desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit

DESAIN PRIMER SPESIFIK UNTUK DETEKSI DINIPENYAKIT VIBRIOSIS PADA UDANG PENAEID

Ince Ayu Khairana Kadriah*), Endang Susianingsih*), Sukenda**),Munti Yuhana**), dan Enang Harris**)

*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air PayauJl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan

E-mail: [email protected]

**) Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,Institut Pertanian Bogor

Jl. Rasamala, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680

(Naskah diterima: 13 Juli 2012; Disetujui publikasi: 28 Februari 2013)

ABSTRAK

Serangan Vibriosis, yang disebabkan oleh Vibrio harveyi berpendar pada budidayaudang telah menyebabkan penurunan yang signifikan dalam produksi, baik padapembenihan maupun di tambak pembesaran. Pengembangan metode deteksi cepatberbasis PCR (Polymerase Chain Reaction) sangat penting untuk mencegah penularanvibriosis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode cepat deteksivibriosis pada udang penaeid dengan menggunakan penanda molekuler yang spesifik.PCR berbasis deteksi gen spesifik dilakukan menggunakan primer spesifik toxR,haemolysin (vvh), dan gyrB. Dari 35 isolat, 22 isolat yang terdeteksi memiliki genspesifik toxR, haemolysin (vvh) dan gen gyrB dan 9 isolat terdeteksi memiliki dua gentertentu. Penanda molekuler spesifik telah dirancang menggunakan data urutan genpenyandi protein haemolysin dan gyrase. Desain pasangan primer yang didasarkanpada program perangkat lunak dari Primer3 dan secara manual menggunakan programperangkat lunak Bioedit. Tiga pasangan primer untuk gen haemolysin dan dua primergyrase telah diperoleh dan dipilih sebagai primer.

KATA KUNCI: vibriosis, udang penaeid, PCR, deteksi cepat, penandamolekuler spesifik

ABSTRACT: Specific primer design for rapid detection of Vibriosis onpenaeid shrimp. By: Ince Ayu Khairana Kadriah, EndangSusianingsih, Sukenda, Munti Yuhana, and Enang Harris

Vibriosis occurrences, due to luminous Vibrio harveyi, on shrimp culture maycaused substantial declines in production, either in hatcheries or in grow out ponds.Development of Polymerase Chain Reaction (PCR)-based rapid detection methods isvery crucial in preventing vibriosis outbreaks. The aims of this study was to developrapid methods of detection of the vibriosis in penaeid shrimp by using specificmolecular markers. PCR-based detection of specific genes were performed employingspecific primers of toxR, haemolysin (vvh) and gyrB. Out of the 35 isolates, 22 isolateswere detected to have toxR, haemolysin (vvh) and gyrB specific genes and 9 isolateshave two out of these specific genes. Specific markers have been designed usingsequence data of the genes encoding the haemolysin protein and gyrase. Primerpairs design were based on the software program of Primer3 and manually aligned

Desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

131

by using Bioedit software program. Three of primer pairs for haemolysin gene andtwo of gyrase primers were obtained and selected as primer.

KEYWORDS: vibriosis, penaeid shrimp, PCR, rapid detection, specificmolecular marker

PENDAHULUAN

Kementerian Kelautan dan Perikanan masihmenempatkan udang sebagai komoditasunggulan perikanan budidaya selama 2010-2014. Selama periode 2010-2014 produksiudang diharapkan meningkat 74,75% ataudari 400 ribu ton menjadi 699 ribu ton yangterdiri atas udang vaname dan udang windu.Industri budidaya udang windu secara inten-sif dan transportasi udang windu ke seluruhdunia melalui perdagangan diketahui ber-hubungan erat dengan meningkatnya kejadianinfeksi penyakit yang menyerang udangwindu selama dua dekade ini (Saulnier et al.,2000). Bakteri vibrio berpendar adalah salahsatu penyebab penyakit yang cukup banyakmenyerang hewan budidaya seperti udang(Baticados et al., 1990; Karunasagar et al.,1994; Moriarty, 1998; Zhang & Austin, 2000),beberapa spesies ikan dan kekerangan (Aus-tin & Zhang, 2006) bahkan juga karang (Ben-Haim et al., 2003) di seluruh dunia.

