digilib.uns.ac · pdf fileisolasi, identifikasi dan deteksi gen ice nucleation active bakteri...

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN DETEKSI GEN ICE NUCLEATION

ACTIVE BAKTERI PADA TUMBUHAN BERDAUN LEBAR DI JALUR

PENDAKIAN CEMORO SEWU GUNUNG LAWU

TESIS

Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Guna Memperoleh Gelar MagisterProgram Studi Biosain

Oleh:

RIA KARNOS901302007

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2014

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user


commit to user

iii

PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI ISI TESIS

Saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa:

1. Tesis yang berjudul: “Isolasi, Identifikasi dan Deteksi Gen Ice Nucleation

Active Bakteri pada Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro

Sewu Gunung Lawu” ini adalah karya penelitian sendiri dan bebas plagiat,

serta tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk

memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang

pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali secara tertulis

digunakan sebagai acuan dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber

acuan serta daftar pustaka. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam

karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai ketentuan

peraturan perundang-undangan (Permendiknas No. 17, tahun 2010).

2. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi tesis pada jurnal atau forum ilmiah

lain harus seijin dan menyertakan tim pembimbing sebagai author dan PPs

UNS sebagai institusinya. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu

semester (enam bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan

publikasi dari sebagian atau keseluruhan isi Tesis ini, maka Prodi Biosain

PPs-UNS berhak mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan

oleh Prodi Biosain PPs-UNS. Apabila saya melakukan pelanggaran dari

ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik

yang berlaku.

Surakarta, Agustus 2014

Mahasiswa,

Ria Karno

S901302007


commit to user

iv

MOTTO

(Q.S. Ar-Rahman)

من خرج فى طلب العلم كان“ ”فى سبیل اللھ حتى یرحع(H.R.Tirmidzi)

“Hidup adalah kegelapan jika tanpa hasrat dan keinginan. Dan semua hasrat

serta keinginan adalah buta, jika tidak disertai pengetahuan”

(Kahlil Gibran)

Lembahlah Yang Membuat Gunung Terlihat Tinggi

“ I have no special talent. I am only passionately curious."(Albert Einstein)

“You have to endure caterpillars if you want to see butterflies”

(Antoine De Saint)


commit to user

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Dengan mengucapkan syukur Alhamdulillah, kupersembahkan

karya ini untuk :

Istri tercinta, Nurrahmawati yang senantiasa menemani,

mendukung, dan memberi semangat dalam berjuang bersama.

Ayah, Ibu, Papa dan Mama mertua tercinta yang senantiasa

mengiringi tiap langkah kami dengan do’a.

Abang dan Kakak-kakak Ipar tersayang serta adik-adikku

tersayang.

Sahabat-sahabat seperjuangan, Program Studi Biosain 2013.

Almamater, Universitas Sebelas Maret.


commit to user

vi

KATA PENGANTAR

Puji syukur pada sang Ilahi Robbi Allah SWT yang selalu melimpahkan

rahmat, hidayah, dan karuniaNya sehingga peneliti dapat menyelesaikan tesis

dengan judul “Isolasi, Identifikasi dan Deteksi Gen Ice Nucleation Active Bakteri

pada Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro Sewu Gunung

Lawu”. Penelitian tesis ini tentunya tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak.

Untuk itu peneliti mengucapkan terima kasih kepada :

1. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, MS. Direktur Program Pascasarjana Universitas

Sebelas Maret, yang telah memberikan izin penelitian ini.

2. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si, Ketua Program Studi Biosain Fakultas Pascasarjana

Universitas Sebelas Maret Surakarta sekaligus selaku penguji dan

pembimbing akademik yang telah memberikan izin untuk keperluan tesis ini

dan memberikan saran dan masukan kepada penulis.

3. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc,Ph.D selaku pembimbing I yang telah memberikan

bimbingan, nasehat, saran dan bimbingan dalam penelitian tesis ini.

4. Dr. Ari Susilowati, M.Si, selaku pembimbing II yang telah begitu sabar dalam

memberikan bimbingan, nasehat dan saran dalam penelitian tesis ini.

5. Ahmad Dwi Setyawan, M.Si. dosen biologi fakultas MIPA yang telah banyak

membantu dan memberikan saran dalam penelitian ini.

6. Staf Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alamserta Staf Sub Laboratorium Biologi UPT Laboratorium Pusat MIPA,

Universitas Sebelas Maret yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan

penelitian.

7. Ayah dan ibu tercinta, istri, kakak, adik serta keluarga yang selalu mendoakan

dan memberikan dukungan.

8. Teman-teman Biosain Pascasarjana UNS yang selalu memberi semangat,

semoga tali silaturahmi kita tetap terjaga, dan semoga kesuksesan menyertai

kita semua.


commit to user

vii

9. Segenap pihak yang telah membantu peneliti dari pembuatan proposal,

penelitian, sampai penelitian tesis ini yang tidak dapat peneliti sebutkan satu

persatu.

Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi peneliti pada khususnya dan

civitas akademika Fakultas Pascasarjana UNS Surakarta.

Surakarta, Agustus 2014

Peneliti

Ria Karno


commit to user

viii

ABSTRAK

RiaKarno. NIM. S901302007. Isolasi, Identifikasi dan Deteksi Gen Ice Nucleation Active Bakteri pada Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu. Pembimbing I: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., Pembimbing II: Dr. Ari Susiolowati, M.Si. Tesis: Program StudiBiosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2014.

Bakteri Ice Nucleation Active (INA) adalah bakteri filosfer yang mampumenyebabkan luka beku (frost injury) pada permukaan daun tanaman danberperan dalam biopresipitasi. Penelitian dan informasi tentang bakteri INA di daerah subtropis telah banyak dilakukan, namun di daerah tropis masih sedikit.Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat, menentukan spesiesberdasarkan gen penyandi 16S rRNA dan mengetahui hubungan kekerabatanbakteri INA yang diisolasi dari tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakianCemoro Sewu, Gunung Lawu yaitu 6 spesies tumbuhan berdaun lebar sertamengetahui gen penyandi protein pembentuk inti es bakteri INA.

Isolasi bakteri INA dilakukan dengan metode spread plate pada media Nutrient agar + gliserol (NAG) dan media King’s B. Aktivitas nukleasi esditentukan dengan metode tube nucleation test menggunakan circulating alcohol bath. Estimasi populasi ditentukan berdasarkan tabel MPN. Amplikon gen 16S rRNA dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan 63 forward primer dan 1387 reverse primer. Hubungan kekerabatan ditentukanberdasarkan pohon filogenetik menggunakan program MEGA 5.1. Deteksi gen ina dilakukan dengan PCR menggunakan primer forward dan reverse dari inaZ, inaA, inaW serta inaX. Sekuens DNA dianalisis untuk mengetahui kemiripan dengan gen daribakteri INA lain yang ada di situs NCBI secara online.

Hasil penelitian didapatkan 3 isolat bakteri INA. Isolat A2N4 daritumbuhan Dodonae viscose Jacq memiliki similaritas 96% dengan Pseudomonas syringae. Isolat C2N9 dari tumbuhan Vaccinium laurifolium memiliki similaritas 97% dengan Pantoea sp dan isolat F1N6 dari tumbuhan Polygonum chinense L yang teridentifikasi memiliki similaritas 98% dengan Pseudomonas sp. Populasibakteri yang ditemukan tergolong rendah yakni <3 x 103/g hingga 5,4 x 103/g daun. Bakteri INA dari jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu dan bakteri INA yang ditemukan sebelumnya memilki hubungan kekerabatan yang dekat.Hasil analisis sekuens gen ina menunjukkan gen pada isolat A2N4 mempunyaisimilaritas 99 % dengan gen pengkode ice nucleation protein pada Pseudomonas syringae, strain INA4.

Kata kunci: Bakteri Ice Nucleation Active (INA), deteksi gen, filogenetik, tumbuhan berdaun lebar, Cemoro Sewu, Gunung Lawu.


commit to user

ix

ABSTRACT

Ria Karno. NIM. S901302007. Isolation, Identification and Detection Ice Nuclation Active Bacteria In Broadleaf Plant At Tracking Route Of CemoroSewu, Gunung Lawu. Adviser I: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D., Adviser II: Dr. Ari Susilowati, M.Si. . Thesis: Bioscience Study Program, Postgraduate Program, Sebelas Maret University.2014.

Ice nucleation Active Bacteria (INA) is a filosfer bacterium that can cause frost injury on the surface of plant leaves, besides, this bacteria also has a role in the process of bioprecipitation. Research and information on INA bacteria in subtropical regions have been carried out a lot, however they are still very little to be done in the tropical regions. This research aims to obtain isolates, to determine species based on 16S rRNA gene and to find out the genetics relationship of INA bacteria which is isolated from broadleaf plants in the Tracking route of Cemoro Sewu, Gunung Lawu which consists of 6 species of Lawu broadleaf plant and also to find out the protein-coding genes of ice nucleating bacteria of INA.

Isolation of INA bacteria was carried out by using spread plate method on the media of Nutrient agar + glycerol (NAG) and King's B media. The ice nucleation activity was determined by the method of tube nucleation test using circulating alcohol bath. The estimation of population were determined based on the MPN table. 16S rRNA gene amplification was done by Polymerase Chain Reaction (PCR) using 63 Forward primer and 1387 reverse primer. Genetic relationship was determined based on the phylogenetic tree in MEGA 5.1. program. Ina gene detection was done with PCR using forward and reverse primer of inaZ, inaA, inaW and inaX. DNA sequences were analyzed to find out its similarity with genes from other INA bacteria that exist in the GeneBank of NCBI online.

The results of the research obtained 3 isolates of INA bacteria. A2N4 isolates which was detected from the plants of Dodonae viscose Jacq had 96% similarity with Pseudomonas syringae. C2N9 isolates from Vaccinium laurifoliumplants had 97% similarity with Pantoeasp and F1N6 isolates from Polygonum chinense L plant identified had 98% similarity with Pseudomonas sp. The estimation of population of bacteria found were relatively low at <3 x 103 to 5.4 x 103/ g of leaf. The genetic relationship of INA positive bacteria from the Tracking route of Cemoro Sewu, Gunung Lawu and INA bacteria which was found previously had very close genetic relationship. The results ina gene sequence analysis showed that isolates A2N4 were 99% detected as ice nucleation protein coding genes in Pseudomonas syringae existing in ice4 gene, strain INA4.

Keywords: Ice nucleation Active Bacteria (INA), isolation, identification, detection of genes, phylogenetic, broadleaf plants.


commit to user

x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL..................................................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN………………………………...................... ii

PERNYATAAN…………………………………………………….……... iv

MOTTO…………........................................................................................... v

HALAMAN PERSEMBAHAN…………........................................................ vi

KATA PENGANTAR….............................................................................. vii

ABSTRAK…………...................................................................................... ix

ABSTRACT………….................................................................................... x

DAFTAR ISI…….......................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR…………..................................................................... xiii

DAFTAR TABEL………….......................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN………….................................................................. xv

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang.................................................................................... 1

B. Rumusan Masalah................................................................................ 4

C. Tujuan Penelitian .............................................................................. 4

D. Manfaat Penelitian.............................................................................. 5

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka……………………………………………………. 6

1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA)…………………………….. 6

2. Gunung Lawu……………………………………………………. 12

B. Kerangka Pemikiran……………………………………………….... 15

C. Hipotesis……………………………………………………………. 17

BAB III METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian………………………………………. 18

B. Alat dan Bahan Penelitian…………………………………………... 18

C. Rancangan Penelitian……………………………………………….. 19

D. Analisis Data………………………………………………………... 24


commit to user

xi

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,

Gunung Lawu………………………………………………………. 25

B. Isolat bakteri ice nucleation active dari tumbuhan berdaun lebar di

Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu…………………….. 26

C. Populasi bakteri ice nucleation active .…………………………….. 28

D. Analisis Kemurnian DNA bakteri………………………………….. 30

E. Gen penyandi 16S rRNA isolat bakteri INA dari jalur Pendakian

Cemoro Sewu, Gunung Lawu……………………………………… 31

F. Sekuens gen penyandi 16S rRNA………………………………….. 33

G. Hubungan kekerabatan……………………………………………... 34

H. Amplikon gen ina…………………………………………………... 36

I. Sekuens gen ina…………………………………………………….. 41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan penelitian……………………………………………… 43

B. Saran……………………………………………………………....... 44

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 45


commit to user

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu……………. 13

Gambar 2. Bagan kerangka pemikiran………………………………… 16

Gambar 3. Tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,

Gunung Lawu……………………………………………… 25

Gambar 4. Aktivitas nukleasi es isolat dari tumbuhan berdaun lebar di

Jalur Pendakian Cemoro Sewu…………………………….. 27

Gambar 5. Estimasi populasi bakteri INA pada uji MPN……………... 29

Gambar 6. Profil amplikon gen penyandi 16S rRNA dengan primer

63f dan 1387r………………………………………………. 32

Gambar 7. Pohon filogenik bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar

di jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu dan

beberapa bakteri INA yang ditemukan sebelumnya……….. 35

Gambar 8. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan

primer inaZ………………………………………………… 37

Gambar 9. Profil amplikon gen ina pada isolat A2N4 menggunakan

primer inaZ f dan inaZr dengan variasi suhu annealing…… 39


primer inaA………………………………………………… 39


primer inaX………………………………………………... 40

Gambar 12. Profil amplikon gen ina pada isolat C2N9 menggunakan

primer inaA untuk optimasi dengan variasi suhu

annealing…………………………………………………… 41

Gambar 13. Profil amplikon gen ina pada isolat F1N6 menggunakan

primer inaX untuk optimasi dengan variasi suhu

annealing…………………………………………………… 41


commit to user

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Jumlah isolat bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dari

tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu....... 27

Tabel 2. Estimasi jumlah bakteri berdasarkan tabel MP.......................... 30

Tabel 3. Konsentrasi dan Kemurnian DNA bakteri................................. 30

Tabel 4. Spesies-spesies yang mirip dengan isolat yang ditemukan

berdasarkan gen penyandi 16S rRNA bakteri INA………... .... 33

Tabel 5. Amplifikasi menggunakan empat primer spesifik gen ina ....... 37

Tabel 6 Gen ina yang memiliki similaritas dengan Sekuens DNA

menggunakan primer spesifik inaZ ……..………………….... 41


commit to user

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Data isolat dari keenam sampel penelitian ………………. 52

Lampiran 2 Tabel MPN (Kombinasi estimasi bakteri) ………………. 53

Lampiran 3. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen 16S

rRNA……………………………………………………... 54

Lampiran 4. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4 pada

program BLAST dan Alligment urutan basa DNA dari

gen 16S rRNA ................................................................... 57

Lampiran 5. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen ina ……… 65

Lampiran 6. Urutan basa DNA dari gen ina pada program BLAST dan

Alligment basa DNA dari gen ina ……………………….. 66

Lampiran 7. Hasil BLASTX asam amino, alligment produk BLASTX

dan urutan asam amino isolat A2N4 …………………….. 67


commit to user

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme merupakan komponen penting dalam ekosistem. Jumlah

mikroorganisme melimpah dan tersebar pada banyak tempat di alam, baik pada

tubuh makhluk hidup maupun pada lingkungan di sekitarnya. Di dalam

komunitas, interaksi mikroorganisme dengan sesama mikroorganisme atau dengan

organisme lain dapat bersifat menguntungkan dan merugikan. Mikroorganisme

cenderung diasosiasikan dengan penyakit-penyakit infeksi atau pembusukan

makanan. Akan tetapi, mayoritas mikroorganisme justru memberikan kontribusi

bagi keseimbangan ekosistem lingkungan hidup (Pelczar, 2003). Salah satu dari

mikroorganisme itu adalah bakteri.

Bakteri merupakan organisme yang penyebarannya sangat luas dan

jumlahnya sangat banyak serta mampu hidup pada tempat-tempat yang ekstrim

dan tidak wajar seperti di tempat dengan suhu panas (60°C - 80°C), di tempat

dengan kondisi asam yang tinggi, miskin oksigen dan tempat ekstrim lainnya.

Bakteri juga banyak terdapat di tubuh organisme baik hewan maupun tumbuhan,

dalam tubuh atau pun bagian tubuh organisme.

Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa bakteri memiliki peranan

yang cukup besar bagi komunitas dan lingkungannya. Bakteri dari genus

Rhizobium berperan dalam menyediakan nitrogen bagi tanaman inangnya,

sedangkan bakteri Pasteuria penetrans berperan dalam pengendalian nematoda

pada tanaman. Bakteri juga memiliki pengaruh yang besar bagi lingkungan

terutama pada daun tanaman, salah satu di antaranya adalah peneltian Lindow et

al., (1982) tentang bakteri Ice Nucleation Active.

