bioinfo

Nama : Ulya Alviredieta

NIM : 10413012

Kelompok : 10

1. HBV Complete Genome:

2. Gen target: S geneLetak gen: 1.3,215

Berdasarkan fitur highlight sequence features, diketahui gen pengode large surface protein yang ditarget ada dalam genom virus. Bagian gen tersebut ditandai dengan highlight warna cokelat pada complete genome.

Karena bentuknya yang sirkuler, dapat disimpulkan sekuens gen tersebut adalah:ATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGACAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCGTTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAAC

CCCAACAAGGATCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCGGGAGCATTTGGTCCAGGGTTCACCCCACCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACAACACTGCCAGCAGCACCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAACTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCACCCATATCGTCAATCTTCTCGAGGACTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGAGCACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAGAACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGA

3. Perancangan primer dilakukan dengan situs NCBI Primer-BLAST Tool dengan spesifikasi khusus berikut untuk mendapatkan primer dengan kualitas terbaik:Parameter Isi KeteranganPCR Product Size 300 (min) – 1000 (max) Merupakan rentang

ideal produk PCR untuk menghindari patah, re-annealing dengan sesame DNA, dan crosslink

Database Genome (chromosomes for all organisms), selected for HBV complete genome

Organism 10407 Kode HBVPrimer Size 18 (min) – 24 (max) Merupakan rentang

ideal ukuran primer dengan spesifisitas terbaik

Primer GC Content 40% (min) – 60% (max) Merupakan rentang ideal primer dengan kemampuan penempelan baik (tidak terlalu lemah dan tidak terlalun kuat)

Sekuens yang dipilih adalah database HBV Complete Genome.

Maka, akan dihasilkan hasil sebagai berikut.

Dari 10 primer yang dirancang oleh situs, pemilihan pasangan primer dilakukan berdasarkan kriteria berikut:

a. Panjang produk. Panjang produk ideal adalah 300-1000 bp. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah terjadinya patah, re-annealing dengan sesama DNA (bukan dengan primer), dan terbentuknya cross-link (NEB, 2015). Seluruh pasangan primer memenuhi kriteria panjang produk. Menurut Harvard Medical School, primer terbaik adalah primer yang menghasilkan ukuran produk antara 500 bp. Semakin kecil ukuran produk, efisiensi amplifikasi mendekati 100% sehingga kualitas produk semakin baik.

Pri 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Size 392 437 384 396 388 393 436 439 392 437Rank 2,5 8,5 4 6 1 5 7 9 2,5 8,5

Diantara 10 pasangan primer, primer 5 menghasilkan panjang produk terkecil sehingga, dilihat dari parameter panjang produk, primer 5 adalah yang terbaik. Primer lain yang dapat dijadikan alternative adalah primer 1 dan 9 dengan panjang produk 392 bp.

b. Panjang pasangan primer. Semua pasangan primer memiliki panjang masing-masing sebesar 20 bp. Panjang primer berada dalam rentang wajar, yaitu 18 – 24 bp. Artinya, pasangan primer 10 memiliki spesifisitas yang tinggi: tidak terlalu pendek untuk penempelan acak dan tidak terlalu panjang sehingga menyulitkan proses penempelan dengan template yang menjadikan amplifikasi kurang efektif (Judelson, 2006).

c. TM. Selisih TM yang kecil mencegah misprime, kondisi saat salah satu primer lepas dari template sementara primer yang lain masih menempel, sehingga amplifikasi berjalan efisien (Judelson, 2006). Idealnya, selisih TM antarprimer tidak lebih dari 5°C, semakin kecil semakin baik (Judelson, 2006). Karena memiliki TM yang mirip, maka temperatur penempelannya mirip sehingga waktu penempelannya dapat dikatan mirip. Hal ini meningkatkan efisiensi waktu dan energi reaksi PCR (Judelson, 2006)Pri 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10∆TM 1,51 1,5 1,43 1,86 1,93 1,21 1,21 1,21 0,86 0,87