Pengembangan metode deteksi cepat,tepat, akurat dan murah sangat bermanfaatkarena dapat digunakan dalam upaya pen-cegahan penyakit vibriosis di lapangan baikdi panti benih maupun pada pembesaranudang di tambak. Upaya pencegahan ini harusdilakukan sebelum koloni bakteri mencapaiquorum. Penelitian yang dilakukan olehDefoirdt (2007) menyimpulkan bahwa ke-mampuan bakteri vibrio untuk melakukanquorum sensing sangat dipengaruhi olehpopulasi bakteri tersebut di alam. Upaya untukdeteksi cepat secara molekular salah satu-nya dengan mengisolasi gen spesifik yangdimiliki oleh bakteri vibrio berpendar dandigunakan sebagai penanda molekular dalamdiagnosis cepat untuk penyakit vibriosis ber-pendar (kunang-kunang) pada budidaya udang.

Gen haemolysin diketahui merupakan genspesifik yang dimiliki bakteri Vibrio berpendar.Gen haemolysin adalah gen yang bertang-gung jawab pada penghancuran membran seldarah atau proses hemolisis. Gen yang meng-kode haemolysin ini dilaporkan ditemukanpada beberapa spesies bakteri di antaranya

adalah V. harveyi (Nishibuchi et al., 1990;Nishibuchi & Kaper, 1995; Zhang et al., 2001)dan V. parahaemolyticus (Bej et al., 1999).

Selain gen haemolysin gen toxR yangsecara spesifik mengkode protein trans-membran juga memegang peranan pentingpada regulasi gen toksin ctx dan beberapagen-gen toksin lainnya. Gen toxR akan meng-aktifkan gen-gen lainnya untuk menghasilkantoksin (Pang et al., 2006). Gen gyrB diketahuiberperan untuk mengkode protein subunit Bdari DNA gyrase (topoisomerase type II). DNAgyrase mengatur superkoiling pita ganda DNA.Gen gyrB sangat diperlukan untuk replikasiDNA di mana gen ini berperan dalam pem-bentukan protein yang mengkode enzimgyrase.

Pendekatan yang memanfaatkan kemajuanbioinformatika dan teknik PCR dapat diguna-kan untuk mengembangkan penanda spesifiktersebut. Metode PCR digunakan untuk meng-amplifikasi sekuen spesifik dari rantai DNA.Primer rantai pendek oligonukleotida yangdidesain akan berkomplemen dengan masing-masing ujung dari daerah target pada rantaiDNA dan kemudian memperpanjangnya padasisi yang berlawanan dari DNA template.Karena fungsi primer sebagai inisiator seka-ligus pembatas daerah yang akan diamplifi-kasi, maka idealnya primer memiliki urutanbasa nukleotida yang tepat berpasangandengan urutan basa DNA target yang akandiamplifikasi, dan tidak menempel di bagianlainnya. Desain primer yang bagus merupakanhal esensial bagi keberhasilan reaksi PCR.

Untuk mendesain suatu primer memer-lukan data-data sekuen gen yang menyandi-kan protein sejenis dengan gen yang akandiamplifikasi melalui PCR. Data-data sekuengen dapat diperoleh pada basis data gen darilembaga-lembaga penyedia informasi gen danprotein atau hasil sekuen gen tertentu yangbersifat spesifik yang telah dihasilkan. Prosesamplifikasi dari gen-gen yang mengkode sifat-sifat tertentu utamanya sifat patogen dapatmenjadi suatu pendekatan baru dalam metodedeteksi cepat penyakit (Cunningham, 2002).

