DETEKSI SALMONELLA TYPHI DENGAN SEKUMPULAN RANTAI POLIMERASE

REAKSI DALAM DARAH, URINE, DAN SAMPEL TINJA

Mochammad HATTA DAN Henk L. Smits *

Departemen Mikrobiologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi

Selatan, Indonesia; Koninklijk Instituut voor de Tropen Biomedical Research, Royal Tropical Institute /

Koninklijk Instituut voor de Tropen, Amsterdam, Belanda

Abstrak. Sebuah reaksi berantai polimerase bersarang (PCR) khusus untuk enterica serovar Salmonella Typhi

digunakan untuk deteksi patogen dalam darah, urine, dan sampel tinja dari 131 pasien dengan kecurigaan klinis

demam tifoid. Sensitivitas budaya darah, PCR dengan darah, urin, dan kotoran, dan uji Widal adalah 61,8%,

84,5%, 69,3%, 46,9%, dan 39,0%, masing-masing. Sensitivitas dari PCR dengan darah (P < 0,001) dan urin (P =

0,01) adalah secara signifikan lebih tinggi, dan sensitivitas PCR dengan kotoran (P > 0,05) mirip dengan budaya

darah. Gabungan, yang PCR pada urin dan feses menunjukkan hasil positif untuk 16 (70%) dari 23 pasien tifoid

dengan hasil negatif dengan darah budaya dan PCR dengan darah. Hasil ini menunjukkan bahwa PCR dengan

darah adalah metode yang sensitif untuk diagnosis demam tipus, dan bahwa PCR dengan urin dan tinja bisa tes

melengkapi berguna.

PENDAHULUAN

Demam tifoid merupakan masalah kesehatan yang penting di berbagai Negara berkembang. Di seluruh

dunia, sebanyak 17 juta orang diperkirakan mengidap penyakit ini setiap tahun. Kebanyakan penyakit ini terjadi

pada warga negara berpenghasilan rendah, khususnya di Asia Tenggara, Afrika, dan Amerika Latin. Di Sulawesi

Selatan, Indonesia, demam tipus adalah salah satu penyakit menular yang sangat penting. Penyakit ini merupakan

endemik di seluruh daerah dan merupakan penyakit menular keempat yang paling sering dilaporkan di 24

kabupaten. Di Sulawesi Selatan, tipus merupakan penyebab yang paling penting yang diperoleh dari komunitas

septicemia, dengan tingkat insiden yang dilaporkan melebihi 2.500 / 100.000 di banyak kabupaten.

Demam tifoid disebabkan oleh Salmonella serovar enterica Typhi dan ditularkan melalui jalur fecal-oral

oleh konsumsi air dan makanan yang terkontaminasi. Kehadiran dari pasien konvalesen atau carrier aktif

menghasilkan patogen yang dapat menimbulkan peningkatan risiko infeksi. Di daerah nonendemik, wabah

penyakit dapat terjadi dari sumber makanan yang unik atau carrier.2,3 Di daerah endemik penyakit baru-baru ini,

kontak dengan pasien atau pembawa telah diidentifikasi sebagai utama faktor risiko, 4,5 tetapi faktor risiko lainnya

termasuk kemiskinan, pendidikan yang rendah tingkat, kondisi higienis yang buruk dan pasokan air, dan makan di

luar rumah atau warung makan .1 ,6-10

Hampir setengah dari pasien yang diobati terus mengekskresikan patogen satu bulan setelah gejala telah

menghilang, dan sekitar 5% masih melakukannya lima bulan kemudian.11, 12 Sekitar 3% menjadi operator dan terus

mengekskresikan organisme, sering bertahan hidup lama.13 Tahap pembawa mungkin juga mengembangkan

setelah infeksi tanpa gejala. Metode deteksi molekul yang paling cocok untuk mengidentifikasi patogen dalam

ekskresi manusia karena metode ini sangat spesifik dan sensitif. Secara khusus reaksi berantai polimerase (PCR)

yang mampu untuk mendeteksi jumlah menit DNA patogen spesifik melalui amplifikasi dari segmen DNA yang

didefinisikan, dan diskriminasi dalam satu reaksi antara organisme yang berbeda bahkan jika mereka berhubungan

erat. Dalam kombinasi dengan metode persiapan sampel yang sesuai, PCR diterapkan pada kebanyakan spesimen

termasuk darah utuh, tinja, dan urine.14, 15 Dengan demikian, PCR tampaknya cocok untuk mengidentifikasi pasien

yang aktif mengeluarkan organisme dan untuk menyelidiki pembawa tahap melalui deteksi spesifik DNA

Salmonella typhi pada sampel urin dan tinja.

Song dan rekan kerja menggambarkan kumpulan PCR untuk deteksi DNA S. typhi dalam darah

specimen.16 Dalam studi ini, kita menilai sensitivitas kumpulan PCR pada sampel darah dan menyelidiki apakah

metode yang dapat digunakan untuk deteksi DNA S. typhi dalam sampel urin dan tinja. Hasil akhir, darah, urine

dan sampel kotoran dari pasien yang diduga demam tipus telah diuji dan hasilnya dibandingkan dengan kultur

darah dan uji Widal.

