasi

L-asparaginase digunakan dalam kemoterapi bagi penderita leukimia

terutama Acute Lymphoblastic Leukimia (ALL), chronic lymphocytic leukimia,

penyakit Hodgkin’s dan melonosarcomaand non-Hodgkin’s lymphoma (Basha et

al., 2009 ; Pandey, 2015). Acute L-asparagin dibutuhkan oleh sel leukimia untuk

pertumbuhan sel malignannya, sehingga pemberian L-asparaginase akan

mengurangi konsentrasi L-asparagin dalam sel dan pertumbuhan sel leukimia

menjadi terhambat (Siddalingeshawara dan Lingappa, 2011; Jain et al., 2012).

Sel leukimia mempunyai perbedaan dengan sel normal yaitu ekspresi yang

rendah untuk L-asparagin. Oleh karena itu, sel leukimia tidak mampu

memproduksi L-asparagin. Sebagian besar L-asparagin didapatkan dari sirkulasi

plasma darah. Jika L-asparaginase diberikan kepada pasien yang menderita

leukimia maka jumlah L-asparagin berkurang sehingga sel leukimia akan rusak

(Manikandan et al., 2010; Siddalingeshwara dan Lingappa, 2011; Jain et al.,

2012). Acute Lymphoblastic Leukimia (ALL) mempunyai karakteristik

17

pembelahannya yang berlebihan dari malignant dan lymphoblast yang tidak

matang dalam sumsum tulang belakang. Terapi yang dilakukan untuk penderita

leukimia akut adalah kemoterapi, steroid, terapi mennggunakan radiasi,

kombinasi yang intensif dengan melakukan transplantasi sumsum tulang

belakang atau sel. Dari semuanya yang paling disukai adalah kemoterapi (Jain et

al., 2012).

Enzim asparaginase sebagai terapi diproduksi secara komersial dari E.coli

dan Erwinia (Borisova et al., 2003). Produk-produk yang ada di pasaran yang

berasal dari Escherichia coli diantaranya adalah Asparaginase medac, Kidrolase,

Paronal Leunase, Elspar. Sedangkan produk dipasaran yang berasal dari

Erwinia chrysanthemi (Erwinase) adalah Oncaspar(Pieters et al., 2008).

Faktanya tidak semua L-asparaginase memiliki sifat antitumor, hal ini

berhubungan dengan afinitas dari enzim pada substrat dan faktor yang

mempengaruhi kecepatan reaksi dari sistem. Baru-baru ini diketahui bahwa L-

asparaginase yang diperoleh dari E.coli dan Erwinia carotovora memiliki aktivitas

antitumor untuk melawan acute lymphoblastic leukimia (Jain et al., 2012).

Pemberian protein enzim dalam waktu yang lama, pada umumnya

menghasilkan antibodi yang sama dalam jaringan, menghasilkan anaphylactic

shock dan mungkin juga menyebabkan efek obat menjadi netral (Jain et al.,

2012). Disamping sebagai agen terapi, obat ini juga menyebabkan reaksi

imunologi (Ebeid et al., 2008), menghasilkan sejumlah toksisitas, termasuk

trombosis, pankreatitis hiperglikemia, dan hepatotoksisitas (Earl, 2009), Tetapi

sejauh ini penghambatan aktivitas tumor telah didemonstrasikan hanya

asparaginase dari E.coli, Erwinia acroideae dan Serratia marcescens. Oleh

karena itu, L-asparaginase yang berasal dari mikroba lain dengan efek sama

sebagai agen terapi sangat diperlukan (Jain et al., 2012).

18

Gambar 7. Mekanisme penghambatan sel tumor (Sinha et al., 2013)

2. Bidang Industri Pengolahan Makanan

Selain dalam bidang farmasi, L-asparaginase juga banyak diaplikasikan

dalam bidang industri pengolahan makanan sebagai agen dalam mengurangi

terbentuknya senyawa akrilamid dalam beberapa tahun terakhir ini. Akrilamid

terbentuk oleh reaksi Maillard, yang mana terjadi antara gula pereduksi dan

asparagin bebas dengan temperatur diatas 100-120oC (Bordaet al., 2011; Sun et

al., 2016). Akrilamid adalah senyawa yang berpotensi kanker terhadap manusia.

