TUGAS ANALISIS KLINIK LANJUT

ANALISIS KADAR KALSIUM DALAM SAMPEL URIN YANG DIGANGGU OLEH MAGNESIUM MENGGUNAKAN

METODE KOLORIMETRI

Oleh:

Evi Kurniawati051414153005

PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASIFAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA2015

1

DAFTAR ISI

Hal.

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ 1

DAFTAR ISI ........................................................................................................ 2

ISI MAKALAH .................................................................................................... 3

1. Pendahuluan.................................................................................................... 3

2. Urin ................................................................................................................. 3

2.1. Definisi dan Sifat Urin............................................................................. 3

2.2. Kandungan Urin....................................................................................... 4

3. Kalsium ........................................................................................................... 4

3.1. Definisi..................................................................................................... 4

3.2. Nilai Normal Kalsium Urin .................................................................... 5

4. Penentuan Kadar Kalsium dalam Urin............................................................ 5

5. Kolorimetri O-CPC ........................................................................................ 5

5.1. Spektrofotometri Visible.......................................................................... 7

5.2. Bahan dan Alat......................................................................................... 7

5.3. Tahapan Penelitian................................................................................... 7

5.3.1 Pengambilan Sampel...................................................................... 75.3.2 Pembuatan Larutan Kerja.............................................................. 85.3.3 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum.................................. 85.3.4 Penentuan Waktu Operasional....................................................... 85.3.5 Pembuatan Kurva Baku................................................................. 85.3.6 Analisis Sampel............................................................................. 9

5.4. Senyawa Pengganggu.............................................................................. 9

5.5. Pembahasan.............................................................................................. 9

6. Penutup ...........................................................................................................10

DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................12

2

ANALISIS KADAR KALSIUM DALAM SAMPEL URIN YANG DIGANGGU OLEH MAGNESIUM MENGGUNAKAN METODE

KOLORIMETRI

1. Pendahuluan

Pemeriksaan air kemih atau urin sebagai salah satu cara untuk

membantu menetapkan diagnosis berbagai penyakit telah dilakukan selama

berabad-abad oleh praktisi kesehatan. Beberapa metode pemeriksaan yang

hingga kini masih dijalankan tergolong cara yang tradisional, seperti misalnya

mengamati penampakan dan bau contoh urin dan juga pemeriksaan

mikroskop terhadap endapan di dalamnya. Sedangkan yang relatif baru ialah

penggunaan batang/kertas celup (dipstick/test strip) untuk menandai atau

mengukur (semikuantitatif) beberapa golongan senyawa dan juga dalam

mengukur osmolalitas urin sebagai petunjuk atas konsentrasi zat linarut total.

Meskipun tidak 'kuantitatif, pemeriksaan visual dan mikroskop tidak boleh

diabaikan karena dapat mengandung informasi klinis yang berguna untuk

diagnosis penyakit.

Urinalisis rutin biasanya terdiri atas pemeriksaan air kemih di pagi hari

(bangun tidur) terhadap warna, bau, berat jenis, atau osmolalitas: dapat juga

dilakukan berbagai uji kualitatif atau pun semikuantitatif untuk pH, protein,

glukosa atau gula pereduksi, badan-badan keton, darah dan mungkin juga

biltrubin. Urobilinogen, dan nitrit; dan pemeriksaan mikroskop terhadap

endapan di dalam urin.

2. Urin

2.1. Definisi dan Sifat Urin

Urin atau air seni atau air kencing adalah cairan sisa yang diekskresikan

oleh ginjal yang kemudian akan dikeluarkan dari dalam tubuh melalui

proses urinasi. Urin disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter menuju

kandung kemih, akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Cairan dan

materi pembentuk urin berasal dari darah atau cairan interstisial.

Komposisi urin berubah sepanjang proses reabsorpsi ketika molekul yang

penting bagi tubuh. Cairan yang tersisa mengandung urea dalam kadar yang

3

tinggi dan berbagai senyawa yang berlebih atau berpotensi racun yang akan

dibuang keluar tubuh. pH urin berkisar antara 4,8-7,5, urin akan menjadi

lebih asam jika mengkonsumsi banyak protein, dan urin akan menjadi

lebih basa jika mengkonsumsi banyak sayuran. Berat jenis urin 1,002-

1,035 (Sumardjo, 2009).