Bakteri Ice Nucleation Active (INA) adalah salah satu bakteri yang

terdapat pada bagian organ tumbuhan yaitu pada permukaan daun. Menurut

Lindow et al., (1982), keberadaan bakteri INA pada permukaan daun mampu

meningkatkan kemungkinan terbentuknya luka beku (frost injury) pada suhu


commit to user

2

diatas -5ºC. Penelitian Hirano & Upper (2000), juga telah membuktikan

kemampuan bakteri INA menyebabkan kerusakan beku pada beberapa tumbuhan.

Bakteri INA mampu menginisiasi pembentukan es, kemampuannya dalam

menginisiasi es didapat secara alami karena adanya substansi pembentuk inti es

(Lindow, 1983). Pembentukan inti es oleh bakteri INA dilakukan dengan

mengekspresikan jenis protein tertentu. Protein yang terdapat pada bakteri INA

misalnya pada Pseudomonas syringae, mengekspresikan protein inti es (ice

nucleation protein) yang terdapat pada membran luar selnya. Secara normal air

dingin akan membeku secara spontan apabila suhu di bawah -40ºC, dan apabila di

atas suhu -40ºC, maka air murni hanya akan menjadi super dingin (supercool).

Adanya pembentuk inti es pada bakteri INA dapat membantu mempercepat

pembekuan es. Hal ini karena inisiasi pembentukan es tergantung pada kehadiran

inti es, ukuran partikel dan bentuk inti es. Bakteri INA mampu mengkatalis

pembentukan es pada suhu di atas -10°C, bahkan beberapa di antaranya dapat

membentuk inti es pada suhu -1,5°C. Bakteri INA sebagian besar berasosiasi

dengan tanaman (Waturangi et al., 2008).

Bakteri INA umumnya tumbuh pada permukaan daun tanaman, beberapa

di antaranya yang telah ditemukan adalah Pseudomonas syringae, Pseudomonas

viridiflava, Pseudomonas fluorescens, Erwinia herbicola dan Xanthomonas

campestris (Edwars et al., 1994). Sebagian dari bakteri-bakteri ini secara potensial

memainkan peranan dalam pembentukan salju, perubahan cuaca, dan

pembentukan inti es di awan serta menstimulasi terjadinya hujan (Wahyudi,

1995).

Bakteri INA berpartisipasi dalam siklus biopresipitasi yaitu membantu

dalam mempengaruhi pembentukan awan dan hujan. Bakteri INA yang terdapat

pada daun terbawa oleh angin ke awan dan akan membantu dalam mempengaruhi

terjadinya hujan, sebaliknya hujan akan menguntungkan bagi pertumbuhan

bakteri yang terdapat pada permukaan tanaman karena kebutuhannya akan air

terpenuhi (Morris et al., 2004).

Bakteri INA melimpah pada permukaan daun, terutama pada daerah

dengan temperatur udara yang mendukung keberadaannya. Di Gunung Lawu,


commit to user

3

temperatur udaranya relatif rendah yaitu berkisar 20°C dan curah hujan yang lebih

tinggi. Menurut penelitian Setyawan (2000) jalur pendakian Cemoro Sewu

Gunung Lawu, merupakan daerah dengan tangkapan air hujan yang paling banyak

di antara lereng-lereng gunung lawu yang lainnya. Berdasarkan penelitian

Khussurur (2005) di jalur pendakian Cemoro Sewu ditemukan puluhan jenis

tumbuhan dan sebagian besar di antaranya adalah tumbuhan berdaun lebar.

Penelitian Lindow et al., (1978) menyatakan bahwa bakteri INA telah ditemukan

pada 74 spesies tanaman yang didapatkan dari California, Colorado, Florida,

Lousiana dan Wisconsin, Amerika Serikat. Penelitian ini mengindikasikan

kemungkinan terdapatnya bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar.

Tumbuhan berdaun lebar merupakan tumbuhan yang memiliki kanopi

lebih luas jika dibandingkan dengan tumbuhan lain. Dengan curah hujan yang

tinggi serta temperatur udara yang rendah di jalur pendakian Cemoro Sewu,

kemungkinan terdapatnya bakteri pengkristal es akan berpeluang sangat besar,

karena sebagian bakteri INA adalah bakteri yang banyak terdapat di udara dan air

hujan, sehingga penutupan kanopi yang luas dari tumbuhan berdaun lebar

memungkinkan peluang yang besar dalam menemukan bakteri pengkristal es.

Sebagian besar penelitian tentang bakteri INA dilakukan di daerah

subtropis, sedangkan di daerah tropis penelitian tentang bakteri INA masih relatif

sedikit, terutama pada tanaman berdaun lebar. Padahal, jumlah tanaman berdaun

lebar melimpah. Selain itu identifikasi dan karakterisasi gen bakteri juga masih

sangat sedikit. Identifikasi bakteri dan karakterisasi bakteri diperlukan untuk

mengetahui jumlah bakteri ini di alam dan memperkirakan peranannya bagi

lingkungan khususnya pada permukaan daun tumbuhan berdaun lebar di daerah

tropis.

Bakteri INA memiliki peran yang penting dalam biopresipitasi. Dengan

peranan bakteri INA itu, maka penelitian tentang isolasi, identifikasi molekuler

dan deteksi gen bakteri INA pada tanaman berdaun lebar di wilayah beriklim

tropis sangat perlu untuk dilakukan.


commit to user

4

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut dapat dirumuskan permasalahan

sebagai berikut :

1. Adakah bakteri Ice Nucleation Active (INA) yang dapat diisolasi dari

tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu?

2. Berapakah jumlah bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan

berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu ?

3. Apa saja spesies bakteri Ice Nucleation Active (INA) berdasarkan gen

penyandi 16S rRNA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar di jalur

pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu ?

4. Bagaimana hubungan kekerabatan antar bakteri Ice Nucleation Active

(INA) pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu

Gunung Lawu ?

5. Bagaimanakah karakter gen penyandi protein pembentuk inti es pada

bakteri Ice Nucleation Active (INA) yang ditemukan dari tumbuhan

berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu ?

C. Tujuan Penelitian

1. Menemukan dan mendapatkan isolat bakteri Ice Nucleation Active (INA)

pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung

Lawu.

2. Mengetahui jumlah bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan

berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu.

3. Mengetahui spesies bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan

berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu berdasarkan

gen 16S rRNA.

4. Mengetahui hubungan kekerabatan bakteri Ice Nucleation Active (INA)

pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung

Lawu.


commit to user

5

5. Mengetahui karakter gen penyandi protein pembentuk inti es pada bakteri

Ice Nucleation Active (INA) yang ditemukan dari tumbuhan berdaun lebar

di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu.

D. Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi kepada masyarakat tentang adanya bakteri Ice

Nucleation Active (INA) pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian

Cemoro Sewu Gunung Lawu.

2. Memberikan informasi tentang jenis, jumlah, karakter gen dan hubungan

kekerabatan bakteri Ice Nucleation Active (INA) pada tumbuhan berdaun

lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu.

3. Memperkirakan kemampuan bakteri Ice Nucleation Active (INA) dalam

peranannya sebagai biopresipitasi.

4. Membantu pengolahan lahan dengan memilih vegetasi yang sesuai dalam

rangka memodifikasi cuaca.


commit to user

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA)

Jumlah bakteri di alam sangat melimpah, baik yang hidup di air, tanah,

tubuh organisme, tanaman atau bagian dari organ tanaman. Pada organ tanaman

khususnya daun, populasi bakteri yang paling banyak merupakan kelompok

bakteri filosfer yaitu bakteri yang berada di permukaan daun tanaman. Salah satu

diantaranya adalah bakteri yang mampu secara aktif menginisiasi pembentukan es

pada permukaan daun (Lindow et al., 1978).

Menurut Wahyudi (1995) pada umumnya organ tanaman, khususnya daun

membawa sejumlah bakteri pembentuk inti es. Adanya bakteri inti es pada daun

tanaman memungkinkan terbentuknya partikel-partikel es. Transisi pembentukan

cairan ke bentuk es ini disebut dengan nukleasi. Sedangkan zat yang memfasilitasi

transisi sehingga mengakibatkan pembekuan pada sub-nol disebut dengan

nucleator (Stephanie & Diana, 2011). Bakteri yang memiliki kemampuan dalam

nukleasi dan memiliki protein yang memfasilitasi transisi sehingga terjadi

pembekuan ini yang disebut dengan bakteri Ice Nucleation Active (INA).

Bakteri Ice Nucleation Active (INA) adalah bakteri yang habitatnya di

permukaan daun tanaman atau sering disebut dengan bakteri filosfer. Bakteri INA

merupakan bakteri yang mampu menginisiasi pembentukan inti es pada

permukaan daun tanaman. Kemampuan bakteri INA menginisiasi pembentukan

inti es dikarenakan kandungan protein yang memungkinkan bakteri ini mengawali

pengkristal es pada suhu diatas -5˚C, bahkan ada yang mampu membentuk es

pada suhu -1,5˚C (Gurian-Sherman & Lindow, 1993). Jika bakteri INA tidak

memiliki protein nukleasi es, air dingin murni hanya dapat sebatas menjadi super

dingin dan tidak akan langsung membeku hingga suhu mencapai -40˚C.

Bakteri INA telah ditemukan pada genus dari tiga bakteri gram-negatif

yaitu : Pseudomonas, Erwinia dan Xanthomonas (Waturangi & Amelia, 2009).

Dari genus Pseudomonas ditemukan dua spesies yakni Pseudomonas syringae

6


commit to user

7

dan Pseudomonas fluorescens. Dari genus Erwinia juga dua spesies yakni

Erwinia herbicola dan Erwinia ananas. Sedangkan Xanthomonas spesies yang

ditemukan adalah Xanthomonas translucens (Edwars et al., 1994).

Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, bakteri dari genus

Pseudomonas banyak ditemukan. Menurut Rostami (2012), bakteri INA dari

strain Pseudomonas syringae paling banyak ditemukan pada tanaman yang telah

diteliti.

a. Habitat dan Distribusi

Bakteri INA umumnya ditemukan hampir pada seluruh permukaan daun di

daerah yang memiliki suhu relatif rendah. Sebagian besar bakteri INA merupakan

bakteri filsofer yakni bakteri yang terdapat di bagian permukaan daun di antaraya

pada stomata, di sepanjang tulang daun dan dinding sel epidermi (Battie &

Lindow, 1999). Besarnya populasi bakteri nukleasi es mencapai 106 sel/g jaringan

tanaman. Jumlah populasi dapat berkurang bahkan hilang pada permukaan

tanaman. Hal ini tergantung pada kondisi lingkungan dan spesies tanaman (Hirano

& Christen, 2000). Selain itu kandungan nutrisi daun tanaman juga akan

mempengaruhi keberadaan bakteri INA. Permukaan daun yang memiliki senyawa

organik seperti fruktosa, sukrosa, asam amino dan vitamin akan dijadikan energi

dan sumber karbon bagi bakteri INA.

Menurut Beattie & Lindow (1999), kondisi stres lingkungan seperti

ketersediaan air, fluktuasi panas, stres osmotik dan paparan radiasi UV matahari

akan mempengaruhi jumlah populasi bakteri. Bakteri juga harus dapat bertahan

dari keadaan lingkungan yang berubah-ubah.

Kemampuan bakteri INA dalam pembentukan inti es dapat membantu

dalam menghadapi kondisi lingkungan yang berubah-ubah. Hal ini dikarenakan

kemampuan bakteri INA dalam mematikan sel-sel dan jaringan tanaman akibat

luka beku pada permukaan daun tanaman. Dalam hal ini bakteri pembentuk kristal

es sering dikonotasikan sebagai bakteri parasit (Morris et al., 2004). Adanya luka

beku pada sel-sel dan jaringan tanaman ini memberikan keuntungan bagi bakteri

INA karena mudah untuk diuraikan dan digunakan sebagai nutrisi bagi bakteri.


commit to user

8

Bakteri INA sangat melimpah di alam. Bakteri INA banyak ditemukan di

permukaan daun.Lindow et al., (1978) telah mendapatkan beberapa isolat bakteri

dari spesies Pseudomonas syringae dan Erwinia herbicola pada permukaan daun

tanaman. Bakteri INA juga melimpah di dalam salju dan air hujan (Morris et al.,

2004; Christner et al., 2008). Penelitian Brent Christner et al., (2008) menemukan

bahwa setiap sampel salju yang dikumpulkan ketika baru turun berisi bakteri

pembentuk inti es.

Studi tentang bakteri INA yang telah dipublikasikan lebih banyak

dilakukan di daerah subtropis. Namun, pada penelitian Waturangi et al. (2008)

ditemukan bakteri INA dari tanaman berdaun tropis yang dimakan yakni pada

tanaman poh-pohan (Pilea glaberina). Spesies bakteri yang ditemukan adalah

Pseudomonas sp. Bakteri INA dari genus Pseudomonas dan Xanthomonas juga

ditemukan oleh Ketabachi (2004), pada pohon Almond di provinsi Fars di Iran.

Ghasemi (1993), juga berhasil mengisolasi bakteri INA dari pohon Cherry dan

pohon-pohon Aprikot di wilayah Shahroud, Iran.

Isolasi bakteri dari air hujan dan udara juga pernah dilakukan di daerah

tropis. Waturangi (2011) dalam penelitiannya pada Maret hingga Mei 2008 di

Jakarta, Bogor, Bekasi, Tangerang dan Depok telah berhasil mengisolasi bakteri

INA dari air hujan dan udara. Dari hasil penelitiannya populasi bakteri INA

tertinggi ditemukan pada sampel air hujan dan udara yang diambil di Jakarta.

Sedangkan persentase bakteri INA dari air hujan lebih tinggi dari pada yang

diambil dari udara. Hal ini menunjukkan bahwa distribusi bakteri INA di daerah

tropis telah beberapa ditemukan, baik dari permukaan daun, dari air hujan maupun

dari udara.

Bakteri INA banyak ditemukan di permukaan daun tumbuhan. Arwiyanto

(2009), mengemukakan beberapa penelitian di Jepang ditemukan bakteri INA

pada tanaman teh, brokoli, murbei dan kubis. Bakteri INA juga ditemukan pada

tanaman jeruk, tomat, gandum dan beberapa tanaman keras di Amerika Serikat.

b. Gen penyandi Ice Nucleation Protein pada bakteri INA.

Pada membran bagian luar sel bakteri INA terdapat protein yang berperan

dalam pembentukan inti es dan dapat berinteraksi langsung dengan lingkungan


commit to user

9

eksternal. Protein pembentuk inti es ini diperlukan sebagai adaptasi bakteri

terhadap situasi yang berubah-ubah. Adanya protein pembentuk inti es membantu

bakteri INA dalam mempertahankan diri terhadap kondisi perubahan tersebut.

Pembentukan inti es pada bakteri dikendalikan oleh gen yang bertanggungjawab

dalam pembentukan inti espada suhu -2˚C sampai -4˚C, meskipun perannya yang

berkaitan dengan fisiologis bakteri belum diketahui (Morris et al., 2008). Hal ini

telah dibuktikan dari semua bakteri pembentuk inti es yang telah diuji, dan gen

tersebut telah diklon dari hampir semua spesies bakteri pembentuk inti es.

Kloning gen ina juga telah dilakukan. Beberapa yang telah berhasil

dikloning dan diurutkan adalah gen dari lima spesies bakteri yaitu : inaZ dari

Pseudomonas syringae (Green & Warren, 1985), inaW dari Pseudomonas

fluorescens (Warren et al., 1986), inaE dari Erwinia herbicola (Warren &

Corotto, 1989), inaA dari Erwinia ananas (Abe et al., 1989) dan inaX dari

Xanthomonas campestris pathopar translucens (Zhao & Orser, 1990).

Semua struktur gen pembentuk inti es serupa, walaupun gen

pembentuknya memiliki panjang yang berbeda. Semua gen akan menyandikan

protein yang unik dan atau khas pada ujung asam amino dan karboksilnya. Pada

bagian ujung aminonya bermuatan positif dan menyisip pada membran luar. Ini

berfungsi untuk stabilitas. Sedangkan pada ujung karboksilnya bermuatan positif

maupun negatif. Bagian tengah terdapat 16 asam amino yang diulang-ulang

hingga 120 kali ulangan (80% - 90% dari total protein) dan kaya akan asam amino

polar serin dan threonin yang berperan dalam mengorientasikan molekul-molekul

air tertata rapi hingga membentuk inti es (Kozloff et al., 1991b; Gurian-Sherman

& Lindow, 1993).

