disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh ... fileperpustakaan.uns.ac.id...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

DETEKSI TRANSMISI TRANSOVARIAL VIRUS DEN3 PADA

SEMUA STADIUM Aedes aegypti SECARA IMUNOSITOKIMIA

DENGAN KONFIRMASI RT-PCR

TESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan

memperoleh gelar Magister

Program Studi Biosain

oleh :

Adhi Kumoro Setya

S-901302001

PROGRAM PASCA SARJANA

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2015


commit to user




TESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan

memperoleh gelar Magister

Program Studi Biosain

oleh :

Adhi Kumoro Setya

S-901302001

PROGRAM PASCA SARJANA

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2015

i


commit to user




TESIS

Oleh

Adhi Kumoro Setya

S-901302001

Telah disetujui oleh tim pembimbing

Komisi Nama Tanda Tanggal

pembimbing Tangan

Pembimbing I Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si ..................

...............NIP. 19670430 199203 1 002 .................. ...............2015

Pembimbing II dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D

NIP. 195111201986011001 .................. ...............2015

Mengetahui

Ketua Program Studi Biosain

Program Pasca Sarjana

Dr. Ari Susilawati, S.Si., M.Si

NIP. 196904281997022006

ii


commit to user




TESIS

Oleh

Adhi Kumoro Setya

S-901302001

Jabatan Nama Tanda tangan Tanggal

Ketua Dr. Agung Budiharjo, S.Si., M.Si

NIP. 196808232000031001

........................

.................

Sekretaris Dr. Ari Susilawati, S.Si., M.Si

NIP. 196904281997022006

........................

.................

Anggota Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si

NIP. 196704301992031002

........................

.................

dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D

NIP. 195111201986011001

........................

.................

Telah dipertahankan di depan penguji

Dinyatakan telah memenuhi syarat

Pada tanggal ............................. 2015

Mengetahui,

Direktur Program Pascasarjan UNS

Prof. Dr. M. Furqon Hidayatullah, M.Pd

NIP. 196107171986011001

Ketua Program Studi

Dr. Ari Susilawati, S.Si., M.Si

NIP. 196904281997022006

iii


commit to user

PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa:

1. Tesis yang berjudul: ”Deteksi Transmisi Transovarial Virus DEN3 Pada Semua

Stadium Aedes aegypti Secara Imunositokimia Dengan Konfirmasi RT-PCR” ini

adalah karya penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya ilmiah yang pernah

diajukan oleh orang lain untuk memeroleh gelar akademik serta tidak terdapat karya

atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang

secara tertulis dikutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan

daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan terdapat

unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis ini beserta gelar MAGISTER saya

dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku

(UU No.20 Tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70)

2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi Biosain PPs-UNS. Publikasi sebagian atau

keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin Ketua-Prodi

Biosain PPs-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan tim pembimbing

sebagai author. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu semester (6 bulan

sejak pengesahan Tesis) saya tidak mengajukan publikasi dari sebagian atau

keseluruhan Tesis ini, maka Prodi Biosains PPs-UNS berhak mempublikasikannya

pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosain PPs-UNS dan atau media

ilmiah yang ditunjuk. Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi

ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku

Surakarta, Juli 2015

Mahasiswa

Adhi Kumoro Setya

S901302001

iv


commit to user

Adhi Kumoro Setya. 2015. Deteksi Transmisi Transovarial Virus DEN3 Pada

Semua Stadium Aedes aegypti Secara Imunositokimia Dengan Konfirmasi RT-

PCR. TESIS. Pembimbing I: Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si., II: dr. Ir. Ruben Dharmawan,

Ph.D. Program Studi Biosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret

Surakarta

ABSTRAK

Salah satu penyakit berbahaya akibat virus yang ditularkan oleh vektor nyamuk

adalah demam berdarah dengue (DBD). Tidak hanya di Indonesia virus ini banyak

menimbulkan masalah kesehatan masyarakat dunia, bahkan upaya pemberantasan DBD

belum berhasil sampai saat ini. Di alam, keberadaan virus dengue terpelihara dengan

baik dalam tubuh vektornya dalam mekanisme penularan horizontal dan transovarial.

Penelitian virus dengue dari isolat nyamuk Aedes spesies belum banyak dilakukan.

Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi penularaan transovarial virus dengue secara

imunositokimia sebagai prosedur untuk deteksi dini potensi terjadinya DBD.