BAHAN DAN METODE

Kelompok pasien dan spesimen klinis. Sebanyak 131 (74 laki-laki dan 57 wanita) pasien (median usia = 20

tahun, rentang = 6-54 tahun) dengan kecurigaan klinis demam tifoid yang datang pada dua rumah sakit yang

berbeda dan satu pusat perawatan kesehatan primer yang lokasinya dekat dengan Makassar, ibukota Sulawesi

Selatan, dilibatkan dalam penelitian yang didasarkan pada demam tinggi secara terus-menerus (suhu rata-rata =

38 °C, kisaran = 37,2-40 °C), jenis toxic, splenomegali, dan gejala konstitusional. Durasi rata-rata penyakit pada

konsultasi adalah 7 hari (kisaran = 4-15 hari). Sampe darah untuk kultur dan PCR, dan sampel serum untuk

analisis serologi yang dikumpulkan dari semua pasien. Sampel urin dikumpulkan dari 105 pasien (60 pria dan 45

wanita), dan sampel kotoran dikumpulkan dari 50 pasien (38 pria dan 12 perempuan). Spesimen klinis

dikumpulkan pada hari yang sama atau dalam 1-2 hari setelah konsultasi pertama.

Pertimbangan etis. Penelitian ini ditinjau dan disetujui oleh badan penelaahan dari lembaga yang

berpartisipasi dan penyampaian persetujuan diperoleh dari semua peserta atau orang tua atau wali.

Kultur darah. Lima mililiter darah segar yang terkumpul ditempatkan dalam 15 ml kaldu empedu

Sapi/Ox bile broth (Merck, Darmstadt, Jerman) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ° C. Satu mililiter

kultur ini kemudian dilapisi pada agar-agar Salmonella Shigella (SS) (Oxoid, Basingstoke, Inggris), diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37 ° C, dan diperiksa pertumbuhannya. Jika terjadi pertumbuhan, koloni individu

diperiksa dengan pewarnaan Gram dan identifikasi bakteri dilakukan setelah subkultur pada agar SS dengan

pengujian biokimia dengan tes triple gula besi, motilitas indol sulfida, reaktivitas metil merah Voges 'Proskauer,

konsumsi sitrat, urea, dan aktivitas dekarboksilase, dan fermentasi karbohidrat pada glukosa, laktosa, manitol,

sukrosa, dan arabinose.17

Serologi analisis. Uji Widal dengan antigen O (Murex Biotech Ltd, Dartford, Inggris) dilakukan dan

ditafsirkan menurut prosedur laboratorium rutin. Titer A ≥ 1:320 dianggap positif.

Persiapan DNA dari darah, tinja, dan urin. DNA diekstraksi dari seluruh darah segar yang

dikumpulkan, urine, dan sampel tinja menurut isothiocyanate diatom-guanidinium (GuSCN) metode yang

dijelaskan oleh Boom dan lainnya.14 Untuk ekstraksi DNA dari darah, 100 µL sampel darah segar yang

dikumpulkan dicampur dengan 900 µL buffer lisis (50 mM Tris-HCl, 5.25M GuSCN, 20 mM EDTA, 0,1% Triton

X-100) dan disentrifugasi pada 12.000 × g selama 10 menit. Untuk persiapan DNA dari urine, 1-mL sampel urin

disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dikumpulkan dan disentrifugasi lagi pada 5.000 rpm

selama 30 menit, dan lisis/penyangga (900 µL ) ditambahkan ke sedimen. Untuk persiapan DNA dari kotoran,

sampel tinja dengan volume sekitar 100 µL ditempelkan pada kapas, ditangguhkan dalam 1 mL air steril, pusaran

air yang kencang, dan disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 5 menit. Untuk mendapatkan DNA, sampel

diinkubasi selama 15 menit pada 18 °C dan ditambahkan 20 µL suspensi diatom.14 Diatom yang mengandung

DNA terikat diendapkan dengan sentrifugasi pada 12.000 × g selama 15 detik. Pellet/butiran diatom dicuci

dengan larutan pencuci (5,25 M GuSCN dalam 0,1 M Tris-HCl, pH 6.4), dibilas dengan 70% etanol dan aseton,

dan dikeringkan dengan inkubasi pada 56 °C selama 10 menit. Pelet/butiran tersebut dicampur dengan 60 µL dari

10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM larutan EDTA dan DNA dielusi dengan inkubasi pada 56 °C selama 10 menit.

Setelah sedimentasi dari diatom dengan sentrifugasi, supernatan dikumpulkan dan disimpan pada -20 °C sampai

PCR dilakukan.

