BAB IVMETODE PENELITIAN

4.1 Jenis PenelitianPenelitian yang dilakukan ini adalah penelitian eksperimental laboratoris4.2Lokasi Penelitian1. Pengumpulan, aklimatisasi, pemeliharaan dan pemberian perlakuan sampel dilakukan di Laboratiorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya1. Pembuatan ekstrak air teripang emas dan uji kandungan teripang emas dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Konsultasi Industri Surabaya.1. Pembuatan sediaan dan pengamatan sediaan histometri dilakukan di Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

4.3 Unit sampelPenelitian ini menggunakan sampel tikus (Rattus norvegicus) dengan kriteria:1. Jenis kelamin jantan.2. Usia antara 2- 4 bulan3. Berat badan 200- 300 gram 4. Mukosa bibir bawah normal, tidak terdapat kelainan.5. Ulser dibuat dengan cara mukosa bawah bibir tikus dilukai dengan burnisher no.4 yang telah dipanaskan selama 1 menit, dan disentuhkan selama 1 detik pada mukosa.6. Kondisi fisik sehat dan memungkinkan untuk dijadikan sampel.(Harmani, 2005)4.4Besar SampelBesar sampel diperoleh menggunakan rumus (Lemmeshow et al, 1990):

n =22 [Z 1-/2 + Z 1-]2 (1 - 2)2Keterangan:n = jumlah sampel minimal pada masing-masing kelompok = level signifikasi 5%, = 0,051-= kekuatan (kuasa) dari test 80%, =0,2Z1-/2= nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan tingkat kemaknaan (untuk = 0,05 adalah 1,64)Z1- = nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan kuasa (power) sebesar diinginkan (untuk =0,2 adalah1,28 )1 - 2 = Selisih rata- rata perlakuan 1 dan 2 ( 21,125-26,0)

n = 2(2,47)2{1,64+1,28}2(21,125-26,0)2

n= 12,20 (8,52) 23,76

n= 4,37 = 5

Apabila telah dilakukan penelitian pendahuluan, maka akan didapatkan hasil. Kemudian dilakukan perhitungan menggunakan hipotesis tes untuk menentukan means dua populasi (two-sided test). Didapatkan jumlah sampel masing-masing kelompok sebanyak 5 sampel, pada masing- masing kelompok. Rancangan penelitian yang dipergunakan adalah rancangan Randomized Post test only control group design, karena pengukuran variabel dilakukan setelah perlakuan dan pengambilan sampel dilakukan secara acak, serta ada kelompok kontrol atau pembanding. Hewan coba dibagi dalam 4 kelompok, yaitu kelompok kontrol 1 (KI) yang diberi ekstrak teripang emas konsentrasi 80% dan kelompok Perlakuan 1 (P1), kelompok kontrol 2 (KII) yang diberi ekstrak teripang emas konsentrasi 40% dan kelompok Perlakuan 1 (P1), kelompok kontrol 3 (KIII) yang diberi ekstrak teripang emas konsentrasi 20% dan kelompok Perlakuan 1 (P1), dan kelompok ke IV adalah kelompok kontrol negatif yang tidak diberi perlakuan ekstrak teripang emas. P1 dapat diperoleh dari pengamatan pada hari ke- 7.

