ACARA II

ISOLASI DNA TANAMAN

A. Pendahuluan

1. Latar Belakang

Sel-sel tanaman seperti halnya sel-sel hewan, sel-sel tanaman

juga mengandung informasi genetik yang nantinya informasi tersebut dapat

diturunkan kepada generasi berikutnya.Informasi genetik ini dikode dalam

suatu molekul besar DNA yaitu kromosom. Pada sel tanaman ini DNAnya

dibagi menjadi DNA intrakromosomal dan ekstrakromosomal. DNA

intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan

DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel.

Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di

mitokondria dan kloroplas (Farrel 2008).

Isolasi merupakan pemisahan materi dari materi lain untuk di

identifikasi. Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai

sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga,

kalus, akar batang, daging. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali

terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin,

pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak

mengandungn protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi

adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini

disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali

pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari

ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat

aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan

menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada

hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan

14

15

teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat

terpisah atau keluar dari sel.

Kemampuan mengisolasi DNA tanaman sangat diperlukan karena

sangat bermanfaat dalam kajian ilmu biologi molekuler dan ilmu lainnya.

Hal ini berkaitan dengan pemanfaatan hasil analisis dari DNA tanaman yang

dapat digunakan untuk berbagai macam hal, seperti mengetahui hubungan

kekerabatan, evolusin dan lain seabagainya. Selain itu, kemampuan dalam

mengisolasi DNA tanaman juga diperlukan dalam menentukan letak gen-gen

yang termutasi pada tanaman transgenik ataupun untuk menentukan letak

gen-gen yang mengkode sifat unggul dalam pembatan tanaman tansgenik

yang memiliki sifat unggul (Heldt 2010). Karena pentingnya mengetahui

cara mengisolasi DNA tanaman, maka praktikum tentang Iolasi DNA

Tanaman sangat perlu dilakukan.

2. Tujuan praktikum

Tujuan Praktikum acara Isolasi DNA Tanaman ini adalah:

a. Membandingkan 3 metode isolasi yang berbeda

b. Mengetahui Proses Isolasi DNA

c. Memahami fungsi tiap-tiap perlakuan

d. Mendapatkan DNA yang baik dan sesuai standar

3. Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 10 Maret 2014 di

Laboratorium Bioteknologi Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Sebelas

Maret Surakarta.

B. Tinjauan Pustaka

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.

Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan

teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.

Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah

tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil

16

sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan

pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell et al 2007).

CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran

plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen

yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika

konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M. Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan

adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan massa bergelatin yang

komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya terlihat jelas dalam massa

tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya, sehingga untuk menghindari

terbentuknya massa ini digunakan presipitasi yang tidak menggunakan alcohol

(Chawla 2008).

Pemurnian DNA menurut dapat dilakukan menggunakan: 

1. Enzim ribonuklease (Rnase) yang berfungsi untuk mendegradasi RNA 

2. Ekstraksi phenol-chloroform, untuk menghilangkan protein  

3. Pencucian menggunakan alkohol, untuk menghilangkan sisa-sisa pheno-

chloroform, garam-garaman dan kandungan ion lain 

4. Sentrifuge dengan kecepatan sedang, untuk memisahkan kotoran sisa

degradasi sel.

Langkah penting selanjutnya adalah mengetahui konsentrasi DNA total yang kita

isolasi. Konsentrasi DNA dapat dilakukan menggunakan spektrofotometer pada

260 nm atau elektroforesis. Spektrofotometer kurang sensitif dan terkadang

terhalang oleh protein, sehingga elektroforesis lebih banyak digunakan.

Elektroforesis DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA melalui pori-

pori agarose dengan bantuan arus listrik. Kecepatan pergerakannya tergantung

ukuran DNA yang dilarikan, arus listrik, dan konsentrasi gel

(Dale and Malcolm 2007).

Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) yaitu teknik

pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen

17

DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya

ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR

dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer

menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer

adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%

(Subandiyah 2006).

Setelah tahapan presipitasi, DNA selanjutnya dipresipitasi dengan

menggunakan ethanol absolute. Penambahan larutan garam seperti amonium

asetat juga sangat membantu presipitasi DNA. Sedangkan ethanol 70% yang

ditambahkan setelah presipitasi ini dapat digunakan sebagai larutan pencuci.