Deteksi molekuler. Kumpulan PCR dijelaskan oleh Song dan lainnya16 dengan modifikasi primer

lanjutan untuk PCR pertama seperti yang disarankan oleh Frankel dan lainnya18 untuk meningkatkan spesifisitas

berdasarkan amplifikasi pada sekuens unik dalam VI daerah gen flagellin. Modifikasi PCR memperkuat 458-

basepair (pb) fragmen yang sesuai dengan nukleotida 1063-1530 gen dalam reaksi pertama dan kumpulan 343-bp

fragmen sesuai dengan nukleotida 1072-1435 pada reaksi kedua.18 PCR pertama dilakukan dengan penambahan

2µL dari ekstraksi DNA pada 25µL campuran PCR dan amplifikasi selama 40 siklus (1 menit pada suhu 94 °C, 75

detik pada 57 °C, dan 3 menit pada 72 °C) dalam thermocycler (Hybaid, Ashford, Inggris). Campuran PCR terdiri

dari Standar larutan PCR (100 mM Tris-HCl, pH 8,3 , 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, gelatin 0,1%, 200 - µM

masing-masing dari keempat dNTPs, dan 0,625 unit polimerase DNA Taq) ditambah dengan 25 pmol pada primer

ST1 (5’-ACT GCT AAA ACC ACT ACT-3’) dan 25 pmol dari primer ST2 (5’-ACT GCT AAA ACC ACT ACT-

3’). Kumpulan PCR dilakukan dengan penambahan 2 µL dari produk PCR pada 20 µL PCR buffer standar

dilengkapi dengan 25 pmol dari ST3 primer (5’-AGA TGG TAC TGG CGT TGC TC-3’) dan 25 pmol dari ST4

primer (5’-TGG AGA CTT CGG TCG CGT AG-3’) dan amplifikasi selama 40 siklus dengan siklus program suhu

yang sama sebagai reaksi pertama. PCR dilakukan tanpa pengetahuan sebelumnya dari klasifikasi sampel.

HASIL

Berdasarkan hasil kultur darah, evolusi dari penyakit, dan respon terhadap pengobatan, diagnosis demam tifoid

dibuat pada 119 pasien pada serangkaian dari 131 klinis yang diduga kasus demam tipus. Kultur positif untuk 68

(57,1%) pasien. Kumpulan PCR pada darah menunjukkan positif pada 93 (78,2%) pasien, dan 45 (37,8%) positif

dengan uji Widal (titer ≥ 1:320) (Tabel 1). Hasil tes negatif

dalam kultur darah dan PCR pada darah yang diperoleh pada 25 pasien dengan diagnosis demam tifoid. Diagnosis

klinis selain demam tifoid dilakukan dalam 12 kultur lainnya-dan PCR-negatif pasien. Dari 12 pasien, empat

(33,3%) positif dalam uji Widal (titer ≥ 1:320). Pada tahap satu nilai cut-off terendah (titer 1:160), 57 (47,9%)

pasien didiagnosis dengan demam tipus dan 11 (91.7%) pasien dengan diagnosis selain demam tifoid

menunjukkan hasil yang positif di

uji Widal.

PCR pada urin dan tinja menunjukkan hasil yang positif pada

65,6% dan 39,5% dari penderita demam tifoid dari sampel yang dikumpulkan (Tabel 2). PCR dengan urin dan

feses menunjukkan hasil positif pada 72,9% pasien yang didiagnosis dengan demam tipus, dan ketiga PCR

menunjukkan hasil positif di 95,7% pasien. Stratifikasi berdasarkan hasil kultur menunjukkan bahwa PCR pada

urin memiliki hasil positif pada 61,1% dari kultur darah pasien positif dan 71,8% dari kultur darah pasien

negative tipus, dan PCR pada feses memiliki hasil positif pada 23,8% dan 58,8% dari kedua kelompok pasien,

secara berturut-turur.

Sampel darah dari 26 pasien tipus diuji negatif di PCR. Sampel urin dikumpulkan dari 18 dari pasien

dan sampel tinja dari 16 dari mereka. Dari jumlah tersebut, 13 (72,2%) dinyatakan positif di PCR pada urin dan 10

(62,5%) diuji positif di PCR pada feses. PCR dengan urin dan feses juga dilakukan untuk 12 pasien non-tifoid

dan semua menunjukkan hasil negatif.

Berdasarkan hasil gabungan kultur darah dan tiga PCR, kepekaan kultur darah, PCR pada darah, PCR

pada urin, PCR pada kotoran, dan uji Widal berturut-turut adalah 61,8%, 84,5%, 46,9%, 69,3%, dan 39%, (Tabel

3). Kepekaan kumpulan PCR pada darah (P < 0,001) dan urin (P = 0,01) signifikan lebih tinggi, dan kepekaan

kumpulan PCR pada feses (P > 0,05) tidak berbeda dengan sensitivitas

kultur darah. Empat pasien dengan diagnosis klinis demam tipus menunjukkan hasil negatif dalam kultur darah

dan tiga PCR pada darah, urine, dan tinja. Untuk lima pasien lainnya dengan diagnosis klinis demam tifoid,

diperoleh hasil negatif dalam kultur darah tanpa sampel tinja ataupun urin, atau salah satu di antara kedua sampel.

