Teknik biakan murni digunakan untuk memisahkan berbagai macam bakteri. Peranan bakteri baik yang menguntungkan ataupun yang merugikan dalam kehidupan melalui proses isolasi dan identifikasi. Prinsip isolasi bakteri adalah memisahkan suatu mikroba dari mikroba lainnya sehingga diperoleh kultur murni. Identifikasi dilakukan setelah kultur murni yang berasal dari satu progeni didapatkan untuk diketahui potensinya, namun sebelum dilakukan identifikasi bakteri harus sudah diklasifikasikan. Klasifikasi merupakan proses untuk mengenali dan mengelompokkan organisme hidup. Tujuan dari klasifikasi adalah untuk mengatur kedudukan dari berbagai organisme di alam. Langkah identifikasi adalah inokulasi, inkubasi, isolasi, eksaminasi dan identifikasi. Identifikasi bakteri didasarkan pada berbagai macam sifat bakteri seperti sifat biokimia, morfologi koloni dan morfologi selnya.            Bakteri Bacillus sp. biasanya banyak ditemukan di tanah. Cara untuk mendapatkan bakteri Bacillus sp. yaitu dengan mengambil sampel tanah menggunakan sendok yang telah disterilisasikan terlebih dahulu kemudian ambil tanah sekitar kedalaman 3 cm dari permukaan tanah. Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif dengan sel batang berukuran 0,3-22x1,27-7 πm, sebagian bersifat motil (mampu bergerak) mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel, jika dipanaskan akan membentuk endospora, yaitu bentuk dorman sel vegetatif sebagai bentuk pertahanan diri yang muncul saat kondisi ekstrim yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora dibentuk dalam sporangium di dalam sel dan dibentuk saat sel masak. Endospora memiliki dinding tebal, reaktif, dan sangat resisten. Letak endospora dalam sel ukuran selama pembentukannya tidak sama antara spesies satu dengan lainnya. Beberapa spesies memiliki spora sentral, terminal, atau letal. Endospora dapat berbentuk oval, silindris, bulat, atau lainnya.

Gambar. Bacillus sp        Bacillus sp. bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, metabolisme dengan fermentasi dan respirasi.

Isolat-isolat murni tersebut dipelihara dalam medium agar miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Bacillus, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu

pengecetan gram, pengecetan negatif dan motilitasnya. Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainnya berdasarkan sifat-sifatnya yaitu: keseluruhannya merupakan pembentuk spora, hidup pada kondisi aerob baik sebagai jasad yang sepenuhnya aerob maupun aerob fakultatif, selnya berbentuk

batang, dan memproduksi katalase. 

B. Tujuan

            Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi bakteri Bacillus sp. dan mengidentifikasi

bakteri Bacillus sp. hasil isolasi dengan pendekatan mikrobiologis.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

            Alat yang digunakan adalah jarum ose, object glass, mikroskop, mikrometer, kertas

merang, tissue, tabung reaksi, pipet tetes, beaker glass, cawan petri, oven, pembakar spirtus,

inkubator, wrapper.

            Bahan yang digunakan adalah akuades, alcohol 70%, medium Nutrient Agar (NA), Nitrat

Broth (NB), Malachite Green, Starch Agar (SA), SIMA semisolid, Skim Milk Agar (SMA), Simon

Citrat, MR-VP Broth, KOH-alffanaftol, reagen A dan B, NaCl (0%, 6,5%, 10%), Kristal Violet.

Lugol’s iodine, safranin, etanol 96%, reagen H2O2, reagen lactose, rafinosa, reagen oksidase.

B. Metode

a. Pengambilan Sampel

  Pengambilan dilakukan secara aseptis

  Alumunium foil yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%

  Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam alumunium foil

steril kemudian ditutup rapat

b. Tahapan Isolasi Bacillus

  Preparasi suspense dilakukan, sebelumnya sampel tanah dimasukkan kedalam tabung

pengenceran pertama kemudian direbus 10 menit dengan suhu 80oC diatas dandang.