Penelitian diawali dengan peremajaan virus DEN3 dari stok dalam media kultur

essensial C6/36, sampai deteksi terjadinya transovarial menggunakan pemeriksaan

imunositokimia metode SBPC (Streptavidine Biotin Peroxidase Complex) dengan

antibodi DSSC7. Penelitian ini menggunakan kontrol positif dari kultur virus dan

kontrol negatif dari sampel darah probandus yang tidak diinfeksi virus. Sebanyak 12 A.

aegypti betina umur 1 minggu yang belum terkontaminasi diinfeksikan virus DEN3

secara peroral dan dibiakan untuk diperiksa terjadinya penularan transovarial. Hasil

positif adanya antigen DEN3 dalam tubuh vektor akan berikatan dengan antibodi

spesifik dari reagen dan dengan adanya enzim serta substrat kromogen akan muncul

warna coklat pada sel dan granula disekitar sel. Sampel yang mendapat peluang

diperiksa, diperoleh dengan cara pengundian dan dinyatakan sebagai hasil Transovarial

Index Rate (TIR)

Hasil penelitian menunjukkan metode imunositokimia SBPC mampu mendeteksi

adanya virus DEN3 pada semua stadium metamorfose A. aegypti dengan nilai TIR

stadium telur 82%, larva 89%, pupa 94% dan dewasa 100%. Konfirmasi dengan RT-

PCR menunjukan semua induk betina hasil pembiakan positif mengandung virus DEN3

yang teramplifikasikan sebagai gen E (penyandi protein envelope) berukuran 538bp.

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa virus DEN3 terbukti terpelihara secara

transovarial dalam vektornya (A. aegypti) dan metode imunositokimia SBPC dengan

antibodi DSSC7 dapat dipakai sebagai prosedur deteksi dini potensi terjadinya DBD.

Kata kunci: Virus DEN3, Transovarial, Aedes aegypti, Imunositokimia.

v


commit to user

Adhi Kumoro Setya. 2015. The Detection of Transovarial Transmission of DEN3

Virus on All of Aedes aegypti Stadium Immunocytochemistry with RT-PCR

Confirmation. Thesis. Supervisor I: Prof. Dr. Sugiyarto, M.Sc., Supervisor II: dr. Ir.

Ruben Dharmawan, Ph.D. Bioscience Studies Program, Graduate Program, Sebelas

Maret University of Surakarta

ABSTRACT

One of the dangerous diseases was caused by a virus transmitted by mosquito

vectors is Dengue Hemorrhagic Fever (DHF). Not only in Indonesia this virus was

caused a lot of health problems in the world community, even the DHF eradication

efforts have not been successful to date. In nature, the presence of dengue virus in the

body is well-maintained in the body vector in the transmission mechanism of horizontal

and transovarial. The studies of dengue virus from Aedes species isolates are rare. This

study was aimed detect the transovarial transmission of dengue virus

immunocytochemistry as procedures for early detection of potential occurrence of DHF.

The study begins with the rejuvenation of the DEN3 virus stock in culture media

of C6/36 essential, to detect the occurrence of transovarial used immunocytochemistry

examination with SBPC (Streptavidine Biotin Peroxidase Complex) methods with

DSSC7 antibodies. This study was used positive control of virus culture and negative

control of probandus blood samples was not infected virus. A total of 12 females A.

aegypti aged 1 week were not been contaminated by the DEN3 virus orally and cultured

to examine the transovarial occurrence. The positive results of DEN3 antigen in the

vector body will be related to the specific antibodies from reagents and in the presence

of enzyme and chromogen substrate will appear brown on cells and granule surrounding

the cells. The samples had chance to examined, obtained by the draw and expressed as a

result of Transovarial Index Rate (TIR)

The study results were showed SBPC immunocytochemistry method are capable

to detect the presence of DEN3 virus at all stages of A. aegypti metamorphosis with TIR

value of egg stage is 82%, larva is 89%, pupa and adult is 94% to 100%. The RT-PCR

confirmation was showed all of the female parent from culture results were positive for

the DEN3 virus were amplificated as E gene (encoding of protein envelope) measured

of 538bp. From the study result can be concluded that the DEN3 virus are proven

transovarially maintained in vector (A. aegypti) and immunocytochemistry method of

SBPC with DSSC7 antibodies can be used as an early detection procedure of DHF

potential.

Keywords: DEN3 Virus, transovarial, Aedes aegypti, immunocytochemistry.

vi


commit to user

MOTTO

Semangat dan percaya dalam doa !!!

vii


commit to user

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini saya persembahkan kepada:

Tuhan Yang Maha Esa

Orang Tuaku

Semua Guru Dan Dosenku

Sisilia Tri Nastiti

Terima Kasih........

viii


commit to user

KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan kasih karunianya,

sehingga penulis dapat menyelesaikan dan menyajikan penelitian Tesis yang berjudul:

“Deteksi Transmisi Transovarial Virus DEN3 Pada Semua Stadium Aedes aegypti

Secara Imunositokimia Dengan Konfirmasi RT-PCR”. Penyusunan tesis ini merupkan

salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program studi

Biosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Percobaan deteksi transovarial DEN3 dalam laboratorium, diawali dengan

peremajaan virus DEN3 dari stok dalam media kultur essensial agar berpropagasi.

