Penerapan Rekayasa Genetik Teknik DNA Rekombinan dalam Bidang Kesehatan

1. Pendahuluan1.1 Latar BelakangDewasa ini kemajuan teknologi dalam suatu ilmu pengetahuan telah berpengaruh pada kedalaman penelitian suatu ilmu. Prosedur baru mengantikan prosedur lama sehingga pekerjaan yang dulunya sulit dan lama menjadi sangat mudah dan cepat. Inti teknologi biologi molecular dipengaruhi oleh perkembangan teknik dari berbagai bidang. Sebagai contoh, sekuensing DNA dan sekuensing protein, amplifikasi fragmen DNA dengan PCR, atau identifikasifragmen DNA atau molekul RNA dengan pelacak, telah menjadi pekerjaan rutin pada penelitian biologi molecular. Setiap prosedur ini diperoleh dari informasi yang diperoleh dari penelitian sifat dna, replikasi DNA dan protein. Prosedur kerja ini telah menjadi bagian dari rekayasa genetic yang digunakan untuk mengisolasi, karakterisasi, manipulasi dan pemindahan suatu fragmen DNA.1.2 Skenario DGen bagi protein P diisolasi dan sekuens DNA-nya telah ditentukan. Gen tersebut ditemukan mengandung 1.000 bp sekuens pengkode dan dua situs enzim retriksi EcoRI,-GAATTC-. Satu diantara kedua situs tersebut terletak 150 bp kearah dalam gen dari kodon start dan satunya lagi 150 bp kearah dalam dari kodon stop (lihat ilustrasi dibawah ini). Telah ditemukan suatu protein P defektif, dan gennya pun telah diklona serta di-sequencing. Dalam gen yang abnormal, salah satu sekuens tersebut telah berubah menjadi GCATTC-.

Kita ingin tahu apakah sel-sel janin mengandung gen normal atau abnormal. Jadi, DNA dari sel-sel janin dipotong dengan EcoRI dan fragmen-fragmennya dipisahkan pada gel agarosa. Kemudian, fragmen-fragmen itu ditransfer ke sebuha membrane nilon. Probe bagi gen normal berhibridisasi ke sebelah dalam fragmen EcoRI 700 bp dan juga akan berhibridisasi dengan sekuens gen abnormal pada daerah yang sama. Ukuran fragmen-fragmen DNA janin bisa diestimasi dengan cara melakukan running (melanjutkan fragmen DNA pada gel agarosa), bersama fragmen-fragmen DNA yang diketahui ukurannya pada gel yang sama.

1.3 Sasaran Belajar

Mahasiswa mampu mengerti dan memahami definisi gen. Mahasiswa mampu mengerti dan memahami struktur gen. Mahasiswa mampu mengerti dan memahami pengertian, teknik, dan tujuan dari DNA rekombinan. Mahasiswa mampu mengerti dan memahami pengertian, teknik, dan tujuan dari rekayasa genetik. Mahasiswa mampu mengerti dan memahami pengertian dan penyebab dari mutasi.2. Isi

2.1. Mind Map

StrukturDefinisi

GEN

Rekayasa GenetikDNA Rekombinan

DefinisiTeknikTujuanDefinisiTeknikManfaatTujuan

2.2. Pembahasan

2.2.1. Gen

2.2.1.1. Definisi GenIstilah gen diciptakan oleh W. Johannsen pada tahun 1909. Gen adalah suatu unit instruksi untuk menghasilkan atau mempengaruhi suatu sifat herediter tertentu. Gen terdiri dari DNA yang diselubungi dan diikat oleh protein. Secara kimia dapat disebut bahwa unit informasi genetic adalah DNA. Penelitian Mendel menunjukkan bahwa sebuah gen adalah suatu factor diskrit yang mengontrol suatu fenotipe tertentu. Walaupun sifat fisik gen belum berhasil dipahami sebelum pertengahan abad kedua puluh, penelitian para ahli genetika menetapkan gen sebagai unit biologis dasar hereditas. Penelitian-penelitian yang dilakukan belakangan menunjukkan bahwa gen terdiri atas DNA, bukan protein. Salah satu konsep paling awal mengenai kerja gen untuk menjelaskan kelainan-kelainan metabolic pada manusia menyatakan bahwa masing-masing gen bertanggung jawab bagi sebuah reaksi enzimatik spesifik.1

