BIOANALISISJunaidi Khotib, Ph.DDrs. Didik Hasmono, M.SDra. Aniek Setiya Budiatin, M.SiDra. Toetik Aryani, M.Si

Bagian Farmasi KlinikFakultas Farmasi Universitas Airlangga

SpektrofotometriUV dekat : 190 - 380 nmVIS : 380 -780 nm- Sumber radiasi : Lampu D2 (UV), Tungsten (VIS)- Analisis kuantitatif > kualitatif- Melibatkan energi elektromagnetik yang cukup besar- Diagram tingkat energi :Eksitasi Eksitasi Eksitasi nEnergi besarUV jauhMis: alkanaUV jauhMis: alkena, alkunaUV jauhMis:Keton, aldehid = 12 -16 (Mr < 1000)- Panjang GelombangEksitasi n

- Gugus kromofor : gugus/atom yang mengabsorpsi radiasi UV-VIS Gugus auksokrom: gugus fungsional yang mempunyai elektronbebas -OH, -O-NH2 dan -O-CH3Eksitasi n-Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor (C=C; C=O; CHO; NO2; N=N)BatokromikMerahAdanya ikatan rangkap terkonjugasipergeseran pita absorpsil yang lebih panjang

Pemilihan PelarutTidak mengandung ikatan rangkap terkonjugasi dan tidak berwarnaTidak terjadi reaksi/ interaksi dengan molekul/senyawa yang dianalisisKemurnian harus tinggi- Misal : air, etanol, sikloheksan, isopropanol- Perhatikan absorpsi pelarutPengaruh polaritas larutan1. Polaritas pelarut meningkat - Pergeseran biru- Pergeseran merahEnergi nEnergi Energi mantap EIkatan hidrogen lebih mantap

- Sensitifitas : ppm atau mg/ml- Hukum Lambert & BeerAnalisis Kuantitatif Sampel BiologikA= log 1/T = e c.bPembuatan Kurva BakuAda korelasi antara absorbansi dengan konsentrasip r tabel; p

3. Penetapan kadar sampelHarga absorbansi atau serapan sampel dimasukkan ke persamaan recovery sebagai Y1 sehingga akan didapat X1 sebagai kadar sampel

- Instrumen sama dengan spektro UV-VISSpektrofluorometri- Sumber radiasi : busur merkuri atau xenon (250 -600 nm)- Yang modern: laser nitrogen (360 -650 nm)- Monokromator:2 prisma untuk eksitasi pendar fluor2 kisi difraksi untuk eksitasi dan pendar fluor Emisi dan pendarPendarRadiasiReaksi kimia- Hukum Beer:Intensitas fluoresensi sebanding dengan kadar molekul yang berpendarRentang dinamik A0.05 tidak berlakuSensitifitas ng/ml, pg/mlMisal: digoksin (dalam etanol + vitamin C)

Penetapan kadar asetosal Na salisilat dalam urin1. Kurva BakuY = 2.64 x10-3X + 1.41 x10-3r = 0.999

Kadar (ppm)Absorbansi20.170.04150.430.084100.860.164201.720.330302.580.487403.440.671

Y = 1.31 x10-3X + 8.49 x10-3r = 0.9972. Kurva recovery tentukan kadarnya bila diket : A = 0,021; 0,475 dan 0,874Rata-rata % = 83.4Y = 1.31 x10-3X + 0.321Y = 1.30 x10-3X + 0.003r = 0.999r = 0.899

Kadar (ppm)AbsorbansiKadar Yang didapat% Recovery23.920.03520.5185.7454.800.08551.0485.35119.600.166100.4984.02239.200.317192.6980.56358.800.510310.5386.55478.400.614379.0371.18

Kromatografi GasBanyak dipakai :Aliran fase mobil (gas) sangat terkontrol dan kecepatan tetapSangat mudah terjadi pencampuran uap sampel ke fase mobilPemisahan fisik terjadi didalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan suhu bisa diaturBanyak macam detektor yang bisa dipakaiMudah digabung dengan intrumen lain misal GC, FT-IR, MSMacam:KGPKGCKerugian KGP:Kromatogram berekorEfektivitas dipengaruhi BMCocok untuk BM rendah

KGCFase gerak gasFase diam cairan yang disalutkan tipis pada permukaan butiran padat sebagai pendukungMekanisme pemisahan adalah perbedaan partisi komponen sampel diantara fase gas dan cairYang diamati:Waktu tambat (tR)Lebar puncak (w)

Fase mobilGas harus inertDiatur dengan tekanan dan aliran tertentuCepat resolusi rendahLambat pelebaran puncak, waktu lamaBiasa dipakai N2, H2, argon-metana (9:1 atau 19:1)Untuk analisis dengan waktu singkat umumnya disertai P tinggiDerivatisasiUntuk mendapatkan senyawa yang lebih volatile dan termostabil dari pada senyawa induk dan juga lebih sensitifHarus berlangsung cepat dalam kondisi yang sudah disiapkan harus reproducibleKadang perlu double derivatisasi untuk kuantifikasi jumlah yang sangat kecilDer 1. Cairan pelarut diuapkan dengan aliran gas N2bebas O2. Residu dilarutkan lagi, lalu diinjeksikan (der II)Perlu suhu tinggi / flash alkylation