Ukuran protein pembentuk inti es pada bakteri INA berkisar antara 150 -

190.000 kilo Dalton (Govindarajan & Lindow, 1998). Sedangkan ukuran fragmen

DNA yang membawa gen ice+ yang berperan menghasilkan protein aktif

pembentuk inti es berkisar antara 3,4 sampai 4,0 kilo pasangan basa (Orser, et al.,

1985).

Protein aktif pembentuk inti es pada umumnya bersifat hidrofilik sehingga

terdapat pada permukaan membran luar bakteri. Pada Pseudomonas syringae


commit to user

10

protein pembentuk inti es terdapat pada membran luar sel dan untuk aktivitasnya

diperlukan kesatuan dengan lipid membran (Kozloff et al., 1991b). Dengan

demikian protein INA tersebut akan menjadi aktif bila telah disisipkan pada

membran luar sel bakteri.

Berdasarkan akitivitasnya protein INA terbagi atas tiga kelas utama yaitu

kelas A (aktif membentuk inti es pada suhu -2˚C hingga -5˚C), kelas B (aktif

membentuk inti es pada suhu -5˚C hingga -7˚C ) dan kelas C (aktif membentuk

inti es pada suhu -7˚C hingga -10˚C). Adanya pembagian kelas ini dipengaruhi

oleh lipid fosfatidilinositol dan karbohidrat pada protein INA. Kelas A strukturnya

mengandung protein pembentuk inti es yang bergabung dengan fosfatidilinositol

dan manosa kompleks manan serta glukosamin. Kelas B strukturnya mengandung

protein pembentuk inti es yang bergabung dengan manan dan glukosamin, tapi

tidak bergabung dengan fosafatidilinositol. Sedangkan kelas C strukturnya

mengandung protein pembentuk inti es yang bergabung dengan beberapa residu

manosa saja (Turner et al., 1991).

c. Mekanisme pembentukan inti es

Pembentukan inti es diperlukan oleh bakteri INA sebagai cara untuk

memperoleh nutrisi dengan cara melukai tumbuhan dan digunakan untuk

menghambat bakteri lain yang menggunakan sumber nutrisi yang sama atau untuk

adaptasi perubahan cuaca seperti angin, hujan dan radiasi sinar ultraviolet

matahari (Suwanto, 1994).

Pembentukan inti es dapat dilakukan oleh bakteri INA karena adanya

protein unik yang berada pada membran luar sel bakteri pembentuknya. Protein

tersebut disandikan oleh satu gen tunggal yang disebut gen ice + atau ina.

Mekanisme pembentukan inti es dilakukan oleh protein INA yang bersifat

hidrofilik dengan cara mengkatalisis pembentukan inti es. Efektivitas protein ini

tergantung pada penataan di permukaan membran dan tingkat agregasinya. Pada

populasi bakteri yang tinggi, penataan dan agregasinya kompak sehingga jika satu

protein sudah membentuk inti es, maka protein yang lainnya akan lebih mudah

terinisiasi. Dengan terbentuknya satu pembentuk inti es maka protein yang


commit to user

11

disusun kompak tersebut akan langsung menginisiasi air di sekitarnya menjadi es

juga (Sastry, 2005).

Pembentukan inti es oleh bakteri dipengaruhi oleh suhu, yaitu ketika suhu

rendah (kurang dari 0°C) air berada dalam keadaan metastabil. Populasi sel dari

galur-galur bakteri INA mampu mengkatalis pembentukan inti es dalam supercool

water yang suhunya antara -2°C hingga -12°C. Pada suhu hangat (-5°C) inti es

cenderung menjadi jarang dalam suatu populasi sel (Govindarajan & Lindow,

1998). Secara invitro pembentukan inti es sering dilakukan pada suhu -5°C hingga

-10˚C (Lindow et al., 1982a). Hal ini dilakukan untuk menjaga suhu pertumbuhan

atau suhu inkubasi sel sebelum diuji aktivitas pembentukan inti esnya. Selain

suhu, media kultur juga dapat mempengaruhi pembentukan inti es secara invitro.

Frekuensi pembentukan inti es dapat meningkat apabila ditumbuhkan pada

media yang sesuai di antaranya: media yang mengandung polialkohol seperti

gliserol, manitol, sorbitol dan sejenisnya (Lindow et al., 1982a). Frekuensi

pembentukan inti es pada bakteri INA dapat dipengaruhi oleh kondisi sel-sel

tumbuh dan suhu selama pertumbuhan serta pada komposisi media yang

digunakan sebagai media tumbuh (Hirano et al., 1991).

Kemampuan bakteri INA dalam pembentukan inti es terjadi karena adanya

inisiasi transisi dari bentuk cair ke es yang disebut nukleasi. Nukleasi merupakan

salah satu langkah awal yang penting dalam menciptakan es. Tanpa langkah ini,

es tidak akan pernah terbentuk atau hanya berada pada kondisi super dingin (Du et

al., 2003).

d. Peran bakteri INA dalam biopresipitasi

Biopresipitasi merupakan suatu siklus biologi berupa partisipasi bakteri

INA pada tanaman yang dapat memberikan kontribusi terhadap peningkatan curah

hujan. Bakteri INA yang berada pada kanopi-kanopi tanaman akan pindah ke

awan dan menstimulasi terjadinya hujan, sebaliknya peningkatan curah hujan

akan mempengaruhi penyebaran dan pertumbuhan bakteri INA serta

meningkatkan pertumbuhan tanaman (Morris et al., 2004). Tanpa adanya bakteri

INA, air di awan akan tetap menjadi cair hingga suhu mencapai -38°C (Attard et

al., 2012).


commit to user

12

Kemampuan bakteri INA dalam peningkatan curah hujan didasarkan pada

gagasan bahwa bakteri INA mampu mengkatalis pembentukan inti es.

Pembentukan inti es sangat diperlukan dalam pembentukan hujan pada awan

dingin (Polymenakou, 2012). Pembentukan hujan diawali dengan peristiwa

pembentukan kristal-kristal es yang berasal dari titik-titik air di dalam awan. Uap

air yang membentuk awan akan menempel pada kristal-kristal es tersebut

sehingga semakin membesar dan bertambah berat. Kristal-kristal es yang semakin

besar dan bertambah berat tidak mampu ditopang oleh angin sehingga akan jatuh

ke permukaan bumi dalam bentuk butiran-butiran air yang sering disebut hujan.

Peran bakteri INA dalam menstimulasi terjadinya hujan didasari oleh

keberadaannya yang melimpah di atmosfer. Bakteri INA terdapat dalam curah

hujan dan untuk beberapa lokasi geografis, aktivitas dan konsentasi bakteri ini

terkait dengan musim dan kimia curah hujan (Christner et al., 2008). Bakteri INA

ditemukan dalam beberapa sampel air hujan yang diambil dari Jakarta, Bogor,

Tangerang, Bekasi dan Depok (Stephanie & Waturangi, 2011).

Bakteri INA mudah menyebar ke jarak yang luas melalui pergerakan

angin. Penyebaran bakteri INA yang luas di atmosfer dapat mempengaruhi proses

meteorologi dan menyebabkan presipitasi (Morris et al., 2008).

2. Gunung Lawu

Gunung Lawu adalah gunung yang terletak di Pulau Jawa. Gunung Lawu

merupakan pegunungan vulkanik tuayang tidak aktif. Secara geografis gunung

Lawu terletak di sekitar 111˚15’ BT dan 7˚ 30’LS. Lereng di sebelah barat gunung

ini secara administratif termasuk wilayah Provinsi Jawa Tengah, meliputi

Kabupaten Karanganyar, Sragen dan Wonogiri, sedang lereng timur termasuk

Propinsi Jawa Timur, meliputi Kabupaten Magetan dan Ngawi. Gunung ini

memanjang dari utara ke selatan, dipisahkan jalan raya penghubung propinsi Jawa

Tengah dan Jawa Timur, dengan Cemoro Sewu sebagai dusun teratas. Topografi

bagian utara berbentuk kerucut dengan puncak Argo Dumilah setinggi 3.265 m

diatas permukaan laut (Setyawan & Sugiyarto, 2001).

Bagian selatan gunung Lawu memiliki topografi sangat komplek yang

terdiri dari bukit dan jurang dengan puncak Jobolarangan setinggi 2.298 m dpl. Di


commit to user

13

lereng ini kawasannya sangat subur, karena merupakan daerah tangkapan hujan,

dimana angin tenggara yang berawan dan mengandung uap air menabrak gunung

dan terangkat ke atas, sehingga terjadi kondensasi dan titik-titik air turun sebagai

hujan. Pada lereng selatan, sepanjang tahun relatif mendapatkan curahan hujan

lebih tinggi bandingkan dengan lereng-lereng yang lain (Setyawan, 2000).

Sedangkan di sebelah utara terlihat lembah, bukit pasar dieng dan selo pundutan

(Sunarto, 2000).

Hutan di Gunung Lawu relatif beragam. Hal ini diakibatkan oleh

konsekuensi ketinggian gunung sehingga dijumpai beberapa zonasi tipe hutan

menurut ketinggian, yaitu zona hutan dataran rendah, zona hutan pegunungan

rendah, zona hutan pegunungan tinggi dan zona hutan sub-alpin (Stenis, 1972).

Pada kondisi hutan primer yang sangat lebat, sebagian besar ditumbuhi

oleh spesies-spesies herba dan jarang dijumpai rumput (Stenis, 1972,

Resosoedarmo et al., 1985). Hal ini diakibatkan karena intensitas cahaya matahari

yang relatif sedikit. Pada daerah dengan cahaya matahari yang cukup pertmbuhan

rumput, tumbuhan paku, lumut dan herba melimpah (Stenis, 1972).

Bagian dalam hutan berupa hutan primer dengan pohon-pohon tua dan

besar. Bagian luar berupa tanaman industri yang didominasi pohon Pinus, Puspa

dan Akasia.

a. Jalur pendakian Cemoro Sewu

Gambar 1. Jalur pendakian cemoro sewu, Gunung Lawu


commit to user

14

Puncak tertinggi gunung Lawu berada pada ketinggian 3.265 m di atas

permukaan laut dengan puncak Argo (Hargo) Dumilah (Setyawan & Sugiyarto,

2001). Ada dua jalur yang sering digunakan untuk mencapai puncak gunung

Lawu. Jalur pertama dapat ditempuh melalui Jalur selatan yaitu melalui Cemoro

Sewu dan yang kedua Jalur Barat melalui Cemoro Kandang. Jalur pendakian

Cemoro Sewu dimulai pada ketinggian 1.800 m dpl. Jalur ini berada di wilayah

Magetan, Jawa Timur. Di jalur pendakian ini terdapat 5 pos pendakian yakni : Pos

I (Wesen-Wesen), Pos II (Watu Gedeg), Pos III (Watu Gede), Pos IV (Watu

Kapur) dan Pos V (Jolo Tundo).

b. Tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu

Hutan alam yang terdapat di jalur pendakian Cemoro Sewu mempunyai

tingkat keragaman jenis tumbuhan lebih sedikit bila dibandingkan dengan hutan

alam dataran rendah tetapi beberapa tumbuhan mempunyai nilai kerapatan yang

tinggi, hal ini disebabkan oleh faktor pengaruh ketinggian tempat hutan Cemoro

Sewu yang tinggi dan kelembaban yang tinggi (Stennis, 1972).

Hasil penelitian Khussurur (2005) menemukan 19 jenis tumbuhan yang

terdapat di kawasan hutan Cemoro Sewu terbagi 2 divisio yaitu divisio

Pteridophyta dan Spermatophyta. Beberapa di antaranya adalah tumbuhan

berdaun lebar. Jenis-jenis tumbuhan tersebut diantaranya adalah, Croton argiratus

BI, Melastoma malabatricum, Eugenia operculata Roxb, Willughbeia firma BI,

Cincona ledgeriana (Howard) Moens, Corchorusa cutangulus Lmh, Eupatorium

inulifolium H.B.K, Euphorbia sp, Xanthophyllum excelsum Miq, Lygodium

circinatum Swartz, Oenanthe javanica, Pandanus furcatus Roxb, Nephelium sp,

Baringtonia macrostachya Kurtz, Vemonia arborea, Drynaria sparsisora Moore

dan Drymaglossum heterophyllum.

Penelitian Setyawan & Sugiyarto (2001), memberikan data bahwa terdapat

142 spesies tumbuhan Spermatophyta di lereng selatan Gunung Lawu, sebagian

merupakan tumbuhan berdaun lebar. Beberapa di antaranya yaitu Amaranthus

gracilis, Acer laurinum, Urena lobata, plantago major, Podocarpus norifoilus D.

Don, Rubus chrysophillus Miq, Schefflera sp dan Rubus fraxinifolius Poir


commit to user

15

B. Kerangka Pemikiran

Bakteri INA adalah bakteri yang terdapat di permukaan daun dan memiliki

kemampuan menginisiasi pembentukan inti es, sehingga dapat menyebabkan luka

beku (frost injury ) pada daun tumbuhan. Dalam perkembangannya, bakteri INA

secara potensial memiliki peranan penting di dunia klimatologi. Bakteri INA

berpartisipasi dalam siklus biopresipitasi. Christner et al., (2008), menyatakan

bahwa bakteri INA yang berada pada daun tanaman yang terbawa oleh siklus

angin dapat menstimulasi terjadinya hujan. Bakteri INA penting sebagai

nucleators troposfer.

Peran penting dan keunikan bakteri INA telah banyak diteliti dan

dipelajari di daerah-daerah subtropis, sedangkan di daerah tropis seperti Indonesia

masih sangat sedikit. Gunung Lawu adalah salah satu gunung yang terdapat di

pulau Jawa, Indonesia yang memiliki temperatur relatif rendah dan merupakan

pegunungan hujan tropis yang memiliki vegetasi hutan yang cukup beragam,

salah satunya adalah tumbuh-tumbuhan yang berdaun lebar. Kondisi ini

memungkinkan ditemukannya bakteri pembentuk inti es. Oleh karena itu perlu

dilakukan penelitian tentang identifikasi bakteri INA dan deteksi gen inaserta

hubungan kekerabatan bakteri INA yang terdapatpada jalur pendakian Cemoro

Sewu gunung Lawu, sehingga dapat digunakan dalam dunia klimatologi dan

biopresipitasi melalui pengelolaan lahan dengan vegetasi yang sesuai di masa

mendatang. Skema kerangka pemikiran dapat dilihat pada Gambar 3 berikut ini :


commit to user

16

Gambar 2. Bagan kerangka pemikiran.

Estimasi bakteri INA

Tumbuhanberdaunlebar

Informasi dan penelitian yang masih sedikit di daerah tropis

Bakteri Ice Nucleation Active (INA)

Mampu menginisiasi pembentukan inti es

Menyebabkan luka beku (frost injury) pada daun tanaman

Berperan dalam proses biopresipitasi

Jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu adalah daerah tropis

Keberadaan, jenis/spesies, estimasi dan hubungan kekerabatan bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar di Cemoro Sewu serta

peran bakteri INA di alam

Isolasi bakteri INA Identifikasi gen

Jenis-jenis bakteri INA

Gen ina bakteri

Deteksi gen


commit to user

17

C. Hipotesis

1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA) dapat ditemukan dan diisolasi dari

tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu.

2. Identifikasi bakteri berdasarkan gen penyandi 16S rRNA yang ditemukan

pada tumbuhan berdaun lebar, memiliki identitas yang berbeda-beda.

3. Bakteri INA yang ada pada tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian

Cemoro Sewu, Gunung Lawu memiliki jumlah yang tinggi yaitu sekitar

106/ g daun.

4. Bakteri INA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar termasuk ke

dalam beberapa gen bakteri yang telah ditemukan.

5. Bakteri INA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar memiliki

hubungan kekerabatan yang dekat.


commit to user

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Juni 2014.

Pengambilan sampel dilakukan di jalur pendakian Cemoro Sewu Lereng Gunung

Lawu, Magetan, Jawa Timur.

Isolasi bakteri dilakukan di Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas

Maret. Uji aktivitas nukleasi es dilakukan di laboratorium Mikrobiologi

Universitas Atmajaya Jakarta. Identifikasi bakteri Ice Nucleation Active (INA),

deteksi dan kloning gen dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat

Tabung reaksi, cawan petri, gelas beker, erlenmeyer, Laminar Air Flow,

autoklaf, neraca analitik, bunsen burner, batang pengaduk, jarum ose, batang L,

hot plate, aluminium foil, mikropipet, tip, freezer, shaker, magnetic stirer, kapas,

kertas label, pulpen, vortex, rak tabung reaksi Polymerase Chain Reaction,

seperangkat alat elektroforesis, Biophotometer, gel doc, tabung Eppendorf dan

digital camera.