2.2.1.2. Struktur GenStruktur Gen Prokariot Secara umum gen prokariot tersusun atas beberapa bagian penting yaitu: promoter, bagian structural, dan terminator. Secara skematis, struktu gen pada prokariot secara umum dapat dilihat pada gambar. Transkripsi diawali dari nukleotida yang terletak beberapa basa di sebelah hulu dari gen structural. Ujung gen structural berupa kodon STOP (TAA,TAG, atau TGA), tetapi transkripsi dilakukan sampai beberapa basa di sebelah hilir dari kodon STOP yaitu sampai pada daerah terminator. 1

Gambar 1. Struktur Gen Prokariot 1

Struktur Gen pada Manusia (Eukariot) Manusia memiliki banyak sekali gen-gen, dan kumpulan dari gen-gen ini disebut genom yang berada dalam sebuah kromosom. Secara umum struktur utama dari gen manusia adalah DNA. Kebanyakan gen manusia umumnya terdiri dari Sembilan ekson per gen, walaupun beberapa lebih. Saat gen berekspresi RNA mensintesis salinannya pada gen yang menyebabkan intron sama dengan ekson, peristiwa ini disebut spicing.Perbedaan umum gen manusia yaitu oleh adanya V28 dan V29-1, karena hanya terdapat segmen gen saja, sedang pada individu sel T segmen gennya saling berhubungan pada variasi combinasi yang nantinya malah menghasilkan fungsi reseptor yang berbeda. 1

Gambar 2. Struktur Gen pada Manusia 1

Dari seluruh pembahasan diatas dapat diketahui bahwa struktur umum pada gen manusia adalah DNA dan RNA, sedangkan variasi-variasi yang ada hanyalah bagian dari keseluruhan aktivitas genom.

2.2.3. DNA Rekombinan 2.2.3.1. Definisi DNA RekombinanDNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan karena penyisipan suatu sekuens deoksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul DNA yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi.2 DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama-sama.3 Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi antibiotik. Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui proses alam dalam sel, tetapi direkayasa. Sebuah protein rekombinan adalah protein yang berasal dari DNA rekombinan.2.2.3.2. Teknik Teknologi DNA rekombinanTeknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk: mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi:- Teknik untuk mengisolasi DNA.- Teknik untuk memotong DNA.- Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.-Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup. 3,4

Teknik Blotting Untuk melihat potongan DNA atau RNA spesifik di antara ribuan molekul pencemar diperlukan perpaduan sejumlah teknik yang secara kolektif disebut blot transfer.

Gambar 3. Prosedur Blot Transfer 2Pada Southern (DNA) blot transfer, DNA yang diisolasi dari suatu sel atau jaringan dicerna dengan satu atau lebih enzim restriksi. Campuran ini diteteskan ke dalam sebuah sumur pada gel agarosa atau poliakrilamid dan dipajankan dengan arus listrik searah. DNA, karena bermuatan negatif, akan bermigrasi kea rah anoda; fragmen lebih kecil akan bergerak paling cepat. Setelah waktu tertentu, DNA akan mengalami denaturasi akibat pajanan terhadap basa ringan dan dipindakan ke atas kertas nitroselulosa atau nilon, dalam suatu replica yang identik dengan pola pada gel, dengan menggunakan teknik blotting yang dirancang Southern. DNA terikat pada kertas karena pajanan terhadap panas, dan kertas kemudian mengalami pemajanan terhadap pelacak cDNA berlabel, yang berikatan dengan fragmen komplementer pada filter. Setelah dicuci bersih, kertas dipajankan dengan film sinar X yang diciptakan untuk mengungkapkan beberapa pita spesifik yang sesuai dengan fragmen DNA yang dikenali oleh sekuens di pelacak cDNA. Pada hakikatnya baik RNA maupun Northern, teknik blot-nya serupa. Pada RNA dilakukan elektroforesis sebelum blot transfer. Hal ini memerlukan beberapa tahap berbeda dengan tahapan yang dilakukan pada pemindahan DNA, terutama untuk memastikan bahwa RNA tetap utuh, dan umumnya agak lebih sulit. Pada protein, atau Western, blot, protein dielektroforesis dan dipindahkan ke nitroselulosa dan kemudian dilacak dengan antibody spesifik atau molekul pelacak lain. Pada kasus Southwestern blotting, suatu protein blot tang serupa dengan yang diperlihatkan di bawah Western dipajankan dengan asam nukleat berlabel, dan kompleks protein-asam nukleat yang terbentuk kemudian dideteksi dengan autoradiografi. 2ElektroforesisElektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul mempunyai masa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke electrode. Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, danpemurnian fragmen DNA. Selain itu elektroforesis gel poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradien. 3,4Elektroforesis Gel AgarosaAgarosa, yand disari dari ganggang laut, merupakan polimer dengan dasar struktur D-galaktosa dan 3,6-anhidroL-galaktosa. Gel agarosa mempunyai daya pemisahan lebih rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi mempunyai rentang pemisahan lebih besar. DNA dari 200 basa sampai 50 kilobasa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. 3

