Acara II

ISOLASI ENZIM EKSTRASELULER DARI SEL Saccharomyces cerevisiae

LAPORAN RESMI PRAKTIKUMDASAR-DASAR BIOTEKNOLOGI

Disusun oleh:

Nama: Ivana Suprayogi

NIM: 14.I1.0015

Kelompok: C6

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS KATOLIK SOEGIJAPRANATASEMARANG

2015

1. HASIL PENGAMATAN

Hasil pengamatan ekstraksi enzim dengan bahan Saccharomyces cereviceae dapat dilihat

pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Pengamatan Ekstraksi Enzim

Kelompok BahanBerat

Endapan (g)

Absorbansi

Konsentrasi Protein Enzim Ekstraseluler

(mg/g)C1 Saccharomyces

cerevisiae0,13 0,1479 1,423

C2 Saccharomyces cerevisiae

0,14 0,1613 1,576

C3 Saccharomyces cerevisiae

0,11 0,3564 3,809

C4 Saccharomyces cerevisiae

0,12 0,1650 1,617

C5 Saccharomyces cerevisiae

0,11 0,1897 1,900

C6 Saccharomyces cerevisiae

0,11 0,1884 1,882

Tabel 1 diatas menunjukkan hasil pengamatan ekstraksi enzim dengan bahan

Saccharomyces cereviceae pada kloter C. Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa

nilai absorbansi dan konsentrasi terbesar ada pada kelompok C3 secara berurutan yaitu

0,3564 dan 3,809 mg/g. Sementara nilai absorbansi dan konsentrasi paling rendah dijumpai

pada kelompok C1 secara berurutan yaitu 0,1479 dan 1,423 mg/g. Dari data hasil

pengamatan yang dipaparkan tabel dapat disimpulkan semakin besar absorbansinya, maka

semakin besar konsentrasi enzim yang diperoleh.

2

3

2. PEMBAHASAN

Secara ringkas Lee (1992) menerangkan ekstraksi dilakukan dengan cara memisahkan

komponen yang diinginkan dari campuran suspensi atau larutan menggunakan pelarut.

Beliau menambahkan prinsip dalam melakukan ekstraksi yaitu substansi dimasukkan dalam

2 larutan yang tidak bisa bercampur maka substansi yang akan terdistribusi dalam kedua

pelarut dengan proporsi pembagiannya berdasarkan tingkat kelarutan yang berbeda-beda

pada setiap pelarutnya. Sementara menurut Gaman& Sherrington, (1994) enzim merupakan

substansi alami yang dihasilkan sel makhluk hidup berfungsi mempercepat laju reaksi atau

disebut katalisator, tetapi hebatnya substansi tersebut tidak akan merubah kestimbangan

reaksi dan tidak merubah hasil akhir reaksi pula. Hal tersebut dapat terjadi karena cara kerja

enzim adalah dengan menurunkan energi aktivasi substrat dalam suatu sel untuk

mengendalikan jalannya suatu reaksi. Beliau juga menuturkan sebagian besar enzim

dinamai dengan menambah akhiran –ase, yang menunjukan senyawa asal yang dapat

diubah oleh enzim tersebut atau nama reaksi kimia yang dikatalisis enzim. Contohya enzim

protease memecah protein, enzim lipase memecah lipid.

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu biakan khamir Saccharomyces cereviceae

yang merupakan penghidrolisa karbohidrat yang baik sebab menghasilkan enzim amilase

pemecah polisakarida sehingga sering dipakai dalam fermentasi tape (Winarno, 1994).

Vidyalakshmi et al., 2009 dalam jurnalnya yang berjudul “Amylase on Submerged

Fermentation by Bacillus spp. Indian Institute of Crop Processing Technology” juga

mengisolasi enzim amilase namun pada Bacillus spp disini beliau menegaskan pendapat

