Laporan Biokimia

ISOLASI DNA DARI BUAH DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Nama : Ansori Muchtar

NIM : 10510071

Kelompok : 02

Tanggal Praktikum : 14 November 2012

Tanggal Laporan : 21 November 2012

Asisten: Bunga (10510 )

Laboratorium Biokimia

Program Studi Kimia

Fakultas Matematika Dan IPA

Institut Teknologi Bandung

2012

ISOLASI DNA DARI BUAH DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

I. Tujuan

Menentukan fragmen-fragmen DNA hasil isolasi dari buah

menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa

II. Teori Dasar

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk

kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan

kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk

linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA

mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan

protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri

khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal

ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan

sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA

prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak

memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot

berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994:

315--316; Raven & Johnson 2002: 94).

Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan

mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah

pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa

atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk

memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan

dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat

memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis

poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA

(sekuensing).

III. Data Pengamatan

IV. Pembahasan

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Pada

praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap buah naga dan kiwi.

Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang

dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan

mengambil beberapa bagian dagiang buah naga yang dihancurkan didalam

tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel

dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan detergen.

Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.

Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan

berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul

besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada

pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada

bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa

larutan ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa

endapan yang berwarna merah. Fasa atas yang kemudian diambil untuk

digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap

purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan DNA dari zat-zat

lainnya.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui

elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau

molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam

sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan

dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif. Pergerakan ini dapat dijelaskan

dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan

yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa

oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan

untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA

Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan

bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA

bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari

kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada

ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus

listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses

elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna

loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas

sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini

digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur

dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga

dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

Agarosa merupakan suatu koloidal laut yang dimurnikan dari alga.

Gel agarosa ini dibuat dengan melarutkan sebanyak 0,4 gram agarosa

dalam 40 mL buffer TAE ( tris asetat 0,04M, EDTA 0,001 M pH 8) sambil

dipanaskan hingga mendidih agar agarosa larut semuanya. Ketika

dididihkan dalam suatu larutan buffer, agarosa akan larut dan ketika

didinginkan akan memadat membentuk gel. Dengan menambahkan larutan

buffer Tris Asetat  EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik

untuk DNA. Gel agarosa mempunyai  laju pemisahan lebih cepat, dapat

memisahkan fragmen DNA antara 100 bp–50 kb tergantung dari

konsentrasi gel agarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal.

Pendinginan dilakukan sekitar suhu 50-60°C, apabila terlalu panas akan

merusak karet-karet penyimpan agar. Selain itu, viskositasnya rendah

sehingga akan menimbulkan gelembung-gelembung, sehingga apabila

dituangkan dikhawatirkan ada udara yang terjebak. Dalam hal ini buffer

TAE sebagai media penghantar arus, dimana fragmen DNA akan

bergerak dengan perbedaan kecepatan akibat adanya perbedaan kekuatan

ionik. Fragmen DNA akan memisah berdasarkan ukuran pasangan basa.

Ethidium bromida ditambahkan setelah agarosa bersuhu sekitar 50-60°C.

Senyawa ini berfluorosence merah-orange dibawah sinar UV dan tingkat

fluorosence bertambah ketika terikat pada DNA untai tunggal. Stuktur

ethidium bromida cukup kompleks dikenal juga dengan

nama phenenanthridium-3,8-diamino-5-etil-6-fenil-bromida. Ethidium

bromida dapat tersisipkan diantara basa asam nukleat dan memberikan

deteksi dalam gel. Larutan etidium bromida yang akan masuk diantara

ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan

dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan

membandingkannya dengan pita DNA standar. Ethidium bromida ini

terdapat dalam bentuk bubuk atau larutan yang larut dalam air. Kristal atau

bubuknya tidak berbau dan menunjukkan warna merah tua.

Dapat tersisipnya ethidium bromida diantara basa asam nukleat,

karena ethidium bromida sedikit mirip pasangan basa dan dapat masuk ke

dalam rantaiganda DNA di antara pasangan basanya. Hal tersebut sangat

mutagen. Ethidium bromida merupakan fluoresence yang lemah.

Fluorosensi terjadi karena electron tereksitasi ke tingkat energi yang lebih

tinggi (dengan UV 365 nm). Ketika electron kembali pada tingkat energi

yang lebih rendah, menimbulkan perbedaan energi (sinar tampak).