Pasangan primer 5 yang merupakan pasangan primer terbaik dari segi panjang produk memiliki selisih TM sebesar 1,93°C, tertinggi di antara 9 pasangan primer lain. Pasangan primer dengan selisih Tm terendah adalah pasangan primer 9. Secara efisiensi reaksi akibat perbedaan TM, pasangan primer 9 adalah pasangan primer terbaik. Pasangan primer yang dapat menjadi alternative adalah pasangan primer 10.

d. Presentase GC. Jika presentase GC terlalu rendah, stabilitas ikatan primer-template juga rendah sehingga ada kemungkinan primer sering terlepas dari template. Jika presentase GC terlalu tinggi, ada kemungkinan spesifisitas primer menjadi rendah, disebabkan oleh ikatan sembarang antara GC pada primer dengan GC dengan template. Ikatan ini cenderung stabil karena ikatan GC membutuhkan energi lebih tinggi untuk dilepaskan. Akibatnya, efisiensi reaksi menurun. Kesepuluh pasangan primer memiliki konten %GC yang baik, berada pada rentang optimum yaitu 40-60%. Persentase GC yang baik meningkatkan stabilitas ikatan template-primer sehingga reaksi berjalan efisien.

e. Self-complementary. Self complementary merujuk pada kemampuan basa nitrogen primer untuk berikatan dengan basa nitrogen lainnya membentuk struktur yang disebut hairpin (Judelson, 2006).

Keberadaan hairpin menurunkan kemampuan primer berikatan dengan template sehingga efisiensi PCR berkurang. Hal ini sangat dihindari. Untuk itu, primer harus dirancang sedemikian rupa dengan nilai self complementary sekecil mungkin (Ye et al., 2012).

Pasangan Primer

Self Complementary

Rata-Rata Keterangan

1 Forw. = 8Revs. = 4

6


5,5 Terendah


6


5,5 Terendah


6


6


5,5 Terendah


5,5 Terendah


6

10 Forw. = 8Revs. = 3

5,5 Terendah

Pasangan primer 2, 4, 7, 8, dan 10 memiliki nilai self complementary paling kecil dibanding pasangan primer lain. Artinya, pasangan primer 2, 4, 7, 8, dan 10 memiliki kemungkinan membentuk dimer selama reaksi paling kecil dibanding pasangan primer lain sehingga efisiensi reaksi yang relatif lebih tinggi dibanding pasangan primer lain (dari segi pembentukan hairpin). Alternatif pasangan primer lain adalah pasangan primer 1, 3, 5, 6, dan 9.

f. Self 3’ complementary. Adalah kemungkinan basa nitrogen pada bagian 3’ pasangan primer berikatan satu sama lain dan membentuk struktur yang disebut primer-dimer (Ye et al., 2012; Judelson, 2006).

Seperti halnya hairpin, keberadaan primer-dimer juga menurunkan efisiensi reaksi. Hanya saja, keberadaan primer-dimer menurunkan laju reaksi lebih besar dari keberadaan hairpin. Hal ini dikarenakan primer-dimer ‘mengonsumsi’ primer forward dan reverse pada saat

bersamaan, bukan salah satunya saja seperti pada pembentukan hairpin.

Pasangan Primer

Self 3’ Complementary



2


2


2


2


2


2


2


2


2

10 Forw. = 2Revs. = 2

2

Self 3’ complementarity semua pasangan primer bernilai 2, sehingga dapat disimpulkan kemungkinan pembentukan primer-dimer pada seluruh pasangan primer adalah sama.

g. Di antara 9 primer lainnya, keberadaan poli-X pada pasangan primer 10 relatif lebih rendah. Poli-X merupakan salah satu parameter perancangan primer yang kemungkinannya harus ditekan serendah mungkin (Judelson, 2006). Poli-X adalah daerah dimana basa nitrogen yang sama berada berdampingan pada primer. Keberadaan poli-C dan poli-G dapat menurunkan spesifisitas primer (Judelson, 2006). Hal ini disebabkan oleh kemungkinan poli-C dan poli-G bertemu dengan daerah selain target yang kaya akan GC. Jika hal ini terjadi, akan terbentuk ikatan kuat antara daerah nontarget dengan primer yang menyebabkan primer menempel pada target yang salah. Keberadaan poli-A dan poli-T, karena memiliki energi ikatan lemah, dapat menyebabkan ‘breath’, suatu keadaan ketika sebagian primer terlepas dari template (Judelson, 2006). Keberadaan poli-A, poli-G, poli-C, dan poli-T pada semua pasangan primer telah diteka hingga maksimal 2 nukleotida berurutan saja. A