Stratifikasi sampel berdasarkan durasi penyakit saat diagnosis pertama menunjukkan bahwa uji Widal

menunjukkan hasil negatif untuk sampel yang dikumpulkan selama beberapa hari pertama penyakit (Tabel 4).

Sensitivitas uji Widal meningkat dengan durasi penyakit menjadi 88,2% untuk sampel serum yang dikumpulkan

lebih dari sembilan hari setelah timbulnya penyakit. Kepekaan PCR sudah tinggi untuk sampel yang dikumpulkan

pada tahap awal.

TABEL 1

Perbandingan pengujian kultur darah, uji Widal, dan polimerase

reaksi berantai (PCR) dalam darah pada pasien yang diduga tifoid

Kelompok pasien/

jumlah kasus tipus

Hasil uji dan jumlah total (%)dengan

hasil positif dalam tes masing-masing Durasi rata-rata

penyakit(hari)Kultur darah PCR dalam darah Uji Widal

33 + + + 9

34 + + - 4

1 + - + 7

6 - + + 8,5

20 - + - 6

5 - - + 7

20 - - - 7

Total 119 68 (57,1) 93 (78,2) 45 (37,8) 7

Non

typhoid

4

8

-

-

-

-

+

-

6,5

7

Total 12 0 (0) 0(0) 4 (33,3) 7

TABEL 2

Hasil kumpulan reaksi berantai polimerase (PCR) pada spesimen klinis berbeda

sesuai dengan hasil kultur darah untuk pasien tipus dan non-tifusd

Kelompok pasien dan pengujian No.Positive (%, 95% dipercaya interval)/no.uji

Pasien dengan demam tifoid (n = 119)

PCR pada darah 93 (78,2, 71-86) / 119

PCR pada urin 61 (65,6, 51-71) / 93

PCR pada tinja 15 (39,5, 24-55) / 38

PCR pada feses dan / atau urin 70 (72,9%, 64-82) / 96

PCR lain 110 (95,7%, 91-99) / 115

Kultur dkonfirmasi (n = 68)

PCR pada darah 67 (98,5, 97-100) / 68

PCR pada urin 33 (61,1, 48-81) / 54

PCR pada feses 5 (23.8, 7-42) / 21

PCR pada feses dan / atau urin 38 (70,4, 58-83) / 54

PCR lain 68 (100, 93-100) / 68

Kultur negative (n = 51)

PCR pada darah 26 (51,0, 37-65) / 51

PCR pada urin 28 (71,8, 58-86) / 39

PCR pada feses 10 (58,8, 35-82) / 17

PCR pada feses dan / atau urin 32 (71,1, 56-84) / 45

PCR lain 42 (82,3, 72-93) / 51

Pasien Non-Tifus (n = 12)

PCR pada darah 0 (0, 0-30) / 12

PCR pada urin 0 (0, 0-30) / 12

PCR pada feses 0 (0, 0-30) / 12

TABEL 3

Sensitivitas berbagai metode laboratorium untuk pasien tipus yang dikonfirmasi

dengan kultur darah, polymerase chain reaction (PCR) pada darah, PCR pada feses, dan / atau PCR pada

urin

Pengujian No.positif (sensitifitas, 95% interval dipercaya), no.uji

Kultur 68 (61,8, 53-71) / 110

PCR pada darah 93 (84,5, 78-91) / 110

PCR pada tinja 15 (46,9, 30-64) / 32

PCR pada urin 61 (69,3, 60-79) / 88

Uji Widal (titer ≥ 1:320) 43 (39, 30-48) / 110

Uji Widal (titer ≥ 1:160) 57 (51,8, 42-61) / 110

DISKUSI

Demam tifoid merupakan masalah kesehatan masyarakat yang utama di banyak negara-negara

berkembang. Gejala dan tanda-tanda penyakit tidak spesifik dan uji laboratorium sangat penting untuk diagnosis.

Kultur memberikan bukti yang pasti tentang demam tipus. Dalam satu kelompok untuk 131 pasien, demam tipus

dikonfirmasi pada 68 pasien dengan kultur darah dan tambahan 51 pasien didiagnosis demam tifoid berdasarkan

tanda-tanda klinis dan gejala. Aplikasi kumpulan PCR memperkuat suatu segmen dari gen flagellin S. typhi dalam

darah seluruh sampel yang menunjukkan hasil positif untuk 67 (98,5%) kultur yang dikonfirmasi demam tipus

pada pasien, serta 26 (51%) kultur negatif pasien didiagnosa dengan demam tipus. Sensitifitas PCR tampaknya

lebih tinggi daripada sensitifitas kultur darah yang dilakukan pada sampel 5-mL darah. Hasil temuan PCR positif

untuk sampel darah dari pasien tifus kultur-negatif adalah konsisten dengan sebelumnya pengamatan, yang

menunjukkan bahwa nested PCR yang sama, seperti serta PCR lainnya untuk demam tipus, mungkin memiliki

kepekaan yang lebih tinggi dari darah culture.19-23 Prakash dan lain-lain menggunakan sama nested PCR tetapi

metode ekstraksi DNA yang berbeda dan melaporkan sensitivitas 29,8% untuk kultur darah dan 92,8% untuk

