3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

Pada bab ini akan diuraikan tinjauan pustaka yang berkaitan dengan penelitian

yang dilakukan, yang meliputi informasi mengenai genom mitokondria, DNA

mitokondria sebagai materi genetik, daerah D-loop mtDNA, laju mutasi mtDNA,

peran mutasi mtDNA pada penuaan, peran mtDNA dalam identifikasi forensik,

Polymerase Chain Reaction (PCR), Direct Sequencing dengan metode Dideoksi –

Sanger.

II. 1. Genom Mitokondria

Mitokondria merupakan organel intrasel penghasil energi yang terdapat pada

semua sel eukariot. Mitokondria berbentuk elips dengan diameter ~5μ m dan

panjang ~1μ m (Gambar II.1). Struktur mitokondria terdiri dari membran luar,

membran dalam, ruang antar membran, dan matriks mitokondria. Membran luar

berpori, mengandung sejumlah protein transpor yang disebut dengan porin, yang

membentuk saluran yang berukuran relatif besar pada lapisan bilayer membran

luar. Adanya protein ini memungkinkan membran luar untuk menyaring ion-ion

atau molekul-molekul berukuran 5 kDa atau kurang. Membran luar juga

mengandung enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis dan katabolisme lipid.

Membran dalam mitokondria memiliki struktur berlipat-lipat, yang disebut

dengan krista. Struktur ini meningkatkan luas permukaan membran dalam

sehingga meningkatkan kemampuan mitokondria dalam menghasilkan ATP.

Membran dalam mengandung protein yang terlibat dalam reaksi oksidasi pada

proses respirasi, enzim ATP sintase yang berfungsi membentuk ATP pada matriks

mitokondria, dan protein transport yang mengatur lalu lintas metabolit keluar

masuk matriks mitokondria melewati membran dalam. Ruang antar membran

terletak di antara membran dalam dan membran luar dan mengandung sekitar 6%

total protein mitokondria.

4

DNAKrista MatriksRibosomMembran dalamMembran luar

Gambar II. 1. Struktur Mitokondria. Mitokondria memiliki membran luar,

membran dalam, ruang antar membran, dan matriks mitokondria (Cooper, 2000).

Matriks mitokondria mengandung sebagian besar protein mitokondria, yaitu

sekitar 67%. Banyak proses metabolisme yang terjadi pada matriks mitokondria,

sehingga di dalamnya banyak ditemukan enzim-enzim yang berperan dalam

proses metabolisme tersebut, misalnya kompleks piruvat dehidrogenase, enzim-

enzim yang berperan dalam siklus Krebs,β oksidasi asam lemak, dan oksidasi

asam amino. Di dalamnya juga terdapat DNA, ribosom, ATP, ADP, ion-ion,

seperti Mg2+, Ca2+, K+, serta metabolik intermediet yang larut (Karp, 1999). Peran

nukeotida purin dan pirimidin diketahui berfungsi sebagai prekursor monomer

asam nukleat. Nukleotida purin berfungsi juga sebagai sumber energi dalam

bentuk ATP. Nukleotida pada DNA berikatan secara kovalen melalui jembatan

fosfat dan ikatan fosfodiester antar nukleotida terletak pada arah yang sama

disepanjang rantai ujung 5’ dan ujung 3’ (Gambar II.2)

5

Ujung 5’ a). b).

Ujung 3’Ujung

5’

Ikatan fosfodiester

Ujung 3’

Gambar II.2. Struktur molekul DNA. a). Struktur kovalen DNA melalui jembatan fosfodiester antar nukleotida pada DNA, b). Skematik urutan nukleotida pada potongan DNA dengan lima unit nukleotida

Mitokondria dalam sel eukariot berfungsi sebagai penghasil energi, dalam bentuk

ATP, melalui serangkaian tahap yang disebut dengan fosforilasi oksidatif. Reaksi

ini melibatkan lima macam kompleks enzim, yaitu Kompleks I NADH-ubikuinon

reduktase, Kompleks II suksinat-ubikuinon reduktase, Kompleks III ubikuinol-

sitokrom c oksidase, Kompleks IV sitokrom oksidase, dan Kompleks V ATP

sintase. Secara singkat, proses fosforilasi oksidatif adalah sebagai berikut

kompleks I dan kompleks II mengalirkan pasangan elektron masing-masing dari

NADH dan suksinat menuju ubikuinon (Q). Ubikuinon merupakan titik temu

6

antara elektron yang dilepaskan oleh kompleks I, II, dan elektron yang dilepaskan

oleh FADH2. Kompleks III selanjutnya memindahkan pasangan elektron dari

ubikuinon menuju sitokrom c. Pada tahap terakhir, kompleks IV mengalirkan

elektron dari sitokrom c menuju O2, sekaligus mereduksi O2 menjadi H2O.