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa akrilamid terbentuk akibat pengolahan

pada suhu tinggi terhadap asam amino asparagin, terutama apabila

dikombinasikan dengan gula pereduksi dan produk antara reaksi Maillard. Pada

tahapan intermediet reaksi Maillard, asam amino mengalami dekarboksilasi dan

deaminasi untuk membentuk senyawa aldehid yang selanjutnya akan

membentuk senyawa akrilamid (Gambar 8). Senyawa akrilamid terbentuk apabila

setelah diproses dengan suhu tinggi, permukaan pangan membutuhkan aW

(water activity, molekul air yang tidak terikat pada suatu molekul) yang relatif

Pertumbuhan

tumor

Pertumbuhan

tumor terhambat

Aspartat +

NH4-

L-Asparagine L-Asparaginase

19

rendah serta prosesnya pada temperatur ±120oC (Weisshar dan Gutsche, 2005).

Seperti gambar 8, asparagin dan gula pereduksi mengalami reaksi konjugasi

menghasilkan bentuk N-glycosylasparagine sebagai hasil akibat pengolahan

suhu tinggi melalui reaksidecarboxylated Schiff base. Reaksi deacarboxylated

Schiff Base dengan cepat membentuk senyawa akrilamid dan juga

menghidrolisis membentuk senyawa 3-aminopropionamide. Senyawa 3-

minipropionamide dipercaya merupakan prekursor yang sangat penting untuk

akrilamid (Hedgaard et al., 2008; Xu et al., 2016)

Gambar 8. Mekanisme terbentuknya senyawa akrilamid (Parker et al., 2012; Xuet al., 2016)

Sejak tahun 2002, Industri makanan telah bekerja sama dengan para

peneliti untuk mengurangi terbentuknya senyawa akrilamid dalam makanan yang

diolah dengan suhu tinggi. Teknik Mitigasi dibedakan menjadi 3 jenis. Pertama,

mereduksi bahan prekursor akrilamid dapat mengurangi terbentuknya senyawa

20

akrilamid diakhir proses, kedua pengkondisian proses selama berlangsung untuk

mengurangi jumlah terbentuknya akrilamid, dan ketiga pengkondisian setelah

proses berlangsung dapat mengurangi akrilamid (Pedreschi et al., 2014; Xu et

al., 2016). Ketiga proses tersebut sejauh ini masih dipertimbangkan oleh para

peneliti, seperti contoh penggunaan superkritikal ekstraksi CO2 untuk mengurangi

akrilamid dalam kopi. Hampir 80% senyawa akrilamid dalam kopi terbuang

menggunakan teknik ini (Banchero et al., 2013), namun uji sensori diperlukan

untuk mengetahui efek dari teknik ini.

Penggunaan L-asparaginase dalam mengurangi pembentukan senyawa

akrilamid termasuk teknik yang pertama, yaitu L-asparaginase berfungsi sebagai

prekursor penghambat terbentuknya senyawa akrilamid dalam pengolahan

makanan bersuhu tinggi. Penelitian tentang proses mitigasi senyawa akrilamid

dengan enzim L-asparaginase telah dilakukan oleh Dias et al (2017),

menjelaskan bahwa penambahan enzim L-asparaginase dari bakteri A.oryzae

CCT3940 mampu mengurangi terbentuknya senyawa akrilamid pada pengolahan

kentang goreng sebesar 72%, jika dibandingkan dengan L-asparaginase

komersial mampu menghambat terbentuknya senyawa akrilamid sebesar 92%.

2.5 Isolasi MikroorganismePenghasil Enzim L-asparaginase

Isolasi merupakan proses untuk mendapatkan mikroorganisme yang

diinginkan dari sekelompok mikrooganisme yang terdapat dalam habitat yang

sama. Isolasi bertujuan untuk mendapatkan isolat murni yang hanya terdiri dari

satu spesies saja. Isolat murni yang didapatkan kemudian ditumbuhkan dalam

media pertumbuhan untuk mendapatkan kultur isolat dalam jumlah banyak.