DNA hasil kemudian ditambahkan dengan TE dan disimpan dalam frezer suhu -

20ºC (Birren et al 2007).

Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan

memurnikan fragmen-fragmen DNA ataupun RNA. Prinsip elektroforesis adalah

memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negativ

karena adanya phosphate akan bergerak ke arah kutub positif selama

elektroforesis. Fragmen DNA mempunyai muatan negative yang sama untuk

tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan

yang sama untuk mencapai kutub positif (Clark dan Christopher 2008).

Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen

lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi

untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk

menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al.,

2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman

dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang

kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol

perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008).

Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat

18

dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi

DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebski et al 2007).

C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja

1. Alat

a. Spektrofotometer

b. Centrifuge

c. Elektroforesis

d. Timbangan analitis

e. Water bath

f. Mortar dan pestle

g. Incubator

h. Hot plate

i. Vortex

j. Tabung Eppendorf

k. Mikropipet

l. Pinset

m. Gunting

n. Erlenmeyer

2. Bahan

a. Daun Mawar

b. Tris-EDTA

c. CTAB

d. Mercaptoetanol

e. CIAA

f. Isopropanol

g. Aquades

h. Sodium Asetat

i. Loading dye

j. Etidium Bromide

19

k. TAE/TBE

l. Etanol Chloroform

3. Cara Kerja

Cara kerja pada acara isolasi DNA tanaman ini menggunakan metode

2 dari Setiawan 2014, yaitu sebagai berikut

a. DNA genomik sampel diisolasi dengan menggunakan 50 mg daun, digerus

hingga halus, sebelumnya daun didinginkan dalam freezer terlebih dahulu

hingga beku.

b. Memanaskan buffer ekstraksi CTAB (yang sudah ditambahkan 10%

Mercaptoetanol) 800µl pada suhu 65˚C selama 30 menit.

c. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam Waterbath selama 60

menit dan setiap 10 menit dibolak-balik.

d. Setelah 60 menit dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut

ditambahkan dengan 500µl kloroform – isoamil alkohol (24:1)

e. Campuran disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm.

f. Supernatan yang terbentuk diambil dengan hati-hati dan dipindahkan ke

mikrotube yang baru dan mencatat volumenya.

g. Menambahkan isopropanol 2/3 volume, kemudian di vortek hingga

tercampur rata dan menyimpan dalam freezer selama minimal 1 jam.

h. Sampel kemudian di sentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 12000

rpm.

i. Setelah disentrifugasi, buang cairan atas dan endapan DNA dicuci dengan

menambahkan etanol 70% 400µl.

j. Melakukan sentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm.

k. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25µl bufer TE (10Mm

Tris-HCl pH 8,0 ; 1 Mm EDTA pH 8,0).

l. DNA disimpan pada suhu 4˚C.

20

D. Hasil dan Pembahasan

1. Hasil

2a. Pemanasan Larutan Buffer CTAB

2b. Mendinginkan daun jeruk dengan mortar & pastle dalam freezer selama 30 menit

Water bath

3. Memotong, Menimbang dan Menggerus dengan larutan buffer CTAB, memasukkan hasil ke tabung effendof yang ditambahkan chloroform (800 nm) dan digojog hingga homogen

Khloroforom

4. Melakukan sentrifuge pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit

5. Mengambil cairan lapisan atas, kemudian dipindahkan ke tabung baru Lapisan Atas

6. Menambahkan 1/10 dari volume 2,5 Soidum asetat & 650 ul Isopropanol dingin, mencampur hingga homogen kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 13.000 selama 5 menit

Isopropanol dingin

Sodium Asetat

7. Membuang supernatant, kemudian mencuci pellet dengan etanol 70% 500 ul

8. Mengeringkan pellet DNA dengankering angin

Pellet

Supernatant + etanol

Ditutup dengan tissue

21

2. Pembahasan

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk

berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui

elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan

DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama

dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau

pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008).  Menurut

Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses

isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan

seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk

semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan

fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan: preparasi

ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA, akan

tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah

berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida

dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga

mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease

restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan

DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. (Zubaidah 2004).