132

J. Ris. Akuakultur Vol. 8 No. 1 Tahun 2013: 131-143

BAHAN DAN METODE

Penelitian dilakukan di Laboratorium Ke-sehatan Ikan dan Lingkungan Balai Penelitiandan Pengembangan Perikanan Budidaya AirPayau, Maros. Analisis sekuensing dilaksana-kan di Laboratorium Bioteknologi UNIKAAtmajaya, Jakarta dan Laboratorium 1st BaseSingapura. Tahapan Penelitian terdiri atas:

Isolasi Bakteri Vibrio Patogen dariPanti Benih dan Tambak Udang Windu

Sampel bakteri dan udang windu diko-leksi dari tambak percobaan Balai Penelitiandan Pengembangan Budidaya Air Payau,Maros di Maranak dan Takalar serta tambak-tambak udang windu di Barru, Pangkep,Pinrang, Banyuwangi, dan Bali. Bakteri diiso-lasi dari air tambak, sedimen tambak, danudang sakit. Sampel air diambil dengan meng-gunakan botol steril kemudian dibawa kelaboratorium. Sedangkan sampel sedimendiambil menggunakan sudip steril dan di-bawa ke laboratorium menggunakan botolsteril. Isolasi bakteri dilakukan dengan caramengambil 1 mL air sampel dan 1 g sedimentambak kemudian diencerkan secara ber-tingkat dalam larutan fisiologis (Benson, 1985)dan dikultur pada media TCBSA (ThiosulfateCitrate Bile Sucrose Agar). Bakteri juga diisolasidari hepatopankreas udang windu.

Deteksi Gen Spesifik pada BakteriVibrio Berpendar

Pada penelitian ini digunakan primerspesifik untuk mendeteksi gen-gen spesifiktoxR gene, haemolysin (vvh) gene dan GyrBgene dengan metode PCR (Tabel 1). Primer-primer ini digunakan untuk mendeteksi gen-gen spesifik pada isolat bakteri yang diisolasidari tambak dan panti benih di berbagai daerahdi Sulawesi Selatan dan Jawa.

Isolasi Genom Bakteri Kandidat

Metode yang digunakan dalam isolasigenom bakteri adalah metode phenol-chloro-form yang dikembangkan oleh Parenrengi(2000). Bakteri dikultur di dalam nutrient brothselama empat jam kemudian dipanen dengancara sentrifugasi. Sebanyak 1 mL biakan bakteridipindahkan ke dalam tabung eppendorf steril1,5 mL dan disentrifugasi (6.000 rpm; 10 menit).Proses sentrifugasi diulang sebanyak dua kalidan kemudian dilakukan pencucian denganlarutan fisiologis juga dengan sentrifugasi.

Pelet bakteri yang dihasilkan kurang lebih50 mg kemudian dicampur dengan 500 μLlysis buffer, 20 μL proteinase-K (stok 20 mg/mL), dan 40 μL sodium dodecyl sulfate (SDS)10%. Setelah itu, lisat bakteri diinkubasi dalamwaterbath selama 1-3 jam pada suhu 55oC.Penambahan 12,5 μL RNAse dilakukan sebe-lum lisat disimpan pada suhu ruang selama 15-30 menit. Selanjutnya ditambahkan Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (PCIA 25:24:1)sebanyak 500 μL. Tabung eppendorf di-homogenkan dengan menggunakan minimixer secara perlahan sampai homogen dandisimpan pada suhu ruang selama 10 menit.Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan13.000 rpm selama delapan menit. Lapisanpaling atas diambil dan dipindahkan ke tabungeppendorf baru dan dilakukan penambahanPCIA seperti sebelumnya.

Setelah lapisan paling atas dipindahkan ketabung eppendorf baru, kemudian dilakukanpenambahan satu bagian larutan Chloroform:Isoamyl alcohol (CIA 24: 1) dan disentrifugasiselama empat menit dengan kecepatan 13.000rpm. Lapisan paling atas dipindahkan ke tabungeppendorf baru. Kemudian ditambahkan duabagian ethanol absolut dingin dan dicampurperlahan sampai homogen selanjutnya di-lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 6.000rpm selama 30 menit. Cairan dibuang kemudianpelet DNA dicuci dengan 1 mL ethanol 70%kemudian disentrifugasi dengan kecepatan6.000 rpm selama 15 menit. Pellet DNA di-keringkan selama satu malam dan setelahkering ditambahkan 100 μL Buffer Tris-Etilendiamin Tetra Acetic Acid (EDTA) (TE) danselanjutnya disimpan pada suhu -20oC sampaidigunakan (Parenrengi, 2000).