  Diinokulasikan sebanyak 1 ose pada medium NA, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30oC

selama 2x24 jam.

c. Tahap Pemurnian Dengan Metode Streak Kuadran

  Dipilih satu koloni yang Nampak terdiri dari satu tipe sel

  Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan

distreak pada plating NA

  Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan NA

  Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streak primer kesatu

atau kedua dan kemudian dilanjutkan kestreak sekunder tanpa kembali streak primer

  Jarum ose dibakar, angkat lalu dinginkan dan disteakan melewati streak sekunder dan

kemudian dilanjutkan kestreak tersier tanpa kembali kestreak primer dan sekunder

  Diinkubasi pada suhu 30OC selama 2x24 jam

d. Pengamatan Morfologi Koloni

  Dibuat biakan pada media Nutrient Agar (NA) cawan

  Inkubasi 2x24 jam pada suhu 30oC

  Perbedaan bentuk koloni, bentuk tepi, elevasi dan lainnya diamati

e. Pengukuran Panjang dan Lebar Sel

  Disiapkan mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang terkalibrasi

  Dibuat preparasi ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana dengan

menggunakan pewarnaan metilen blue

  Diukur panjang dan lebar sel kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya (µm).

f. Uji Pewarnaan Gram

  Dibuat ulasan bakteri pada object glass, difiksasi

  Ditetesi dengan gram A (kristal violet), dibiarkan selama 60 detik

  Dicuci dengan air mengalir, keringanginkan

  Ditetesi dengan gram B (lugol’s iodin), dibiarkan selama 60 detik

  Dicuci dengan gram C (ethanol 96%) setetes demi setetes sampai etanol yang jauh

berwarna bening dan jangan sampai terlalu banyak.

  Ditetesi dengan D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan dikeringanginkan

  Diamati dibawah mikroskop

g. Uji Pewarnaan Endospora

  Dibuat ulasan bakteri pada object glass lalu ditutupi dengan kertas merang

  Ditetesi dengan Malachite Green diatas kertas merang dan diletakkan di atas air mendidih.

Dibiarkan selama 5 menit, jika pinggir mulai mengering tambahkan lagi Malachite Green

  Setelah dingin , object glass dibilas dengan aquades mengalir

  Ditetesi dengan safranin sebagai counter stain

  Didiamkan selama 45 detik

  Dicuci dan dikeringanginkan

  Diamati di bawah mikroskop

h. Uji Motilitas

  Diinokulasikan bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose

  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 30oC

  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitas koloni menandakan

hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif.

i. Uji Hidrolisis Starch

  Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose

  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC

  Kemudian permukaan media digenangi dengan larutan Lugol’s iodine

  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitas koloni menandakan

hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih (warna biru reagen) menandakan hasil

uji negatif.

k. Uji Hidrolisis Kasein

  Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Skim Milk Agar (SMA) sebanyak 1 ose.

  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC

  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitas koloni menandakan

hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif.

l. Uji VP (Voges Proskaner)

  Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak satu ose

  Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose

  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 30oC 

  Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40 % 2 tetes

  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan

hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif.

m. Uji Katalase

  Dibuat preparat ulas bakteri pada object glass

  Ditetesi dengan larutan H2O2

  Diamati perubahan yang terjadi

  Jika terbentuk gelembung gas menunjukan bahwa hasil uji positif dan sebaliknya

n. Uji Oksidase

  Dibuat preparat ulas bakteri pada object glass, tutup dengan potongan tissue

  Ditetesi dengan reagen oksidase

  Diamati perubahan yang terjadi

  Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil negatif tidak terbentuk warna biru marun.

o. Uji Penggunaan Sitrat

  Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simon Citrate sebanyak 1 ose

  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC

  Diamati perubahan yang terjadi, jika hasil positif media berwarna biru sedangkan hasil

negatif tetap berwarna hujau.

p. Uji Lactosa dan Raffinosa

  Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Lactosa dan Raffinosa           

  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC

  Diamati perubahannya, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan

hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.

q. Uji Toleransi NaCl

  Dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang mengandung NaCl 0%, 6,5%, dan 10%

  Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu

  Diinokulasikan selama 2x24 jam pada temperature 30oC

  Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan dengan media

r. Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi

  Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber

  Ditentukan persen homologinya dengan rumus:

% Homologi= 

III.       HASIL DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil

Tabel 1. Pengamatan Morfologi sel

No Pengamatan Hasil

1. Bentuk koloni Circular

2. Ukuran Moderate

3. Elevasi Convex

4. Margin Entire

5, Permukaan Halus mengkilap

Tabel 3. Perbandingan Isolat dan Spesies-spesies Bacillus

No Jenis Uji Isolat A B C D E

1. Gram + + + + + +

2. Endospora + + + + + +

3. Katalase +

4. Starch + + + + + +

5. Casein + + + + + +

6. Rafinossa - - - - d +

7. NaCl 10% - + D d - d

8. Sitrat - - D + + +

9. Motilitas - - + + + +

10. VP + + + + - +

11. Oksidase + d D d - -

Tabel 4. Pengukuran Homologi

No Jenis Uji IA IB IC ID IE

1. Gram 1 1 1 1 1

2. Endospora 1 1 1 1 1

3. Starch 1 1 1 1 1

4. Casein 1 1 1 1 1

5. Rafinossa 1 1 1 0 0

6. NaCl 10% 0 0 0 1 0

7. Sitrat 0 0 0 0 0

8. Motilitas 1 0 0 0 0

9. VP 1 1 1 0 1

10. Oksidase 1 1 1 0 0Jumlah  karakter yang sama

8 7 7 5 5

Keterangan :

d    =    16-84% strain positifA   =    Bacillus anthracisB   =    Bacillus cereusC   =    Bacillus thuringiensisD   =    Bacillus megateriumE    =    Bacillus subtilis

Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu antara isolat

dengan spesies A (Bacillus anthracis).

B. Pembahasan

             Pengambilan sampel (tanah kandang) dilakukan dengan cara sterilisasi sendok yang ingin dipakai terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf kemudian ambil sampel tanah kedalaman 3cm dari permukaan, masukkan kedalam alumunium foil yang sebelumnya disterilisasikan terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol 70% kemudian ditutup rapat. Pengambilan sampel dilakukan dengan mensterilisasikan alat terlebih dahulu agar dapat dilindungi dari kontaminasi. Dilakukan dengan prosedur kerja aseptik dengan senyawa desinfektan yang sesuai. Menyesuaikan wadah sampel yang diambil dan metode yang sesuai dengan jenis sampel.  Kemudian sampel yang mengandung bakteri tersebut dijaga agar tetap menggambarkan kondisi yang ada sebelum memasuki tahap analisa (Anonim, 2011).v    Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan cara sampel tanah yang telah didapat dimasukkan kedalam tabung yang berisi akuades steril kemudian direbus 10 menit dengan suhu 80oC

diatas dandang, tanah rebusan diinokulasikan kedalam cawan yang telah berisi medium NA kemudian disreak sinambung, inkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang. Proses perebusan dilakukan agar bakteri yang diinginkan (Bacillus sp.) membentuk endospora. Terbentuknya endospora bertujuan untuk melindungi bakteri dari lingkungan yang kurang menguntungkan (Sudjadi, 2006).