Alat yang digunakan pada praktikum isolasi DNA yaitu sentrifuge,

mortar dan pestle, timbangan analitik, mikrotube, freezer, mikropipet.

Sentrifuge berfungsi untuk memisahkan suatu larutan dengan berat molekul

yang berbeda berdasarkan gaya sentrifugal, pada praktikum kali ini

9. Melarutkan DNA 200 ul TE, menghitung konsetrasi DNA dengan spektrofotometer ODkering angin

10. Menyimpan dalam suhu rendah -20 oCkering angin

-20 oC

22

sentrifuge digunakan untuk memisahkan antara supernatant dan pellet.

Mortar dan pestle digunakan untuk menghaluskan daun mawar. Timbangan

analitik digunakan untuk menimbang berat mawar hingga 0,15 gram.

Mikrotube digunakan sebagai wadah komponen yang akan diisolasi. Freezer

digunakan untuk mendinginkan daun mawar agar mudah untuk dihancurkan

sebagai pengganti nitrogen cair, dan mikropipet digunakan untuk mengambil

larutan ataupun cairan dengan ukuran mikro.

Bahan yang digunakan pada acara isolasi DNA kali ini adalah buffer

CTAB, chloroform, sodium asetat, isopropanol dingin, dan etanol 70%.

Buffer CTAB digunakan untuk melisiskan membrane sel DNA pada isolasi

DNA serta purifikasi DNA. Chloroform digunakan sebagai pendenaturasi

protein. Sodium asetat digunakan untuk mengendapkan DNA. Isopropanol

dingin digunakan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga menjadi presipitasi.

Etanol 70% digunakan untuk memurnikan DNA.

Hasil isolasi yaitu setelah dilakukan sentrifuge, larutan seharusnya

terlihat perbedaannya dan jernih. Pada hasil isolasi DNA kelompok kami,

didapatkan daun mawar. Proses sentrifuge berlangsung lebih lama dari

prosedur, karena cairan lapisan atas belum terpisah dengan lapisan bawah,

dan supernatan yang diperoleh hasilnya agak keruh. Hal ini diduga

disebabkan kurang sterilnya alat dan kesalahan praktikan dalam melakukan

proses isolasi sehingga pengotor ikut masuk ke dalam mikrotube.

A. Kesimpulan dan Saran

1. Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari acara isolasi DNA tanaman ini adalah :

a. Perbedaan dari ketiga metode isolasi DNA yang ada adalah berbagai

pereaksi dan buffernya.

b. Proses isolasi DNA dimulai dari menimbang bahan dengan berat tertentu

hingga didapatkan pellet melalui beberapa tahapan.

23

c. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan padatan dan cairan dengan berat

tertentu.

2. Saran

Saran untuk praktikum acara isolasi DNA tanaman ini berjalannya sudah

cukup baik, namun untuk ketepatan waktu dirasa masih kurang sehingga untuk

praktikum kedepan diharapkan praktikum yang dilaksanakan tepat pada

waktunya.

24

DAFTAR PUSTAKA

Birren,B.; E.D. Green; S. Klapholz; R.M. Myers;J. Roskams. 2007. Genome Analysis. A Laboratory manual. Volume 1. Cold Spring Harbour Laboratory Press.New York. Halaman 621

Chawla, H. S. 2008. Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science Publishers, Inc. Plymouth.

Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA : Spechtrophotometry, Degradation, and the “Frangekel” Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/ able/ volumes/ vol-22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.

Farrel, R.E. 2008. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705

Heldt, H. W. 2010. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. 491

Lodhi MA, Ye GN, Weeden NF, Reisch BI (2004). A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and vitis species. Plant Mol. Biol. Rep. 12(1): 6-13.

Moyo M., Amoo S.O., Bairu M.W., Finnie J.F., Van Staden J. 2008. Optimising DNA isolation for medicinal plants. South African Journal of Botany 74, 771–775.

Porebski S, Bailey LG and Baum BR (2007) Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Reptr 15: 8–15.

Ranjan M, Mukerjee A, Luchowski R 2010. Enhanced Fluorescence of curcumin on plasmonic platforms. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11:223-228

Subandiyah, S. 2006. Polumerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. Hlm.43-50