PCR.20 nested Den Haag dan lain-lain dilaporkan kepekaan sebesar 14,5% untuk kultur darah dan 58,2% untuk

PCR.19 bersarang. Pasien dengan demam selama 3-30 hari diuji dan itu menyarankan bahwa sensitivitas lebih

tinggi dibandingkan dengan PCR kultur darah adalah akibat dari penggunaan sebelumnya antibiotik dan

rata-rata sejarah penyakit yang relatif panjang yang akan memiliki dampak negatif pada tingkat pemulihan dalam

budaya. Dalam penelitian kami, sebagian besar pasien yang didiagnosis tifoid pada awal relatif tahap penyakit dan

dilaporkan telah demam selama kurang dari 10 hari. Sensitivitas dari PCR pada darah 84,5% dibandingkan dengan

61,8% untuk kultur darah dan tertinggi (95%) untuk sampel yang dikumpulkan selama lima hari pertama sakit.

Jumlah basil tifus dalam darah biasanya rendah dengan kira-kira setengah dari pasien yang kurang satu

colonyforming unit per mililiter blood.24 Khasiat kultur darah menurun dengan durasi penyakit, dan penggunaan

antibiotik sebelum pengumpulan darah sampel untuk budaya sangat mempengaruhi isolasi rate.25, 26 Antibiotik

tersedia dengan gratis di Indonesia dan banyak pasien mungkin telah mengambil antibiotik sebelum konsultasi. Ini

kemungkinan dan sampel darah yang relatif kecil yang digunakan untuk kultur bisa menjelaskan tingkat budaya

yang relatif rendah. Hanya

volume kecil darah dapat dikumpulkan dari setiap pasien karena pasien Indonesia enggan untuk menyumbangkan

darah. Pasien terinfeksi dengan S. typhi-MDR biasanya memiliki darah tinggi jumlah bakteri dan mungkin suatu

isolasi yang lebih tinggi rate.24 Namun-MDR S. typhi tidak dilaporkan dari Indonesia. Hasil penelitian kami

mengkonfirmasikan gagasan bahwa sebagian besar pasien tifus mengeluarkan patogen melalui air kencing mereka

dan atau tinja. Wain dan lain-lain melaporkan bahwa 14,3% dari kultur tinja dari pasien tifus yang positif untuk

pathogen.24 Kami Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase pasien yang mengeluarkan patogen bisa lebih

tinggi. Salmonella typhi DNA terdeteksi dalam air seni atau tinja 72,9% dari pasien yang didiagnosis dengan

demam tipus.

Dalam penelitian kami, sampel urin lebih (65,6%) dari sampel tinja (39,5%) adalah positif untuk

patogen. PCR pada sampel tinja mungkin telah kurang berhasil karena inhibitor hadir pada konsentrasi yang lebih

tinggi dalam tinja sampel dari dalam sampel urin atau karena inhibitor adalah lebih sulit untuk dihilangkan dari

kotoran. Pasien yang mengekskresikan bakteri berisiko tinggi untuk penyebaran penyakit ini. tindakan pencegahan

yang ketat sanitasi harus diambil untuk menghindari infeksi ketika kontak dengan pasien yang pulih dari disease.4

Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa Nested PCR dapat digunakan untuk mendeteksi DNA S. typhi dalam

urin atau

tinja dari pasien dengan demam tipus.

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menunjukkan bahwa deteksi DNA dalam urin dan bangku

mencerminkan kehadiran bakteri hidup. Sebuah sebelumnya penelitian menunjukkan adanya antigen S. typhi

dalam urin sampel dalam proporsi yang tinggi pasien tipus, yang mungkin konsisten dengan kehadiran bakteri

dalam kemih tract.27 Karena sejumlah besar patogen yang berbeda mungkin hadir dalam urin dan tinja pasien

tifoid dengan spesifisitas dari metode deteksi antigen dan DNA perlu pemeriksaan lebih lanjut, dan adanya

patogen layak di urin sampel dari pasien dengan demam tifoid harus dikonfirmasikan

oleh culture.28

Sebuah penelitian di Vietnam menunjukkan bahwa pengangkutan S. typhi dalam tinja terutama

ditemukan pada pasien tifoid dengan jumlah bakteri yang lebih tinggi di blood.24 Kami belum menentukan para

bakteri menghitung untuk pasien dalam kelompok penelitian kami. Menggunakan nested PCR, kami tidak

menemukan perbedaan persentase pasien budaya-budaya positif dan negatif buang air

patogen dalam urin dan atau kotoran. Kemungkinan besar, sebagian besar pasien negatif dalam budaya kita

Penelitian telah mengambil antibiotik sebelum konsultasi, yang mempengaruhi hasil kultur darah. budaya Darah

dan PCR pada darah menunjukkan hasil negatif dalam 25 pasien dengan diagnosis klinis demam tifoid.