- Obat yang mengandung gugus fenolik alkoholik acyl clorida, acyl anhidride- Misal : Oxyprenolol (b-blocker) + trifluoro asetik anhidridaSenyawa yang lebih volatil- Kadang reaksi tidak terjadi -Desipramin terjadi diacyl-Misal: propanolol, prokainamid (antiaritmia), karbamazepin (antikonvulsan) Acylation (asilasi)

Alkilasi (katalisator basa)- Dimetil sulfat Memetilasi molekul yang punya atom hidrogen yang reaktif (sulfonil urea : tolbutamid)Dimetil sulfat bersifat toksik alkil halidaMisal: clorazepam + etil iodida 10 menit, pada 75oC dengan katalis K2CO3- Diazoalkana Toksik dan eksplosif Keuntungan: Cepat Tidak perlu suhu tinggi Mudah dihilangkan Misal: Warfarin Indoprofen Probenesid

Alkilasi Ekstraktif Terjadi proses bersamaan ekstraksi dan derivatisasi Digunakan pelarut campuran yang salah satunya alkil halida ekstraksi dan reaksi nukleofilik Keuntungan : cepat, mudah dan aman Misal: Tiazid Furosemid Mefenamat Indometazine Oxazepam

Flash Alkilation (Katalisator Cahaya) Keuntungan cepat dan rendemen tinggi Dipakai pereaksi tri alkil anilin hidroksidatetra alkil amonium hidroksida

Langsung diijeksikan Dengan suhu tinggi reaksi akan berjalan cepatMisal: Barbiturat AntiinflamasiArilasi Relatif stabil dibanding acyl tetapi tidak volatil Pereaksi: halobenzene 2,4 dinitro fluorobenzena Misal: senyawa amin primer, skunder, fenol

Esterifikasi (Katalisator Asam)DiklofenakIndolon derivatPembentukan karbamatSiklisasiSiklisasi (biguanid dan guanid)O

- Hidrolisis- Oksidasi Fenil butazon- Reduksi- SililasiAnalisis kuantitatif Standar Eksternal Internal

KCKT /HPLCKromatografi cair Kinerja Tinggi/High Performance Liquid ChromatographyDitinjau dari:Alat- Kromatografi kolom- Fase diamnya terpacking dalam kolom2. Pemisahan- Kromatografi adsorpsi / partisi- tergantung pada butiran adsorben dalam kolomKeuntungan:Dapat dilakukan pada suhu kamarDetektor dapat divariasiPelarut pengembang dapat dipakai berulang kali demikian juga kolomnyaKetepatan dan ketelitian relatif tinggi di jajaran teknik analisis fisikokimia

Waktu tambat / time retension (tR) Selang waktu yang diperlukan oleh sampel mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya dapat ditangkap detektorTm waktu tambat pelarut < tR Bahan metal anti korosif dan tahan zat kimia Bahan gelas Bahan gelas yang dilapisi metal Panjang 6-20 cm dengan diamter 2.4 - 4.6 mmKolom HPLC Kepekaan meningkat Menghemat larutan pengembang Meningkatkan kemampuan detektor Sampel yang dianalisis sedikit Menghasilkan resolusi yang baik tR dan tM singkat

Derivatisasi Banyak zat absorban maksimal 200 - 210 nmDiganggu oleh pelarut yang punya ikatan H- Zat tidak berfluoresensi Mereaksikan dengan zat tertentu Pergeseran merah Mereaksikan dengan zat tertentu Fluoresnesi Misal: asam amino + ninhidrin berwarna isoindol + o ptalaldehida fluoresensi Dengan mengukur tinggi puncak kromatogram Dengan mengukur area kromatogramAnalisis Kuantitatif:

Jika t puncak tidak ada:Yang diluar skala banyak informasi kadar yang tak terdeteksiTanggap detektor yang sama / mendekatiInternal standar:Karena GLC dan HPLC mampu memisahkan senyawa dengan struktur analog Dapat mengurangi kerja lab yang repotSyarat:Sifat fisikokimia mendekati komponen sampelStruktur molekulnya miriptR berdekatan UnchangedMetabolit+123SI4

Eksternal standar:Standarisasi kurva baku

Kadar (ng/ml) vs areaContoh: Diazepam Digoksin Fenitoin Kaptopril Nifedipin AmlodipinY = BX + A

Contoh:1. Spektrofotometer a.Asetosal dalam darah dan urin

Darah + Trinder

Protein mengendap

Sentrifuge AmatiUrine + Trinder

Amatib. Sulfa dalam darah+ aquades + TCA Protein mengendapSupernatan + pereaksi diazo amati