Sedangkan kompleks V akan mengkatalisis rekasi pembentukan ATP dari ADP

dan fosfat anorganik (Pi). Proses ini terkait dengan aliran proton dari ruang antar

membran menuju matrik melewati membran dalam (Karp, 1999). Proses

fosforilasi oksidatif untuk menghasilkan ATP secara singkat dapat dilihat pada

Gambar II. 3.

Ruang antar membran

FumaratSuksinat

Matriks

Gambar II. 3. Reaksi Fosforilasi Oksidatif. Reaksi untuk menghasilkan ATP ini melibatkan lima kompleks enzim, yaitu Kompleks I NADH-ubikuinon reduktase, Kompleks II suksinat-ubikuinon reduktase, Kompleks III ubikuinol-sitokrom c oksidase, Kompleks IV sitokrom oksidase, dan Kompleks V ATP sintase (Karp, 1999)

Komposisi genom mitokondria manusia terdiri atas dua gen ribosom RNA (12 S

rRNA dan 16 S rRNA), 22 gen tRNA (1 gen tRNA untuk masing-masing asam

amino dan 2 tRNA ekstra: tRNAleu dan tRNAser), 13 gen yang mengode 13

subunit (tujuh subunit kompleks I NADH-dehidrogenase: ND1, ND2, ND3,

ND4L, ND4, ND5, ND6, satu subunit kompleks III sitokrom b: cyt.b, tiga subunit

kompleks IV sitokrom oksidasi: COI, COII, COIII, dan dua subunit kompleks V

ATP sintase: ATP 6 dan ATP 8) dari 70 subunit kompleks enzim respirasi, dan

daerah D-loop (Anderson et al., 1981; Horaiet et al., 1995).

7

II. 2. DNA Mitokondria (mtDNA) sebagai Materi Genetik

Mitokondria memiliki sistem genetik yang berbeda dengan sistem genetik inti sel.

DNA mitokondria manusia berbentuk lingkaran tertutup dan beruntai ganda

(double stranded). Dua untai pada DNA mitokondria ini dikenal dengan untai

heavy (H) dan untai light (L). Penamaan ini didasarkan pada perbedaan densitas

tiap untai dalam gradien denaturan CsCl, dimana untai H memiliki berat molekul

yang lebih besar dibandingkan dengan untai L karena untai H memiliki lebih

banyak basa-basa purin yang memiliki dua buah cincin pada strukturnya yang

dinyatakan dalam rasio G : C. Jika rasio G : C lebih dari satu maka untai tersebut

adalah untai H (Anderson et al., 1981). Urutan nukleotida DNA mitokondria

sudah ditentukan secara lengkap oleh Anderson pada tahun 1981. MtDNA

berukuran 16569 pb (Gambar II.4) dan menyandi 37 gen, yaitu 22 tRNA, 2 rRNA,

dan 13 polipeptida untuk kompleks protein yang dibutuhkan pada reaksi

fosforilasi oksidatif.

Untai H

16569 pb

Untai L

Gambar II.4. Struktur DNA Mitokondria. Mitokondria berukuran 16569 pb,

beruntai ganda, untai H dan untai L. MtDNA menyandi 37 gen untuk 2 rRNA, 22 tRNA, dan 13 polipeptida untuk kompleks protein yang dibutuhkan pada fosforilasi oksidatif. MtDNA juga memiliki daerah pengontrol yang tidak mengode protein yang disebut dengan D-loop berukuran 1121 pb (Anderson et al.,1981; Andrews et al., 1999)

8

Bentuk mtDNA adalah sirkular terdiri atas untai H (Heavy) memiliki basa G lebih

banyak dan untai L (Light) memiliki basa C lebih banyak (Wallace, 1997).