Proses PCR

Deteksi gen spesifik dilakukan denganmelakukan amplifikasi DNA menggunakanteknik Polymerase Chain Reaction (PCR).Proses PCR dilakukan menggunakan Kit PCRReady To Go (RTG) dengan primer spesifikkomersil yang sudah ada dan dilakukanoptimasi pada beberapa tingkatan suhu an-nealing.

Proses ampifikasi DNA untuk primer toxRadalah sebagai berikut: larutan master mixdibuat dengan mencampur 20 μL aquadestmilliQ ke dalam 1 tube RTG (GE Healthcare UKLimited Little Chalfont Buckinghamshire, UK),kemudian ditambahkan masing-masing 1 μLPrimer toxRR1 dan toxRF1 (Pang et al., 2006).


133

Tab

el 1

.Pr

imer

spes

ifik

yan

g d

igunak

an u

ntu

k m

endet

eksi

keb

erad

aan g

en s

pes

ifik

Tab

le 1

.Sp

ecif

ic p

rim

ers

wer

e use

d t

o det

ect

the

pre

sence

of

spec

ific

gen

es

Sum

ber

(So

urc

e):

Can

o-G

om

ez e

t al. (

20

09

)

Ge

nPr

od

uk

gen

Na

ma

pri

mer

Se

ku

en

pri

me

r (5

' - 3

')Pa

nja

ng

Refe

ren

siG

enes

Gen

es p

rod

uct

Pri

mer

na

me

Pri

mer

sec

uen

ce (

5' - 3')

Len

gth

(b

p)

Ref

eren

ce

Su

b u

nit

B d

ari D

NA

gy

rase

A2

TC

TA

AC

TAT

CC

AC

CG

CG

G

Sub u

nit

B f

rom

gyra

se D

NA

B3

AG

CAA

TG

CC

ATC

TT

CA

CG

TT

C

tox

RF1

GA

AG

CA

GC

AC

TC

AC

CG

AT

tox

RR

1G

GT

GAA

GA

CT

CAT

CA

GC

A

VH

F1A

TC

AT

GA

AT

AA

AA

CT

ATT

AC

GT

TA

CT

VH

R1

GA

AA

GG

AT

GG

TT

TG

AC

AA

T

Vh

hem

oR

GC

TTG

AT

AAC

AC

TT

TG

CG

GT

308

Co

neje

ro &

He

dre

yd

a (2

004

)

gyrB

363

Th

aith

on

gn

um

et

al.

(20

06)

Re

gu

lato

r u

ntu

k tr

ansk

rip

tor

tran

smem

bra

ne (R

egul

ato

r fo

r tr

an

scri

pto

r tr

an

smem

bra

ne

)

vvh

Pro

tein

haem

oly

sin

Ha

emol

ysi

n p

rote

in1,2

57

Zh

ang

et

al.

(20

01

)

tox R

382

Pan

g e

t a

l. (2

006

)

134


Setelah larutan dihomogenkan selanjutnyadimasukkan template DNA sebanyak 3 μL. Kon-disi proses amplifikasi untuk primer spesifiktoxR diatur sebanyak 30 siklus pada suhudenaturasi 94oC selama satu menit, annealing57oC selama satu menit dan elongasi 72oCselama satu menit serta tahap ekstra elongasi72oC selama sepuluh menit pada mesin PCR(Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler).Proses amplifikasi DNA untuk primer spesifikvvh gen (haemolysin) diatur sebanyak 30 sikluspada suhu denaturasi 94oC selama satu menit,annealing 53oC selama satu menit danelongasi 72oC selama satu menit (Conejero &Hedreyda, 2004). Sedangkan untuk amplifikasigen gyrB proses PCR juga diatur sebanyak 30siklus dengan suhu denaturasi 94oC selamasatu menit, annealing 60oC selama satu menitdan elongasi 72oC selama dua menit sertatahap ekstra elongasi 72oC selama tujuh menit(Thaithongnum et al., 2006).