4.5Waktu PenelitianPengumpulan sampel, pemberian perlakuan sampel, pembuatan sediaan histopatologi serta analisis data dimulai sejak bulan Januari 2012 sampai dengan bulan Mei 2013 sampai Juni 2013.4.6 Variabel Penelitian1.Variabel bebas: ekstrak air teripang emas2.Variabel tergantung: tebal epitel mukosa rongga mulut tikus wistar3.Variabel terkendali: a. Jenis anastesib. Dosis obat anastesic. Cara pemberian ekstrak teripang emasd. Lingkungan kandange. Berat badan hewan cobaf. Umur hewan cobag. Jenis tikus h. Pakan hewan cobai. Teknik perlakuan j. Pembuatan ulserk. Lokasi ulser4.7Definisi Operasional1.Ekstrak teripang emas dibuat dengan cara maserasi teripang emas dalam air, kemudian dilakukan dalam freeze dried untuk mendapatkan kandungan bahan aktif pada teripang emas. Setelah itu dibuat sediaan topikal dengan bahan dasar Polieten Glikol 4000 (PEG 4000) dan Polieten Glikol 400 (PEG 400)2.Tebal epitel diukur dengan cara menghitung peningkatan yang dihasilkan setelah perlakuan dengan cara histometri. Tebal epitel yang diukur merupakan panjang epitel yang diukur dari stratum basal hingga stratum terluar mukosa pada hari ke-7 setelah perlakuan (Prasetyo et al, 2010) menggunakan program Cell D (Olympus) melalui fotomikroskopi yang berupa mikroskop IX- 71 (Olympus) dan kamera DP- 72 (Olympus, Japan). Pengukuran tebal epitel ini dilakukan sebanyak tiga kali dan diambil rata- rata dalam satuan mikrometer. 4.8Alat penelitian0. Autoclave0. Stirer 0. Gelas ukur0. Burnisher0. Timbangan0. Termometer0. Vibrator0. Tabung reaksi dan rak0. Pengaduk kaca0. Becker Glass0. Pipet0. Sarung tangan0. Kaca Mulut0. Oven0. Lampu0. Disposible syringe 2,5 ml0. Penutup mulut0. Botol tempat sampel 0. Label, Slide dan Cover glass0. Petri disk0. Burner0. Pinset kedokteran gigi0. Eskavator

4.9Bahan Penelitian0. Teripang Emas Stichopus hermanii dewasa, diperoleh dari hasil tangkapan nelayan di Provinsi Kalimantan daerah Bontang, dengan berat 200-300 gr/ ekor0. Cotton buds0. Paraffin0. Xylol0. Aquadest0. Eter0. Buffer Formalin0. Etanol 50%

4.10Prosedur Penelitian4.10.1Pengajuan Laik Etik PenelitianPengajuan Laik Etik diajukan ke Komite Kelaikan Etik Penelitian Kesehatan (KKEPK) Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga sebelum melakukan penelitian. Penelitian dapat dilakukan setelah mendapatkan sertifikasi kelaikan etik yang dikeluarkan oleh komisi etik penelitian.4.10.2 Tahap persiapan1.Persiapan BahanTeripang Emas yang telah didapat dari Bontang, dikumpulkan dan kemudian dicuci dengan air mengalir, lalu dipotong secara longitudinal mengikuti sumbu tubuh teripang, kemudian organ dalam dipisahkan. Bagian tubuh yang masih tersisa dikeringkan diatas kertas blooting, sebelum di homogenisasi menjadi tekstur yang halus. Ekstrak disiapkan dengan cara, setiap 50 gram jaringan yang telah dihomogenisasi ditempatkan pada conical flask 250 ml ditambahkan 100 ml air (distiled water). Kemudian campuran dikocok dengan water-bath shaker pada kecepatan 80rev/min pada suhu kamar selama 4jam. Hasil dari percampuran di sentrifugal pada 3.000rpm selama 20 menit. Kemudian ekstrak difreeze dried dengan menggunakan freeze-dryer (model Heto FD3, ID 87164). Hasil yang didapatkan berupa bubuk teripang dan disimpan dalam botol steril pada suhu 4o (Ridzwan et al, 2001). Dari 800 gram teripang segar didapatkan ekstrak teripang kering sebanyak 15 gram.

Prosedur pembuatan basis gel dengan PEG 400 dan PEG 4000 : Ekstrak Teripang Emas diletakkan pada mortir panas. PEG 400 dan PEG 4000 dilelehkan dalam cawan porselin diatas penangas air dengan perbandingan 1:2, setelah cair/leleh, basis dituang dalam Ekstrak Teripang Emas dan diaduk sampai homogen. Kemudian ditambah sisa basis sedikit demi sedikit sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan yaitu 80%, 40%, dan 20% kemudian diaduk sampai terbentuk massa gel yang halus dan homogen. Kemudian Gel dikemas dalam wadah tertutup rapat (Muryani, 2007).