2.2. Kandungan Urin

Urin normal yang baru selalu jernih, pH 4,8 – 7,4 dan bert jenis 1,008 –

1,030. Warna kekuning-kuningan karena adanya pengaruh pigmen yang

berwarna kuning. Air merupakan komponen terbesar dari urin yang di

dalamnya terdapat garam-garam anorganik dan senyawa-senyawa organik.

Senyawa anorganik yang berupa kation: Na+, K+, Ca+2, Mg+2, NH4+, sedikit

Fe+3, Cu+2, Zn+2, sedangkan yang berupa anion: Cl-, PO4-3, SO4

-2, CO3-2 dan

sedikit NO3-. Sebagian besar senyawa organik yang terdapat dalam urin

merupakan sampah dari proses metabolisme, antara lain ureum, asam urat,

kreatin, kreatinin, asam hipurat, asam-asam amino, asam-asam organik (asam

asetat, asam format, asam butirat, asam sitrat, asam oksalat, asam laktat, asam

glukuronat, asam benzoat). Beberapa enzim (amilase, lipase, tripsin),

beberapa hormon (hormon-hormon kelamin), dan vitamin (vitamin C, vitamin

B1) terdapat juga dalam urin. Urin patologis kemungkinan mengandung

protein, glukosa, aseton, bilirubin, urobilinogen dan urobilin (Sumardjo,

2009).

3. Kalsium

3.1. Definisi

Kalsium urin adalah kalsium yang berada di dalam urin yang berasal

dari pengendapan garam kalsium di dalam rongga ginjal, saluran ginjal atau

kandung kemih yang berbentuk kristal yang tidak dapat larut. Ekskresi

kalsium dalam urin berbeda-beda menuruti konsentrasi kalsium dalam serum

dan isi kalsium dalam seluruh tubuh. Dengan diit yang mengandung 0,5 - 1 g

kalsium sehari, orang normal mengekskresi 200-400 mg. Kalau kalsium

dalam makanan ditingkatkan, ekskresi juga meningkat, tetapi mengurangi

kalsium tidak banyak berpengaruh terhadap banyaknya kalsium dalam urin.

4

3.2. Nilai Normal Kalsium Urin

Menurut National Institute of Health (2011), nilai normal kalsium

dalam urin 24 jam adalah 100-300 mg.

Hiperkalsiuria merupakan suatu kondisi dimana kadar kalsium di dalam

urin lebih besar dari 300 mg/24 jam. Ini merupakan kelainan yang banyak

dijumpai pada penderita batu saluran kemih (batu kalsium). Hiperkalsiuri

kronis bisa menimbulkan kalkuli ginjal, nefrokalsinosis dan kemudian gagal

ginjal (Handaru, 2006).

Rendahnya kadar kalsium dalam urin, dimana kadarnya < 100 mg/24

jam menandakan rendahnya kalsium dalam tubuh, yang akan mengakibatkan

timbulnya gangguan-gangguan yang berhubungan dengan kekurangan

kalsium dalam tubuh seperti osteoporosis, kram otot, palpitasi, hipertensi,

rickets dan penurunan kognitif (Handaru, 2006).

4. Penentuan Kadar Kalsium dalam Urin

Pada tahun 1986 Gowans and Fraser melakukan penelitian mengenai

penentuan kadar kalsium dalam urin dengan membandingkan lima metode yang

berbeda. Kelima metode tersebut adalah metode Spektrofotometri Serapan Atom

(SSA), metode Kolorimetri dengan reagen Metiltimol Biru, metode titrasi

Fluorometri EGTA, metode Kolorimetri o-CPC dengan Technicon RA-100 dan

Du Pont aca. Berdasarkan penelitian tersebut dilaporkan bahwa kedua metode

Kolorimetri dengan reagen o-CPC memiliki nilai presisi paling baik dan nilai

recovery yang lebih baik daripada metode kolorimetri dengan reagen Metiltimol

Biru dan metode Titrasi Fluorometri EGTA.