Elektroforesis

Hasil PCR kemudian diaplikasikan padagel agarosa 2% untuk diobservasi dan di-dokumentasikan. Elektroforesis minigel hanyaoptimum untuk pemisahan DNA berukurankecil (ratusan bp hingga sekitar 10 kb). Proseselektroforesis menggunakan minigel yangdialiri listrik dengan voltase 150 V dan kuatampere 70 waktu running selama 30 menit.Larutan yang digunakan adalah buffer elek-troforesis yang diperlukan untuk menciptakankondisi stabil selama proses berlangsung. Padaumumnya buffer yang digunakan berupa TrisAceticacid EDTA (TAE) atau Tris Boric EDTA (TBE).Untuk pewarna gel digunakan red gel sebagaipengganti etidhium bromide yang sudah tidakdianjurkan lagi karena bersifat karsinogenik.

Desain Primer Spesifik

Gen-gen spesifik yang sudah berhasildiamplifikasi dengan primer terpublikasikemudian dianalisis urutan basa DNA-nyadengan metode sekuensing. Hasil sekuensingini menjadi rujukan untuk mendesain primerspesifik. Setelah hasil sekuensing sudah di-peroleh selanjutnya adalah mengumpulkansekuen gen target sebagai referensi. Sekuenreferensi dapat diperoleh dari databaseGenBank di situs NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sekuen referensi akan digunakandalam uji BLAST (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast) untuk mengetahui kemiripansekuen gen yang dimiliki dengan sekuen dari

gen sejenis yang sudah terdeposit pada NCBI.Urutan basa dari gen target dalam formatnotepad dapat langsung diunduh setelahlaman NCBI/BLAST/blastn suite terbuka.Tahapan selanjutnya adalah menentukanperangkat lunak yang akan digunakan untukdesain primer. Pada dasarnya sembarangdaerah tertentu pada sekuen referensi dapatdiambil untuk dijadikan primer, tanpa perlubantuan perangkat lunak khusus. Namun padapenelitian ini digunakan bantuan perangkatlunak Primer3 Plus (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3). Setelah software sudahberhasil diunduh, maka proses desain primersudah dapat dimulai.

HASIL DAN BAHASAN

Hasil Deteksi Gen-Gen Spesifik padaVibrio Berpendar

Dari 35 isolat yang diisolasi dari berbagaidaerah, 22 isolat terdeteksi memiliki genspesifik, di mana sembilan di antaranya terde-teksi memiliki dua gen spesifik (Tabel 2). Isolatbakteri yang memiliki gen spesifik ini kemudiandiuji virulensinya dengan uji patogenisitassecara invivo menggunakan hewan uji udangwindu. Isolat kode 1, 120, 170, dan 275 ter-bukti memiliki tingkat patogenisitas lebihtinggi dibandingkan isolat bakteri vibrioberpendar lainnya (Tabel 2). Isolat yangmemiliki tingkat patogenisitas tinggi kemudiandipilih untuk dikarakterisasi gen spesifikhaemolysin dan gyrase-nya dengan prosessekuensing. Untuk gen spesifik ToxR tidakdapat disekuensing disebabkan hasil PCRyang divisualisasikan pada gel elektroforesismenunjukkan adanya penempelan yang tidakspesifik dari primer (unspecific annealing)sehingga tidak terbentuk pita tunggal DNA.

Haemolysin adalah eksotoksin yang ber-tanggung jawab dalam proses penyerapanmembran eritrosit atau proses hemolisis seldarah. Gen yang mengkode haemolysin inidilaporkan ditemukan pada beberapa spesiesbakteri yang termasuk genus vibrio (Conejero& Hedreyda, 2004). Bakteri vibrio patogenyang memiliki gen haemolysin diketahui dapatmenyebabkan terjadinya lysis pada sel darahinang.