Berdasarkan analisis tersebut, dapat disimpulkan bahwa pasangan primer 10 merupakan pasangan primer terbaik yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekuens 1 menggunakan PCR.

Untuk sekuens 2, didapatkan hasil sebagai berikut.

Dengan detil sebagai berikut.

Dari 10 primer yang dirancang oleh situs, pasangan primer 10 sebenarnya merupakan primer yang paling baik untuk mengamplifikasi sekuens 1 menggunakan PCR. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor:

a. Pasangan primer 10 memiliki panjang produk amplifikasi 306 bp. Panjang produk ini berada dalam rentang 300 – 1000 bp sehingga tidak terlalu panjang untuk menyebabkan produk patah, terjadinya crosslink, dan re-annealing sebelum reaksi selesai. Panjang produk yang dihasilkan oleh reaksi relatif lebih kecil dibanding panjang produk primer lain. Artinya, kemungkinan terjadinya patah, cross link, dan re-annealing sebelum reaksi selesai lebih sedikit. Selain itu, karena berukuran pendek, tidak perlu banyak dilakukan optimasi reaksi dari segi suhu, mastermix, dan enzim sehingga menekan biaya operasional.

b. Pasangan primer 10 memiliki panjang primer 20 bp. Panjang ini masih berada dalam rentang wajar. Karena panjang primer lebih besar dari 18 bp dan lebih kecil dari 24 bp, panjang primer tidak terlalu pendek sehingga memungkinkan penempelan tidak spesifik dan tidak terlalu panjang sehingga meningkatkan waktu dan temperatur penempelan. Hal ini menjadikan reaksi lebih efisien dan cost-effective.

c. TM kedua primer relatif sama (∆TM = 0,38°C). Hal ini menyebabkan kedua primer memiliki temperatur dan waktu annealing yang dapat dikatakan serupa. Menempelnya primer pada suhu dan waktu yang

serupa meningkatkan efektivitas dan efisiensi reaksi sehingga mengurangi biaya operasional.

d. Presentase GC kedua pasangan primer berada dalam rentang 40% hingga 60%. Presentase GC yang berada dalam rentang ideal ini cukup kuat untuk menghindari breathing dan cukup lemah untuk mencegah terlalu kuatnya ikatan antarDNA yang berakibat pada menurunnya efisiensi reaksi pada setiap siklus. Hal ini otomatis menekan operational cost reaksi.

e. Self-complementary pasangan primer relatif lebih rendah dari pasangan lain. Artinya, kemungkinan pasangan primer 10 membentuk hairpin lebih rendah dari pasangan lain. Hal ini berarti efektivitas dan efisiensi reaksi yang dilakukan dengan pasangan primer 10 lebih tinggi dari reaksi dengan primer lain.

Pasangan Primer

Self Complementary



4,5


4


4,5


4,5


5


5


4


4


4

10 Forw. = 4Revs. = 2

3 Terendah

f. Self 3’ complementary pada pasangan primer 10 merupakan yang terendah, meski nilai rata-ratanya sama dengan pasangan primer nomor 9. Karena pasangan primer nomor 9 memiliki nilai kemungkinan pembentukan self complementary atau hairpin lebih besar dari pasangan nomor 10, maka pasangan nomor 10 lebih unggul dari pasangan nomor 9 dalam hal efektivitas dan efisiensi reaksi. Memiliki nilai terendahberarti kemungkinan terjadinya primer-dimer pada reaksi dengan primer 10 cukup kecil dibanding pasangan primer lain. Karena primer-dimer menurunkan efektivitas reaksi, maka nilai kemungkinan munculnya primer-dimer harus ditekan serendah mungkin agar reaksi berjalan efektif dan efisien.