Parentoni et al. (2001) melaporkan bahwa dalam penentuan total kalsium

dalam urin, metode Kolorimetri dengan reagen o-CPC memiliki batas linearitas

yang lebih tinggi daripada metode Spektrofotometri Serapan Atom (SSA).

5. Kolorimetri o-Cresolpthalein Complexon (o-CPC)

Kolorimetri adalah suatu metode analisis kimia yang didasarkan pada

perbandingan intensitas warna standar. Metode ini merupakan bagian dari analisis

fotometri. Metode kolorimetri o-CPC berdasarkan pada ikatan spesifik atau

5

kompleks (warna ungu) antara o-CPC sebagai indikator metalorkromik dengan

kalsium pada pH basa (Cahyani, 2013).

Gambar 1.

Struktur kimia o-Cresolphthalein Complexon

Metode kolorimetri o-CPC berdasarkan pada terbentuknya kompleks

kalsium o-CPC pada pH basa. Kompleks kalsium-CPC secara teoritik menyerap

radiasi elektromagnetik (REM) pada panjang gelombang 570 nm (20-25°C) dan

578 nm (37°C) (Cahyani, 2013).

Peningkatan pH diatas 7 dapat menyebabkan proses reaksi laktonolisis

(terbukanya cincin lakton) pada o-CPC.Ikatan kompleks warna ungu, terjadinya

ikatan kompleks warna ungu karena adanya formasi lakton di bagian phthalein

dari molekul (Cahyani, 2013).

6

Gambar 2. Reaksi Pembentukan Kompleks Kalsium – CPC

5.1. Spektrofotometri Visible

Spektrofotometer adalah suatu instrumen untuk mengukur transmitan

atau absorbansi suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang, pengukuran

terhadap sederetan sampel pada suatu panjang gelombang tunggal. Pada

Spektrofotometri Visible digunakan sumber sinar/energi cahaya tampak.

Cahaya tampak termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap

oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 400 sampai 780

nm (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 3. Instrumentasi Spektrofotometer UV-Visible

5.2. Bahan dan Alat

Peralatan yang digunakan dalam penentuan kadar kalsium dalam urin

menggunakan metode Kolorimetri meliputi Spektrofotometer UV-Vis

Shimadzu UV-100, mikropipet 20 µL, alat-alat gelas, vortex, cool box dan

botol sampel.

Bahan yang digunakan adalah sampel urin, ice gel, CaCl2.2H2O p.a,

aquades, HCl 6 N, Reagensia-1 yang berisi etanolamin pH 10,7 750 mmol/L

7

dan surfaktan, Reagensia-2 yang berisi o-Cresolphtalein Complexon 0,13

mmol/L, 8-hidroksikuinolin 35 mmol/L dan HCl pH 1,1 100 mmol/L.

5.3. Tahapan Penelitian

5.3.1 Pengambilan Sampel

Penampungan urin dilakukan sesaat setelah pengosongan

kandung kemih. Urin waktu ke-0 hingga urin ke-24 jam ditampung

dalam botol yang sama. Sampel urin yang telah diberi identitas

disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu 2-8°C. Volume urin

lengkap harus dikirim ke laboratorium pada hari yang sama setelah

pengumpulan selesai (Oregon Health & Science University, 2012).

5.3.2 Pembuatan Larutan Kerja

Reagensia-1 dicampur dengan Reagensia-2 dengan perbandingan

4:1. Larutan tersebut stabil selama 3 hari pada suhu 15-25°C (Cahyani,

2013).

5.3.3 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

20 µL larutan standar kalsium 5,082 mg/dl ditambah 1 mL larutan

kerja kemudian dicampur. Larutan dapat dibaca absorbansinya setelah

5-30 menit. Larutan standar diukur absorbansinya pada rentang panjang

gelombang 400-780 nm dengan blanko 1 mL larutan kerja ditambah 20

µL aquades. Secara teoritik, kompleks kalsium-CPC menyerap radiasi

elektromagnetik (REM) pada panjang gelombang 570 nm (20-25°C)

(Cahyani, 2013).