2. Bahan

Bahan yang digunakan adalah sampel tumbuhan berdaun lebar yang

berasal dari jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu, Media Nutrient Agar +

2,5% glieserol (NAG), Media King’s B, Aquades, alkohol, pepton, buffer fosfat

pH 7, Plasmid pGEM-T Easy, PrestoTMMini gDNA Bacterial Kit (Geneaid), Kapa

2G Fast Ready Mix (Kapa Biosystem), dNTP, MgCl2, Buffer PCR, 63 forward

Primer, 1387 reverse primer, agarose, buffer TAE 1X.

18


commit to user

19

C. Rancangan Peneltian

Penelitian dilakukan dengan beberapa metode, yaitu :

1. Pengambilan sampel

Pengambilan sampel dilakukan di jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung

Lawu berdasarkan titik sampling yang telah ditentukan, yaitu di stasiun I pada

ketinggian 2.200 m dpl, stasiun II pada ketinggian 2.500 m dpl dan stasiun III

pada ketinggian 2.700 m dpl. Penentuan titik sampling menggunakan metode

purposive sampling. Sampling ditetapkan berdasarkan perbedaan ketinggian dan

keberadaan sampel pada masing-masing pengambilan sampel.

Sampel daun tumbuhan berdaun lebar yang didapat dimasukkan kedalam

kantong yang dibuat dari kertas koran dan secepatnya dibawa ke Laboratorium

untuk diidentifikasi, diisolasi atau disimpan di dalam lemari pendingin sebelum

diisolasi pada hari berikutnya. Identifikasi sampel dilakukan dengan

menggunakan buku acuan Steenis (1978).

2. Sterilisasi alat dan bahan

Alat dan bahan yang digunakan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf

pada suhu 121o C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Peralatan yang disterilisasi

antara lain : tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, erlenmeyer, pipet tetes dan tip.

Bahan-bahan yang disterilisasi yaitu aquades, media NA, King’s B, buffer fosfat

dan pepton.

3. Pembuatan media

a. Media NAG

Media NAG (natrium agar gliserol) dibuat dengan mencampur 28 g bubuk

NA dengan 25 mL gliserol dalam tabung erlenmeyer dan ditambahkan aquades

hingga batas 200 mL. Tabung erlenmeyer diletakkan di atas hot plate dan

ditunggu hingga mendidih sampai larutan berwarna jernih. Lubang tabung

erlenmeyer ditutup kapas dan aluminium foil, disterilkan dengan menggunakan

autoklaf suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Kemudian media dituang ke

cawan petri dan dibiarkan kering pada suhu ruang 28°C.

Untuk membuat agar miring, setelah larutan mendidih dan berwarna jernih

maka media NA langsung dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 4 ml


commit to user

20

dan diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Setelah

disterilkan tabung dimiringkan 45°C hingga media mengeras.

b. Media King’s B

Pembuatan media King’s B dilakukan dengan mencampur 20 g protease

pepton, 10 mL gliserol, 1,5 g K2HPO4, 1,5 g MgSO4.7H2O dan 15 g agar kedalam

erlenmeyer dan ditambah 1 L aquades. Erlenmeyer diletakkan diatas hot plate dan

ditunggu hingga mendidih sampai larutan berwarna jernih. Lubang tabung

erlenmeyer ditutup kapas dan aluminium foil, disterilkan dengan menggunakan

autoklaf suhu 121°C selama 20 menit. Kemudian media dituang ke cawan petri

dan dibiarkan kering pada suhu ruang 28°C.

Untuk membuat agar miring, setelah larutan mendidih dan berwarna jernih

maka media King’s B langsung dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing 4

ml dan diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Setelah

disterilkan tabung dimiringkan 45°C hingga media mengeras.

c. Buffer fosfat 0,1 M pH 7 dan 0,1, pepton

Pembuatan buffer fosfat dilakukan dengan melarutkan NaH2PO4.2H2O

sebanyak 0,6 g dan Na2HPO4.2H2O sebanyak 1,6 g ke dalam 1000 mL akuades.

Kemudian ditambahkan peptone meat sebanyak 1 g dan disterilisasi dengan

menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm.

d. Isolasi Bakteri INA

Masing-masing sampel daun sebanyak 10-20 g dipotong-potong dengan

ukuran 5 cm2 selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer

berukuran 500 mL yang di dalamnya berisi 200 mL 0,1 M buffer fosfat pH 7

dengan 0,1 pepton (Difco) (Lindow, 1978). Tabung erlenmeyer yang berisi

larutan buffer fosfat dan sampel digoyang pada rotary shaker dengan kecepatan

150 rpm selama 2 jam. Sampel diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi berisi 9 mL aquades steril. Selanjutnya dilakukan 3 seri

pengenceran yaitu 10-1, 10-2, dan 10-3. Dari tiap pengenceran diambil sebanyak 0.1

mL kemudian disebar pada media NA yang mengandung 2,5% gliserol (NAG)

dan media King’s B dengan teknik cawan sebar. Masing-masing pengenceran

disebar pada dua cawan petri. Setelah permukaan media cukup kering selanjutnya


commit to user

21

dibungkus dengan kertas dan diinkubasikan pada suhu 18° - 24°C dengan posisi

terbalik selama 2 hari (Lindow et al., 1982).

e. Koleksi kultur murni isolat

Untuk mendapatkan kultur murni, isolat bakteri yang sudah tumbuh di

media NA + 2,5% gliserol dan media King’s B ditumbuhkan kembali dengan

Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke

agar miring dengan terlebih dahulu memilih koloni-koloni yang berbeda pada

media NAG dan King’s B pada cawan petri. Sel-sel bakteri tunggal ini akan

membentuk koloni tunggal yang kemudian ditumbuhkan selama 4-6 hari pada

suhu ruang, selanjutnya disimpan di freezer pada suhu -4oC (Kartika, 2009).

f. Analisis DNA dengan biofotometri

Analisis DNA dilakukan dengan menambahkan 5 µl DNA hasil isolasi

dengan aquadest sehingga volumenya mencapai 1 ml, kemudian DNA

dipindahkan kedalam kuvet biofotometer. Blanko biofotometer dengan kuvet

berisi 1 ml aquadest dibaca absorbansi sampel dengan biofotometer pada λ260

nm, kemudian dilakukan pembacaan yang ke-2 pada λ280 nm. Selanjutnya

ditentukan rasio absorbansi yang ke-2 pada λ260 nm dan λ280 nm. Kualitas DNA

yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat

dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm

terhadap 280 nm. Rasio OD260 / OD280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA

yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein.

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA /

RNA menggunakan biofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk

mengetahui kandungan protein menggunakan biofotometri UV dengan panjang

gelombang 280 nm.

g. Uji aktivitas pembentukan inti es

Aktivitas pembentukan inti es ditentukan dengan metode tube nucleation

test yaitu dengan memasukkan 100 µL suspensi bakteri berumur 4-6 hari kedalam

supercool water (Lindow et al., 1978). Suspensi bakteri dibuat dengan mengambil

1 ose pada agar miring dan mengencerkannya dalam 2 mL aquades steril.

supercool water dibuat dengan memasukkan 3-5 mL aquades masing-masing ke


commit to user

22

dalam tabung reaksi kemudian disimpan di dalam freezer pada suhu -5°C selama

2-3 jam. Untuk mengetahui koloni mengandung inti es, 1 ose koloni bakteri

dicampur ke dalam 40µl buffer fosfat masing-masing ke dalam tabung reaksi,

kemudian dimasukkan ke dalam circulating alcohol bath pada suhu -2°C sampai

10°C selama 5 menit. Suatu koloni dianggap mengandung inti es aktif, jika

supercool water yang ditetesi suspensi bakteri membeku dalam waktu 30 detik

pada suhu -5°C.

h. Estimasi jumlah bakteri

Estimasi jumlah bakteri INA yang terdapat pada masing-masing sampel

penelitian dilakukan dengan metode multiple tube nucleation (Cazorla et al.,

1995). Tabung reaksi yang berisi 9 mL buffer fosfat steril didinginkan pada suhu -

10°C selama 3 menit. Kemudian tabung dikocok dan semua tabung yang

mengalami pembekuan dipisahkan. Tabung berisi buffer fosfat yang tidak

membeku dihangatkan pada suhu 5°C. Masing-masing sampel penelitian

sebanyak 2 g dihomogenkan dalam 20 mL buffer fosfat dan 0,1 % peptone meat,

kemudian sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9

mL buffer fosfat steril. Selanjutnya dilakukan 3 seri pengenceran 10-1, 10-2dan 10-3

ke dalam tabung berisi fosfat yang tidak membeku. Setiap seri pengenceran

dilakukan sebanyak tiga kali ulangan sehingga didapatkan pengenceran seri 3

tabung. Setiap tabung berisi buffer fosfat yang tidak membeku dan masing-masing

sampel yang telah dihomogenkan dimasukkan ke dalam circulating alkohol bath

selama 10 menit sehingga suhunya mencapai -3°C sampai -9°C. Jumlah bakteri

INA per gram berat segar sampel diestimasi berdasarkan metode MPN. Jumlah

tabung reaksi yang membeku dihitung untuk setiap pengenceran, kemudian

dicocokkan dengan angka pada tabel MPN seri 3 tabung sehingga diperoleh nilai

tabel. Nilai yang didapat ini dikalikan dengan faktor pengenceran untuk

mendapatkan jumlah MPN mikroba pada sampel (Fardiaz, 1993).

i. Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan PCR

DNA genom diekstraksikan dengan menggunakan kit Preston Mini 9

DNA Bacterial kit (Geneaid). Gen 16S rRNA diamplifikasi menggunakan

polymerase Chain Reaction (Perkin Elmer geneAmp PCR system 2400). Reaksi


commit to user

23

PCR dilakukan dengan mencampurkan 25 µl Kapa 2G Fast Ready Mix (Kapa

Biosystem), 1 µl 63 forward primer (New England BioLabs) (25pmol) (63f:5’-

CAGGCCTAACACAT-GCAAGTC-3’). 1 µl 1387 reverse primer (New England

BioLabs) (25pmol) (1387r : 5’-GGGCGGAWGTGTACAAGGCA-3’), 1 µl

DNAtemplate dan 9,5 µl ddH2O. Siklus yang digunakan terdiri dari predenaturasi

pada suhu 94°C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 94°C 30 detik, annealing

pada 55˚C selama 30 detik, elongasi 72°C selama 1 menit dan finalizing pada

suhu 72°C selama 5 menit dan dihentikan, kemudian disimpan pada suhu 4°C

hingga digunakan dan diperiksa dengan elektroforesis. Proses denaturasi,

annealing dan elongasi masing-masing terdiri dari 25 siklus (Marchesi et al.,

1988).

j. Analisis hubungan kekerabatan

Hubungan kekerabatan antar spesies yang ditemukan dan spesies lain yang

sudah ditemukan pada penelitian-penelitian sebelumnya dianalisis dengan

menggunakan software Mega 5.1 pada perangkat komputer.

k. Deteksi gen ina menggunakan PCR

Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen ina adalah:

Pseudomonas syringae menggunakan primer inaZ forward (5’ GCA GAC TGC

GGG TTA TGA GAG C 3’); primer inaZ reverese (5’CGC CGG TCA GTT TGC

TTC TAT C 3’); Erwinia ananas menggunakan primer inaA forward (5’ AGG

CTT TGA GAA CGG ACT AAC G 3’); primer inaA reverse (5’TTT CTG TCG

GCT GCG TAC TG 3’); Pseudomonas fluorescent menggunakan primer inaW

forward (5’ GCA GTA CGC AGA CGG CAC AG 3’) primer inaW reverse

(5’TTT CGT AGC CAG CAG TTG ATG TG 3’); Xanthomonas campestris

menggunakan primer inaX forward (5’GCA AGG GCA GCG ATG TCA C 3’);

primer inaX reverse (5’ TCT GCG TGC TGC CGT AAC C 3’) (Nejad et al.,

2006). Primer didapatkan dari integated DNA Technologies, Singapura.

Proses running PCR dilakukan dengan mencampurkan 12,5 µl Kapa 2G

Fast Ready Mix (Kapa Biosystem), 2 µl DNA template, 1,25 primer (inaA, , inaX,

inaW, inaZ forward dan inaA, inaX, inaW, inaZ reverse ) dan 8 µl ddH2O.

Amplifikasi gen dilakukan dengan tahapan :


commit to user

24

1) Predenaturasi pada suhu 94˚C selama 5 menit.

2) Denaturasi pada suhu 94°C selama 45 detik.

3) Annealing pada suhu 55°C - 65°C selama 1 menit. Suhu annealing dipilih

yang sesuai sehingga didapatkan kondisi optimasi yang terbaik.

4) Elongasi pada suhu 72°C selama 1 menit.

5) Finalizing pada suhu 72°C selama 5 menit.

Proses denaturasi, annealing, dan elongasi terjadi sebanyak 35 siklus.

Selanjutnya produk PCR disimpan pada suhu -20°C dan diperiksa dengan

elektroforesis (Nejad et al., 2006).

l. Analisis sekuens DNA

DNAdisekuensing menggunakan ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Kit.

Sekuen DNA dianalisis secara bioinformatika di pusat data GeneBank yang

dilakukan dengan progam Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yang

terdapat di National Center for Biotechnology Information (NCBI),

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (Waturangi et al., 2008).

D. Analisis Data

Data isolat dan data uji aktivitas pembentukan es diamati secara deskriptif,

Amplikon hasil amplifikasi gen 16S rRNA diperiksa dan dianalisis dengan

melihat adanya band-band pada gel elektroforesis. Sekuens gen 16S rRNA

dianalisis dengan bioinformatika untuk mendapatkandata identifikasi spesies

bakteri INA.

Sekuen DNA gen ina dan gen 16S rRNA yang diperoleh dianalisis

menggunakan perangkat BLAST pada NCBI. Hubungan kekerabatan dianalisis

dengan menggunakan software MEGA (Molecular Evolutionary Genetics

Analysis) 5.1. untuk mendapatkan struktur pohon phylogenetic yang

menggambarkan hubungan kekerabatan bakteri INA kemudian di analisis secara

deskriptif.


commit to user

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Tumbuhan Berdaun Lebar Di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,

Gunung Lawu

Tumbuhan berdaun lebar yang digunakan dalam penelitian ini adalah

sebagian dari beberapa jenis tumbuhan berdaun lebar yang ditemukan di jalur

pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu. Tumbuhan berdaun lebar yang

digunakan diperoleh berdasarkan hasil pengamatan dan keberadaan tumbuhan

pada tiga stasiun penelitian sehingga ditemukan enam spesies. Keenam spesies

yang dijadikan sampel penelitian disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian cemoro sewu, Gunung Lawu.Keterangan :

(A) Dodonae viscosa Jacq(B) Rubus fraxinifolius(C) Vaccinium larifolium(D) Chromolaena odorata(E) Conodopsis javanica (B) Hook F(F) Polygonum chinense

25

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)


commit to user

26

Keenam spesies tumbuhan berdaun lebar yang dijadikan sumber utama

untuk isolasi bakteri Ice Nucleation Active (INA) diambil dengan jarak yang tidak

berjauhan.

B. Isolat bakteri Ice Nucleation active dari tumbuhan berdaun lebar di Jalur

Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu

Isolasi bakteri INA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan

media selektif untuk isolasi bakteri yaitu Nutrient Agar (NA) dan KING’S B yang

masing-masing ditambahkan dengan 2,5% dan 1,5% gliserol. Penambahan

gliserol digunakan sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri terutama

bakteri Ice Nucleation Active (Lindow, 1990). Menurut Waturangi & Tjhen

(2009) Media NA dan King’s B yang mengandung gliserol merupakan media

selektif yang diharapkan memiliki kandungan nutrisi yang hampir sama dengan

nutrisi pada dan tanaman yang menjadi habitat bakteri.

Bakteri yang ditumbuhkan pada media NAG dan King’s B menunjukkan

adanya koloni-koloni bakteri yang berbeda-beda dari penampakan morfologi dan

pigmentasi yang kemudian dimurnikan. Dari masing-masing sampel penelitian

yang diperoleh dari ketiga stasiun penelitian ditemukan beberapa isolat bakteri.