Pasangan Primer

Self Complementary



2


2


3


1,5


2


2


2


1,5


1 Terendah

10 Forw. = 1Revs. = 1

1 Terendah

Namun, analisis poli-X menunjukkan keberadaan poli-G dan poli-purin pada pasangan primer. Poli-G dapat menurunkan spesifisitas pasangan primer karena dapat berikatan kuat dengan sekuens nontarget dan pemutusan ikatannya memerlukan energi tinggi. Pada sekuens juga teramati poli-purin berupa deretan basa nitorgen A-G yang beresiko membuat bentuk produk tampak sebagai dobel heliks yang ganjil (Judelson, 2006). Untuk mencegah hal tersebut, maka perlu dipilih primer dengan spesifikasi tidak jauh berbeda dengan pasangan primer 10 namun tidak memiliki banyak poli-X. Pasangan primer tersebut adalah pasangan primer 9.

Pasangan primer 9 memiliki ∆Tm =1,55°C. Selisih tersebut masih di bawah nilai 5°C sehingga dapat diabaikan dan waktu serta temperatur penempelan primer dapat dianggap sama. Pasangan primer ini terdiri atas 20 nukleotida, dan dengan analisis yang sama, sepadan dengan pasangan primer 10. Produk yang dihasilkan memiliki panjang 306 bp, sama dengan panjang produk pasangan primer 10 sehingga kualitas produk yang dihasilkan sama. %GC untuk setiap primer berada dalam rentang ideal sehingga kemungkinan terjadinya breath, lepasnya primer dari template, dan penurunan efisiensi reaksi setiap siklus akibat kuatnya ikatan primer dengan template dapat dihindari. Meskipun memiliki kemungkinan terbentuknya hairpin lebih tinggi dari pasangan primer 10, pasangan primer 9 masih memiliki kemungkinan terbentuknya hairpin relatif lebih rendah dari pasangan primer lain. Kemungkinan pembentukan primer-dimer pasangan primer ini sama dengan pasangan primer 10. Ditambah lagi, pasangan primer 9 memiliki poli-G, poli-T, dan poli-purin yang lebih

sedikit dari pasangan primer 10 sehingga kemungkinan terjadinya penempelan acak, breath, dan bentuk dobel heliks yang ganjil lebih rendah dari pasangan primer 10. Artinya, secara umum, kualitas primer 9 lebih baik dari kualitas primer 10.

Berdasarkan analisis tersebut, dapat disimpulkan bahwa pasangan primer 9 merupakan pasangan primer terbaik yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekuens 2 menggunakan PCR.

Sebenarnya, dalam analisis pemilihan primer, data-data seperti ∆G, %stabilitas, analisis sticky end, dll. diperlukan untuk menunjang keakuratan pemilihan primer. Data-data tersebut disediakan oleh program analisis primer berbayar seperti OligoTM (Judelson, 2006). Dengan menggunakan program seperti OligoTM, energi yang dibutuhkan untuk keberlangsungan suatu reaksi, stabilitas primer, analisis struktur sekunder primer, dan prediksi bentuk akhir serta panjang produk dapat diketahui dengan jelas. Akibatnya, primer yang dipilih memiliki kualitas lebih baik dibanding primer yang dipilih dengan analisis manual nonkuantitatif (Judelson, 2006).

Daftar Pustaka

Judelson, H. 2006. Primer Guidelines. [Online] http://oomyceteworld.net/protocols/primer%20designing2.pdf, diakses tanggal 26 September 2015.

NEB. 2015. Guidelines for PCR Optimization with OneTaq® and OneTaq® Hot Start DNA Polymerases. [Online] https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-onetaq-and-onetaq-hot-start-dna-polymerases, diakses tanggal 25 September 2015.

Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., & Madden, T.L. 2012. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics, 13, 134.

https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-onetaq-and-onetaq-hot-start-dna-polymerases

https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-onetaq-and-onetaq-hot-start-dna-polymerases

http://oomyceteworld.net/protocols/primer%20designing2.pdf

bioinfo

Documents