5.3.4 Penentuan Waktu Operasional (Operating Time)

20 µL larutan standar kalsium 10,164 mg/dl ditambah 1 mL

larutan kerja kemudian dicampur. Larutan dapat dibaca absorbansinya

setelah 5-30 menit. Larutan standar diukur absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum dengan blanko 1 mL larutan kerja ditambah 20

µL aquades, selama 60 menit dengan interval pengukuran 1 menit

(Cahyani, 2013).

5.3.5 Pembuatan Kurva Baku

8

66,8 mg CaCl2.2H2O p.a dilarutkan dalam aquades hingga

diperoleh 100 mL larutan stok kalsium 18,177 mg/dL. Dari larutan stok

tersebut kemudian dilakukan pengenceran hingga diperoleh seri larutan

standar 7,271 mg/dL; 6,362 mg/dL; 5,453 mg/dL; 4,545 mg/dL; 3,636

mg/dL dan 0 mg/dL dibaca absorbansinya pada panjang gelombang

maksimum dengan blanko 1 mL larutan kerja ditambah 20 µL aquades.

Kemudian dibuat persamaan regresi linier hubungan konsentrasi

kalsium terhadap absorbansi pada panjang gelombang maksimum.

5.3.6 Analisis Sampel

Volume urin diambil 50 mL kemudian diasamkan dengan 0,5 mL

HCl 6 N dan dipanaskan pada suhu 56°C selama 10 menit yang

bertujuan untuk melarutkan endapan kalsium oksalat. Sampel urin

diambil 2 mL kemudian diencerkan dengan aquades sampai volume 10

mL (Cahyani, 2013)..

20 µL sampel urin yang telah diencerkan, kemudian ditambah 1

mL larutan kerja dan dicampur. Larutan sampel dapat dibaca

absorbansinya setelah 5-30 menit. Larutan sampel diukur absorbansinya

pada panjang gelombang maksimum dengan blanko 1 mL larutan kerja

ditambah 20 µL aquades dalam rentang waktu operasional (Cahyani,

2013).

5.4. Senyawa Pengganggu

Penentuan kadar kalsium dengan menggunakan metode Kolorimetri

dengan reagen o-CPC memiliki potensi gangguan dalam hal adanya reaksi

antara magnesium dengan o-CPC. Selain kalsium, magnesium dalam urin

juga dapat berikatan dengan o-CPC dalam suasana basa membentuk

kompleks berwarna ungu. Gangguan ini diatasi dengan penambahan 8-

hidroksiquinolin yang terdapat dalam reagensia-2, dimana 8-hidroksiquinolin

ini akan mengikat magnesium yang terdapat dalam urin yang akan dianalisis

(Cahyani, 2013).

5.5. Pembahasan

Langkah-langkah yang dilakukan untuk memperoleh kadar kalsium

dalam urin meliputi pengumpulan urin, penentuan panjang gelombang

9

maksimum, penentuan waktu operasional, pembuatan kurva baku, dan

penentuan kadar kalsium dalam sampel urin.

Penentuan kadar kalsium dalam urin dilakukan dengan mengukur

absorbansi larutan sampel pada panjang gelombang maksimum 573,4 nm.

Sebelum dilakukan pengukuran, urin diasamkan terlebih dahulu

menggunakan HCl 6 N dan dipanaskan pada suhu 56oC selama 10 menit yang

bertujuan untuk melarutkan endapan kalsium oksalat, karena analisa kalsium

dalam urin bisa dilakukan tepat bila semua endapan kalsium dilarutkan lebih

dahulu (Cahyani, 2013).

Pengukuran kadar kalsium dalam urin ini menggunakan reagensia-1

dan reagensia-2 dengan perbandingan 4:1 (Diasys, 2009). Reagensia-1 berisi

etanolamin pH 10,7 dan surfaktan, dimana etanolamin merupakan basa amin

yang berperan sebagai larutan penyangga atau buffer untuk memberikan dan

mempertahankan suasana basa pada reaksi pembentukan kompleks antara o-

CPC dengan ion kalsium dan surfaktan untuk mengurangi kekeruhan pada

urin sehingga meningkatkan intensitas warna dari kompleks tersebut

(Cahyani, 2013).