Enzim gyrase terdistribusi hampir padasemua spesies dalam genus vibrio. Enzim iniyang mengurangi tekanan saat double-stranded DNA sedang tidak terikat oleh ikatanhelikase hal ini menyebabkan terjadinya


135

superkoiling DNA. Banyak antibiotik bekerjadengan menyerang gyrase. Gyrase DNAbakteri hadir di prokariota dan beberapaeukariota, tetapi enzim ini tidak sepenuhnyamirip dalam struktur atau urutan, dan memi-liki kedekatan yang berbeda untuk setiapmolekul yang berbeda. Enzim ini tidak dite-mukan pada manusia. Hal ini membuat gyrasesebagai target yang baik untuk antibiotik.Bakteri patogen memiliki struktur gen Gyr-Byang spesifik dibandingkan bakteri lainnya(Thaithongnum et al., 2006).

Hasil Sekuensing Gen-Gen SpesifikVibrio Berpendar

Hasil sekuensing gen haemolysin daribakteri hasil koleksi menunjukkan kemiripan94% dengan gen haemolysin bakteri V. harveyiyang terdeposit pada NCBI (Gambar 1).

Sedangkan hasil sekuensing gen gyrasememiliki kemiripan 99% dengan gen gyrasebakteri V. harveyi (Gambar 3). Kemiripan gentarget yang diisolasi dibandingkan denganbeberapa sekuen referensi menentukanberhasil tidaknya isolasi gen spesifik. Jumlahsekuen referensi yang diperlukan tergantungdari sampel target. Semakin banyak referensisekuen gen yang kita peroleh akan lebih baikagar kita dapat mendesain primer di daerahyang benar-benar sama (conserved region)setelah sekuen tersebut disejajarkan (align-ment). Pada dasarnya satu data sekuen sudahdapat dijadikan referensi dengan syarat bahwasampel target nantinya memiliki kesamaanspesies atau dengan kata lain secara genetiksangat mirip. Hasil sekuensing selanjutnyadigunakan untuk mendesain primer spesifikbakteri Vibrio patogen.

136


Tabel 2. Hasil deteksi gen-gen spesifik bakteri vibrio berpendar

Table 2. The results of the detection of specific genes luminous Vibrio

tox-R haemo gyr-B

1 Banyuwangi

2 Bali

3 Bali

5582 Maros

5584 Maros

5585 Maros

109 Maros

120 Maros

128 Maros

133 Maros

137 Maros

139 Maros

154 Maros

159 Maros

671 Maros

672 Maros

673 Maros

676 Maros

168 Takalar

170 Takalar

275 Pinrang

276 Pinrang

Kode isolat uji Code of isolates

Asal Origin

Gen-gen spesifik (Specific genes )

Sekuen gen haemolysin

>1st_BASE_399953_1hem_VhF1

GTAGTGCTATACTACATTAATCTTGCTCCGCAGCCGACTCATCAGAGCCTTCTTACCTGCTAAATGCCTCAGAAGTGAGAAGCGCACAACAAAAGCAAACATACACCTACGTACGATGCTGGTATCGAACTAGTTATTCACATGATGACCCAGAAACCGACTGGGAGTGGGCAGAAAATCCAGATGGCAGTTATTTCACTATCGAAGGCTATTGGTGGAACGCACTCTCGTTTAAAAACATGTTCTATACCAATACACCGCAAAGTGTTATCAAGCAAAANCCCATTNAG

Gambar 1. Hasil sekuensing dan alignment gen haemolysin

Figure 1. Result of sequencing and alignment of haemolysin gene


137

Gam

bar 2

.El

ektr

ofo

regra

m h

asil

seku

ensi

ng u

ntu

k gen

haem

olys

in

Figu

re 2

.El

ectr

ofor

egra

m o

f h

aem

olys

in g

ene

sequen

cing r

esult

138


Gambar 3. Hasil sekuensing dan alignment gen gyrase

Figure 3. Gyrase gene sequencing and alignment result

Sekuen gen gyrase

>1st_BASE_399959_120_gyr_A2

NGGCCTTATAGCAAACTTACCATCACGGTGAGCCTCAAGCGCCACTAGCAGTAATTGGTGATACTGACCAAACGGGTACACAGATCCGCTTCTGGCCAAGCGCTGAAACCTTCACAAATATCGAATTCCATTACGATATCCTAGCAAAACGTCTACGTGAGCTTTCTTTCCTAAACTCAGGTGTTTCTATCAAGCTGGTTGATGAGCGTGAAGCAGACAAGAGTGACCACTTCATGTTTGAAGGTGGTATTCAAGCGTTCGTTGAGCACCTAAACACCAACAAAACACCGATCATTGAGAAAATCTTCCACTTCTATTTTGAACGTGAAGATGGCATTGCTATAAAATA