Gambar 4. Alat Elektroforesis Gel Agarosa 3DNA campuran dimasukkan dalam sumuran gel. DNA bermuatan negatif bergerak kekutub positif. Fragmen DNA berukuran pendek bergerak lebih cepat daripada yang lebih panjang.Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dalam buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnit di berikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan mifrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. 3,4Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. Mekanisme seksual pada bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Jadi mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat). 4

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi.

- Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.- Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. Ingat: Griffith (1928), Avery dkk (1944)- Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat ber-integrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. 4Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.

- Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA- Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA- Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mngklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri.-Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda.- Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. - Enzim traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA.- Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. 2,4Berdasarkan mekanisme bakteri, perangkat bakteri, dan beberapa teknik diatas, DNA rekombinan dapat dibuat paling tidak melalui tiga pendekatan, yaitu:1) Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, memilih fragmen yang dikendaki, mengklonkan fragmen yang telah terpilih,2) Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, mengklonkan semua fragmen DNA pada vektor yang sesuai, menguji setiap klon untuk mendapatkan gen yang diinginkan,3) Sintesis gen atau fragmen DNA yang diinginkan secara langsung dan mengklonkan gen atau fragmen DNA hasil sintesis. 3,4

Gambar 5. Prosedur Kloning 3,42.2.3.3. Manfaat Teknologi DNA RekombinanTeknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari-hari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA Rekombinan.Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh: insulin telah digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan insulin manusia. Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri. Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri.

Contoh lainnya adalah kapas transgenik. Kapas transgenik pernah ramai dibicarakan di media masa kita pada awal abad 21 ini. Salah satu kapas transgenik adalah kapas-bt. Tanaman kapas-bt telah mengandung gen penyandi toksin yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis (Bt). Toksin tersebut dapat membunuh hama kapas sehingga kapas-bt tersebut tahan terhadap serangan hama.

Bakteri penghasil insulin dan tanaman kapas-bt tersebut merupakan sebagian dari hasil rekayasa yang dilakukan manusia terhadap makhluk hidup dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan. 5