Komponen penyusun mitokondria seperti protein struktural, protein transpor,

”mesin” sintesis protein-protein mitokondria seperti DNA polimerase, RNA

polimerase, amino asil tRNA sintetase, protein ribosomal, dan faktor pengendali

transkripsi, translasi dan replikasi DNA mitokondria (mtDNA) semua dikode oleh

inti, disintesis di sitosol kemudian ditranspor ke mitokondria (Strachan dan Read,

1999; Moraes et al., 1999) seperti tercantum dalam Tabel II.1. Sebagian besar

protein mitokondria dikode oleh DNA inti, disintesis oleh sitosol kemudian

ditranspor ke mitokondria untuk mensintesis protein mitokondria atau tergabung

dalam sistem fosforilasi oksidatif.

Tabel II.1. Hubungan Fungsi Mitokondria dengan Inti.

Komponen Dikode mtDNA Dikode DNA Inti Komponen Sistem Fosforilasi Oksidatif : I. NADH dehidrogenase II. Suksinat CoQ reduktase III. Sitokrom b-cl IV. Sitokrom c oksidase V. ATP sintase

13 subunit 7 subunit 0 subunit 1 subunit 3 subunit 2 subunit

80 subunit

> 41 subunit 4 subunit 10 subunit 10 subunit 14 subunit

Komponen Sintesis Protein : tRNA rRNA Ribosomal protein Protein mitokondria lainnya

24 22 tRNA 2 rRNA - -

∼ 80 - - ∼ 80 semua misal : DNA pol, RNA pol, enzim struktural dan transpor

Setiap sel eukariot mengandung ratusan bahkan ribuan kopi DNA mitokondria.

Mutasi dapat terjadi pada seluruh kopi mtDNA atau hanya pada beberapa kopi

saja. Apabila mutasi terjadi pada seluruh kopi mtDNA dalam sel maka kondisi ini

disebut homoplasmi, tetapi jika terjadi pencampuran lebih dari satu tipe mtDNA

di dalam sel dimana terdapat mtDNA yang termutasi dan mtDNA wild type, maka

kondisi ini disebut dengan heteroplasmi. Penyebab heteroplasmi belum diketahui

dengan pasti, Grzybowski pada tahun 2000 menjelaskan bahwa heteroplasmi

9

disebabkan karena mutasi yang terjadi pada mtDNA sel telur diikuti oleh

diferensiasi selama perkembangan embrio. Heteroplasmi dapat terdeteksi pada

berbagai jaringan, termasuk tulang, otak, hati, otot, rambut, dan darah. Pada satu

individu, heteroplasmi dapat terjadi pada satu atau lebih jaringan (Tully et al.,

1999). Namun, rambut manusia memiliki frekuensi heteroplasmi yang tinggi. Dari

satu akar rambut telah ditemukan enam macam perbedaan (Grzybowski, 2000).

Pola panjang heteroplasmi mirip untuk individu-individu segaris keturunan ibu

tetapi bervariasi untuk individu yang tidak segaris keturunan ibu (Malik et al.,

2002).

II.3. Daerah D-loop mtDNA

Daerah D-loop adalah daerah pada mtDNA sepanjang 1121 nukleotida mulai dari

nukleotida 16024 sampai 576 terletak antara gen tRNA prolin (15955-16023 pb)

dan gen tRNA fenilalanin (577-647 pb) yang tidak menyandi (mengkode) protein

tetapi mengandung beberapa basa yang mengontrol proses transkripsi dan

replikasi mtDNA sehingga disebut juga control region (CR).

Daerah D-loop merupakan daerah beruntai tiga (triple stranded), mengandung

origin of replication untuk untai H (OH) dan dua promoter utama untuk untai H

dan L (PH dan PL) (Gambar II. 3). Gen-gen mtDNA terdistribusi pada untai H dan

L. Titik awal replikasi untai H dan dua promotor transkripsi terletak pada D-loop.

Kedua promotor transkripsi tersebut berjarak 150 nukleotida dengan daerah

pengenalan oleh faktor transkripsi mitokondria pertama sepanjang 27 pasang basa

(Clayton, 1991).