Winarno bahwa amilase merupakan enzim pemecah pati pada organisme. Amilase bekerja

mencairkan pati dg mengurangi viskositasnya untuk memprduksi maltosa campuran

oligosakarida, sirup tinggi fruktosa, pada produksi detergent diaplikasikan meningkatkan

efek pembersihan dan mengurangi ukuran patti di industri tekstil. Saccharomyces

cereviceae disini ditumbuhkan dalam media padat Malt Extract Agar (MEA) kemudian

diinkubasi dalam media cair broth 1 hari. Hadioetomo, 1993 menjelaskan alasan biakan

khamir dipindahkan ke media broth adalah sebab media broth bersifat cair dimana dalam

ekstraksi, komponen antara campuran cair, suspense, larutan dapat dipisahkan

3

4

menggunakan pelarut. Kusumaningtyas et al. (2010) dalam jurnalnya menyatakan media

broth seperti MRS (Malt Extract Btoth) cocok digunakan dalam fermentasi karena

komposisi dan konsentrasi medium mudah diatur, memberikan kondisi optimum bagi

pertumbuhan, pemakaian medium lebih efisien. Goltum (2009) menerangkan inkubasi

dilakukan agar selama pembiakan enzim berada pada suhu optimal sehingga laju kinerja

enzim meningkatkan. Selanjutnya bahan diambil 8 ml dan disentrifuge 3000 rpm selama 15

menit. Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul

dengan memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi terpisah dimana yang berat

menjadi endapan dan yang ringan menjadi supernatant sesuai perkataan Kimball, 1992.

Menurut Fox (1991) Supernatant berupa larutan dimana terdapat enzim sedangkan endapan

atau residunya merupakan ekstraksi dari enzim. Yang digunakan dalam praktikum ini

adalah bagian supernatantnya sedangkan endapannya dipakai dalam praktikum protein sel

tunggal. Supernatant dipindahkan ke Erlenmeyer dan ditambahkan ammonium sulfat

hingga membentuk dua lapisan dimana ada lapisan kuning (bawah) dan lapisan putih (atas).

Tujuan adanya penambahan ammonium sulfat adalah untuk mengurangi kadar air dalam

larutan sehingga dapat mengendapkan protein (Winarno, 1995). Pendapat Winarno juga

didukung Sari, D.P., et al. (2013) dalam jurnal“Isolasi Purifikasi dan Karakterisasi alfa

amilase dari Saccharomyces cerevisiae FNCC 3012” menerangkan penggunaan amonium

sulfat berguna dalam pemurnian awal enzim, tingkat kelarutan garam amonium sulfat yang

besar membuatnya mudah berinteraksi dengan molekul air. Kemudian diaduk dalam

baskom berisi es agar kestabilan suhu pada suhu rendah terjaga, karena pengadukan dapat

menyebabkan panas yang merusak enzim (Langga et al., 2012) perlahan–lahan setelah 10%

amonium pertama dimasukan larut amonia kedua sebanyak 10% juga ditambahkan hingga

amonia ketiga dengan jumlah yang sama pula. bertujuan menjaga kestabilan suhu.

Selanjutnya filtrat dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang telah ditimbang. Kemudian

larutan disentrifugasi lagi 15 menit pada kecepatan 3000 rpm. Sehingga enzim diperoleh

dalam jumlah maksimal sesuai yang dikatakan Fox (1991). Endapan yang dihasilkan

ditambahkan larutan tris-HCl pH 6,8 dengan perbandingan berat endapan dan berat tris-HCl

sebesar 1:4. Fungsi penambahan tris HCl untuk menguji kegunaan dari kultur sel

(sitotoksisitas), biologi molekuler (DNase,RNase,protease tidak terdeteksi), kecocokan

5

dalam elektroforesis (Hardjadi,1986). Disamping itu tris HCl juga merupakan buffer yang

mempengaruhi kemampuan enzim dalam menghidrolisis substrat, sehingga dapat

menjaga kondisi pH yang memang tepat ditambahkan setelah sentrifugasi pemisahan

supernatan dan endapan dilakukan dengan. Setelah itu sampel disentrifugasi lagi 15 menit

dengan kecepatan 3000 rpm dan dimasukkan dalam tabung reaksi. Selanjutnya larutan

dapat dispektrofotometri namun setelah diberi 10 ml larutan Bradford dan divorteks sesaat

agar homogen baru diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer berpanjang

gelombang 595 nm. Larutan Bradford menurut Caprette (2005) berguna menentukan kadar

protein fraksi sel, memperkirakan konsentrasi protein dimana pengujiannya dilakukan