2. HPLC Diazepam dalam darah 1000 mL serum + 500 ml dapar boraks + 500 mL CHCl3

Ekstraksi dan sentrifuge 5000 rpm 20 menit

Lapisan CHCl3 diambil ulangi 2 kali

Ekstrak CHCl3 dikeringkan dengan mengaliri gas N2. Residu + 1000 mL metanol / air 6:4 ultrasonik 5 menitVortexSaring dengan puradiskInjeksiEluen : Metanol : air = 6:4Detektor : UV 230 nmKolom: 15 cm Shimpack ODS C-18Kecepatan: 2 ml/menitSuhu: 35oC

Imunologi Terjadi proses imunisasi melibatkan reseptor dalam tubuh antibodi dan masuknya zat asing antigen Respon bersifat spesifik Respon non spesifikSistem imun 1 trilyun sel limfosit 100 juta trilyun, molekul antibodi (protein)AntigenBM > 5000, jika < 5000 dikenal dengan haptenHapten tidak dapat membentuk antibodi sehingga perlu carrier

BM >> Misal: konjugasi dengan BSA (Bovine Serum Albumin)

Determinan Ag: Bagian dari antigen yang terikat dengan antibodiValensi: jumlah determinan Ag yang efektif dan menentukan jumlah antibodi yang terikat

Antibodi :Dihasilkan oleh sel b-limfositProtein dengan aktivitas Ab imunoglobulin Misal: IgG, M, A, D, dan EInteraksi Ag-Ab:3 kategori : primer, sekunder dan tersierPrimer : jarang bisa dilihat deteksi dengan reaksi sekunder (alat bantu visualisasi) PresipitasiAglutinasiPenting untuk uji labTersier: Tanda-tanda biologik Misal: Fagositosis, netralisasi toksin dan virus, imunitas mikroba

Untuk mengetahui interaksi primer Ag-Ab:RIA (Radio Immuno Assay) : Radioaktif

ELISA (Enzyme Link Immunosorbent Assay) : Enzimatis

3. IMMULITE (Chemiluminecent Immuno Assay) : Enzimatis

4. FPIA (Flourence Polarization Immuno Assay) : Floresensi

RIA (Radio Immuno Assay)Dikemukakan tahun 1960 oleh Yallow & Berson untuk menetapkan kadar insulin dalam serum- Reaksi imunologi Spesifik Peka (ng/mL) Perunut radioaktif- Dasar: Kompetisi Ag bertanda dan tak bertanda terhadap Ab yang jumlahnya terbatasAgAg*AbAg-AbAg*-Ab+

Jika Ag* (Jumlahnya tetap)Ag (Jumlahnya berubah)+ Ab (Jumlah tertentu dan tetap)Ag* yang membentuk Ag*-Ab akan berubah sesuai jumlah AgJumlah Ag > menyebabkan kompleks Ag*-Ab

SampelSampel : - Mengandung Ag tak bertanda - Kadarnya tidak diketahuiStandar: Kadarnya diketahuiKit RIA didesain untuk sampel serum dan plasmaAg bertanda (Ag*)Disebut juga perunut atau tracerBentuk murni dari Ag ditandai dengan radioisotopRadioisotop : H3, C14, Co57, Se75, I131, I135

Tidak stabil karena meluruh memancarkan partikel sub atomik/ energi dalam bentuk gelombang elektromagnetik (a, b dan g)

Partikel yang dipancarkan inilah yang akan diukur dengan sistem detektor yang sesuaiPada RIA yang paling banyak menggunakan I125Energi cukup besarT1/2 = 60 hariPemancar g murniDeteksinya mudah ---- gcounterJarang dipakaiEnergi terlalu rendah --- tidak pekaPada RIA yang menggunakan H3 (tritium)

AntibodiDihasilkan dari imunisasi binatang tertentu dengan Ag murni (imunogen)- Konsentrasi Ab harus terbatas 1/2 dari Ag* yang ditambahkanJika [Ab] >> menurunkan kepekaan [sampel] > --- rotasi menuruncahaya terpolarisasi meningkatAgAg-FI+Ab

TDx analyser:Ketepatan tinggiKetelitianPeka (ng/ml)Waktu singkatSpesifikSederhanaJumlah sampel kecil ( 50mL)MahalPerubahan intensitas cahaya terpolarisasi berbanding terbalik dengan konsentrasi Ag dalam sampelKeuntungan:Kerugian:

Contoh soalHitung kadar obat dengan cpm rata-rata 1860 dan 880

Dasar perhitunganTC = Total Count = Ab yang dilapiskan pada tabungMB = Maksimum Binding = Ag*-Ab dmn Ag=0NSB = Non Specific Binding = PengotorBo = A NSB = 100 %CPM netto = CPM rata2- NSBBuat persamaan : Y= BX+A dimana :Y = Log Bo B / (1- Bo/B)X = Log kadarYX