             Misalnya, lingkungan yang terlalu kering, banyak mengandung bahan kimia, dan panas yang terlalu tinggi. Endospora memiliki dinding yang tebal, oleh karena itu bakteri yang menghasilkan endospora dapat bertahan hidup pada lingkungan yang ekstrim. Jika keadaan lingkungan membaik, maka pembungkus spora segera pecah dan bakteri kembali memulai aktivitas hidupnya sebagaimana biasanya. Contoh bakteri yang menghasilkan endospora adalah Bacillus dan Clostridium (Sudjadi, 2006).v    Pemurnian sampel dari hasil yang telah diisolasi dilakukan dengan cara pemilihan satu koloni (koloni tunggal) yang nampak terdiri dari satu tipe sel, amati bakteri Bacillus sp. inokulasikan ke media NA disteak kuadran kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang 30oC. Hasil pemurnian ambil koloni tunggal kemudian diamati bentuk, ukuran, elevasi, permukaan, dan margin didapatkan hasil koloni berbentuk bulat atau circular, berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap, dan margin entre. Bacillus berbentuk bulat (coccus), memiliki permukaan yang halus dan mengkilap (Anonim, 2011). Koloni tunggal yang terbentuk diperiksa menggunakan pewarnaan Gram untuk melihat karakteristik dinding sel dan bentuk dari sel tersebut. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan mikroskop jenis mikroskop cahaya. Untuk pengamatan dinding sel bakteri, digunakan perbesaran sebesar 1000x dan menggunakan minyak imersi (….)Selain diamati ciri-ciri morfologi koloninya hasil pemurnian juga digunakan untuk pembuatan stok di media NA miring kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang.  Pembuatan stok dilakukan dua kali, digunakan untuk melakukan berbagai macam uji.v    Pengukuran panjang dan lebar sel dilakukan dengan menyiapkan mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang terkalibrasi, dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana dengan menggunakan pewarnaan metilen blue kemudian diukur panjang dan lebar sel kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya (µm). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut (Anonim, 2011). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin (Sudjadi, 2006).            Hasil perhitungan kalibrasi dimana skala object dibagi dengan skala okuler dikali 10 µm didapatkan hasil 2,5 µm, sehingga didapatkan panjang sel sebenarnya, skala panjang dikali hasil kalibrasi yaitu 2,5 µm kemudian lebar sel sebenarnya, skala lebar dikali hasil kalibrasi yaitu didapatkan 2,5 µm. Bacillus thuringiensis atau biasa disebut Bt berbentuk batang dengan ukuran panjang 3-5 μm dan lebar 1,0-1,2 μm. Bacillus antracis yaitu bakteri berbentuk batang berukuran panjang 1-8 μm, lebar 1-1,5 μm (Sudjadi, 2006).v    Uji pewarnaan gram dilakukan dengan mengulas bakteri pada object glass kemudian difiksasi selama 3-5 kali tujuan dari fiksasi adalah untuk mematikan sel bakteri tanpa merubah bentuk dan strukturnya, membuka pori-pori dari sel bakteri sehingga mudah terwarnai, dan merekatkan bakteri ke object glass (Udin, 2001). Kemudian ditetesi dengan gram A yaitu Kristal violet didiamkan selama 60 detik, pemberian Kristal violet bertujuan untuk memberikan warna dasar atau pewarna primer yaitu pewarnaan dinding sel bakteri (Anonim, 2011).            Kemudian dicuci keringanginkan, ditetesi lugol’s iodine dibiarkan selama 60 detik bertujuan sebagai pewarna kedua atau pewarna pengganti. Setelah terwarnai dicuci keringanginkan kemudian dicuci dengan gram C (ethanol 96%) setetes demi setetes sampai

ethanol yang jatuh berwarana bening, namun jangan sampai terlalu banyak. Berfungsi untuk melarutkan pewarna (decolorizing agent) kemudian ditetesi dengan gram D (safranin) dibiarkan 45 detik lalu cuci keringanginkan, pemberian safranin digunakan sebagai pewarna pembanding (James, 2008). Setelah itu amati dibawah mikroskop. Hasil yang didapat terlihat warna ungu muda. Bakteri gram positif mempertahankan zat warna gentian violet dan bakteri gram negatif mempertahankan warna merah (Udin, 2001)

    Uji pewarnaan endospora dilakukan dengan mengulas bakteri pada object glass kemudian

ditutup dengan kertas merang lalu ditetesi dengan malachite green diatas kertas merang

kemudian diuapkan diatas dandang, pemberian malachite green bertujuan untuk melumuri

fiksasi panas. Jangan sampai mengering jika kering ditetesi lagi malachite green. Pemanasan

bertujuan untuk membantu warna menembus dinding endospora. Kemudian bilas dengan

aquades lalu ditetesi dengan safranin sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri

bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (James, 2008). Didiamkan selama 45 detik,

dicuci keringanginkan kemudian diamati dibawah mikroskop didapatkan hasilkan endospora

berwarna hijau sedangkan sel vegetative berwarna merah.

    Uji mortilitas bakteri yang diinokulasikan pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose

kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang 30oC, menunjukan tidak adanya

pertumbuhan koloni pada medium tegak SIMA yang telah ditusuk dengan jarum ose, hasilnya

hanya tumbuh diatas permukaan medium. Banyaknya koloni bakteri yang tumbuh pada suatu

substrat sangat dipengaruhi oleh tersedianya kondisi fisik, nutrisi, dan sifat hudupnya (Priyani,

2006). Pertumbuhan dipermukaan medium ini dikarenakan Bacillus merupakan bakteri yang

bersifat aerob. Namun tidak membuktikan mortilitas, hal ini disebabkan pada saat

menginokulasikan bakteri dengan menggunakan jarum ose, bakteri tersebut tidak masuk ke

dalam media hanya tertanam dipermukaan. Namun ada beberapa spesies Bacillus yang tidak

bersiat motil salah satunya adalah Bacillus anthracis merupakan bakteri  berbentuk batang,

berukuran 1,6 µm, tidak mempunyai alat gerak atau motil (Akoso, 2009).