2.2.3.4. Tujuan Penerapan Teknologi DNA Rekombinan Isolasi gen spesifik dari genom keseluruhan memerlukan suatu teknik yang akan membedakan satu bagian dari sejuta. Identifikasi suatu regio regulatorik dengan panjang yang hanya dapat mencapai 10 pb memerlukan sensitivitas satu bagian per 3 x 108, suatu penyakit seperti anemia sel sabit disebabkan oleh perubahan satu basa, atau satu bagian dari 3 x 109. Teknologi DNA rekombinan cukup kuat untuk melaksanakan semua tugas ini. 2Pemetaan Gen Menentukan Lokasi Gen Spesifik di Kromosom TertentuPenentuan lokasi gen dapat mendefinisikan peta genom manusia. Hal ini sudah mengahasilakn informasi bermanfaat dalam mendefinisikan penyakit manusia. Hibridisasi sel somatic dan hibridisasi in situ adalah dua teknik yang digunakan untuk melakukan hal ini. Pada hibridisasi in situ, yaitu prosedur yang lebih sederhana dan langsung, ditambahkan suatu pelacak radioaktif ke penyebaran metafase kromosom pada kaca obyek. Fluorescence in situ hybridization (FISH) adalah teknik yang sangat sensitive juga digunakan untuk tujuan ini. Dengan teknik ini, lokasi gen sering diketahui di pita atau regio tertentu pada kromosom. 2Protein Dapat Diproduksi untuk Kepentingan Riset dan DiagnosisTujuan praktis riset DNA rekombinan adalah menghasilkan bahan yang dapat digunakan dalam bidang biomedis. Memiliki dua manfaat berbeda: 1. Dapat menghasilkan bahan dalam jumlah besar yang tidakdapat diperoleh dari metode pemurnian konvensional. Misalnya interferon, plasminogen activating factor jaringan.2. Dapat menghasilkan zat yang terdapat pada manusia. Misalnya insulin, hormon pertumbuhan. 2Teknologi DNA Rekombinan Digunakan dalam Analisis Molekular Penyakit1. Variasi Gen Normal2. Variasi Gen yang Menyebabkan Penyakit3. Mutasi Titik4. Delesi, Insersim dan Tata-Ulang DNA5. Analisis Sisilah6. Diagnosis Pranatal7. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) & Polimorfisme Nukletida Tunggal (Single Nuclotide Polymorphism (SNP)8. Polimorfisme DNA Miktosatelit9. RFLP & VNTR dalam Kedokteran Forensik10. Terapi Gen11. Hewan Transgenik 2,4,5DNA kromoson bakteri dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dan disisipkan pada plasmid. Kemudia plasmid rekombinan dimaskkan dalam sel inang dan sel yang membawa plasmid rekombinan dimasukkan dalam sel inang dan sel yang membawa plasmid rekombinan diidentifikasi dan ditumbuhkan. DNA dari organisme donor diekstraksi, dipotong dengan enzim restriksi endonuklease, disambung (ligasi) dengan dan vector sehingga membentuk molekul DNA rekombinan ( DNA donor tersisipkan pada DNA vector). DNA rekombinan ini dimasukkan ke dalam sel inang. Pemasukkan DNA ke dalam sel bakteri (Eschericia coli) dinamakan transformasi. Sel bakteri yang membawa DNA rekombinan(transforman) dipisahkan (diseleksi) dari sel yang tidak membawa vector. Kemudian sel-sel ini diidentifikasi dan di karakterisasi terhadap sel transforman yang membawa DNA yang diinginkan. Jika diperlukan, DNA rekombinan dapat dimanipulasi sehingga gen yang dibawa itu dapat terekresi menghasilkan protein dalam jumlah banyak.Enzim RestriksiEnzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan enzim retriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri). Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut, Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagain pada DNA yang dikenai kasi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang aka dipotongnya. 2Tabel 1. Endonuklease Restriksi Tertentu dan Spesifitas Sekuensnya 2

Salah satu contoh enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotongpada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA untas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends (ujung tumpang-tindih/ujung lengket) atau blunt ends (ujung tumpul). 2-4

Gambar 6. Ujung Lengket atau Sticky Ends 2

Gambar 7. Ujung Tumpul atau Blunt Ends 2

2.2.4. Rekayasa Genetik2.2.4.1. Definisi Rekayasa GenetikRekayasa genetik adalah tindakan sengaja untuk memodifikasi DNA (substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas perwarisan sifat). Dalam arti luas, Tettamanzi melukiskannya sebagai bentuk-bentuk manipulasi dan pergantian tatanan gen dari organisme hidup. Rekayasa genetic adalah suatu teknik bioteknologi yang digunakan untuk mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan. Rekayasa genetik adalah proses mengidentifikasi dan mengisolasi DNA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Sebelum dimasukkan, materi genetik tersebut dapat direkayasa di laboratorium. Sering pula dsebut dengan Teknik DNA Rekombinan /Teknik Plasmid/Transplantasi Gen. 6