139

Gam

bar 4

.El

ektr

ofo

regra

m h

asil

seku

ensi

ng u

ntu

k gen

gyr

ase

Figu

re 4

.El

ectr

ofor

egra

m o

f gyr

ase

gen

e se

quen

cing r

esult

140


Desain Primer Spesifik

Desain primer spesifik dilakukan denganbantuan perangkat lunak Primer3Plus denganmenggunakan hasil sekuen gen spesifikhaemolysin dan gyrase (Gambar 5). Penseja-jaran secara manual dilakukan untuk mem-bandingkan sekuen gen dari bakteri hasilkoleksi dengan sekuen gen sejenis yangterdeposit pada NCBI (Gambar 6). Pada dasar-nya sembarang daerah tertentu pada sekuenreferensi dapat diambil untuk dijadikan primer,tanpa perlu bantuan software khusus. Namuncara ini amat berisiko karena kita tidakmengetahui bagaimana kualitas primer yangdihasilkan nantinya.

Hasil desain diperoleh tiga pasang primeruntuk deteksi gen haemolysin dan dua pasangprimer untuk gen gyrase (Tabel 3). Pada setiaphasil desain primer yang dikeluarkan olehperangkat lunak Primer3 selalu terdapatpasangan primer forward dan reverse yangdirekomendasikan serta pilihan pasanganprimer lain sebagai cadangan.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini bagian dari riset ManajemenKesehatan Ikan dan Lingkungan Balai Pene-litian dan Pengembangan Budidaya Air Payaudan dibiayai oleh APBN Kementerian Kelautandan Perikanan tahun anggaran 2010-2011.

Gambar 5. Proses desain primer menggunakan perangkat lunak Primer3Plus

Figure 5. Primer design process using software Primer3Plus


141

DAFTAR ACUAN

Austin, B. & Zhang, X.-H. 2006. Vibrio harveyi: asignificant pathogen of marine vertebratesand invertebrates. Lett. Appl. Microbiol., 43:119-124.

Baticados, M.C.L., Lavilla-Pitogo, C.R., Cruz-Lacierda, E.R., de la Pena, L.D., & Sunaz,N.A. 1990. Studies on the chemical con-trol of luminous bacteria Vibrio harveyi

and V. splendidus isolated from diseasedPenaeus monodon larvae and rearing wa-ter. Diseases of Aquatic Organism., 9: 133-139.

Bej, A.K., Patterson, D.P., Brasher, C.W., Vickery,M.C., Jones, D.D., & Kaysner, C.A. 1999.Detection of total and haemolysin-produc-ing Vibrio parahaemolyticus in shellfishusing multiplex PCR amplification of tl, tdhand trh. J. Microbiol. Methods, 36: 215-225.

Tabel 3. Hasil desain primer spesifik

Table 3. The result of specific primer design

Nama oligo Sekuen (5’ - 3’ ) PanjangOligo name Secuence (5’ - 3’ ) Length (bp)

IAVhF1 CAAAAGTGAAAAGCGCACAA 20

IAVhF2 TGAAAAGCGCACAACAAAAG 20

IAVhF3 GAAGTGAGAAGCGCACAACA 20

IAVhR1 TTCCACCAATAGCCTTCGAT 20

IAVhR2 TTAAACGAGAGTGCGTTCCA 20

IAVhR3 AACACTTTGCGGTGTATTGG 20

IAGyrF1 TGACCAAACGGGTACACAGA 20

IAGyrF2 CCAAACGGGTACACAGATCC 20

IAGyrR1 CAACGAACGCTTGAATACCA 20

IAGyrR2 CGAACGCTTGAATACCACCT 20

Gambar 6. Proses pensejajaran hasil sekuen secara manual menggunakan perangkat lunak Bioedit