    Uji hidrolisis starch dengan menggunakan medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose yang

diinkubasi selama 2x24 jam dalam suhu ruang kemudian permukaan media digenangi dengan

larutan Lugol’s iodine menghasilkan positif karena terbentuknya zona jernih pada media hal ini

disebabkan karena  enzim amilase yang bersifat eksoenzim akan memecah amilum menjadi

monomer-monomernya. Starch atau pati dipecah menjadi unit-unit yang lebih kecil yaitu dengan

memotong ikatan-ikatan glikosidiknya. Salah satu yang dapat memotong ikatan glokosidik

adalah enzim amilase (Anonim, 2011).

    Uji hidrolisis kasein menggunakan medium padat Skim Milk Agar (SMA) diinokulasikan

bakteri sebanyak 1 ose kedalam medium tersebut kemudian diinkubasi selama 2x24 jam suhu

ruang. Hasil menunjukan positif yaitu terdapatnya zona jernih pada media SMA. Kaseinase

akan memecah kasein menjadi parakaseinase yang dapat bereaksi dengan susu tersebut

sehingga menghasilkan kalsium parakaseinat.

    Uji VP (Voges Proskaner) menggunakan medium cair MR-VP yang telah diinokulasikan

dengan 1 ose bakteri kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC, bakteri

ditetesi dengan alfanaftol sebanyak 3 tetes dan KOH 40% 2 tetes menunjukan hasi positif

karena warna media menjadi orange muda mendekati merah. Penambahan alfanaftol akan

bereaksi dengan aseton sedangkan pemberian KOH 40% untuk mengoksidasi proses tersebut

sehingga terjadi warna orange sampai merah.

            Prinsip dari uji ini adalah menentukan kemampuan beberapa mikroorganisme untuk

menghasilkan produk akhir yang netral (asetil-mythyil karbinol) dari fermentasi glukosa. Uji ini

digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-

butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk

utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan (Sudjadi, 2006).  

            Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alfanaphtol dalam etanol dapat menentukan

adanya asetolin (asetilmethylkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintetis 2,3-butanadiol.

Penambahan KOH adanya asetolin ditunjukan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah

muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alfanaphtol. Perubahan

warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian

2,3-butanadiol dioksidasi kembali menjadi asetolin sehingga memperjelas hasil reaksi (Sudjadi,

2006).

    Uji katalase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object glass, ditetesi

dengan larutan H2O2 kemudian diamati perubahan yang terjadi hasil menunjukan positif karena

terbentuknya gelembung gas. Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif),

mikroorganisme menghasilkan hydrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan

superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah yang besar akan menyebabkan

kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif

aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur repirasi aerobik.

            Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk menguraikan

khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase

bisa diidentifikasikan dengan menambahkan reagen H2O2 pada suspense bakteri. Jika

dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika

tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif (Anonim, 2011).

         Uji oksidase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object glass, ditutup

dengan potongan tissue, ditetesi dengan reagen oksidase kemudian diamati perubahan yang

terjadi. Hasil yang didapat positif karena hasil ulasan yang telah ditetesi reagen oksidase

berwarna biru marun. Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport electron

selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh

molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan

mikroaerofilik. Sifat kemoorganotrop dan fakultatif anaerob pada Bacillus sp. Menyebabkan

bakteri ini mampu memanfaatkan sumber karbon tersedia (Priyani, 2006).

            Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama

penguraian karbohidrat untuk menghasilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom

oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada

koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses

foforilasi oksidatiif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-

phenylenediaminedihyrocloride. Reagen akan mendonorkan electron terhadap enzim ini

sehingga akan terosidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda

(warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki

sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan

negatif (James, 2008).

    Uji penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji pada medium agar

miring Simon Citrate sebanyak 1 ose, inkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC

kemudian diamati  perubahan yang terjadi, hasil yang didapat adalah negatif karena media

tetap berwarna biru. Sumber karbon asam sitrat akan dipecah menjadi oksalo asetat kemudian

menjadi asam asetat. Karena adanya proses peningkatan ph sehingga berwarna biru (Anonim,

2011).