berdasarkan nilai.Beliau menambahkan prinsip Uji Bradford adalah pengikatan cat,

pewarna Coomassie Briliant Blue (CBB) akan mengikat protein dan jumlah protein akan

terlihat sebagai absorbansi kompleks protein dengan pewarna pada panjang gelombang 595

nm. Panjang gelombang 595 nm dipilih sebab disesuaikan dengan kemampuan zat

menyerap energi radiasi untuk larutan berwarna biru pada panjang gelombang 465-595 nm,

dalam praktikum ini dipilih 595 nm agar lebih akurat (deMan, 1997). Kelebihan uji

bradford yaitu mudah, sederhana, stabil, tidak memerlukan pelarutan atau filtrasi (cepat),

responsif terhadap suhu dan pH, dapat berikatan dengan ion logam, garam buffer, agen

pereduksi. Nielsen (1998) juga ikut menjelaskan keunggulan uji Bradford yaitu hanya

membutuhkan 1 reagen, tidak ada reagen pengkorosi dan tidak mengukur nitrogen non

protein. Beliau juga menambahkan kerja reagen Bradford tidak terpengaruh ammonium

sulfat, polifenol dan sukrosa, K+, Na+, Mg2+. Kelemahan reagen bradford dipaparkan

Bradford (1976) yaitu mudah terpengaruh deterjen non-ionik dan ionik, jika larutan

didiamkan terlalu lama terjadi reaksi dengan NaCl pada Bovine Serum Albumin (BSA)

sebagai larutan standar penentuan kadar protein uji ini. Setelah penambahan NaCl

absorbansi larutan akan terus semakin kecil, karena terjadi pengompleksan protein pada zat

warna CBB dalam reagen Bradford sehingga membuatnya semakin sedikit karena protein

yang larut semakin banyak. Selain itu reagennya dapat mengakibatkan perbedaan respon tes

pada jenis protein yang berbeda jadi sebaiknya, protein yang diuji memberikan nilai

absorbansi mendekati konsentrasi sampel, kurang sensitif terhadap sampel yang kandungan

6

proteinnya sedikit. Pemberian reagen Bradford menimbulkan warna biru larutan

mengandung asam amino, dan merah-coklat bila tidak terdapat asam amino.

Konsentrasi protein enzim ekstraseluler yang paling tinggi ditemukan pada kelompok C3

berupa berat basah sebesar 3,809 mg/g. Sedangkan konsentrasi enzim ekstraseluler berupa

berat basah yang paling rendah pada kelompok C1 sebesar 1,4323 mg/g. Walau dengan

bahan yang sama dan penambahan larutan dengan volume yang sama namun selisih data

terbesar dan paling kecil cukup besar ini diduga disebabkan jumlah biakan Saccharomyces

cerevisiae yang ada dalam setiap kelompok dalam jumlah berbeda. Sementara bila dilihat

dari data keseluruhan pada tabel 1 maka dapat isimpulkan konsentrasi protein enzim

ekstraseluler berbanding lurus dengan absorbansinya jika data memiliki absorbansi terbesar

sperti C3 yang nilai absorbansinya 0,3564 memiliki konsentrasi protein enzim ekstraseluler

paling besar pula yakni 3,809 mg/g. Suarni dan Rauf Patong (2007) dalam jurnal mereka

menunturkan konsentrasi protein enzim ekstraseluler perlu diukur untuk menilai

peningkatan aktivitas enzim yang merepsentasikan protein-protein lain yang larut dalam

ekstrak enzim. Jumlah kelarutan protein dalam ekstrak enzim berbeda-beda dipengaruhi

kadar protein dalam bahan dan tahap penyaringan dan sentrifugasi. Sementara nilai

absorbansi bergantung kepekatan larutan semakin pekat maka semakin tinggi, akan tetapi

berdasarkan teori Tranggono (1989) semakin pekat larutan berarti nilai aktivitas enzimnya

semakin berkurang.

Gaman & Sherrington (1994) mengungkapkan bahwa enzim memiliki beberapa sifat yang

mempengaruhi kinerjanya, antara lain :

1. Spesifitas, dimana aktivitas enzim terbukti sangat spesifik sebab hanya mengkatalisis

satu reaksi. Contohnya laktase hanya menghidrolisis gula laktosa dan tidak terpengaruh

disakarida lain karena molekul laktosa saja yang dapat menyesuaikan sisi aktif molekul.