The nested PCR dengan baik sampel urin dan atau sampel kotoran dikumpulkan dari 23 pasien ini

terdeteksi DNA patogen dalam 16 dari mereka. Darah budaya, PCR pada darah, PCR pada urin, dan PCR pada

kotoran mengkonfirmasi diagnosis tipus demam pada 115 pasien. Hal ini penting untuk menyebutkan bahwa

PCR baik pada urin maupun PCR pada feses menunjukkan positif hasil dalam sampel dari 12 pasien dengan

diagnosis demam tipus selain; semua pasien ini juga memiliki negatif PCR hasil pada darah. Hasil ini

menunjukkan bahwa selain dengan PCR pada darah, PCR bersarang pada kotoran dan atau urin berguna sebagai

tes pelengkap dalam diagnosis tipus demam, terutama bagi pasien yang diduga penyakit ini

dan yang memiliki hasil negatif dalam kultur darah.

Pengujian urin mungkin disukai karena koleksi urin lebih mudah untuk melakukan dan sensitivitas PCR

baik. PCR pada urin menunjukkan hasil positif untuk 13 urin sampel yang dikumpulkan dari pasien dengan hasil

negatif untuk darah di PCR. Jika PCR pada urin digunakan untuk melengkapi PCR pada darah, sensitivitas akan

meningkat dari 84,5% untuk PCR pada darah 96,4% untuk PCR gabungan. Yang sangat efisien GuSCN-silika

metode digunakan untuk memperoleh DNA dari sampel tinja dan urin. Penggunaan ini Metode ekstraksi bisa

bermanfaat karena efisien menghapus zat dari sampel yang dapat menghambat PCR. Analisis serologi dengan uji

Widal memberikan hasil cepat tetapi adalah nilai terbatas karena sensitivitas ini

test (titer 1:320?) berdasarkan hasil gabungan darah budaya dan PCR bersarang hanya 34%. Nilai ini lebih rendah

dari sensitivitas 47,5% dilaporkan untuk tes Widal

dalam penelitian kami sebelumnya, 29 dan lebih rendah dari sensitivitas 47%

melaporkan pada titer 1:400 dalam studi yang dilakukan di Vietnam.30

Sensitivitas rendah sebagian dijelaskan oleh relatif tinggi proporsi pasien yang diuji pada tahap awal penyakit

yang mungkin belum berkembang signifikan tingkat tertentu agglutinating antibodi. Sensitivitas uji Widal

meningkat dengan durasi penyakit dari 0% untuk sampel dikumpulkan kurang bahwa enam hari setelah terjadinya

penyakit 48,4% untuk sampel yang dikumpulkan antara 6 hari dan 9 hari dan 88,2% untuk sampel yang

dikumpulkan antara 9 hari dan 15 hari. Pengujian sampel serum pasangan meningkatkan kepekaan serologi

analisis melainkan dari nilai praktis kurang untuk pasien treatment.31 membutuhkan segera Selain itu, spesifisitas

uji Widal relatif rendah. Sebelumnya, kami telah melaporkan spesifisitas 84,4% untuk tes Widal (titer 1:320?)

untuk pasien dengan kecurigaan klinis demam tifoid di Sulawesi Selatan. 29 Dalam penelitian ini, 33,3% pasien

dengan diagnosis selain demam tifoid menunjukkan hasil positif dalam tes ini. Meskipun spesifisitas uji Widal

dapat relatif tinggi jika cut-off tinggi nilai dipilih, nilai ini menurun cukup jika cut-off yang lebih rendah nilai

digunakan karena latar belakang tingkat tinggi antibodi reaktif dalam populasi. 30 Darah budaya adalah relatif

tidak sensitif dan memakan waktu, dan sensitivitas dan spesifisitas analisa serologik dengan uji Widal terlalu

rendah untuk berguna dalam diagnosis. Sensitivitas budaya sumsum tulang dilaporkan lebih tinggi tetapi invasif

metode ini tidak selalu practicable.32, 33 A nested PCR bisa menjadi alternatif yang menarik. Namun, nested PCR

adalah

relatif rumit untuk melakukan dan tidak cocok untuk digunakan dalam rutin klinis praktek di laboratorium di

negara-negara dimana demam tifoid adalah endemik. Juga, di negara-negara di mana S. paratyphi adalah

penyebab umum dari demam enterik, metode ini akan tidak akan berguna. Studi ini menunjukkan bahwa ada

kebutuhan untuk perbaikan alat diagnostik untuk demam tifoid yang disesuaikan dengan

kebutuhan sarana sumber daya klinis miskin di diseaseendemic daerah. Diterima 10 Juli 2006. Diterima untuk

publikasi 27 September 2006.