    Uji lactose dan raffinosa dilakukan dengan cara bakteri uji ditumbuhkan pada medium

lactosa dan raffinosa, diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30oC kemudian diamati

perubahan warna pada media, hasil menunjukan bahwa warna media tidak berubah tetap

berwarna ungu.

    Uji toleransi NaCl dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang mengandung NaCl 0%, 6,5%,

dan 10%, isolate diinokulasikan kedalam ketiga tabung masing-masing 1 ose, diinkubasi

selama 2x24 jam pada temperature 30oC kemudian diamati hasilnya dengan melihat tingkat

kekeruhan media. Hasil yang didapat tingkat kekeruhan yang paling tinggi adalah pada

konsentrasi NaCl 0%.

    Penentuan spesies melalui pendekatan homologi dilakukan dengan mengumpulkan data-

data yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber.  

Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu antara isolat

dengan spesies A (Bacillus anthracis). Karena pengambilan sampel tanah disekitar  kandang

maka tanah tersebut mengandung banyak Bacillus anthracis. Bakteri ini banyak menyerang

hewan herbivora. Misalnya domba, lembu, unta, rusa, sejenis campuran kuda-keledai, kuda,

dan kambing. Bacillus anthracis termasuk klasifikasi gram positif, nonmotile, yang menjadi cikal

bakal bakteri spora. Kuman ini berkembang dan bertahan tahunan dalam berbagai keadaan di

tanah, air, atau benda apa pun. Vegetasi sel berukuran panjang 8 mikron dengan lebar 1-1,5

mikron ini mampu hidup selama bertahun-tahun di tanah (Akoso, 2009).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

            Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Bacillus sp. memiliki ciri-ciri morfologi sebagai berikut: koloni berbentuk bulat   atau circular,

berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap, dan margin

entre.

2. Lebar sel Bacillus sebenarnya 2,5   sedangkan Panjang sel sebenarnya 2,5  .

3.  Hasil uji positif yaitu uji pewarnaan gram, pewarnaan endospora, uji hidrolisis starch, uji

hidrolisis kasein, uji VP, uji katalase, dan uji oksidase.

4.  Hasil uji negatif  yaitu uji lactose dan raffinosa, uji motilitas, uji penggunaan sitrat,  dan uji

toleransi NaCl.

5.  Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu

isolat Bacillus anthracis karena sampel yang digunakan adalah tanah kandang.

B. Saran

            Saran untuk praktikum selanjutnya adalah sebaiknya pada saat praktikum dan

pengamatan jangan terlalu pagi, dan lebih diperbanyak lagi  alat-alat praktikum

DAFTAR REFERENSI

Akoso., B. 2009. Epidemiologi dan Pengendalian Anthrax Penyakit Menular pada  Hewan dan Manusia. Penerbit Kanisius (Anggota IKAPI). Yogyakarta.

Anonim. 2011. http://dunia-mikro.blogspot.com/2008/08/pengecatan-endospora.html. diakses pada tanggal 29 November 2011.

                                                         

Anonim. 2011. http://gurungeblog.wordpress.com/2008/11/17/bakteri-ciri-ciri-struktur-perkembangbiakan-bentuk-dan-manfaatnya/. diakses pada tanggal 29 November 2011.

Anonim. 2011. http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri. diakses pada tanggal 29  November 2011.

Anonim.  2011. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2010/12/pengambilan-dan-preparasi-sampel.html. diakses pada tanggal 30 November 2011

Anonim. 2011. http://eprints.undip.ac.id/13402/1/Laporan_penelian.pdf. Diakses pada tanggal 1 Desember 2011.

Barrow, G. I and Feltham, R.K.A.1993. Cowan and Steel’s Manual for The Identification of Medical Bacteria Third Education. Cambridge: University    Press, Australia.

Dwipayana., Herto. D. 2010. Identification of Bacterial Diversity in Waste Recycling Paint Sludge by Conventuonal Microbiological Technique. Environmental Engineering Study Program. Bandung.

James. J., Colin. B. 2008. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Penerbit Erlangga.

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia            coli dalam             Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif Detergen.Jurnal Biologi Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37.

Sudjadi. B., S. Laila. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan. Penerbit Yudhistira.

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia coli dalam

Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif                     Detergen.Jurnal       Biologi

Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37.

Sudjadi. B., S. Laila. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan. Penerbit Yudhistira.

Diposkan oleh fidia permaisari di 07.21