Hadioetomo (1995) menyebutkan bahwa terdapat tiga cara yang umum

digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme, antara lain :

1. Metode goresan (streak plate method)

21

Metode goresan merupakan metode isolasi dengan cara menggoreskan

suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan media agar dalam

petridish steril. Setelah inkubasi, pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni

terpisah pada permukaan media yang berasal dari satu biakan murni.

Gambar 9. Metode Goresan (streak plate method) (Bergey et al., 1994)

Metode ini praktis, hemat biaya dan waktu, hanya membutuhkan

ketrampilan. Kesalahan-kesalahan umum yang dilakukan dalam metode ini

adalah permukaanmedium tidak digunakan dalam proses penggoresan

menyebabkan pengenceran tidak optimal, inokulum yang digunakan banyak

menyebabkan kesulitan dalam pemisahan sel.

2. Metode Sebaran (spread plate method)

Metode sebaran merupakan metode isolasi dengan cara menyebarkan

sampel cair yang mengandung mikroorganisme pada permukaan media agar

dalam petridish steril menggunakan spreader atau hockey glass. Setelah

inkubasi, pada permukaan media akan tumbuh koloni-koloni terpisah sehingga

didapatkan biakan murni.

3. Metode Agar Tuang (pour plate method)

22

Metode agar tuang adalah metode dengan menginokulasikan suspensi

bahan yang mengandung bakteri dalam petridish steril kemudian dituang dalam

media agar dalam bentukcair pada suhu kurang dari 45oC, bertujuan agar bakteri

masih mampu hidup. Setelah inkubasi, pada permukaan media akan tumbuh

koloni-koloni terpisah sehingga didapatkan bakteri murni.

Kelemahan dari metode ini adalah membutuhkan waktu dan bahan yang

lama dan banyak akan tetapi tidak membutuhkan keterampilan tinggi. Biakan

campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan

dan didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh

koloni tunggal.

Gambar 10. Metode Sebaran (spread plate method) dan Metode Agar Tuang

(pour plate method) (Bergey et al., 1994)

Isolasi menggunakan metode gores dilakukan dengan cara menggoreskan

inokulum di permukaan medium nutrient agar secara steril (Lay, 1994). Isolasi

metode tuang dilakukan menggunakan media cair sebagai medium pengenceran

mikroba. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah

mikroorganisme, sehingga pada pengenceran terakhir akan didapatkan jumlah

sel yang semakin sedikit di dalam media. Oleh karena itu, dengan cara agar

23

tuang akan diperoleh lempengan jumlah bakteri yang optimum untuk isolasi (Lay,

1994). Penggunaan media khusus bersifat memberi kemudahan bagi tumbuhnya

galur mikroba tertentu yang dikehendaki dan dapat menghalangi tumbuhnya

galur lain yang tidak dikehendaki. Namun cara ini masih memungkinkan

tumbuhnya galur yang lain dengan sifat hampir bersamaan, akan lebih baik bila

dilanjutkan dengan pengenceran sehingga hasilnya akan lebih meyakinkan

terutama dalam hal kemurniannya (Judoamidjojo et al., 1990).

2.6 Identifikasi Molekuler 16S rRNA

Pada tahun 1980-an, standar baru identifikasi bakteri mulai dikembangkan

oleh Woose. Hubungan kekerabatan filogenetik diantara bakteri dapat ditentukan

oleh kode genetik pada daerah gen yang disebut dengan unit 5S, 16S dan 23S

rRNA dan daerah diantaranya. Gen 16S rRNA paling akurat untuk menentukan

taksonomi suatu bakteri dibandingkan dengan gen 5S dan 23S. Panjang urutan

basa gen 16S rRNA adalah 1500-1550 pasang basa. Adanya mutasi ataupun

perbedaan basa pada urutan basa tersebut dijadikan sebagai penentu identifikasi

suatu bakteri pada tingkat genus, spesies bahkan sampai galur (Clarridge, 2004).

16S rRNA paling sering digunakan karena molekul ini bersifat ubikuitus

dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme sehingga lebih mudah untuk

dianalisa. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah banyak digunakan sebagai

prosedur untuk menentukan hubungan filogenik (Pangestuti, 2006).