2.2.4.2. Teknik Rekayasa GenetikTahapan dalam Rekayasa Genetik1. Isolasi DNA,2. Manipulasi DNA,3. Perbanyakan DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)4. Visualisasi hasil manipulasi DNA,5. DNA rekombinan,6. Kloning Gen 6

1. Isolasi DNA Untuk mengeluarkan DNA dari sel maka teknik pemurnian DNA secara biokimia dilakukan dengan merusak dinding sel yang telah dilarutkan dalam larutan penyangga tertentu dengan menggunakan berbagai jenis deterjen. Dengan terbukanya lapisan sel maka DNA dapat dikeluarkan dan diendapkan dengan penambahan alkohol. 6,7

2. Manipulasi DNABeberapa perangkat penting: Gunting Untuk memotong molekul DNA, dengan menggunakan enzim. Enzim yang dikenal dengan nama enzim restriksi.

Lem/perekat Untuk menggabungkan molekul DNA, enzim yang berperan adalah enzim ligase.

Gergaji Untuk membelah molekul DNA, dengan pemanasan atau yang dikenal dengan denaturasi (suhu 90C) atau dengan larutan NaOH (konsentrasi 0,4 M). 2,6,7

3. Perbanyakan DNA dengan PCRSuatu reaksi enzimatis untuk melipatgandakan suatu urutan nukleotida tertentu secara in vitro. 7

PCR (Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium. 2,7PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. 2PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat. 7PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase.Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:1. Amplifikasi urutan nukleotida.2. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.3. Bidang kedokteran forensik.4. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print. 6,7

4. Visualisasi Hasil Manipulasi DNA Untuk menganalisis hasil manipulasi DNA dapat dilihat melalui elektroforesis.Pita DNA pada gel dapat dilihat dengan menggunakan berbagai teknik, yaitu sebagai berikut: Pemberian zat warna ethidium bromide, Visualisasi langsung semua pita DNA di bawah sinar UV dengan menggunakan alat transiluminator dan dilakukan pada ruangan khusus yang gelap, Hasil visualisasi DNA kemudian difoto. 7

5. DNA rekombinan DNA rekombinan merupakan gabungan antara DNA vektor dan DNA asing yang merupakan gen target. Penggunaan teknik DNA rekombinan untuk diagnosis penyakit. Hasil daripada teknologi pengklonan. Teknik yang terlibat disebut sebagai penjuruteraan genetik . 2

6. Kloning Gen

Suatu teknik untuk menghasilkan banyak salinan dari satu gen tunggal, kromosom, atau keseluruhan individu. Kultur jaringan atau mikropropagasi merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman dengan menempatkan sejumlah kecil sel yang berasal dari tanaman induk yang kemudian ditumbuhkan dalam medium kaya nutrien yang mengandung hormon pertumbuhan. Untuk kloning ini diperlukan plasmid dan enzim untuk memotong DNA, serta enzim untuk menyambungkan gen yang disisipkan itu ke plasmid. 7,8

Cara Menyisipkan GenJika kita ingin memasukkan suatu gen manusia ke dalam sel lain, gen perlu diisolasi, sehingga dapat disisipkan dalam sel baru. Contoh, gen insulin manusia diisolasi kemudian digabungkan dalam sel bakteri E. coli selanjutnya gen yang disisipkan tersebut menyebabkan sel bakteri memproduksi protein insulin manusia, yang dapat diberikan pada penderita diabetes. 2,7,9