Fluorosensi ethidium bromida bebas dalam larutan rendah, karena electron

dapat mengalir diantara dua level energi, dalam tingkatan energi vibrasi.

Ketika ethidium bromida terikat pada DNA yang lebih kaku maka

jalur pengeluaran energy rendah. Jalur fluorosensi ini yang umum terjadi

dimana Ethidium bromida tidak tersisipkan lebih panjang di antara

pasangan basa yang bersesuaian dengan stemakseptor tRNA valin. Karena

itu tersisipnya akan berada di antara pasangan basa pada struktur stem-

loop panjang bagian bawah. Dengan demikian ethidium bromida lebih

suka sisi penyisipannya dekat dari basa RNA helical stem.

Gambar : Penyisipan Ethidium Bromida pada Pasangan Basa

Setelah penambahan ethidium bromida, agarosa cair dituangkan ke

dalam cetakan yang memiliki sisir untuk membentuk sumur gel. Setelah

cetakan jadi, pada tiap sumur dimasukkan masing-masing sampel yang

sebelumnya telah dicampur dengan Loading buffer. Loading buffer terdiri

atas sukrosa 50%,EDTA Ph 8,0 dan brom fenol biru yang digunakan

sebagai pewarna guna mempermudah pengamatan berpindahnya noda

dalam gel dan memonitoring sejauh mana proses elektroforesis telah

berlangsung, dengan adanya warna biru yang bergerak dalam agar. Selain

itu, penambahan sukrosa ini sebagai pemberat bagi sampel sehingga

sampel tenggelam ke dalam sumur gel.

Setelah sumur diisi, kemudian dimasukkan ke dalam alat

elektroforesis dan proses dijalankan dengan tegangan. Tegangan yang

digunakan tidak boleh dinaikkan karena fragmen besar akan berpindah

sebanding dengan kecepatan fragmen kecil. Diketahui elektroforesis

merupakan suatu pemisahan zat berdasarkan pengaruh medan listrik.

Karena adanya aliran listrik yang mengalir pada gel, maka fragmen DNA

bergerak ke kutub positif (ditandai dengannoda biru bergerak ke kutub

positif). Hal ini karena molekul DNA relatif lebih kecil sehingga bergerak

lebih dulu daripada molekul lain yang besar, selain itu DNA ini bermuatan

negatif akibat adanya gugus fosfat pada ujung 5-nya.

Faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA

bergerak menembus gel agarosa, sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA

linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA

pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan

basa.

2. Konsentrasi gel agarosa

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak

sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Rumusnya

adalah: log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis mobility,

Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta

adalah electrophoretic mobility DNA.

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu

bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-

opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat

yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan

laju migrasi ini karena:

Konsentrasi gel agarosa

Kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

Densitas kembaran superheliks pada bentuk I

Pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III

Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr

meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas

meningkat tajam, contoh untuk bentuk I

Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg.

Semakin padat gel agarosanya maka akan semakin lambat laju

migrasinya dan semakin basar berat molekul DNA maka laju

migrasinya pun semakin lambat. Berdasarkan ukuran, semakin berat

molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya, begitu juga

sebaliknya. Menurut Pramono (2011), berdasarkan struktur

molekulnya, DNA yang paling cepat lajunya adalah DNA bentuk

covalently closed circular (CCC) disusul oleh bentuk linier, dan yang

paling lambat adalah bentuk open circular (OC).

Fungsi fungsi reagen:

1. Loading dye, digunakan sebagai pemberat (Bromophenol blue sebagai

penanda jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal

jalannya elektroforesis.

2. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam

asetat glasial sebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk

menginaktifkan enzim perusak DNA yaitu DNAase).

3. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.

DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat

dilihat pergerakannya. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan

besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran

DNA yang tidak terlalu besar, Akan tetapi pada beberapa kelompok

pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena

kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa

jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel

sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga

dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot

kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.

V. Kesimpulan

Ukuran DNA tidak dapat ditentukan.

VI. Daftar Pustaka

Clark,John M. 1964. Experimental Biochemistry. WH Freeman and

Company. San Franciso

Eaton,David C.1980.The World of Organic Chemistry.Mc-Graw-Hill

Book

Company. New york.

http://biology-community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html , tanggal

akses 20 November 2012.

http://ditjenbun.deptan.go.id/bbp2tpsur/images/stories/perbenihan/uji

%20kualitatif%20dna.pdf, tanggal akses 20 November 2012.

http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis#Agarose , tanggal akses

20 November 2012.