Masing-masing isolat yang didapat dari keenam sampel penelitian, setelah

dilakukan uji aktivitas nukleasi es dengan menggunakan circulating alkohol bath

diperoleh 3 isolat positif bakteri INA di antaranya terlihat pada Tabel 1 dan tube

yang menunjukkan hasil positif INA disajikan pada Gambar 4. Data isolat yang

didapat dari keenam tumbuhan berdaun lebar secara lengkap disajikan pada

Lampiran 1.


commit to user

27

Tabel 1. Jumlah isolat bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dari tumbuhan berdaun lebar di Jalur pendakian Cemoro Sewu

Sampel Penelitian Jumlah Isolat /stasiun

Jumlah isolat positif

INA/Stasiun

Kode Isolat

I II III I II IIIDodonae viscose Jacq,

5 8 7 - 1 - A2N4Rubus fraxinifolius

6 6 5 - - - -Vaccinium laurifolium

6 6 8 - 1 - C2N9Chromolaena odorata L

8 5 4 - - -Conodopsis javanica (B) Hook F 6 6 8 - - - -

Polygonum chinense L7 7 9 1 - - F1N6

Keterangan : A2N4,A: Nama Spesies Penelitian (A: Dodonae viscose Jacq; B: Rubus

fraxinifolius; C: Vaccinium laurifolium; D: Chromolaenaodorata; E: Conodopsis javanica (B) Hook F dan F; Polygonumchinense L).

2: Stasiun PenelitianN: Media Pertumbuhan (K: King’s B dan N: NAG)4: Nomor Isolat

Gambar 4. Media beku akibat Aktivitas nukleasi es hasil isolasi dari tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu

Keterangan : a : Tube isolat A2N4; b : Tube isolat C2N9; c : Tube isolat F1N6K : Kontrol

a b c K


commit to user

28

Berdasarkan hasil uji aktivitas nukleasi es 2 isolat diklasifikasikan ke

dalam kelas C yaitu isolat A2N4 dan isolat F1N6 yaitu dengan suhu pembentukan

inti es -10°C, sedangkan isolat C2N9 diklasifikasikan ke dalam kelas B yaitu pada

suhu -7°C. Pengklasifikasian isolat positif INA ke dalam kelas A, B dan C

dilakukan berdasarkan suhu pembentukan inti es. Menurut Rugless et al., (1993),

kelas A aktif membentuk inti es pada suhu >-2°C hingga -5°C, kelas B >-5 hingga

-7 dan kelas C aktif membentuk inti es pada suhu >-7 hingga -10°C.

Hasil uji aktivitas nukleasi es juga menunjukkan bahwa tiga dari enam

sampel tumbuhan berdaun lebar tidak didapatkan isolat positif bakteri INA. Hal

ini dimungkinkan karena tidak adanya bakteri INA di permukaan daun atau

populasi rata-rata bakteri INA yang sangat rendah. Rata-rata populasi bakteri INA

dapat dilihat berdasarkan estimasi tabel MPN (Tabel 2).

C. Populasi bakteri Ice Nukleation Active

Estimasi populasi bakteri INA dilakukan dengan metode Most Probable

Number yaitu suatu metode untuk mengestimasi jumlah inti es dari suspensi

bakteri maupun populasi bakteri INA pada bagian tanaman (Cazorla et al., 1995).

Metode Most Probable Number (MPN) mengasumsikan bahwa dalam satu tabung

yang beku mengandung paling sedikit satu inti es (Govindarajan & Lindow,

1988). Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di

dalam sampel yang berbentuk cair atau berbentuk padat dengan terlebih dahulu

membuat suspensi 1:10 dari sampel penelitian (Fardiaz, 1993).

Menurut Anon (1975), the tube nucleation test digunakan untuk

menghitung jumlah bakteri INA yang berasosiasi dengan tanaman yang

didasarkan dan dikembangkan dari metode MPN yaitu suatu metode yang

digunakan untuk menentukan jumlah koliform pada air. Pengggunaan uji tabung

untuk menentukan jumlah inti es didasarkan pada jumlah tabung yang membeku

pada setiap pengenceran (Montesinos & Viraldell, 1991). Hasil uji metode MPN

adalah nilai MPN yaitu perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit

pembentuk koloni dalam sampel. Nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan

jumlah individu bakteri. Estimasi populasi bakteri dilakukan dengan metode


commit to user

29

multiple tube nucleation test pada suhu -5°C selama 10 menit dalam circulating

alkohol bath, sesuai dengan pendapat Hirano et al., (1985) dan Baertlein et al.,

(1992). Demikian juga dengan penelitian Cazorla et al., (1995) yang

menggunakan suhu -5°C sebagai suhu optimum untuk melakukan uji estimasi.

Hasil uji estimasi dapat dilihat pada Gambar 5 dan estimasi jumlah bakteri

pada Tabel 2.

Gambar 5. Media beku pada uji estimasi bakteri INA.

Keterangan : a) Kombinasi tabung 0-1-0; b) Kombinasi tabung 1-1-0;

c) Kombinasi tabung 0-0-1; d) Kombinasi tabung 1-0-0

10-1 10-2 10-3

+

a) b)

+ +

10-1 10-2 10-3

d)c)

10-1 10-2 10-3

+

10-1 10-2 10-3

+


commit to user

30

Tabel 2. Estimasi Jumlah Bakteri Berdasarkan Tabel MPN

Sampel Penelitian

Ulangan 1 Estimasi Bakteri

Jumlah/g daun10-1 10-2 10-3

Dodonae viscose Jacq, 0 1 0 3 x 103

Rubus fraxinifolius 0 0 0 <3 x 10

Vaccinium laurifolium 1 0 0 3,6 x 103

Chromolaena odonata L 1 0 0 3 x 103

Conodopsis javanica (B) Hook F 0 0 1 3 x 103

Polygonum chinense L 1 1 0 5,4 x 103

Berdasarkan hasil perhitungan, nilai MPN bakteri INA tertinggi yang ada

pada tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu

khususnya pada keenam sampel penelitian yakni sebesar 5,4 x 103/g, sedangkan

nilai rata-rata MPN terendah yaitu < 3 x 103/g. Nilai ini menunjukkan jumlah

bakteri yang rendah apabila dibandingkan dengan beberapa penelitian

sebelumnya. Beberapa penelitian telah dilakukan di antaranya oleh Lindow (1993)

yang menyatakan bahwa populasi bakteri INA mencapai 106 sel/g jaringan

tanaman. Rendahnya jumlah bakteri INA yang ada pada keenam sampel penelitian

dimungkinkan akibat faktor perbedaan lingkungan. Penentuan rata-rata estimasi

populasi bakteri didapatkan berdasarkan tabel MPN (Lampiran 2).

D. Analisis Kemurnian DNA Bakteri

Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan kemurnian DNA sehingga

memenuhi syarat untuk analisis molekuler. Konsentrasi dan Kemurnian DNA

setelah dianalisis dengan biofotometer didapatkan hasil seperti pada Tabel 3.

Tabel 3. Konsentrasi dan kemurnian DNA bakteri

Isolat Bakteri Konsentrasi DNA (µg/ml)Kemurnian (Ratio

A260/A280)A2N4 24,9 2,00C2N9 45,0 2,00F1N6 41,9 1,90


commit to user

31

Hasil isolasi DNA (Tabel 3) menunjukkan bahwa DNA ketiga bakteri INA

berhasil diisolasi dengan baik. Hal ini dikarenakan nilai rasio A260/280 DNA hasil

isolasi berkisar antara 1,90-2,00. Menurut Sambrook et al., (1989), isolat DNA

dapat dikatakan murni dan memenuhi syarat untuk dilanjutkan ke analisis

molekuler apabila nilai rasio A260/280 berkisar 1,8-2,0.

E. Gen Penyandi 16S rRNA dari Isolat Bakteri INA di Jalur Pendakian

Cemoro Sewu, Gunung Lawu

Masing-masing DNA bakteri INA yang didapat selanjutnya diamplifikasi

menggunakan PCR untuk memperoleh gen 16S rRNA. 16S rRNA merupakan satu

dari tiga jenis RNA ribosomal yang digunakan sebagai penanda molekuler pada

prokaryota. 16S rRNA paling sering digunakan untuk penentuan spesies pada

prokaryota. Analisis sekuen 16S rRNA merupakan metode yang biasa digunakan

untuk mengidentifikasi bakteri dalam bidang molekuler (Case et al., 2006; Amann

et al., 1995).

Menurut Pangastuti (2006), 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda

molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitas, sedangkan menurut Madigan et

al., (1997), dasar penggunaan gen 16S rRNA dengan berbagai alasan mendasar

yaitu ; (1) bersifat universal : protein synthesis machninery (2) sekuen basa-

basanya bersifat konservatif; (3) jumlahnya melimpah dalam sel; (4) memenuhi

ukuran untuk perhitungan secara statistik (tidak terlalu panjang dan tidak terlalu

pendek); (5) ketersediaan informasi (database di GeneBank). Salah satu faktor

penting yang mempengaruhi kualitas deteksi molekuler berbasis PCR yakni

pemilihan primer yang sesuai (Rychlic, 1995). Menurut Marchesi et al., (1998)

primer 63f dan 1387r digunakan karena dapat mengamplifikasi gen 16S rRNA

dengan baik dibandingkan dengan jenis primer lainnya dan konsisten

mengamplifikasi gen 16S rRNA dari berbagai organisme.

Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan PCR dianalisis dengan

elektroforesis gel agarosa 1 % (b/v) selama 60 menit pada tegangan 90 volt dan

arus 400 mA. Profil amplikon dari amplifikasi gen 16S rRNA dengan PCR dapat

dilihat pada Gambar 6.


commit to user

32

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp

Gambar 6. Profil amplikon dari gen penyandi 16S rRNA dengan menggunakan primer 63f dan 1387r Keterangan: a) isolat A2N4; b) isolat C2N9; c) isolat F1N6,M: Marker DNA.

Profil amplikon (Gambar 6) menunjukkan bahwa DNA bakteri yang

diamplifikasi berhasil teramplifikasi dengan baik. Hal ini ditunjukkan dengan

adanya pita (band) yang terang dan tebal. Hal ini mengindikasikan bahwa primer

yang digunakan menempel pada situs spesifik pada template DNA dengan suhu

optimum yang digunakan untuk annealing primer. Suhu optimum primer untuk

dapat melakukan annealing pada template DNA dapat diketahui dengan melihat

informasi yang terdapat pada kemasan primer. Pada amplifikasi gen penyandi 16S

rRNA pada penelitian ini menggunakan suhu annealing 55°C.

Berdasarkan profil amplikon (Gambar 5) juga diketahui bahwa pada

penelitian ini semua produk PCR yang didapat berukuran sekitar 1.300 bp dengan

konsentrasi sekitar 92 ng/5 . Hal ini dapat diketahui dengan membandingkan

pita DNA dengan DNA marker yang digunakan. Produk PCR dapat diketahui

ukurannya dengan membandingkan panjang migrasi pita DNA dengan DNA

marker yang telah diketahui ukuran dan konsentrasinya. Menurut Marchesi et al.,

(1998) hasil amplifikasi gen 16S rRNA dengan primer 63f dan 1387r adalah

a) b) c) M


commit to user

33

sekitar 1.300 bp. Oleh karena itu pada penelitian ini menggnakan DNA marker

yang berukuran 1 Kb.

F. Sekuens gen penyandi 16S rRNA

Sekuensing (DNA Sequencing) merupakan metode yang digunakan untuk

menentukan urutan nukleotida arginin(A), sitosin(C), guanin(G), timin(T) pada

molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuen DNA, yang merupakan

informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi

yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA

dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen

DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA

lain yang sudah diketahui (Madigan et al., 1997).

Urutan basa nukleotida gen penyandi 16S rRNA dan gen ina (hasil

sekuensing pada Lampiran 3) dianalisis dan dibandingkan dengan database pada

GeneBenk menggunakan program BLAST untuk mengetahui identitas dengan

spesies yang telah diketahui sebelumnya. Menurut Stephen et al., (1990) BLAST

merupakan software algoritma untuk membandingkan informasi primer sekuens

biologis, seperti sekuens asam amino dari protein yang berbeda atau sekuens

DNA dilihat dari basa nukleotida. Hasil analisis dengan BLAST dapat dilihat pada

Tabel 4 (hasil BLAST lebih lengkap dapat dilihat pada Lampiran 4).

Tabel 4.Spesies-spesies yang mirip dengan isolat yang ditemukan berdasarkan gen penyandi 16S rRNA bakteri INA

Isolat sampel Kerabat terdekat No. Akses % Similaritas

A2N4 Pseudomonas syringae KC311253 96 %

C2N9 Pantoea sp FJ357836 97 %

F1N6 Pseudomonas sp FJ652623.1 98%

Berdasarkan analisis sekuens dari database yang ada pada GeneBenk, dua

dari tiga isolat memiliki similaritas dengan bakteri INA yang berasal dari

beberapa negara subtropis. Isolat A2N4 memiliki similaritas 96% dengan

Pseudomonas syringae, isolat C2N9 memiliki similaritas 97% dengan Pantoea sp.


commit to user

34

Sedangkan isolat FIN6 teridentifikasi memiliki similaritas 98% dengan

Pseudomonas sp.

Pseudomonas syringae dan Pseudomonas sp yang teridentifikasi dari

isolat A2N4 dan F1N6 merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas dan

merupakan genus bakteri INA yang paling terkenal. Di daerah tropis jenis lain

dari genus Pseudomonas yakni Pseudomonas mosselii, dan Pseudomonas lurida

juga terdeteksi sebagai bakteri INA yang diisolasi dari air hujan (Waturangi et al.,

2011).

Dari Tabel 4 juga diketahui bahwa isolat C2N9 teridentifikasi memiliki

similaritas 97% dengan Pantoea sp. Pantoea sp merupakan bakteri Gram-negatif

dari keluarga Enterobacteriaceae. Bakteri ini adalah bakteri anaerob fakultatif

yang kebanyakan berbentuk batang dengan katalase-positif dan oksidase-negatif.

Bakteri ini ditemukan di tanah, air dan permukaan daun tumbuhan serta beberapa

juga terdapat pada hewan mulai dari serangga hingga manusia (Paradis et al.,

2005).

Pantoea sp juga diklasifikasikan sebagai bakteri INA yang teridentifikasi

sebagai bakteri inaA (Watanabe & Sato, 1998). Bakteri ini pertama kali

dilaporkan sebagai patogen dari tanaman nanas sehingga menyebabkan

pencoklatan dan busuk pada akar. Jenis Pantoea agglomerans dilaporkan

terdeteksi sebagai bakteri INA di daerah tropis (Waturangi et al., 2011).

Hasil analisis BLAST yang terlihat dari Tabel 4, menunjukkan beberapa

spesies dan genus bakteri berhasil teridentifikasi berdasarkan gen penyandi 16S

rRNA. Namun, definisi spesies berdasarkan urutan basa gen 16S rRNA tidak

cukup untuk menggambarkan satu spesies yang identik. Urutan basa 16S rRNA

yang menunjukkan similaritas yang rendah belum dapat ditentukan deskripsi

taksonnya secara lengkap. Biasanya deskripsi takson secara lebih lengkap bisa

dianggap paling mendekati keidentikannya, jika similaritas lebih dari 97%

(Stackebrandt & Goebel, 1995).

G. Hubungan kekerabatan

Hubungan kekerabatan bakteri INA antar isolat pada penelitian ini dan

beberapa bakteri INA yang pernah ditemukan sebelumnya dapat diketahui dengan


commit to user

35

Pseudomonas syringae

ISOLAT A2N4

Pseudomonas sp

Pseudomonas mosselii

ISOLAT F1N6

Xanthomonas sp

Pantoea agglomerans

ISOLAT C2N9

Pantoea ananatis

Bacillus cereus

92

100

71

99

98

54

100

0.02

menggunakan pohon filogenetik dengan melihat jarak genetik. Pohon filogenetik

dibuat dengan menggunakan program MEGA. Pohon filogenetik berdasarkan gen

16S rRNA dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7. Pohon filogenetik bakteri INA pada tumbuhan berdaun lebar di jalur pendakian Cemoro Sewu Gunung Lawu dan beberapa bakteri INA yang ditemukan sebelumnya.

Keterangan: A2N4, C2N9 dan F1N6 : Isolat bakteri INA dari Jalur pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu; Pseudomonas syringae, Pseudomonas sp & Xanthomonas sp : Isolat bakteri INA subtropis; Pseudomonas mosselii, Pantoea agglomersans, dan Pantoea ananatis: Isolat bakteri INA Tropis yang ditemukan sebelumnya. Out Group : Bacillus cereus : bakteri gram positif (Accession Number : AJ277908.1)

Berdasarkan pohon filogenik pada Gambar 7, bakteri INA isolat A2N4

berada satu group dengan Pseudomonas syringae dan Pseudomonas sp,

sedangkan isolat F1N6 berada satu group dengan Pseudomonas mosselii yang

diketahui mampu membentuk inti es. Pseudomonas syringae dan Pseudomonas sp

adalah jenis bakteri ini yang pernah terdeteksi di daerah subtropis, sedangkan

Pseudomonas mosselii yang berada dalam satu group dengan bakteri INA isolat

F1N6 dilaporkan terdeteksi pada air hujan di daerah tropis. Isolat C2N9 memiliki

hubungan kekerabatan yang dekat dengan Pantoea agglomerans dan Pantoea

anantias. Dari Gambar 7 dapat disimpulkan bahwa ketiga isolat yang ditemukan



commit to user

36

memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan beberapa bakteri INA yang

ditemukan sebelumnya, baik dari daerah tropis maupun subtropis.

Analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon filogenik yang terlihat

pada Gambar 7, menunjukkan bahwa semua isolat bakteri INA yang ditemukan


dan bakteri INA yang ditemukan sebelumnya, di daerah subtropis dan daerah

tropis tidak berada satu group dengan bakteri gram positif sebagai out group

yakni Bacillus cereus. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat bakteri INA yang

ditemukan tergolong pada bakteri dari kelompok gram negatif.

H. Amplikon gen ina

Amplifikasi Gen ina dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen ina.

Untuk mendeteksi keberadaan gen ina dibutuhkan primer yang spesifik sehingga

masing-masing gen dapat terdeteksi keberadaannya karena gen ina yang dimiliki

bakteri INA yang telah berhasil diidentifikasi berbeda-beda sesuai dengan

jenisnya. Beberapa gen yang telah diketahuidan diidentifikasi antara lain inaA

pada Erwinia ananas (Abe et al., 1989), inaW pada Pseudomonas fluorescens

(Warren et al., 1986), inaZ pada Psedomonas syringae (Green & Warren, 1985)

dan inaX pada Xanthomonas campestris (Zhao & Orser, 1990).

Pada penelitian ini digunakan empat pasang primer yakni inaZ, inaA, inaW

dan inaX (Nejad et al., 2006). Hasil amplifikasi gen ina menunjukkan bahwa

ketiga isolat bakteri INA dapat teramplifikasi menggunakan tiga dari empat

pasang primer spesifik gen ina. Keempat primer spesifik mengandung gen ina

diujikan pada penelitian ini. Hasil uji menggunakan empat primer spesifik gen ina

dapt dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Amplifikasi menggunakan empat primer spesifik gen ina

Primer Isolat Produk PCR (bp)A2N4 C2N9 F1N6

inaA - √ - 300inaW - - - -inaX - - √ 400inaZ √ - - 657

Keterangan : - (tidak terdeteksi gen ina); √ (terdeteksi gen ina)


commit to user

37

250 bp500 bp

1000 bp

Berdasarkan Tabel 5, isolat A2N4, C2N9 dan F1N6 teramplifikasi sebagai

bakteri INA, masing-masing dengan menggunakan primer inaA, inaX dan inaZ

dengan variasi produk PCR. Panjang produk PCR dapat diketahui dengan

membandingkan pita pada profil amplikon dengan DNA marker yang digunakan.

Profil amplikon amplifikasi gen ina menggunakan primer spesifik pada masing-

masing isolat dapat dilihat pada Gambar 8 (isolat A2N4), Gambar 10 (isolat

C2N9) dan Gambar 11 (isolat F1N6).

Gambar 8. Profil amplikon gen ina ketiga isolat menggunakan Primer inaZ.Keterangan : M: Marker DNA, a)A2N4; b)C2N9; c)F1N6

Berdasarkan profil amplikon pada Gambar 8, terlihat bahwa DNA pada

isolatbakteri INA dengan kode A2N4 berhasil teramplifikasi dengan baik. Hal ini

terlihat pada pita (band) yang terlihat jelas dan terang. Menurut Zein &

Prawiradilaga (2013), terbentuknya pita (band) DNA pada amplikon

menunjukkan bahwa primer yang digunakan sesuai dalam mengamplifikasi gen

yang diinginkan. Untuk mendapatkan hasil amplifikasi yang baik, selain harus

menemukan primer yang spesifik juga diperlukan optimasi kondisi PCR yang

sesuai. Optimasi PCR yang dilakukan mengacu pada saran yang diberikan oleh

Kapabiosystem selaku produsen penyedia master mix untuk amplifikasi dengan

menggunakan PCR.

a) b) c)

M


commit to user

38

250 bp

500 bp

1000 bp

Optimasi kondisi PCR yang dilakukan sehingga gen ina dapat

teramplifikasi dengan primer inaZ ini yaitu pre-denaturation pada suhu 95°C

selama 3 menit, denaturation pada 95°C selama 30 detik, annealing pada 56°C

selama 15 detik, extention pada 72°C selama 1 menit dan post-extention pada

72°C selama 10 menit dengan Siklus PCR berlangsung selama 35 siklus. Kondisi

ini berbeda dengan kondisi PCR sebelumnya dengan primer inaZ, inaA, inaW dan

inaX, peneliti menggunakan PCR dengan pengaturan program antara lain pre-

denaturation pada 94°C selama 5 menit, pos-extention pada 72°C selama 5 menit,

denatration pada 94°C selama 45 detik, annealing pada 60°C selama 45 detik dan

extention pada 72°C selama 1 menit. Siklus PCR berlangsung sebanyak 35 siklus.

(Nejad et al., 2006). Adapun hasil perbandingan penggunaan suhu pada

optimalisasi PCR untuk menentukan suhu annealing terbaik dalam

mengamplifikasi gen ina menggunakan primer inaZ dapat dilihat pada Gambar 9.

Gambar 9. Profil amplikon gen ina pada isolat A2N4 menggunakan primer inaZ dengan variasi suhu annealing.

Keterangan: M:Marker DNA ; a)55°C; b)56°; c)57°C; d)58°C

a) b) c) d)

M


commit to user

39

250 bp

500 bp

1000 bp

250 bp

500 bp

1000 bp

Berdasarkan profil amplikon (Gambar 9), diketahui bahwa suhu annealing

terbaik pada amplifikasi gen inaZ adalah suhu annealing 55°C dan 56°C. Kondisi

PCR ini sangat berbeda dengan yang pernah digunakan pada penelitian Nejad et

al., (2006).

Gambar 10. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan Primer inaA.Keterangan : M: Marker DNA, a)A2N4; b)C2N9; c)F1N6.

Berdasarkan Gambar 10, diketahui gen pada isolat C2N9 berhasil

teramplifikasi dengan baik, sedangkan isolat A2N4 dan F1N6 tidak dihasilkan

produk amplifikasi sesuai dengan yang diinginkan. Demikian juga yang terlihat

pada Gambar 11, gen pada isolat A2N4 dan C2N9 tidak teramplifikasi, sedangkan

isolat F1N6 teramplifikasi dengan baik. Dari gambar juga terlihat perbedaan

produk PCR yang dihasilkan. Produk PCR isolat C2N9 (gambar 10) dan isolat

F1N6 (Gambar 11) berkisar antara 250 hingga 500 bp. Panjang produk PCR pada

gen isolat C2N9 dan F1N6 memiliki panjang produk PCR yang terdapat pada

database untuk bakteri INA Pantoea sp yakni berkisar antara 250 hingga 350 bp

dan Pseudomonas sp yang berkisar antara 400 hingga 750 bp.

a) b) c)

M


commit to user

40

250 bp

500 bp

1000 bp

Gambar 11. Profil amplikon gen ina pada ketiga isolat menggunakan Primer inaX.Keterangan : M: Marker DNA, a)A2N4; b)C2N9; c)F1N6

Hasil perbandingan penggunaan suhu pada optimalisasi PCR untuk

menentukan suhu annealing terbaik dalam mengamplifikasi gen ina menggunakan

primer inaA dan inaX dapat dilihat pada Gambar 12 dan 13.

Gambar 12. Profil amplikon gen ina isolat C2N9 menggunakan primer inaA untuk optimasi PCRdengan variasi suhu annealing.

Ket. M: Marker; a) 55°C; b) 56°C; c) 57°C; d) 58°C

M

a) b) c) d)

M

a) b) c) d)

Gambar 13. Profil amplikon gen inaisolat F1N6 menggunakan primer inaX untuk optimasi PCR dengan variasi suhu annealing.

Ket. M: Marker; a) 55°C; b) 56°C; c) 57°C; d) 58°C


commit to user

41

Optimasi PCR dengan variasi suhu annealing yang terlihat pada profil

amplikon pada Gambar 12 dan 13 menunjukkan bahwa suhu annealing terbaik

pada isolat C2N4 menggunakan primer inaA adalah aneealing dengan suhu 55°C

hingga 56°C, sedangkan pada isolat F1N6 pada suhu annealing 57°C.

I. Sekuens gen ina

Sekuen gen ina yang diperoleh dari isolat A2N4, selanjutnya dianalisis

dengan melakukan BLAST sehingga diperoleh similaritas sekuen DNA dengan

yang ada di database (Tabel 6).

Tabel 6. Gen ina yang memiliki similaritas dengan sekuens DNA menggunakan primer spesifik inaZ

Isolat sampel Teridentifikasi No. Akses % Similaritas

A2N4 Pseudomonas syringae

ice4 gen for ice nucleation

protein

FN650702.1 99 %

C2N9 - - -

F1N6 - - -

Hasil BLAST seperti yang ada pada Tabel 6 (hasil sekuensing lebih

lengkap dapat dilihat pada Lampiran 5 dan hasil BLAST pada Lampiran 6),

Sekuens DNA menggunakan primer inaZ yang didapat dari isolat A2N4 memiliki

similaritas sebesar 99% dengan gen pengkode ice nucleation protein yang ada

pada Pseudomonas syringae. Hal ini dapat diketahui berdasarkan database di

GeneBenk (No. Akses FN650702.1) pada urutan basa 3030 hingga 3686 dan

terletak di bagian tengah dari ice nucleation protein Pseudomonas syringae strain

INA4. Hasil BLAST untuk asam amino juga menunjukkan bahwa asam amino

isolat A2N4 memiliki similaritas 99 % dengan ice nucleation protein pada

Pseudomonas syringae (accession number WP_024664696.1) (hasil Blast lengkap

dapat dilihat pada Lampiran7).

Pseudomonas syringae merupakan isolat bakteri yang telah didapatkan

dari udara saat hujan di hutan pinus Manitou Forest, Colorado, Usa. Gen


commit to user

42

pengkode ice nucleation protein pada isolat A2N4 mengarah pada jenis gen inaZ.

Gen dari bakteri ini dapat membekukan air pada suhu sekitar -4oC (Hill et al.,

2013). Namun pada penelitian ini berdasarkan uji aktivitas nukleasi es, gen isolat

A2N4 yang terdapat pada media membeku dengan suhu -10oC.

Beberapa spesies bakteri dari genus ini yang telah dilaporkan dapat

membentk inti es antara lain Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens

(Maki et al.,1974) dan Pseudomonas viridiflava (Obata et al., 1989). Beberapa

spesies dari genus ini merupakan bakteri patogen terhadap tanaman dan biasa

ditemukan di permukaan daun. Bakteri ini memiliki habitat yang beragam di

antaranya di permukaan daun, tanah, air dan udara. Bakteri ini diduga dapat

berada pada udara sekitar tanaman dan berkontribusi sebagai sumber pembentuk

inti es (Waturangi & Tjhen, 2009).

Hasil BLAST (Tabel 6), juga menunjukkan bahwa potongan DNA yang

teramplifikasi pada isolat C2N9 dan F1N6 tidak memiliki similaritas dengan DNA

yang ada pada bakteri INA yang ditemukan sebelumnya. Hal ini dimungkinkan

karena primer yang digunakan tidak sesuai dengan yang diinginkan. PCR akan

menghasil produk yang baik apabila memiliki primer yang baik (Diaffenbach &

Dveksler, 1995).


commit to user

43

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari penelitian yang telah dilakukan dapat diperoleh kesimpulan sebagai

berikut:

1. Bakteri Ice Nucleation Active (INA) dapat diisolasi dari tumbuhan

berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu yakni

sebanyak 3 isolat. Ketiga isolat yang berhasil diisolasi diperoleh dari

tumbuhan berdaun lebar jenis Dodonae viscosa Jacq, Vaccinium

laurifolium dan Polygonum chinense L.

2. Jumlah bakteri INA yang ada pada tumbuhan berdaun lebar yang

ditemukan di Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu yakni < 3

x 103/g hingga 5,4 x 103/g, menunjukkan jumlah bakteri yang rendah.

3. Spesies bakteri INA yang ditemukan pada tumbuhan berdaun lebar di

Jalur Pendakian Cemoro Sewu, Gunung Lawu berdasarkan gen 16S

rRNA masing-masing yakni isolat A2N4 96% similarity dengan

Pseudomonas syringae, C2N9 97% similarity dengan Pantoea sp.

F1N6 98% similarity Pseudomonassp.

4. Bakteri INA yang ditemukan di Jalur Pendakian Cemoro Sewu,

Gunung Lawu dan bakteri INA yang ditemukan sebelumnya memiliki

hubungan kekerabatan yang dekat.

5. Karakter gen penyandi protein pembentuk inti es bakteri INA pada

tumbuhan berdaun lebar di Jalur Pendakian Cemoro Sewu Gunung

Lawu yang berhasil diamplifikasi menggunakan primer inaZ dari

isolat A2N4 memiliki similaritas sebesar 99% dengan gen inaZ dari

Pseudomonas syringae dan berada di bagian tengah dari ice

nucleation protein Pseudomonas syringae strain ina4.


commit to user

44

B. Saran

Berdasarkan kesimpulan diberikan beberapa saran yakni (1) Perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut pada tumbuhan lain dan pada daerah yang

berbeda untuk mendapatkan bakteri INA yang lebih bervariasi serta jumlah

bakteri yang lebih tinggi (2) diperlukan penelitian dengan menggunakan primer

yang berbeda untuk mengamplifikasi gen ina agar didapatkan produk amplifikasi

yang lebih baik.


commit to user

45

DAFTAR PUSTAKA

Abe, K., Watabe, Y., Emori, M., Watanabe, S. and Arai, 1989. An ice nucleation

active gene of Erwinia ananas: sequences similarity to those of

Pseudomonas species and regions required for ice nucleation activity.

FEBS Lett. 258:297-300.

Amann, R. I., Ludwig, W. and Schleifer, K. H. 1995. Phylogenetic identification

and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.

Microbial. Rev. 59:143-169

Anon. 1975. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,

14th edn. Washington, DC: American Public Health Association. 913-

927.

Arwiyanto, T. 2009. Bakteri Penyebab Penyakit Tumbuhan sebagai Lawan dan

sebagai Kawan. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Attard, E., Yang, H., Delort, A.M., Amato, P., Poschl, U., Glaux, C., Koop, T. and

Morris, C.E. 2012. Effects of atmosphere conditions on ice nucleation

activity of Pseudomonas syringae in buds and leave of Manggo. J Appl

Bacteriol 79:341-346.

Baertlein, D. A., Lindow, S. E., Panapoulos, N. J.M., Lee, S. P., Min-drinos, M.

N. and Chen, T. H.H. 1992. Expression of bacterial ice nucleation gene

in plants. Plant Physiology 100:1730-1736.

Beattie, G.A. and Lindow, S.E. 1999. Bacterial Colonization of Leaves: A

Spectrum of Strategies. University of California, Berkeley.

Case, R. J., Boucher, Y., Dahllöf, I., Holmström, C., Doolittle, W. F., Kjelleberg, S. 2007.”

Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial

ecologystudies”. Appl. Environ. Microbiol. 73 (1), 278–88.


commit to user

46

Cazorla, F. M., Olalla, L., Tores, J. A., Perez-Garcia, A., Codina, J. C., and de

Vicente, A. 1995. A method for estimastion of population densities of ice

nucleation active Pseudomonas syringae in buds and leaves of mango. J.

Appl Bacteriol 79:341-346.

Christner, B.C., Cai, R., Morris, C.E., McCarter, K.S., Foreman, C.M., Skidmore,

M.L., Montross, S.N. and Sands, D.C. 2008. Geographic, Seasonal, and

precipitation chemistry influence on the abundance and activity of

biological of ice nucleators in rain and snow. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

58:1334-1338.

Diaffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. 1995. PCR Primer A Laboratory Manual.

Curtiba.

Du, N., Liu, X.Y. and Hew, C.L. 2003. Ice Nucleation Inhibition Mechanism of

Antifreeze by Antifreeze Protein. Issue 278:36000-36004.

Edwars, A.R., Ronald, A., Wichman, H.A., and Orser C.S. 1994. Unusual pattern

of bacterial ice nucleation gene evolution. Mol. Biol. Evol. 11:911-920.

Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT. Raja Grafindo.

Govindarajan, A.G. and Lindow, S.E. 1998. Size of Bacterial Ice Nucleation Sites

Measured in Situ Low Radiation Inactivation Analysis. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 58:1334-1338.