D-loop memiliki adaptasi yang tinggi terhadap mutasi sehingga antar individu

yang tidak segaris keturunan ibu D-loopnya dapat sangat berbeda. Adaptasi D-

loop terhadap mutasi disebabkan karena tidak menyandi protein sehingga mutasi

pada daerah ini tidak mempengaruhi fungsi protein dan karenanya perubahan pada

D-loop tidak berpengaruh pada fisiologi mitokondria ataupun sel. Variasi antar

individu yang relatif tinggi ini menyebabkan D-loop disebut juga daerah

10

Hypervariable (HV) dan mempunyai laju mutasi lima kali lebih cepat

dibandingkan daerah lain pada genom mitokondria (Creenberg et al., 1983). D-

loop memiliki dua daerah yang sangat bervariasi, yaitu Hypervariable region I

(HVR I) pada nukleotida 16024-16383 dan Hypervariable regio II (HVR II) pada

nukleotida 57-372 (Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999).

Variasi basa atau polimorfisme yang disebabkan oleh mutasi ini disebut dengan

Single Nucleotide Polymorphism (SNP). SNP, yang dapat terjadi pada daerah

pengkode (coding region) maupun daerah bukan pengkode (noncoding region)

pada D-loop, dapat digunakan untuk membedakan satu individu dengan individu

lain. Polimorfisme pada daerah D-loop lebih tinggi daripada polimorfisme daerah

pengkode disebabkan karena laju mutasinya yang lebih tinggi.

II. 4. Laju Mutasi mtDNA

Laju mutasi yang tinggi pada mtDNA disebabkan oleh banyaknya radikal bebas

yang terbentuk sebagai hasil samping reaksi respirasi yang berlangsung pada

mitokondria. Elektron yang ditransfer dapat tertangkap oleh molekul oksigen

membentuk radikal bebas superoksida. Jumlah superoksida ini dalam kondisi

normal mencapai 1-3% jumlah molekul oksigen. Enzim superoksida dismutase

akan mengubah senyawa ini menjadi hidrogen peroksida dan oksigen. Hidrogen

peroksida selanjutnya diubah menjadi air dan oksigen dengan enzim katalase.

Reaksi-reaksi diatas memiliki hasil samping radikal bebas hidroksil yang sangat

berbahaya karena dapat bereaksi dengan protein, asam nukleat, karbohidrat, dan

lipid menghasilkan suatu radikal dan bereaksi lebih lanjut.

Radikal bebas hidroksil juga dapat terbentuk dengan katalis ion besi (Fe3+). Ion

besi dapat menerima elektron dari superoksida dan memindahkannya ke hidroksil

sehingga menjadi radikal bebas. Kompleks ion besi dapat mengkatalisa fosfat

pada DNA. Radikal bebas hidroksil dapat menyerang gugus gula ribosa ataupun

mendeaminasi nukleotida yang menyebabkan mutasi subtitusi misalnya : T > C, C

> G dan T > G. Tingginya laju mutasi mtDNA juga disebabkan oleh karena enzim

11

polimerase λ yang digunakan pada proses replikasi mtDNA tidak memiliki

proofreading yang dapat mengoreksi kesalahan-kesalahan selama proses replikasi

(Watson et al., 1987).

Beberapa mutasi gen penyandi protein mtDNA yang tidak berpengaruh pada

kondisi fisiologis disebut varian normal (Marzuki et al., 1991). Sedangkan mutasi

pada daerah yang tidak menyandi protein seperti daerah D-loop tidak berbahaya

bagi kelestarian mtDNA itu sendiri sehingga mutasi tersebut dapat diturunkan

pada proses replikasi. Replikasi DNA tidak selalu akurat sehingga akan terjadi

mutasi yang akan diturunkan dari satu generasi ke generasi selanjutnya sehingga

makin jauh hubungan kekerabatan antara dua individu, makin besar pula jumlah

perbedaan mutasi.