Perabandingan urutan basa gen 16S rRNA diantara genus bakteri menunjukkan

bahwa urutan basa tersebut mengandung informasi spesifik spesies. Untuk

tujuan identifikasi, diperlukan amplifikasi dengan menggunakan PCR dan analisis

urutan basa sedikitnya 500 pasang basa (Petrosino et al., 2009). Urutan basa

antar isolat dinyatakan homolog jika nilai kemiripannya (similiaritasnya) minimal

94% (Tannock, 2004). Gen 16S rRNA terbagi menjadi sembilan bagian yang

24

disebut dengan daerah V1 sampai V9. Disamping daerah V1-V3, daerah V6-V9

merupakan daerah divergen yang menentukan heterogenitas atau adanya

mutasi gen yang mengarah pada perbedaan spesies suatu bakteri (Cai et al.,

2003).

Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa

yang relatif konservatif dan urutan basa variatif. Perbandingan urutan basa yang

konservatif umumnya digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenik universal

karena mengalami perubahan yang relatif lambat. Sedangkan pada urutan basa

yang bersifat variatif digunakan untuk melacak keragaman dalam satu spesies.

Apabila urutan basa 16S rRNA menunjukkan derajat keasaman yang rendah

antara dua taksa, deskripsi suatu takson dapat dilakukan tanpa hibridisasi DNA.

Selain itu, apabila derajat kesamaan urutan basa gen penyandi 16S rRNA

kurang dari 95% dapat dianggap sebagai spesies baru (Masapho, 2005).

Sifat spesifik dari 16S rRNA yang khas dimiliki oleh setiap spesies bakteri.

Oleh karena itu, gen yang mengkode pembentukan 16S rRNA bisa dijadikan alat

identifikasi spesies bakteri tertentu (Tamarin, 2001). penggunaan metode analisis

gen 16S rRNA sebagai acuan identifikasi bakteri secara molekuler memiliki

keunggulan, dimana gen ini realtif konstan dan tidak berubah dalam jangka

waktu yang sangat lama atau dengan kata lain laju mutasinya sangat kecil

(Janda dan Abot, 2007).

Pada metode molekuler untuk mendeteksi gen 16S diperlukan beberapa

tahapan yang dilakukan untuk menentukan hubungan filogenik, antara lain:

1. Ekstraksi DNA

Karakterisasi molekuler merupakan karakterisasi dengan menggunakan

data molekuler. Salah satu data molekuler yang digunakan untuk

mengindentifikasi mikroorganisme adalah asam nukleat. Pada dasarnya sel

mengandung dua jenis asam nukleat yaitu DNA dan RNA. DNA yang terdapat di

25

dalam nukleus disebut dengan DNA kromosomal, sedangkan DNA yang terdapat

di luar nukleus antara lain DNA ekstrakromosomal (Davidson dan Sittman, 1999).

Beberapa metode yang digunakan untuk mengekstraksi DNA telah banyak

digunakan, antara lain metode dengan menggunakan kit ekstraksi DNA seperti

Wizard Genomic Purification buatan Promega; metode CTAB (Cationic

Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide); dan metode thermal lysis. Beberapa

metode diatas memungkinkan hasil ekstraksi DNA yang berbeda. Hal ini

bergantung terhadap efektifitas metode tersebut dalam menghasilkan isolat DNA

baik dari segi kualitas maupun kuantitas serta efisiensi waktu pengerjaannya

(Mulyani et al., 2011).

2. Polymerase Chain Reaction(PCR)

Polymerase Chain Reaction atau PCR merupakan metode in vitro untuk

mengamplifikasi fragmen DNA atau RNA target dengan memanfaatkan proses

inkubasi pada suhu yang berbeda-beda (Hsu et al., 1996). Dalam proses PCR

memerlukan beberapa bahan yaitu DNA template,sepasang primer (forward dan

reverse), nukleotida, dNTP, Taq polymerase, buffer Taq PCR, ddH2O dan ion

Mg.

Metode PCR sendiri terdiri dari beberapa tahapan, antara lain proses

denaturasi, annealing dan elongasi. Pada tahap denaturasi menggunakan suhu

tinggi, seluruh reaksi enzimatis akan berhenti dan untai ganda pada DNA akan

terpisah menjadi untai tunggal. Suhu yang digunakan adalah sekitar 90-94oC.