Figure 6. The process sequence alignment results manually using software Bioedit

142


Ben_Haim, Y., Thompson, F. L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J., &Rosenberg, E. 2003. Vibrio coralliilyticus sp.nov., a temperature-dependent pathogenof the coral Pocillopora damicornis. Int. J.Syst. Evol. Microbiol., 53: 309-315.

Benson, H.J. 1985. Microbiological Applica-tions: A. Laboratory Manual in GeneralMicrobiology. Fourth Edition. Wm. C. BrownPublishers. Dubuque, Iowa, 450 pp.

Cano-Gomez, A., Bourne, D.G., Hall, M.R., Owens,L. & Hoj, L. 2009. Molecular identification,typing and tracking of Vibrio harveyi inaquaculture systems: Current methods andfuture prospects. Aquaculture, 287: 1-10.

Conejero, M.J.U. & Hedreyda, C.T. 2004. PCRdetection of haemolysin (vhh) gene inVibrio harveyi. J. Gen. Appl. Microbiol., 50:137-142.

Cunningham, C.O. 2002. Molecular diagnosisof fish and shellfish diseases: present sta-tus and potential use in disease control.Aquaculture, 206: 19-55.

Defoirdt, T. 2007. Quorum sensing disruptionand the use of short-chain fatty acids andpolyhydroxyalkanoates to control lumines-cent Vibriosis. PhD thesis, Ghent Univer-sity, Belgium, 228 pp.

Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R., &Karunasagar, I. 1994. Mass mortality ofPenaeus monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquacul-ture, 128: 203-209.

Moriarty, D.J.W. 1998. Control of luminousVibrio species in penaeid aquacultureponds. Aquaculture, 168: 351-358.

Nishibuchi, M., Khaeomanee-iam, V., Honda, T.,Kaper, J.B., & Miwatani, T. 1990. Compara-

tive analysis of the haemolysin genes ofVibrio cholerae non-O1, Vibrio mimicus, andVibrio hollisae that are similar to the tdhgene of Vibrio parahaemolyticus. FEMSMicrobiol. Lett., 67: 251-256.

Nishibuchi, M. & Kaper, J. 1995. Thermostabledirect haemolysin gene of Vibrio para-haemolyticus: A virulence gene acquiredby a marine bacterium. Infect. Immun., 63:2,093-2,099.

Pang, L., Zhang, X.H., Zhong, Y., Chen, J., Li, Y.,& Austin, B. 2006. Identification of Vibrioharveyi using PCR amplification of the toxRgene. Lett. Appl. Microbiol., 43: 249-255.

Parenrengi, A. 2000. Studies on genetic vari-ability of groupers (Genus: Epinephelus)from Indo-Malaysian waters using PCR-RAPD Analysis. Thesis master of Science,Kolej University Terengganu, UniversitiPutra Malaysia, 174 pp.

Saulnier, D., Haffner, P., Goarant, C., Levy, P., &Ansquer, D. 2000. Experimental infectionmodels for shrimp Vibriosis studies: a re-view. Aquaculture, 191: 133-144.

Thaithongnum, S., Ratanama, R., Weeradechapol,K., Sukhoom, A., & Vuddhakul, V. 2006. De-tection of Vibrio harveyi in shrimp post-lavae and hatchery tank water by the mostprobable number technique with PCR.Aquaculture, 261: 1-9.

Zhang, X.H. & Austin, B. 2000. Pathogenicity ofVibrio harveyi to salmonids. J. Fish Dis., 23:93-102.

Zhang, X.H., Meaden, P.G., & Austin, B. 2001.Duplication of haemolysin genes in a viru-lent isolate of Vibrio harveyi. Appl. Environ.Microbiol., 67: 3,161-3,167.


143

desain primer spesifik untuk deteksi dini penyakit

Documents