Green, R. L. and Warren, G. J. 1985. Physical and fuctional repetition in a

bacterial ice nucleation gene. Nature 317:645-648.

Gurian-Sherman, D. and Lindow, S.E. 1993. Bacterial ice nucleation :

significance and moleculer basis. FASEB J. 7:1338-1343.

Hill, T. C. J, Baker, L. T., and DeMott, P. J. Georgakopolous, D. G., Stump, W.

L., and Franc, G. D. 2013. Measurement of ice nucleation-active bacteria


commit to user

47

on plants and in precipitation by qantitative PCR. App.Env. Microbiology

80(4): 1256-1267.

Hirano, S.S., Baker, L.T., and Christian, D.U. 1985. Ice nucleation of individual

leaves in relation to populatioan sizes of ice nucleation active bacteria

and frost injury. Plant. Physiol. 77:259-265.

Hirano, S.S., and Upper, C.D. 2000. Bacteria in the leaf ecocsystems with

emphasis on Pseudomonas syringae a pathogen, ice nucleus, and

epiphyte. Mol. Microbio. Biol. Rev. 64:624-653

Hirano, S.S. and Christen, D.U. 2000. Bacteria in the leaf ecosystem with

emphasis on Pseudomonas syringae- a pathogen, Ice Nucleus and

Epiphyte. Microbiolgy and Moleculer Biology Reviews 64(3): 624-653.

Khussurur, M. 2005. Identifikasi Tumbuhan Penyusun Hutan Cemoro Sewu

Kabupaten Magetan Jawa Timur. Skripsi. Universitas Muhammadiyah

Malang.

Kozloff, L.M., Turner, M.A. and Arellano, F. 1991b. Formation of bacterial

membrane ice nucleating lipo glycoprotein Complexes. J. Bacteriol

173:6528-6536.

Lindow, S.E., Arny, D.C., and Upper, C.D. 1978. Distribution of ice nucleation

active on plants in nature. Appl. Environ. Microbiol. 36:831-838.

Lindow, S.E. Aray, D.C. and Upper, C.D. 1982. Bacterial ice nucleation : A factor

in frost injury to plants. Plant Physiol 70:1084-1089.

Lindow, S.E., Hirano, S.S., Barchet, W.R., Arny, D.C., and Upper, C.D.1982.

Relationship beetween ice nucleation frequency of bacteria and frost

injury. Plants Physiology 70: 1090-1093.

Lindow, S.E. 1983. The role of bacterial ice nucleation in frost injury to plant.

Ann. Rev. Phytopathol. 21:363-384.


commit to user

48

Lindow, S. E. 1993. Novel method for identifying bacterial mutant with reduced

epiphytic fitness. Appl. Environ. Microbiol. 59:1586-1592.

Madigan, M. T., Martinko, J. M., and Parker, J. 1997. Brook, the Biology of

microorganisms. Ed ke-8. New Jersey. Prentice Hall. Upper saddle

River.e

Marchesi, J. R., Sato, T., Weightman, A.j., Martin, T. A.,Fry, J. C., Hiom, S. J.,

and Wade, W. G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium

specific pcr primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA.

Appl. Environ. Microbiol 64:795-764

Montesinos, E. and Viraldell, P. 1991. Relationships among population levels of

Pseudomonas syringae, amount of the nuclei, and incidence of blast

dormant fllower in commercial pear orchards in Catalunya, Spain.

Phytopathology 81:113-119.

Morris, C.E., Georgakopoulus, D.G. and Sands, D.C. 2004. Ice nucleation active

bacteria and their potential role in precipitation. J Phys IV France

121:87-103.

Morris, C.E., Sands, D.C., Vinatser, B.A., Glaux, C., Guilbaud, C., Buffere, A.,

Yan, S., Dominguez, H. And Thompson, B.M. 2008. The life history of

the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.

International Society for Microbial Ecology (ISME) Journal 2:321-334.

Nejad, P., Ramstedt, M., Granhall, U., Roos, S. and Mcivor, I. 2006. Biochemical

caharacterization and identification if ice-nucleation-active (INA)

Willow Pathogens by Means of BIOLOG® Microplate, INA Gene

Primers and PCR Based 16S rRNA Gene Analyses. J. Plant. Dis. Prot.

113:97-106.


commit to user

49

Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen

Penyandi 16S rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas 7 (3):292-

296.

Paradis, S., Boissinot, M., Paquette, N., Bélanger, S. D., Martel, E. A., Boudreau,

D. K., Picard, F. J., Ouellette, M., Roy, P. H., Bergeron, M. G. 2005.

Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding

elongation factor Tu and F-ATPase β-subunit. Int J Syst Evol Microbiol

55:2013-2025

Pelczar, M.J., Krieg, N. R., Roop, R. M, and Chan, E. C. S., 2003. The Microbial

Universe: An Introduction to Microbiology. John Wiley & Sons

Incorporated.

Polymenakou, P. N. 2012. Atmosphere: A Source of Pathogenic or beneficial

Microbs. Atmosphere 3:87-102

Rostami, M. 2012. Isolation and Identification of Ice- Nucleating- Active Bacteria

and Their Antagonistic bacteria from Pistachio Tress in Rafsanjan

Region. Advances in Environmental Biology, 6(4): 1460-1467.

Rugless, J. A., Marshall, M. N., and Fall, R. 1993. Kinetics of Appearance and

Dissappearance of Classes of Bacterial Ice Nucleation Support and

Agregation Model for Ice Nucleus Assembly. J. Bacteriol. 175:7216-

7221.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. Texas:

Cold Spring Harbor Press. Uniersity of Texas South Western Medical

Centre.

Sastry, S. 2005. Ins and outs of ice nucleation. Nature 438:746-747.

Setyawan, A. D. 2000. Tumbuhan Epifit pada Tegakan Pohon Schima wallichi

(DC) Korth di gunung Lawu. Biodiversitas 2(1):14-20


commit to user

50

Setyawan, A. D. and Sugiyarto, 2001. Keanekaragaman Flora Hutan Jobolarangan

Gunung Lawu : 1. Cryptogamae. Biodiversitas 2(1):115-122

Stephanie and Waturangi, D. E. 2011. Distribution of Ice Nucleation Active (INA)

Bacteria from Rain-Water and Air. Hayati Journal of Biosciens 18 (3)

108-112.

Sunarto, 2000. Penyelamatan Biodiversitas Dalam Pandangan Masyarakat

Setempat. Dalam Setyawan, A.D. dan Sunarto (Ed). Menuju Taman

Nasional Gunung Lawu. Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta.

Suwanto, A. 1994. Iptek dan Kesehatan : Membuat Hujan dengan Bakteri.

Kompas, hal 11

Turner, M. A., Arellano, F. and Kozloff, L. M. 1991. Component of Ice

Nucleation Structures of Bacteria. J. Bacteriol 173:6515-6527.

Wahyudi, A. T. 1995. Pembentukan Inti Es oleh Bakteri. Hayati 2:55-59.

Watanabe, K,. Sato, M. 1998. Detection of variation of the domain structure of ice

nucleation genes in Erwinia herbicola group bacteria by PCR-RFLP

analysis. Curr Microbiol 37:201- 209.

Waturangi, D. E., Meicy, V. and Suwanto, A. 2008. Isolation and identification of

Ice-Nucleating active Bacteria From Indonesian Edible plant poh-pohan.

Microbiol. Indones, 1(2):8-10.

Waturangi, D. E., and Amelia, T. 2009. Isolation, Characterization and genetic

diversity of ice nucleation active bacteria on various plant. Hayati

16(2):54-58

Zhao, J. and Orser, C. S. 1990. Conserved repetition in the ice nucleation gene

inaX from Xanthomonas campestris pv. translucens, Mol. Gen. Genet.

223:163-166.


commit to user

51

LAMPIRAN


commit to user

52

Lampiran 1. Data isolat dari keenam sampel penelitian

Jumlah isolat pada keenam sampel penelitian

Stasiun Sampel Penelitian

Jumlah Isolat/Pengenceran

Jumlah MediaNAG King's B

-1 -2 -3 -1 -2 -3

I

Dodonae viscosa Jacq 2 1 1 (-) 1 (-) 5Rubus fraxinifolius 1 2 2 1 (-) (-) 6Vaccinium laurifolium 2 1 1 1 (-) 1 6Chromolaena odonata 2 1 3 1 (-) 1 8Conodopsis javanica (B) Hook F 1 2 1 1 1 6Polygonum chinense L 1 1 2 (-) 2 1 7

Jumlah 9 6 11 4 4 4 38

II

Dodonae viscosa Jacq 1 2 2 1 (-) 2 8Rubus fraxinifolius 1 1 3 (-) 1 (-) 6Vaccinium laurifolium 2 2 2 (-) (-) (-) 6Chromolaena odonata 1 2 (-) 2 (-) (-) 5Conodopsis javanica (B) Hook F 1 3 1 (-) (-) 1 6Polygonum chinense L 3 1 2 1 (-) (-) 7

Jumlah 9 11 10 4 1 3 38

III

Dodonae viscosa Jacq 1 2 1 2 (-) (-) 6Rubus fraxinifolius 2 2 (-) (-) 1 (-) 5Vaccinium laurifolium 1 2 2 (-) 2 1 8Chromolaena odonata 1 1 2 (-) (-) (-) 4Conodopsis javanica (B) Hook F 3 (-) 3 (-) (-) 2 8Polygonum chinense L 2 1 2 2 1 1 9

Jumlah 10 8 10 4 4 4 40Total 116Keterangan : (-)= Kontaminasi


commit to user

53

Lampiran 2. Tabel MPN (Kombinasi estimasi bakteri)

Tabel MPN untuk 3 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum

95% Confidence intervals

Tabung PositifMPN

/ g

Conf. Lim Tabung positifMPN/

g

Conf. Lim

0.1

0.01

0.001

Bawah Atas 0.10.01

0 Bawah Atas

0 0 0 <3.0 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3>110

0420


commit to user

54

Lampiran 3. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA

1. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4

GCCAACGGGTCTTGTACTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACATTATGGTTGGGCACTCTAAGGAAACTGCCGGTGACAAACCGGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACNGCCTGGGGCTAACACCGTGCTTACAATGGTCCGGTACAAAAGGGTTGCCAAGCCCCCGAGGTTGGAGCTAAATCTCCAAAAACCGAACNGTATCCCGGGATCCGANTCTGGCAATTCAACTGGCTTGAAATCCGGAATCCTNTAGAATCCCGAAATCTAATATTGCCCCGTGATAAACGTTCCCGGGGGCTNTGGATAACCCCGCACAA

2. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA isolat

C2N9

AAACGAGAGCTGCTCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCT


commit to user

55

CTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGCGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTCGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCACCAAGTAATGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAAGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGGCCCTTACAAGTAAGGGCTACACCCGTGCTACAATGGCGCCATACAAAGGAGAACGGACCTCCCGAGAGCAAACCGGACCTCACAAAAGTGGGTCGTAATTCCGGATCGGAATTCGCAATTNGACTCCGGGAAATCCGGATCCCTAGAAAACCTGGGAATCAAAATGCCCCGGGGAAAACTTTCCCTCGCGGCTTTTTAAACCCCCCACAAGGCAN

3. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S rRNA isolat

F1N6

NNCCNNCGNNGCCTGGCGGAGAAAGGAGCTTGCCTCCGGGTTTANCG

GGCCGACNGGGTGAGNTAACCCTTAGGAATTTCCCCTGTANATGGGG

GGAAAACGTTTCGGAAAGGGACCGCTAATTCCGGCATACGTCCTACG

GGAGAAAACCAGGGGACCTTCGGCCCTTGCGTTATCAGATGAGCCTA

GGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGAT

CCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACAC

GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG

GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGG

ATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATATCTT

GCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCA


commit to user

56

GCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG

GCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCC

GGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGG

TAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATA

GGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACA

CTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA

GTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGGTCCTTGAGACTT

TAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCC

GCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG

GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTT

GACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCT

GACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG

GTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGT

TATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG

TGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACAC

GTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGC

TAATCCCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGAC

TGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATCGCNNNNN

NNA


commit to user

57

Lampiran 4. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4, C2N9 dan F1N6 pada program BLAST dan Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA

1. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4 pada program BLAST

.

DescriptionMax

score

Total

score

Query

cover

E

valueIdent Accession

Pseudomonas tremae

partial 16S rRNA gene,

strain MWM-03

2158 2158 97% 0.0 96% HE716923.1


16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

2158 2158 97% 0.0 96% KC311253.1

Pseudomonas sp. Tigray 2

16S ribosomal RNA gene,

partial sequence

2158 2158 97% 0.0 96% KC150861.1


strain SQYB-1 16S

ribosomal RNA gene,

partial sequence

2158 2158 97% 0.0 96% JX876901.1


gene for 16S rRNA,

partial sequence, strain:

NBRC 14076

2158 2158 97% 0.0 96% AB680548.1

Pseudomonas tremae

strain Ht3-25 16S

ribosomal RNA gene,

partial sequence

2158 2158 97% 0.0 96% JF899280.1


commit to user

58

2. Urutan basa gen penyandi 16S rRNA isolat C2N9 pada program BLAST

DescriptionMax

score

Total

score

Query

cover

E


Pantoea sp. SB547 16S

ribosomal RNA gene, partial

sequence

2196 2196 97% 0.0 97% FJ357836.1

Uncultured bacterium clone

ncd460h07c1 16S ribosomal

RNA gene, partial sequence

2191 2191 97% 0.0 97% HM326435.1


ncd459g01c1 16S ribosomal


2191 2191 97% 0.0 97% HM315275.1


ncd864h02c1 16S ribosomal


2185 2185 97% 0.0 97% HM306352.1

Pantoeaagglomerans isolate

PSB26 16S ribosomal RNA

gene, partial sequence

2183 2183 97% 0.0 97% HQ242739.1

Pantoea sp. 3DT5 16S


sequence

2183 2183 97% 0.0 97% HQ849996.1


commit to user

59

3. Urutan basa gen penyandi16S rRNA isolat F1N6 pada program BLAST

DescriptionMax

score

Total

score

Query

cover

E


Pseudomonas sp. CMR5c 16S

ribosomal RNA (rrsA) gene,

partial sequence

2233 2233 98% 0.0 98% FJ652623.1

Pseudomonas sp. HMPB1 16S

rRNA gene2228 2228 98% 0.0 98%

AM745260

.1

Pseudomonas sp. HYY0512-PK05

gene for 16S rRNA, partial

sequence

2228 2228 98% 0.0 98%AB269776.

1

Pseudomonas sp. ICB476 16S


sequence

2217 2217 98% 0.0 97%GU990089.

2

Uncultured bacterium clone Ap.ba-

F-DM-HN-1-15 16S ribosomal


2211 2211 98% 0.0 97%HQ639445.