Pada tahap annealing, primer akan menempel pada titik tertentu pada DNA

template. Kondisi ini merupakan tahapan yang kritis, dikarenakan primer akan

menempel pada posisi tertentu dan bila menempel pada posisi target yang

diinginkan, maka didapatkan sintesis produk PCR yang diinginkan. Suhu yang

digunakan adalah 50-55oC. Kemudian pada tahap terakhir adalah elongasi

dimana enzim taq polymerase akan mensintesis DNA target hingga selesai.

26

Pada tahap ini, suhu yang digunakan disesuaikan dengan suhu optimum enzim

tag polymerase yaitu suhu 72oC (Hsu et al., 1996).

3. Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan

molekul berdasarkan muatan molekul yang dialiri dengan larutan elektrolit. Hasil

dari produk PCR dapat dilihat dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.

Agarosa merupakan polisakarida yang tersusun atas unit agarobiosa yang

berulang dengan ikatan 1,3 β-D-galaktopiranosa dan 1,4-terikat 3,6-anhidro-α-L-

galaktopiranosa dengan berat molekul 1200000 Dalton. Menurut Surzicky (2000),

migrasiselama proses elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara

lain ukuran molekul DNA, konsentrasi gel agarosa, larutan buffer, konformasi

DNA, dan besar tegangan (voltage). Pada umumnya gel agarosa yang

digunakan memiliki konsentrasi sebesar 0,8-1% yang dapat memberikan hasil

fragmen DNA ukuran 800-10000bp.

Sebelum atau sesudah proses elektroforesis ditambahkan agen pewarna

etidium bromida yang digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang

terpisah secara semi-kuantitatif. Pewarna ini mengandung zat fluorscene yang

terikat diantara untai ganda DNA sehingga pita DNA akan terlihat berpendar

ketika dianalisa dengan menggunakan UV-transiluminator (Surzicky, 2000).

4. Sekuensing DNA

Sekuensing DNA adalah suatu proses untuk menentukan susunan basa (A,

T, G, dan C) yang membentuk DNA. Sekuensing DNA pada umumnya

menggunakan primer untuk mengawali sisntesis DNA. Primer tersebut

menentukan titik awal sintesis dan arah reaksi sekuen DNA. Metode sekuensing

yang umumnya digunakan yaitu metode Maxam-Gilbert dan Sanger. Metode

Maxam-Gilbert merupakan metode sekuensing yang menggunakan bahan kimia

spesifik untuk memotong untai fragmen DNA target, sedangkan metode Sanger

27

menggunakan enzim DNA polimerase untuk membentuk salinan komplementer

dari fragmen DNA target (Sambrook et al., 1989).

Sebagian besar proses sekuensing telah dimodifikasi menjadi program

komputer, sehingga dikenal sebagai automated DNA sequencing. Proses

tersebut merupakan modifikasi dari metode Sanger yang diawali oleh tahap

cyclesequencing. Cycle sequencing adalah metode amplifikasi DNA

menggunakan satu jenis primer dan dua jenis nukleotida yaitu deoksinukleosida

trifosfat (dNTP) dan dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP). Pelekatan ddNTP pada

sekuen DNA hasil amplifikasi akan menyebabkan proses amplifikasi terhenti

akibat hilangnya gugus oksida pada untai 3’ sehingga enzim DNA polimerase

tidak dapat menempelkan dNTP pada basa berikutnya. Proses amplifikasi DNA

pada akhirnya akan menghasilkan fragmen yang berbeda-beda ukurannya yang

basa terakhirnya merupakan ddNTP. Automated NA sequencing menggunakan

ddNTP yang diberi pewarna berfluoresens. Pada saat produk hasil cycle

sequencing dijalankan pada mesin sekuensing, maka sinar laser yang mengenai

ddNTP akan berfluoresensi dan dibaca oleh detektor yang terhubung dengan

komputer dan menghasilkan grafik elektroferogram (Griffiths et al.,1996)

2.7 Analisis Hasil Sekuensing

Hasil sekuensing berupa elektroferogram dan urutan basa nukleotida

dianlisis dengan menggunakan program DNA yaitu BioEdit. Bioedit merupakan

program yang digunakan untuk mengedit dan menganalisis sequence alignment.