Gambar 8. Rekayasa Genetik

1. Penyiapan molekul DNA kromosom yang mengandung gen yang akan di-kloning.2. Pemotongan molekul DNA kromosom, untuk memperkecil ukurannya serta analisa ukuran hasil pemotongan. Pemotongan ini diatur sedemikian hingga fragment molekul DNA (gen) yang dikehendaki tidak terpotong.3. Peng-insersi-an Fragment DNA yang mengandung suatu gen yang akan diklon ke suatu molekul DNA sirkular (disebut dengan vektor) untuk menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan (chimaera).4. Bagaimana memasukkan (insersi/transformasi) molekul DNA rekombinan kedalam sel inang (host cell), umumnya bakteri atau sel hidup lainnya.5. Bagaimana menumbuhkan sel hasil transformasi pada suatu medium untuk dapat diseleksi lebih lanjut nantinya.6. Bagaimana vektor dengan gen terinsersi (molekul DNA Rekombinan) menggandakan diri menghasilkan sejumlah kopi yang sama.7. Bagaimana sel inang membelah diri dan tentunya dengan mengkopi juga seluruh molekul DNA rekombinan yang ada di dalam sel-nya.8. Setelah sejumlah kali ulangan pembelahan, suatu koloni, atau klon dengan kandungan molekul DNA rekombinan yang sama akan dihasilkan.9. Setelah itu bagaimana memilih diantara koloni-koloni sel yang tumbuh, 1 atau lebih yang mengandung DNA rekombinan yang dimaksud. 2,9Bagaimana mendapatkan (mengisolasi) DNA rekombinan dari sel pembawanya untuk diteliti lebih lanjut semisal ditentukan urutan DNA-nya, dan untuk di-insersi-kan ke dalam vektor ekspresi sehingga dapat diproduksi lebih banyak. 9

2.2.4.3. Tujuan dan Manfaat Rekayasa Genetik

Untuk memajukan perkembangan teknologi dalam bidang biologi dalam upaya perkembangan ilmu maupun pengobatan.

Manfaat Rekayasa Genetik1. Pembuatan insulin manusia dari bakteri 2. Terapi gen3. Pembuatan antibiotik, vaksin4. Pembuatan serum5. Kloning

3. Penutup

3.1. Pembahasan Skenario

Dapat dilihat bahwa pada gen defektif tidak disebelah kiri tidak mengalami pemotongan oleh enzim restriksi. Di dalam kasus ini enzim restriksi yang digunakan adalah EcoRI. Sehingga kemungkinan yang terjadi adalah adanya gen yang abnormal, salah satu sekuens telah berubah menjadi -GCATTC- yang seharusnya mengikuti enzim restriksi EcoRI-GCATTC-, seperti contoh gambar dibawah ini.

Dengan menerapkan rekayasa genetik teknologi DNA rekombinan kita dapat mengetahui suatu DNA itu normal atau abnormal. Seperti dalam kasus kita dapat mengetahui apakah sel-sel janin bersifat normal ataupun abnormal. Karena teknologi DNA rekombinan memiliki banyak manfaat dalam menunjang pemeriksaan kesehatan terutama pada masalah genetic.

3.2. Kesimpulan

Sel normal atau sel yang abnormal dapat diketahui dengan menerapkan teknik DNA rekombinan.

Daftar Pustaka1. Elrod SL, Stansfield WD. Genetika. Jakarta: Penerbit Erlangga; 2007.h.70-1.2. Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. Biokimia harper edisi 27: Genetika molecular, DNA rekombinan, dan teknologi genomic. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 2009.h.414-34.3. News Medical. Recombinant DNA. Diunduh dari http://www.news-medical.net/health/Recombinant-DNA-What-is-Recombinant-DNA-(Indonesian).aspx, 14 Desember 2012.4. Tjahjoleksono A. Teknologi DNA rekombinan. Diunduh dari http://web.ipb.ac.id/~tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/textdnarekombinanpdf.pdf , 14 Desember 2012.5. News Medical. Recombinant DNA applications. Diunduh dari http://www.news-medical.net/health/Recombinant-DNA-Applications.aspx, 14 Desember 2012.6. Yuwono T. Biologi molecular. Jakarta: Penerbit Erlanga; 2010.h.137-507. Chang W. Bioetika. Yogyakarta: Penerbit Kanisius; 2009.h.119-23.8. Sudjadi. Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius; 2008.h.45-95.9. Fried GH, Hademenos GJ. Schaums outline biologi edisi 2. Jakarta: Penerbit Erlangga; 2006.h.79-86.

2