1. Persiapan Hewan CobaSeluruh hewan coba diaklimatisasi selama 3 hari pada lingkungan percobaan (Capdevila et al, 2007). Tikus wistar jantan berumur 2-4 bulan dengan beratbadan 200-300gram, diberi pakan dengan merek yang sama dan diganti setiap hari. Kandang percobaan dibersihkan setiaphari untuk mencegah infeksi yang dapat diakibatkan oleh kotoran tikus tersebut. Hewan coba diletakkan dalam kandang yang jauh dari kebisingan, masing-masing kandang berisi 7 ekor. Kandang hewan coba terbuat dari kotak plastik dengan ukuran 40x30x15 cm, dan ditutup dengan anyaman kawat yang bisa dilepas sehingga mudah dibersihkan, Hewan dipuasakan pada alam hari (air minum tetap diberikan) sebelum penelitian dilakukan keesokan harinya untuk menghilangkan adanya pengaruh makanan (Kusumawati, 2004). Setiap kandang diberi label berupa nama kelompok, alas kandang diberi sekam dan diganti setiap dua hari, diberi tempat makanan, dan botol yang ujungnya terdapat pipa untuk sedotan sebagai tempat minum tikus putih (Yulianto, 2008).

4.10.3 Tahap Perlakuan1. Mukosa bibir bawah tikus dipotong pada 4 hari dan 10 hari setelah perlakuan, kemudian direndam dalam buffer formalin 10 % (pH 7,4). 2. . Fiksasi dilakukan 2 tahap, setelah 48 jam pertama larutan fiksasi diganti yang baru dan pada tahap kedua dibiarkan dalam larutan fiksasi selama 48 jam (ketebalan jaringan 0,5 cm). Fiksasi dilakukan untuk menghentikan proses autolisis pada sel yang disebabkan oleh enzim lisosim yang dilepaskan saat kematian sel dan agar tidak terjadi perubahan pada sel yang disebabkan oleh perlakuan selanjutnya. Setelah dilakukan fiksasi jaringan dibilas dengan air mengalir selama 6 9 jam.1. Tahap selanjutnya adalah dehidrasi I untuk mengekstrasi air dari jaringan dan menggantinya dengan parafin. Prosesnya yaitu dengan cara jaringan dicuci alkohol dengan konsentrasi 80 % selama 1 jam, alkohol 95 % 2 kali 1 jam dan alkohol 100 % (absolut) 3 kali 1 jam.1. Kemudian dilakukan penjernihan atau clearing I dengan cara memasukkan ke dalam larutan Xylene 2 kali 0,51 jam. Pada 10 menit terakhir proses clearing ini dinaikkan sampai 62 C dengan memasukkan ke dalam inkubator (Sudiana, 2004).1. Proses berikutnya adalah dilakukan infiltrasi I pada jaringan. Infiltrasi pertama ini dilakukan tidak lebih dari 5 menit. Kemudian setelah selesai infiltrasi I, jaringan dicelupkan ke dalam xylene selama 23 menit. Kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 95 % selama setengah jam, dicuci dengan air mengalir selama 12 jam (Sudiana, 2004). 1. Setelah proses infiltrasi dilakukan kembali proses dehidrasi II dan clearing II cara sama seperti dehidrasi I dan clearing I. Kemudian dilakukan infiltrasi II yaitu dengan cara mencelupkan jaringan ke dalam paraffin yang telah dicairkan pada suhu 62 C , selama 1,5 jam sebanyak 2 kali (Sudiana, 2004).1. Tahapan selanjutnya adalah embedding. Disini jaringan ditanam ke dalam balok paraffin, caranya paraffin cair dituangkan ke cetakan yang dibentuk dari 2 logam, yang disusun membentuk kotak yang diberi alas lembaran logam. 1. Segera setelah paraffin cair dituangkan ke cetakan, potongan jaringan dimasukkan mamakai alat pinset dengan arah permukaan jaringan yang akan dipotong menghadap ke dasar bagian atas diberi label tanda. Setelah paraffin mengeras selanjutnya logam cetakan dapat dilepas (Sudiana, 2004).1. Tahapan terakhir adalah Pemotongan yang dilakukan dengan rotary microtome secara serial dengan ketebalan 5 . Selama waktu pemotongan suhu blok diusahakan rendah yaitu 5-10 C, hal ini diusahakan dengan mendinginkan blok dan pisau pemotong dengan air es. Gunanya agar sediaan tetap basah dan yang tertanam blok dapat terpotong dengan baik. Dari potonganpotongan ini dipilih yang bagus kemudian dimasukkan ke dalam water bath. 1. Sayatan jaringan ditempelkan pada gelas objek yang dilapisi poly-L- lysine bahan ini kemudian siap diwarnai (Sudiana, 2004).