Untuk kemudian diinfeksikan secara peroral ke dalam 12 A. aegypti induk dan dibiakan.

12 stadium keturunan yang terbentuk diuji keberadaan antigennya secara

imunositokimia metode SPBC dengan anti bodi DSSC7. Hasilnya di baca secara

kualitatif dan derajad transovarial disajikan dalam “Transovarial Index Rate (TIR)”.

Untuk mempertegas keberhasilan imunositokimia dilakukan konvirmasi pemeriksaan

RT-PCR pada stadium akhir metamorfose. Di dalam tulisan ini, disajikan pokok-pokok

bahasan yang meliputi persiapan virus dan vektor A. aegypti untuk siap diteliti,

penyisipan virus dan pembiakan nyamuk, serta pemeriksaan imunositokimia dan PCR.

Nilai penting dalam penelitian ini adalah menambah alternatif pemeriksaan akibat

virus dengue pada vektornya sehingga diharapkan dapat memberikan informasi dan

pengetahuan tentang penanggulangan penyakit DBD sedini mungkin sebelum jatuhnya

korban ataupun meledaknya kejadian kasus sakit (KLB). Hasil yang diperoleh dapat

disimpulkan bahwa metode imunositokimia metode SBPC dengan antibodi DSSC7

dapat dipergunakan untuk pemeriksaan virus dengue dalam tubuh vektornya dengan

nilai TIR pada stadium telur 82%, larva 89%, pupa 94% dan dewasa 100%.

Keberhasilan deteksi transovarial penelitian ini dipertegas dengan pemeriksaan RT-PCR

yang memperlihatkan hasil amplifikasi semua induk betina memperlihatkan band pita

sejajar terhadap primer D3 yang dipakai.

Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih banyak kekurangan dan

keterbatasan, oleh sebab itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun

agar tulisan ini bermanfaat bagi banyak pihak.

Surakarta, Januari 2015

Penulis

ix


commit to user

UCAPAN TERIMA KASIH

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada:

1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S selaku rektor Universitas Sebelas Maret Surakarta

yang telah memberikan izin studi di Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Prof. Dr. M. Furqon Hidayatullah, M.Pd selaku Direktur Program Pascasarjana

Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin studi di Program

biosain Pascasarjana Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Dr. Ari Susilowati, S.Si., M.Si selaku Ketua Program Studi Biosain sekaligus

penguji tesis atas segala ilmu dan saran selama proses penelitian.

4. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si selaku dosen pembimbing I yang telah sabar memberikan

bimbingan, petunjuk dan dukungan dalam proses penyusunan tesis ini.

5. dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D selaku dosen pembimbing II yang telah

memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penulis melaksanakan

penelitian sampai terselesaikannya tesis.

6. Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., SU., Sp.Par(K) selaku kepala bagian Parasitologi

Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada atas ijin yang diberikan untuk

melakukan penelitian.

7. Drh. Siti Rahmah Umniyati, SU selaku supervisi di lapangan yang telah

memberikan banyak ilmu, pengetahuan dan masukan demi keberhasilan tesis ini.

8. Ibu Supriatin yang telah membantu pelaksanaan penelitian baik secara teknis

maupun non teknis.

9. Semua dosen di Prodi Biosain yang telah memberikan ilmu pengatahuan dan

wawasan kepada mahasiswa.

10. Keluarga besar Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta yang selalu

memberikan dukungan dan semangat kepada penulis untuk menyelesaikan studi di

Biosain.

x


commit to user

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...................................................................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING ............................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI ...................................................................... iii

PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS .................................... iv

ABSTRAK .................................................................................................................... v

ABSTRACT ................................................................................................................. vi

MOTTO ........................................................................................................................ vii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................................... viii

KATA PENGANTAR .................................................................................................. ix

UCAPAN TERIMAKASIH ......................................................................................... x

DAFTAR ISI ................................................................................................................ xi

DAFTAR TABEL ....................................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN .............................................................................................. 1