Ucapan Terima Kasih: Kami berterima kasih Mr Romi Usman dan Mr Marwani untuk bantuan teknis. Kami juga

berterima kasih kepada staf di Departemen

Mikrobiologi Rumah Sakit Universitas Hasanuddin, Makassar, RSUD, dan Pusat Layanan Kesehatan Dasar di

Kabupaten Gowa, Sulawesi Selatan, Indonesia atas dukungan antusias dan berharga penelitian ini, dan Dr G.

Frankel untuk memberikan primer. Dukungan keuangan: Penelitian ini didukung oleh Uni Eropa

hibah tidak. IC18CT9980381. Penulis 'Alamat: Mochammad Hatta, Department of Medical Microbiology,

Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Kampus

Tamalanrea, Km 10, Makassar, Indonesia, Telepon dan Fax: 62 - 411-586-971, E-mail: hattaram@indosat.net.id.

Henk L. Smits, Departemen dari Biomedical Research, Koninklijk Instituut voor de Tropen Biomedical Research,

Royal Tropical Institute / Koninklijk Instituut voor de Tropen, Amsterdam, Belanda, Telepon: 31-20-566-5470,

Fax: 31-20-697-1841, E-mail: h.smits @ kit.nl.

DAFTAR PUSTAKA

1. Velema JP, van G Wijnen, P Bult, S Jota, 1997. Tifoid demam pada

Ujung Pandang, Indonesia kelompok risiko tinggi dan perilaku berisiko tinggi.

Daerah tropis Kesehatan Med Int 11: 1088-1094.

2. Birkhead GS, Morse Levine WC, JK Fudala, Kondracki SF,

Chang HG, M Shayegani, Novick L, PA Blake, 1993. Penyakit tipus

demam di sebuah hotel resor di New York: wabah besar dengan

kendaraan yang tidak biasa. Menginfeksi J Dis 167: 1228-1232.

3. Grunen E, M Flepp, Gabathuler U, 1997. Wabah tifus

demam di daerah non-endemik: perbandingan tiga molekul

metode mengetik. J Metode Microbiol 28: 179-185.

4. Luxemburger C, MC Chau, Mai NL, Wain J, TH Tran, Simpson

JA, Le HK, TT Nguyen, White NJ, Farrar JJ, 2001. Faktor risiko

untuk demam tifoid di delta Mekong, Vietnam selatan:

studi kasus-kontrol. Trans R Soc Med Hyg daerah tropis 95: 19-23.

5. Tran HH, G Bjune, BM Nguyen, JA Rottingen, Grais RF,

Guerin PJ, 2005. Faktor Risiko yang terkait dengan demam tipus di

Provinsi Son La, Vietnam utara. Trans R Soc Med ada gunanya

Hyg 99: 819-826.

6. Black RE, Cisneros L, Levine MM, 1985. Studi kasus-kontrol untuk

mengidentifikasi faktor-faktor risiko untuk demam tifoid pediatrik endemik di

Santiago, Chili. Bull World Health Organ 63: 899-904.

7. SP Luby, MK Faizan, Fisher-Hoch SP, Syed Mintz A, ED, Bhutta

ZA, McCormick JB, 1998. Faktor risiko untuk demam tifoid dalam

endemik pengaturan, Karachi, Pakistan. Epidemiol Infect 120: 129 -

138.

8. MH Gasem, Dolmans WM, Keuter MM, RR Djokomoeljanto,

2001. Miskin kebersihan makanan dan perumahan sebagai faktor risiko untuk tipus

demam di Semarang, Indonesia. Daerah tropis Kesehatan Med Int 6: 484-490.

9. Vollaard AM, S Ali, HA van Asten, S Widjaja, LG Visser, Surjadi

C, van JT Dissel, 2004. Faktor risiko untuk tifoid dan paratifoid

demam di Jakarta, Indonesia. JAMA 29: 2607-2615.

10. Hosoglu S, MK Celen, Geyik MF, S Akalin, C Ayaz, Acemoglu

H, M Loeb, 2006. Faktor risiko untuk demam tifoid antara orang dewasa

pasien di Diyarbakir, Turki. Infect Epidemiol 134: 612-616.

11. CW Lai, RC Chan, Cheng AF, Sung JY, Leung JW, 1992. Umum

saluran empedu batu: penyebab salmonellosis kronis. Am J

Gastroenterol 87: 1198-1199.

12. Dutta U, PK Garg, R Kumar, Tandon RK, 2000. Tifoid operator

antara pasien dengan batu empedu akan meningkatkan risiko untuk karsinoma

kandung empedu. Am J Gastroenterol 95: 784-787.

13. Zavala Trujillo Aku, C Quiroz, Gutierrez MA, Arias J, M Renteria,

1991. Fluoroquinolones dalam pengobatan demam tifoid dan

keadaan carrier. Eur Clin Microbiol Infect Dis J 10: 334-341.

14. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, CL Jansen, Wertheim-van Dillen

PM, van der Noordaa J, 1990. Cepat dan metode sederhana untuk

pemurnian asam nukleat. J Clin Microbiol 29: 496-503.