Bioedit dirancang untuk mengatasi permasalahan yang berhubungan dengan

waktu yang relatif lama dan kesulitan peneliti dalam mengatasi sekuen (Hall,

2007).

Hasil sequencingberupa urutan basa nukleotida kemudian dianalisis

dengan menggunakan program BLAST. Program BLAST (Basic Local Alignment

28

Search Tool) merupakan program yang berguna untuk mencari kesamaan

(similiarity) antara sekuen DNA atau protein yang ingin diketahui dengan

database sekuen lain yang terdapat pada GenBank (Bedell et al., 2003).

Program BLAST juga bekerja sangat cepat, dapat dipercaya, dan fleksibel

karena dapat diadaptasikan pada berbagai analisis sekuen. program BLAST

merupakan proram yang berasal dari National Center of Biotechnology

Information (NCBI) dan mulai banyak dikembangkan pada berbagai institusi, baik

institusi pendidikan maupun komersial (Bedell et al., 2003).

2.8 Analisis Filogenetik

Analisis filogenetik dari satu keluarga berdasarkan sekuen asam nukleat

atau protein merupakan penentuan bagaimana suatu keluarga mungkin

diturunkan selama proses evolusi. Hubungan evolusi berdasarkan sekuen

digambarkan dengan menempatkan sekuen sebagai outer branches pada suatu

pohon filogenik. Hubungan percabangan pada bagian dalam pohon

menggambarkan derajat perbedaan sekuen yang berhubungan. Dua sekuen

yang memilki banyak kemiripan akan ditempatkan dalam cabang yang sama di

bawahnya. Analisis filogenik bertujuan untuk menemukan semua hubungan

percabangan dari suatu pohon berdasarkan panjang cabang (Mount, 2001).

Program yang digunakan untuk menganalisis analisis filogenetik adalah

Phylogeny.fr. Phylogeny.fr merupakan program yang digunakan untuk membuat

pohon filogenetik bagi seorang non-spesialis secara cepat.Program Phylogeny.fr

didesain untuk memberikan layanan online dalam membuat rantai alignment dan

metodenya fleksibel. Program Phylogeny.fr mampu menganalisis sekuen DNA

dan protein (Dereeper et al., 2010).

29

2.9 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram ditemukan oleh seorang dokter bernama Chirstian Gram

yang merupakan ahli Bakteriologi berkebangsaan Denmark. Pewarnaan Gram

merupakan metode yang paling umum digunakan untuk menentukan jenis Gram

bakteri dan bentuk bakteri yang diamati dengan menggunakan mikroskop. Zat

pewarna dalam pewarnaan gram adalah pewarna diferensial, karena dapat

memabagi bakteri sejati menjadi dua kelompok fisiologi yaitu Gram Positif dan

Gram Negatif. Bakteri Gram positif bewarna biru atau ungu yang disebabkan oleh

kompleks warna kristal violet-iodin. Sedangkan bakteri Gram negatif berwarna

merah atau merah muda yang disebabkan tidak mampu mempertahankan

kompleks warna tersebut saat diberi larutan etanol 95% dan pewarna safranin

dapat masuk sehingga berwarna merah (Volk dan Wheeler, 1993).

Gambar 11. Tahapan pewarnaan Gram (Bergey et al, 1994).

Tabel 1. Penampilan sel sewaktu pewarnaan Gram

Gram positif Gram negatif

Setelah mendapat : Kristal violet Ungu muda Ungu muda Iodin Ungu muda Ungu muda Pencucian etanol 95% Ungu muda Tak berwarna Safranin Ungu muda Merah

Sumber :Volk dan Wheeler, 1993

30

Perbedaan hasil pewarnaan tersebut disebabkan oleh perbedaan struktur

dinding sel dan komposisi dinding sel dari kedua kelompok bakteri tersebut.

Dinding sel bakteri Gram positif memiliki peptidoglikan yang tebal sehingga

mampu mempertahankan warna kompleks tersebut. Sedangkan dinding sel

bakteri Gram negatif memiliki kandungan lipid yang banyak sehingga ketika

diberi larutan etanol 95% akan larut sehingga warna ungu dari kristal violet

menjadi luntur sehingga safranin dapat mewarnai bakteri tersebut (Volk dan

Wheeler, 1993).