A. Latar Belakang ............................................................................................. 1

B. Rumusan Masalah ........................................................................................ 3

C. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 3

D. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 4

A. Landasan Teori ............................................................................................ 4

1. Aedes aegypti ......................................................................................... 4

2. Demam Berdarah Dengue ..................................................................... 13

3. Virus Dengue ......................................................................................... 18

B. Kerangka Pemikiran .................................................................................... 26

C. Hipotesis ...................................................................................................... 27

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................................ 28

xi


commit to user

A. Tempat dan waktu Penelitian ...................................................................... 28

B. Jenis Penelitian ............................................................................................ 28

C. Subjek Penelitian ......................................................................................... 28

D. Sumber Data Penelitian ............................................................................... 28

E. Teknik Sampling ......................................................................................... 28

F. Alat dan Bahan Penelitian ........................................................................... 29

1. Imunositokimia ...................................................................................... 29

2. RT-PCR ..................................................................................................29

G. Prosedur Penelitian ...................................................................................... 30

1. Persiapan sel C6/36 dan virus DEN3 .................................................... 30

2. Persiapan sampel nyamuk ..................................................................... 31

3. Pemeriksaan imunositokimia ................................................................ 31

4. Pemeriksaan RT-PCR pada induk A. aegypti ....................................... 33

H. Pembacaan data penelitian .......................................................................... 35

I. Alur penelitian ............................................................................................. 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Peremajaan DEN3 dari stok kedalam media kultur ..................................... 37

B. Penginfeksian DEN3 hasil propagasi ke dalam

A. aegypti induk ........................................................................................... 39

C. Deteksi DEN3 dengan imunositokimia SBPC ............................................ 39

D. Konfirmasi hasil dengan RT-PCR ............................................................... 43

BAB V. PENUTUP

A. Kesimpulan .................................................................................................. 44

B. Saran ............................................................................................................ 44

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 46

LAMPIRAN .................................................................................................................. 49

xii


commit to user

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Primer untuk pemeriksaan One-Step Multiplex RT-PCR .................................34

Tabel 2. Hasil imunositokimia DEN3 dari stadium-stadium A. aegypti ........................41

xiii


commit to user

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi dewasa Aedes aegypti dengan ciri lyre form ................................ 5

Gambar 2. Aedes aegypti, bentuk gelap dan bentuk pucat .............................................. 6

Gambar 3. Perbedaan thorax Aedes aegypti kiri dengan Aedes albopictus ..................... 6

Gambar 4. Siklus hidup Aedes aegypti ............................................................................ 7

Gambar 5. Telur Aedes aegypti ....................................................................................... 8

Gambar 6. Larva Aedes aegypti (kiri) dengan comb di segmen kedelapan .................... 9

Gambar 7. Pupa Aedes aegypti ...................................................................................... 10

Gambar 8. Negara-negara atau daerah di dunia dengan kasus infeksi dengue............... 14

Gambar 9. Angka Insiden DBD per 100.000 Penduduk di Indonesia Tahun

1968–2009 .................................................................................................... 15

Gambar 10. Perjalanan khas demam berdarah dengue 35 ............................................. 17

Gambar 11. Struktur bola virus dengue ......................................................................... 19

Gambar 12. Genom virus dengue mengkodekan tiga struktural (kapsid [C],

membran [M], dan amplop [E]) dan tujuh protein nonstruktural

(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, dan NS5) ................................. 19

Gambar 13. Prinsip reaksi imunositokimia metode streptavidin-

biotinperoxidase-complex (SBPC) ............................................................ 23

Gambar 14. Sel C6/36 yang sebelum dan sesudah DEN3 berpropagasi ....................... 26

Gambar 15. Hasil kontrol negatif berwarna biru dan kontrol positif

berwarna coklat ........................................................................................ 36

Gambar 16. Hasil positif pemeriksaan imunositokimia memperlihatkan warna

coklat pada stadium telur, larva, pupa dan dewasa .................................... 40

Gambar 17. Unsur pengotor (artefak) pada pengecatan imunositokimia ...................... 42

Gambar 18. Hasil elektroforesis produk RT-PCR ...................................................... 43

xiv


commit to user

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bahan-bahan kultur virus DEN3 ............................................................... 51

Lampiran 2. Peremajaan virus DEN3 pada sel C6/36 ................................................... 52

Lampiran 3. Inkubasi dalam suasana anaerob (CO2 inkubator) .................................... 53

Lampiran 4. Persiapan penginfeksian virus DEN3 dalam A. aegypti induk ................. 54

Lampiran 5. Pembiakan induk A. aegypti positif DEN3 ............................................... 57

Lampiran 6. Pembuatan preparat squash dan pengecatan imunositokimia ................... 58

Lampiran 7. Hewan percobaan mencit .......................................................................... 59

Lampiran 8. Set alat RT-PCR ........................................................................................ 60

Lampiran 9. Daftar Riwayat Hidup ............................................................................... 61

xv

disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh ... fileperpustakaan.uns.ac.id...

Documents