4.11 Teknik Pemeriksaan Histometri Untuk Menghitung Tebal Epitel1.Teknik yang pertama adalah terlebih dahulu dilakukan deparafinisasi pada pengecatan HE (Hematoxilin eosin). Tahap ini dilakukan untuk menghilangkan parafin yang menempel pada irisan jaringan sehingga bahan cat dapat melekat. 2.Mencelupkan slide ke dalam larutan xylol selama 2 jam sebanyak 2 kali, etanol absolute selama 1jam sebanyak 2 kali, etanol 95% selama 1 jam sebanyak 2 kali, etanol 80% selama 1 jam. 3.Dicuci dengan air 10-15 menit. 4.Dimasukkan ke dalam larutan Mayers haematoksilin selama 15 menit untuk mewarnai inti sel, dicuci dengan air mengalir /air hangat untuk menghilangkan kelebihan cat selama 20 menit. 5.Pengecatan dengan lithium karbonat, slide dimasukkan ke dalam lithium karbonat selama 1-2 menit agar didapatkan inti yang membiru, dicuci dalam air mengalir selama 5-10 menit. 6.Pengecatan dengan Eosin yaitu dengan memasukkan slide ke dalam larutan eosin selama 15 detik-2 menit, tujuan tahap ini untuk memberi pewarnaan pada sitoplasmanya (Sudiana, 2004). 7.Proses berikutnya adalah dehidrasi yaitu dengan memasukkan slide ke dalam etanol 95 % selama 2 menit sebanyak 2 kali dan etanol absolute selama 2 menit sebanyak 3 kali. 8.Proses clearing yang bertujuan untuk menghilangkan sisa- sisa alkohol dengan cara memasukkan ke dalam larutan xylol selama 2 menit sebanyak 3 kali. 9.Tahap terakhir adalah Mounting. Sediaan ditetesi entellan kemudian ditutup dengan gelas penutup dan siap dilakukan pemeriksaan di bawah mikroskop cahaya hasil yang didapatkan adalah inti berwarna biru dan sitoplasma sel berwarna merah (Sudiana, 2004). Perhitungan tebal epitel dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan menggunakan foto mikroskopi IX 71 (olympus) dan dievaluasi dengan program Cell D (Olympus, Japan). Perhitungan fibroblast pada lapang pandang dengan menggunakan digital marking (Moirea, 2006).4.12 Analisis DataHasil yang diperoleh nanti kemudian dilakukan analisa data statistik. Untuk mengetahui data terdistribusi normal digunakan uji kolomogorov- smirnov Test. Apabila distribusi normal maka analisa data tebal epitel menggunakan uji ANOVA, apabila terdapat perbedaan bermakna dilanjutkan dengan uji LSD dan jika distribusi yang tidak normal maka dilakukan analisa data dengan menggunakan uji Mann- whitney test untuk mengetahui perbedaan pengamatan antara perlakuan topikal gel teripang emas konsentrasi 80%, 40%, 20% dengan kelompok kontrol pada pengamatan hari ke-7 (Filho, 2007).

4.13 Alur PenelitianSampel tikus jenis Rattus norvegicus strain Wistar (tikus Wistar)Pembuatan Ulser mukosa bibir bawah dengan burnisherIrigasi aquadest steril dan dikeringkanKonsentrasi 80%Konsentrasi 20%Konsentrasi 40%

Pemberian gel ekstrak teripang emas (kelompok perlakuan)

Tanpa perlakuan (Kelompok kontrol)

7 hari

Aklimatisasi

Pemeriksaan histometri

Tebal Epitel

Hasil

Analisis data

Kesimpulann