2. Suhu, ebagian besar enzim optimal pada suhu tubuh di kisaran 30-40°C, bila suhu

terlalu rendah atau tinggi aktivitas enzim akan berkurang, pada suhu 50°C enzim

bertahap menjadi inaktif dan terenaturasi sepenuhnya suhu 100°C. Pada suhu rendah

enzim hanya inaktif.

7

3. Pengaruh pH, pH optimal enzim adalah pada kisaran netral sekitar pH 7, seperti pH

amilase yang optimum pada titik 6,8. Jika medium menjadi terlalu asam atau basa,

enzim mengalami inaktivasi, kecuali enzim yang memang memiliki pH optimum asam

atau basa contohnya pada enzim pepsin yang optimal pada pH 2. Suarni dan Rauf

Patong (2007) dalam jurnal mereka “Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai Sumber

Enzim Α-Amilase” juga mengamati enzim amilase namun secara lebih spesifik yakni

enzim alfa-amilse pada kacang hijau suhu inkubasi optimum (30°C) ternyata pH

ekstrak kecambah masih diantara pH aktivitas optimal yaitu 4,89-5,79, beliau

menuturkan pH optimum ini tergantung sumper enzimnya.

4. Koenzim dan activator, koenzim adalah substansi bukan protein yang mengaktifkan

enzim. Beberapa vitamin B berfungsi sebagai koenzim dan beberapa ion organik,

seperti Ca2+ dan Cl- akan meningkatkan aktivitas enzim (activator).

5. Kadar substrat, jumlah substrat mempengaruhi kecepatan kinerja substrat sebab

semakin tinggi konsentrasi substrat hingga titik jenuh maka enzim akan bekerja

semakin cepat namun ketika titik jenuh sudah telampaui kinerja enzim melambat.

8

3. KESIMPULAN

Prinsip mengekstraksi enzim amilase dan protease ekstraseluler dari Saccharomyces

cereviceae yaitu protein dapat diendapkan dengan penambahan ammonium sulfat.

Inkubasi bertujuan agar enzim yang dalam media mencapai suhu optimum sehingga

aktifitas amiolitik bisa berjalan dengan optimum.

Sentrifugasi bertujuan memisahkan enzim dari ekstrak enzim

Faktor-faktor yang berpengaruh dalam ekstraksi enzim adalah suhu, pH, jumlah

koenzim dan aktifator, jumlah inhibitor, aktifitas air, dan konsentrasi substrat serta

konsentrasi suatu enzim.

Larutan tris HCl pH 6,8 berfungsi sebagai buffer yang menjaga kestabilan pH dalam

endapan protein yang diekstraksi

Reagen bradford berguna mengetahui keberadaan suatu protein dalam larutan dengan

prinsip penjernihan pada larutan.

Nilai adsorbansi berbanding lurus dengan nilai konsentrasi protein.

Semakin pekat larutan nilai absorbansinya semakin besar, berarti aktivitas enzimnya

semakin rendah.

Kelebihan Reagen Bradford yaitu stabil, mudah, waktu persiapan dan uji singkat,

akurasi tinggi.

Kelemahan reagen bradford yaitu sensifitas yang rendah jika jumlah protein sampel

sedikit dan mudah terpengaruh deterjen non-ionik dan ionik.

Semarang, 19 Oktober 2015Mengetahui,

8

Praktikan :

Ivana Suprayogi(14.I1.0015)

Cindy Elysia

9

4. DAFTAR PUSTAKA

Bradford M.M. (1976). A Rapid and Sensitive Method for The Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing The Principle of Protein-Dye Binding. Journal of Analitical Biochemistry. Georgia.

Caprette, David R. (2005). Bradford protein assay. Rice University. Didapat dari http://www.ruf.ice.edu/~bioslabs/methods/protein/bradford.html pada tanggal 12 Oktober 2014

De Man, J. M. (1997). Kimia Makanan. ITB. Bandung.

Fox, P. F. (1991). Food Enzymologi Vol 1. Elsevier Applied Sciences. London.

Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. (1994). Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi dan Mikrobiologi. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Goltum, Togu.(2009). Petunjuk Praktikum Biokimia. Yogyakarta : Universitas Negeri Yogyakarta.

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Hardjadi, W. (1986). Ilmu Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Kimball, J. W. (1992). Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Erlangga. Jakarta.

Kusumaningtyas, Eni; M. Natasia & Darmono. (2010). Potential Metabolisme Kapang Endofit Rimpang Lengkuas Merah dalam Menghambat Pertumbuhan Escherecia coli dan Staphylococcus aures dengan Media Fermentasi Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY). Puslitbang Peternakan. Bogor.

Langga I. F., Muh. Restu, Tutik K. 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama Inkubasi Dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) Serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi. Vol.12 No.3: 265 – 276.

Lee, J. M. (1992). Biochemical Engineering. Prentice Hall Inc. Englewood Cliffs, New York.

Nielsen, S.Suzanne.(1998). Food Analysis 2nd Edition. Gaithersburg, Maryland. Aspen.

9

10

Sari, D. P. , Wuryanti, Khairul A. (2013). Isolasi Purifikasi dan Karakterisasi alfa amilase dari Saccharomyces cerevisiae FNCC 3012. Chem Info. Vol 1, No 1, Hal 337 – 344.

Suarni dan Rauf Patong. (2007). Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai Sumber Enzim Α-Amilase. Indo. J. Chem., 2007, 7 (3), 332-336.

Vidyalakshmi R.; R. Paranthaman; J. Indhumathi. 2009.Amylase on Submerged Fermentation by Bacillus sp. Indian Institute of Crop Processing Technology. World Journal of Chemistry 4 (1): 89-91.

Winarno, F.G. (1995). Kimia Pangan dan Gizi. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Winarno, F.G., 1994. Bahan Tambahan Makanan. Gramedia Pustaka Utama,. Jakarta.

11

5. LAMPIRAN

5.1. Perhitungan

C1.

Y = 0,0035x + 0,0234

0,1479 = 0,0035x + 0,0234

0,0035x = 0,1245

x = 35,571 ppm

kons = 35,5711000 ml

× 0,520,1

ml

= 0,035572 × 5,2

= 0,185 mg

Per gram =0,1850,13

= 1,42288

= 1,423 mggr

C2.

Y = 0,0035x + 0,0234

0,1613 = 0,0035x + 0,0234

0,0035x = 0,1379

x = 39,4 ppm

kons = 39,4

1000 ml× 0,56

0,1ml

= 0,0394 × 5,6

= 0,22064 mg

= 0,221 mg

Per gram =0,2210,14

= 1,579 mggr

C3.

Y = 0,0035x + 0,0234

0,3564 = 0,0035x + 0,0234

0,0035x = 0,333

x = 95,143 ppm

11

Persamaan

Y = 0,0035x + 0,0234

Kons = xmg

1000 ml× tris HCl

0,1ml…. mg

Per gram= xmg

berat endapan (gr)….. mg

gr

12

kons = 95,1431000 ml

× 0,440,1

ml

= 0,095143 × 4,4

= 0,419

Per gram =0,4190,44

= 1,423 mggr

C4.

Y = 0,0035x + 0,0234

0,1650 = 0,0035x + 0,0234

0,0035x = 0,1416

x = 40,457 ppm

kons = 40,4571000 ml

× 0,480,1

ml

= 0,040457 × 4,8

= 0,1941936

= 0,194 mg

Per gram =0,1940,12

= 1,617 mggr

C5.

Y = 0,0035x + 0,0234

0,1897 = 0,0035x + 0,0234

0,0035x = 0,1663

x = 47,514 ppm

kons = 47,5141000 ml

× 0,440,1

ml

= 0,0475 × 4,4

= 0,209 mg

Per gram =0,2090,11

= 1,9

= 1,900 mggr

C6.

Y = 0,0035x + 0,0234

0,1884 = 0,0035x + 0,0234

0,0035x = 0,165

x = 47,143 ppm

kons = 47,1431000 ml

× 0,440,1

ml

= 0,047 × 4,4

= 0,207

Per gram =0,2070,11

= 1,882 mggr

5.2. Laporan Sementara

13