1

Pseudomonas sp. CMR12a 16S

ribosomal RNA (rrsA) gene,

partial sequence

2211 2211 98% 0.0 97% FJ652622.1


commit to user

60

1. Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat A2N4 bakteri INA dengan Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KC311253.1|Length: 1391Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 22 to 1332

Score Expect Identities Gaps Strand2158 bits(1168) 0.0 1281/1332(96%) 26/1332(1%) Plus/Plus

Query 9 ACGGGT-CTTGTA-CTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT 66 |||||| |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 22 ACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT 81

Query 67 GGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAA 126 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 82 GGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAA 141

Query 127 GCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTG 186 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 142 GCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTG 201

Query 187 AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACT 246 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 202 AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACT 261

Query 247 GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG 306 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 262 GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG 321

Query 307 GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT 366 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 322 GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT 381

Query 367 TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAAT 426 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 382 TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAAT 441

Query 427 AAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCG 486 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 442 AAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCG 501

Query 487 GAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGG 546 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||Sbjct 502 GAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGG 561

Query 547 CTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAAT 606 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 562 CTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAAT 621

Query 607 TTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCA 666 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 622 TTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCA 681

Query 667 CCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC 726 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 682 CCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC 741

Query 727 TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGC 786 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 742 TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGC 801

Query 787 GCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG 846


commit to user

61

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 802 GCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG 861

Query 847 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA 906 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 862 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGA 921

Query 907 ACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAAC 966 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 922 ACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAAC 981

Query 967 ATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC1026 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 982 ATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC1041

Query 1027 CGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACATTATGGTTGGGCACTCTAAGGA1086 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||Sbjct 1042 CGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACATTATGG-TGGGCACTCTAAGGA1100

Query 1087 AACTGCCGGTGACAAACCGGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA1146 |||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1101 GACTGCCGGTGACAAACCGGA-GGAAGGT-GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA1158

Query 1147 CNGCCTGGGGCTA-ACACCGTGCTTACAATGGTCCGGTACAAAAGGGTTGCCAAGCCCCC1205 | ||||||| ||| |||| ||||| ||||||||| |||||| |||||||||||||| | Sbjct 1159 CGGCCTGGG-CTACACAC-GTGCT-ACAATGGTC-GGTACAG-AGGGTTGCCAAGCCGC-1212

Query 1206 GAGGTTGGAGCTAAATCTCCAAAAACCGAACNGTATCCCGGGATCCGANTCTGGCAATTC1265 ||||| |||||||| |||| |||||||| | ||| |||| ||| | |||| ||| ||Sbjct 1213 GAGGT-GGAGCTAA-TCTCACAAAACCGATC-GTAGTCCGG-ATCGCAGTCTG-CAACTC1267

Query 1266 AACTGGCTTGAAATCCGGAATC-CTNTAG-AATCCCGAAATCTAATATTGCCCCGTGATA1323 |||| | |||| || |||||| || || |||| |||| || | || | | |||| |Sbjct 1268 GACTG-CGTGAAGTC-GGAATCGCT--AGTAATCGCGAA-TCAGA-ATGTCGCGGTGA-A1320

Query 1324 AACGTTCCCGGG 1335 |||||||||||Sbjct 1321 TACGTTCCCGGG 1332

2. Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat C2N9 bakteri INA dengan Pantoea sp

Pantoea sp. SB547 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|FJ357836.1|Length: 1478Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 59 to 1365

Score Expect Identities Gaps Strand2196 bits(1189) 0.0 1275/1316(97%) 10/1316(0%) Plus/PlusQuery 10 GAGAGC-TGCTCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCG 68 |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 59 GAGAGCTTGCTCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCG 118

Query 69 ATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG 128 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 119 ATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAG 178

Query 129 AGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGG 188 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 179 AGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGG 238

Query 189 GGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG 248


commit to user

62

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 239 GGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG 298

Query 249 GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG 308 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 299 GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG 358

Query 309 CGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT 368 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 359 CGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTT 418

Query 369 TCAGCGGGGAGGAAGGCGATGCGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGA 428 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 419 TCAGCGGGGAGGAAGGCGATGCGGTTAATAACCGCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGA 478

Query 429 AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG 488 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 479 AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG 538

Query 489 AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGC 548 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 539 AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGC 598

Query 549 TTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATT 608 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 599 TTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATT 658

Query 609 CCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC 668 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 659 CCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC 718

Query 669 CTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT 728 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 719 CTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT 778

Query 729 GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCG 788 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 779 GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCG 838

Query 789 GAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGA 848 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 839 GAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGA 898

Query 849 ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA 908 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 899 ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA 958

Query 909 CCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTCGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACC 968 ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 959 CCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTTGGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACC1018

Query 969 GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC1028 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1019 GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC1078

Query 1029 GCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCACCAAGTAATGTCGGGAACTCAAAGGAGA1088 |||||||||||||||||||||||||||||||| | ||| |||||||||||||||||||||Sbjct 1079 GCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGAGTCATGTCGGGAACTCAAAGGAGA1138

Query 1089 CTGCCGGTGATAAACCGGAAGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGGCCCTTACAA1148 ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| |Sbjct 1139 CTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCAT-GGCCCTTACGA1197

Query 1149 GTAAGGGCTACACCCGTGCTACAATGGCGCCATACAAAGGAGAACGGACCTCCCGAGAGC1208 || |||||||||| |||||||||||||||| |||||||| |||| |||||| |||||||Sbjct 1198 GT-AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGC-ATACAAAG-AGAAGCGACCTCGCGAGAGC1254

Query 1209 AAACCGGACCTCACAAAAGTGGGTCGTAATTCCGGATCGGAATTCGCAATTNGACTCCGG1268 || |||||||||| |||||| |||||| ||||||||||| | |||| | ||||||| Sbjct 1255 AAG-CGGACCTCAC-AAAGTGCGTCGTAG-TCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGT1311


commit to user

63

Query 1269 GAAATCCGGATCCCTAGAAAACCTGGGAATCAAAATGCCCCGGGGAAAACTTTCCC 1324 ||| || | ||| |||| || | ||| |||| |||||| ||| ||| || |||||Sbjct 1312 GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGG--ATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCC 1365

3. Alligment urutan basa DNA dari gen penyandi 16S rRNA isolat F1N6bakteri INA dengan Pseudomonas sp

Pseudomonas sp. CMR5c 16S ribosomal RNA (rrsA) gene, partial sequence Sequence ID: gb|FJ652623.1|Length: 1459Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 39 to 1332

Score Expect Identities Gaps Strand2233 bits(1209) 0.0 1274/1304(98%) 12/1304(0%) Plus/MinusQuery 12 ATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATC 71 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1332 ATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATC1273

Query 72 CGGACTACGATCGGTTTTGTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACC 131 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1272 CGGACTACGATCGGTTTTGTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACC1213

Query 132 GACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCC 191 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1212 GACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCC1153

Query 192 CACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTA 251 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1152 CACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTA1093

Query 252 ACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG 311 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1092 ACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG1033

Query 312 ACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAG 371 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 1032 ACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAG 973

Query 372 TTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT 431 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 972 TTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT 913

Query 432 CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCC 491 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 912 CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCC 853

Query 492 CAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGTCTCAAGGACCCCAACGGCTAG 551 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 852 CAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGTCTCAAGGACCCCAACGGCTAG 793

Query 552 TTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT 611 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 792 TTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT 733

Query 612 CGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTAT 671 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 732 CGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTAT 673

Query 672 ATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGC 731 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 672 ATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTTGC 613


commit to user

64

Query 732 CAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCA 791 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 612 CAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCA 553

Query 792 CCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCG 851 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 552 CCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCG 493

Query 852 GCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGATAT 911 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 492 GCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGATAT 433

Query 912 TAGCTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACAC 971 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 432 TAGCTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACAC 373

Query 972 ACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCC1031 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 372 ACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCC 313

Query 1032 GTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTAC1091 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 312 GTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTAC 253

Query 1092 GGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCT1151 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 252 GGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCT 193

Query 1152 GATAACGCAAGGGCCGAAGGTCCCCTGGTTTTCTCCCGTAGGACGTATGCCGGAATTAGC1211 |||| ||||||| |||||||||||||| ||| |||||||||||||||||| || ||||||Sbjct 192 GATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTT-CTCCCGTAGGACGTATGC-GGTATTAGC 135

Query 1212 GGTCCCTTTCCGAAACGTTTTCCCCCCATNTACAGGGGAAATTCCTAAGGGTTANCTCAC1271 | ||||||| ||||||||| |||||| | ||| || | ||||||| | ||| |||||Sbjct 134 G-TCCCTTT-CGAAACGTTATCCCCC-AC-TACCAGGCAGATTCCTAGGCATTA-CTCAC 80

Query 1272 CCNGTCGGCCCGNTAAACCCG-GAGGCAAGCTC-CTTTCTCCGC 1313 || ||| ||| | |||| ||| ||| ||||||| ||| |||||Sbjct 79 CC-GTCCGCC-GCTAAATCCGTGAG-CAAGCTCACTTCATCCGC 39


commit to user

65

Lampiran 5. Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen ina

Susunan basa nukleotida hasil sekuensing gen ina isolat A2N4 dengan Pseudomonas syringae

NNNANGAGCGGTCGGCAGCACGCAACCGCACAGGAAACAGCTCGCTCACCACCGGGTACGGAAGTACCTCCACAGCCGGCTTTGCCAGCTCGCTGATCGCCGGTTATGGCAGTACGCAGACAGCCGGCTATAAAAGTACCCTCACGGCCGGTTACGGCAGTACTCAGACCGCAGAGTATGGAAGCTCACTCACTGCGGGCTACGGCAGCACTGCAACGGCCGGGCAGGACAGTTCATTGATAGCCGGTTATGGCAGCTCCCTGACCAGCGGAATCAGAAGTTTTCTGACGGCAGGCTATGGCAGTACGCTGATCGCCGGACTTCGCAGCGTTTTGATCGCCGGTTATGGCAGTAGTCTTACATCGGGCATTCGCAGCACGTTGACTGCGGGTTATGGCAGTAACCAGATTGCAAGTTACGGCAGCTCGTTGATTGCAGGCCATGAAAGCATTCAGGTCGCCGGAAATAAAAGCATGCTGATCGCCGGCAAGGGCAGCTCGCAGACAGCAGGTTTTCGCAGCACGCTGATTGCCGGTGCGGGCAGTGTACAACTGGCGGGTGATCGCAGCCGGTTGATTGCCGGTGCAGACAGTAATCAGACCGCGGGTGACCGCAGCAAACTGCTGGCCGGTAATAACAGTTATCTGACTGCCGGCGATAGAAGCAATGGAACCCGGCGA


commit to user

66

Lampiran 6. Urutan basa DNA dari gen ina pada program BLAST dan alligment urutan basa DNA dari gen ina.

1. Urutan produk sekuen parsial DNA dari gen ina isolat A2N4 pada program BLAST

DescriptionMax

score

Total

score

Query

cover

E


Pseudomonas syringae ice4 gene for ice nucleation protein, strain INA4 1190 1190 97% 0.0 99% FN650702.1

Pseudomonas syringae ice nucleation protein (inaK) gene, complete cds 1190 1190 97% 0.0 99% AF013159.1

Pseudomonas syringae S203 ice nucleation gene 1184 1184 97% 0.0 99% X03035.1

Pseudomonas syringaepv. syringae strain MB03 ice nucleation protein (inaQ) gene, complete cds

1112 1239 97% 0.0 97% EU360731.1

Pseudomonas sp. HCh1a ice nucleation protein gene, partial cds 1101 1101 97% 0.0 97% KC311276.1

Pseudomonas sp. PCa2a ice nucleation protein gene, partial cds 1096 1096 97% 0.0 97% KC311275.1

Pseudomonas syringaeinaV gene1068 1068 97% 0.0 96% AJ001086.1

Pseudomonas sp. GCh5Fc ice nucleation protein gene, partial cds 1062 1062 97% 0.0 96% KC311278.1


commit to user

67

2. Alligment urutan basa DNA dari gen ina isolat A2N4 dengan

Pseudomonas syringae ice-4 gene for ice nucleation protein strain

INA4

Pseudomonas syringae ice4 gene for ice nucleation protein, strain INA4 Sequence ID: emb|FN650702.1|Length: 3987Number of Matches: 1Related InformationRange 1: 3030 to 3686

Score Expect Identities Gaps Strand

1190 bits(644) 0.0 653/657(99%) 2/657(0%)Plus/Plus

Query 13 CGGCAGCACGC-AACCGCACAGG-AAACAGCTCGCTCACCACCGGGTACGGAAGTACCTC 70 ||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3030 CGGCAGCACGCAAACCGCACAGGAAAACAGCTCGCTCACCACCGGGTACGGAAGTACCTC 3089

Query 71 CACAGCCGGCTTTGCCAGCTCGCTGATCGCCGGTTATGGCAGTACGCAGACAGCCGGCTA 130 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3090 CACAGCCGGCTTTGCCAGCTCGCTGATCGCCGGTTATGGCAGTACGCAGACAGCCGGCTA 3149

Query 131 TAAAAGTACCCTCACGGCCGGTTACGGCAGTACTCAGACCGCAGAGTATGGAAGCTCACT 190 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3150 TAAAAGTACCCTCACGGCCGGTTACGGCAGTACTCAGACCGCAGAGTATGGAAGCTCACT 3209

Query 191 CACTGCGGGCTACGGCAGCACTGCAACGGCCGGGCAGGACAGTTCATTGATAGCCGGTTA 250 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||Sbjct 3210 CACTGCGGGCTACGGCAGCACTGCAACGGCCGGGCAGGACAGTTCATTGATAGCCGGCTA 3269

Query 251 TGGCAGCTCCCTGACCAGCGGAATCAGAAGTTTTCTGACGGCAGGCTATGGCAGTACGCT 310 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3270 TGGCAGCTCCCTGACCAGCGGAATCAGAAGTTTTCTGACGGCAGGCTATGGCAGTACGCT 3329

Query 311 GATCGCCGGACTTCGCAGCGTTTTGATCGCCGGTTATGGCAGTAGTCTTACATCGGGCAT 370 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |Sbjct 3330 GATCGCCGGACTTCGCAGCGTTTTGATCGCCGGTTATGGCAGTAGTCTTACATCGGGCGT 3389

Query 371 TCGCAGCACGTTGACTGCGGGTTATGGCAGTAACCAGATTGCAAGTTACGGCAGCTCGTT 430 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3390 TCGCAGCACGTTGACTGCGGGTTATGGCAGTAACCAGATTGCAAGTTACGGCAGCTCGTT 3449

Query 431 GATTGCAGGCCATGAAAGCATTCAGGTCGCCGGAAATAAAAGCATGCTGATCGCCGGCAA 490 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3450 GATTGCAGGCCATGAAAGCATTCAGGTCGCCGGAAATAAAAGCATGCTGATCGCCGGCAA 3509

Query 491 GGGCAGCTCGCAGACAGCAGGTTTTCGCAGCACGCTGATTGCCGGTGCGGGCAGTGTACA 550 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3510 GGGCAGCTCGCAGACAGCAGGTTTTCGCAGCACGCTGATTGCCGGTGCGGGCAGTGTACA 3569

Query 551 ACTGGCGGGTGATCGCAGCCGGTTGATTGCCGGTGCAGACAGTAATCAGACCGCGGGTGA 610 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3570 ACTGGCGGGTGATCGCAGCCGGTTGATTGCCGGTGCAGACAGTAATCAGACCGCGGGTGA 3629

Query 611 CCGCAGCAAACTGCTGGCCGGTAATAACAGTTATCTGACTGCCGGCGATAGAAGCAA 667 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 3630 CCGCAGCAAACTGCTGGCCGGTAATAACAGTTATCTGACTGCCGGCGATAGAAGCAA 3686


commit to user

68

Lampiran 7. Hasil BLASTX asam amino, alligment produk BLASTX dan urutan asam amino isolat A2N4

1. Hasil BLASTX asam amino pada isolat A2N4

2. Alligment produk blastx isolat A2N4

Alignment statistics for match #1Score Expect Method Identities Positives Gaps Frame

353 bits(907) 5e-119 Compositional matrix adjust. 191/192(99%) 191/192(99%) 0/192(0%) +3

Query 93 LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSG 272 LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSGSbjct 27 LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSG 86

Query 273 IRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESI 452 IRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESISbjct 87 IRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESI 146

Query 453 QVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAG 632

Sequences producing significant alignments:

DescriptionMax score

Total score

Query cover

E value Ident Accession

hypothetical protein [Pseudomonas syringae]

353 776 84% 4e-119 99% WP_003405688.1

hypothetical protein PSYPI_24104 [Pseudomonas syringae pv. pisi str. 1704B]

352 853 84% 4e-119 99% EGH45241.1

ice nucleation protein [Pseudomonas syringae]

353 869 84% 5e-119 99% WP_024664696.1


352 776 84% 8e-119 99% WP_003368365.1


353 1076 84% 9e-119 99% WP_025168256.1

ice-nucleation protein s octamer repeat protein [Pseudomonas syringae]

353 1172 84% 5e-118 99% WP_003409544.1


commit to user

69

QVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAGSbjct 147 QVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAG 206

Query 633 NNSYLTAGDRSN 668 NNSYLTAGDRS Sbjct 207 NNSYLTAGDRSK 218

3. Urutan asam amino isolat A2N4

LIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQTAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLI

AGYGSSLTSGIRSFLTAGYGSTLIAGLRSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYG

SNQIASYGSSLIAGHESIQVAGNKSMLIAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQ

LAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLAGNNSYLTAGDRS

Urutan asam amino Pseudomonas syringae

STQTAQENSSLTTGYGSTSTAGFASSLIAGYGSTQTAGYKSTLTAGYGSTQ

TAEYGSSLTAGYGSTATAGQDSSLIAGYGSSLTSGIRSFLTAGYGSTLIAGL

RSVLIAGYGSSLTSGIRSTLTAGYGSNQIASYGSSLIAGHESIQVAGNKSML

IAGKGSSQTAGFRSTLIAGAGSVQLAGDRSRLIAGADSNQTAGDRSKLLA

GNNSYLTAGDRSKLTGGHDCTLMAGDQSRLTAGKNSILTAGARSKLIGSE

GSTLSAGEDSTLIFRLWDGKRYRQLVARTGENGVEADIPYYVNEDDDIVD

KPDED DDWIEVE


commit to user

digilib.uns.ac · pdf fileisolasi, identifikasi dan deteksi gen ice nucleation active bakteri...

Documents