15. R Boom, C Sol, Weel J, K Lettinga, Gerrits Y, van Breda A,

Wertheim-van Dillen P, 2001. Deteksi dan kuantisasi dari

manusia sitomegalovirus DNA dalam tinja. J Virol Metode 84:

1-14.

16. Song JH, H Cho, Taman MY, Na DS, HB Moon, CH Pai, 1993.

Deteksi Salmonella typhi dalam darah pasien dengan

demam tipus oleh polymerase chain reaction. J Clin Microbiol

31: 1439-1443.

17. Cruickshank R, 1968. Mikrobiologi Kedokteran: Sebuah Panduan untuk

Laboratorium Diagnosis dan Pengendalian Infeksi, Edinburgh:

E & S Livingstone Ltd

18. Frankel G, SM Newton, Schoolnik GK, Stocker BA, 1989.

Unik urutan di wilayah VI gen flagellin dari

Salmonella typhi. Mol 13 Microbiol: 1379-1383.

19. Haque A, N Ahmed, Peerzada A, Raza A, S Bashir, Abbas G,

2001. Utility PCR dalam diagnosis kasus bermasalah dari tifus.

Menginfeksi Jap J Dis 54: 237-239.

20. Prakash P, OP Mishra, AK Singh, Gulati AK, G Nath, 2005.

Evaluasi nested PCR dalam diagnosis demam tifoid. J Clin

Microbiol 43: 431-432.

21. Messi MN, Shirakawa T, Gotoh A, Bishnu A, Hatta M, Kawabata

M, 2003. Cepat diagnosis demam tifoid dengan alat tes PCR

menggunakan sepasang primer dari gen flagellin Salmonella

typhi. J Infect Chemother 9: 233-237.

22. Kumar A, Arora V, Bashamboo A, S Ali, 2002. Deteksi

Salmonella typhi oleh polymerase chain reaction: implikasi dalam

diagnosis demam tifoid. Menginfeksi Evol 2 Genet: 107-110.

23. Chaudhry R, BV Laxmi, N Nisar, K Ray, Kumar D, 1997. Standardisasi

reaksi rantai polymerase untuk mendeteksi

Salmonella typhi pada demam tifoid. J Clin Pathol 50: 437-439.

24. Wain J, Diep TS, VA Ho, Walsh AM, TT Nguyen, Parry CM,

White NJ, 1998. Kuantisasi bakteri dalam darah tipus

demam pasien dan hubungan antara jumlah dan fitur klinis,

transmisibilitas, dan resistensi antibiotik. J Clin Microbiol

36: 1683-1687.

25. Coleman W, Buxton BH, 1907. The bakteriologi darah di

demam tipus: suatu analisis 1602 kasus. Am J Med Sci 133:

896-903.

26. Wain J, VB Pham, V Ha, NM Nguyen, Untuk SD, AL Walsh, Parry

CM, RP Hasserjian, VA Ho, Tran TH, Farrar J, White NJ,

Hari NP, 2001. Kuantisasi bakteri dalam sumsum tulang dari

pasien dengan demam tifoid: hubungan antara jumlah dan

klinis fitur. J Clin Microbiol 39: 1571-1576.

27. Chaicumpa W, Y Ruangkunaporn, Burr D, M Chongsa-Nguan,

Echeverria P, 1992. Diagnosis demam tifoid oleh deteksi

Salmonella typhi antigen dalam urin. J Clin Microbiol 30: 2513 -

2515.

28. Itah AY, EE Uweh, 2005. Bakteri diisolasi dari darah, tinja dan

urin pasien tifus di negara berkembang. Tenggara

Asian J Med Kesehatan Masyarakat daerah tropis 36: 673-677.

29. Hatta M, Goris MDA, Heerkens E, Smits HL, 2002. Simple dipstick

assay untuk mendeteksi imunoglobulin spesifik Salmonellla typhi

M antibodi dan evolusi kekebalan

respon pada pasien dengan demam tipus. Am J Med Hyg ada gunanya

66: 416-421.

30. Rumah D, Wain J, VA Ho, Diep TS, NT Chinh, PV Bay, Vinh H,

M Duc, Parry CM, G Dougan, White NJ, Hien TT, Farrar JJ,

2001. Serologi demam tifoid di suatu daerah endemisitas dan Anak

relevansi untuk diagnosis. J Clin Microbiol 39: 1002-1007.

31. Rumah D, Chinh NT, Diep TS, Parry CM, Wain J, G Dougan,

White NJ TT, Hien, Farrar JJ, 2005. Gunakan serum pasangan

sampel untuk serodiagnosis demam tipus. J Clin Microbiol 43:

4889-4890.

32. MH Gasem, Dolmans WM, BB Isbandrio, Wahyono H, Keuter

M, R Djokomoeljanto, 1995. Budaya Salmonella typhi dan

Salmonella paratyphi dari darah dan sumsum tulang pada dicurigai

demam tipus. Daerah tropis Geogr Med 47: 164-167.

33. Akoh JA, 1991. Relatif sensitivitas darah dan sumsum tulang

budaya di demam tipus. Daerah tropis Doct 21: 174-176.