Reagensia-2 berisi o-CPC, 8-hidroksiquinolin dan asam klorida.

Reagen o-CPC yang berfungsi untuk mengikat kalsium pada suasana basa

sehingga terbentuk kompleks warna ungu. Dalam suasana basa, cincin lakton

pada phthalein akan terbuka dan berikatan dengan kalsium sehingga

terbentuk kompleks warna ungu. Reaksi laktonolisis (terbukanya cincin

lakton) dari senyawa o-CPC terjadi pada pH diatas 7 atau basa (Cahyani,

2013).

Selain kalsium, magnesium dalam urin juga dapat berikatan dengan o-

CPC dalam suasana basa membentuk kompleks warna ungu, sehingga 8-

hidroksiquinolin ini berfungsi untuk menghilangkan gangguan dari

magnesium tersebut dengan cara mengikat magnesium. Asam klorida pada

pH 1,1 digunakan untuk melarutkan o-CPC dan 8-hidroksiquinolin (Cahyani,

2013).

6. Penutup

10

Pemeriksaan air kemih atau urin dapat digunakan sebagai salah satu cara

untuk membantu menetapkan diagnosis berbagai penyakit. Urin terdiri dari

komponen-komponen baik berupa senyawa organik maupun anorganik. Salah satu

senyawa anorganik yang terdapat dalam urin adalah kalsium. Kadar kalsium

dalam urin perlu dimonitoring karena jika kadarnya berlebih akan mengakibatkan

terjadinya hiperkalsiuria. Metode Kolorimetri dengan reagen o-CPC merupakan

metode terpilih untuk menentukan kadar kalsium urin. Selain metode tersebut

metode lain yang dapat digunakan untuk menentukan kadar kalsium dalam urin

adalah metode Spektrofotometri Serapan Atom (SSA), metode Kolorimetri

dengan reagen Metiltimol Biru dan metode titrasi Fluorometri EGTA. Penentuan

kadar kalsium dengan menggunakan metode Kolorimetri dengan reagen o-CPC

memiliki potensi gangguan dalam hal adanya reaksi antara magnesium dengan o-

CPC. Hal ini dapat diatasi dengan menambahkan 8-hidroksiquinolin yang akan

mengikat magnesium yang terdapat dalam urin yang akan dianalisis. Penentuan

kadar kalsium dengan menggunakan metode Kolorimetri dengan reagen o-CPC

memiliki nilai presisi, recovery dan batas linearitas yang baik jika dibandingkan

dengan metode yang lain.

11

DAFTAR PUSTAKA

Cahyani, Tita Pristi., 2013. Analisis Kadar Kalsium dalam Urin Pekerja di Pengolahan Batu Kapur Desa Karangbawang Kevamatan Ajibarang Menggunakan Metode Kolorimetri. Skripsi, Purwokerto: Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Kesehatan Jurusan Farmasi, Universitas Jenderal Soedirman.

Gowans, Elizabeth and Fraser, Callum., 1986. Five Methods for Determining Urinary Calcium Compared. Clinical Chemistry 32/8, pp. 1560 – 1562.

Handaru, Cahyo 2006. Pengaruh Pemberian Suplemen Kalsium Sebelum dan Sesudah Makan Terhadap Kadar Kalsium Urin. Tesis: Program Pendidikan Dokter Spesialis Bedah, Bagian Bedah FK Undip-RS. Dr. Kariadi Semarang

NIH, 2011, Optimal Calcium Intake, National Institute of Health, Bethesda.

Parentoni, L.S; Pozeti, R.C.S; Figueiredo, J.F and Faria, E.C. 2001. The Determination of Total Calcium in Urine: A Comparison Between The Atomic Absorption And The Ortho-Cresolphtalein Complexone Methods. Journal Brasileiro de Patplogia, Vol. 37 No. 4, pp. 235 – 238

Oregon Health & Science University, 2007, Instructions For 24 Hour Urine Collection, Oregon Health & Science University, Department of Pathology, USA.

Sumardjo, Damin. 2009. Pengantar Kimia, Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. pp 19 – 20.

12