II. 5. Peran Mutasi mtDNA pada Penuaan

Reaksi fosforilatif oksidatif dalam mitokondria menghasilkan ± 90% energi pada

organ dan sistem jaringan (Wei, 1992). Proses fosforilatif oksidatif menghasilkan

berbagai metabolit berupa radikal bebas yang berpotensi merusak DNA. Dalam

kondisi normal, radikal bebas akan dieliminasi oleh dismutase, katalase, dan

peroksidase, namun mekanisme pertahanan ini berkurang fungsinya dengan

bertambahnya umur (Ames, 1989). Berkurangnya fungsi enzim-enzim tersebut

berakibat pada banyaknya mutasi yang disebabkan oleh radikal bebas, hal ini

berpotensi mempengaruhi proses penuaan. Namun demikian, tidak ditemukan

adanya perubahan pola mutasi pada sel rambut seiring dengan pertambahan usia

dalam satu individu (Liu et al., 2001).

Percepatan angka laju mutasi DNA mitokondria dapat menghasilkan penuaan

dini, suatu faktor penyebab utama penuaan. Telah ditemukan bahwa penuaan

berkaitan dengan peranan DNA mitokondria. Mutasi DNA mitokondria terus

menerus terakumulasi sepanjang usia dan bertanggung jawab langsung atas

defisiensi dalam aktifitas fosforilasi oksidatif seluler. Kerusakan DNA

mitokondria dan mutagenesis menyebabkan kerusakan dan disfungsi oksidatif

12

yang meningkat secara eksponensial, yang pada akhirnya terkulminasi pada

penuaan. Sebuah peningkatan tiga hingga lima kali dalam mutasi-mutasi mtDNA

somatik pada mutator DNA mitokondria yang telah ditunjukkan untuk

menghasilkan respirasi defektif dan oleh karenanya terjadi defisiensi energi dalam

sel-sel individu (Trifunovic, 2006).

II.6. Peran mtDNA dalam Identifikasi Forensik

Analisis forensik berupa tindakan identifikasi barang bukti, yang bertujuan untuk

memperkirakan identitas (ras, umur, jenis kelamin) atau menghubungkan

seseorang dengan tempat kejadian perkara. Analisis menggunakan DNA inti telah

terlebih dahulu digunakan dalam bidang forensik dan berkembang pesat. Metode

yang banyak digunakan adalah RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphisme) dan STR (Short Tandem Repeat). RFLP memiliki tingkat akurasi

paling tinggi tetapi juga tingkat kesulitan yang tinggi. Metode STR lebih praktis

dan akurasinya dapat disesuaikan tergantung jumlah lokus yang dianalisis (Gill,

2001). Analisis menggunakan DNA inti memiliki akurasi yang tinggi karena

dirujuk pada inti kedua orang tua (diploid). Akan tetapi metode ini memiliki

kelemahan yaitu bila salah satu atau kedua orang tua tidak ada. Penggunaan DNA

inti saudara seayah-ibu, anak, paman, dan bibi atau kakek dan nenek kandung

memerlukan koreksi yang didasarkan pada segresi mendel. Sedangkan generasi

ketiga atau saudara sepupu, praktis tidak dapat digunakan (Gill, 2001)

Selain DNA inti, mtDNA telah digunakan dalam bidang forensik dan menjadi

barang bukti di pengadilan Amerika Utara dan Eropa (Wilson et al., 1997).

Kelebihan utama penggunaan mtDNA dalam bidang forensik adalah mtDNA

mempunyai jumlah salinan yang tinggi (Robin dan Wong, 1988). Jumlah salinan

per sel sekitar 1000-10.000 sehingga mtDNA dapat digunakan untuk analisis

sampel dengan jumlah DNA yang sangat terbatas (Moore dan Isenberg, 1999;

Holland, 1997; Wilson et al., 1997). Kelemahan penggunaan mtDNA adalah

kemungkinan menemukan kesamaan antar individu yang relatif lebih tinggi,

terutama individu yang terkait hubungan keluarga segaris keturunan ibu.

13

Kelemahan ini menjadi menguntungkan bila yang dilakukan adalah perunutan

hubungan keluarga (Gill et al.,1994).

Perunutan hubungan keluarga dengan mtDNA didasarkan pada pola pewarisan

maternal yang haploid dan hipervariabilitas daerah D-loop. Individu yang terkait

hubungan maternal akan memiliki urutan nukleotida yang sama dan yang tidak

terkait hubungan maternal ini akan berbeda. Terdapat kemungkinan dua individu

yang tidak memiliki catatan hubungan maternal akan memiliki sekuen dengan

urutan basa yang sama. Bila silsilah keluarga hanya diketahui beberapa generasi

keatas, sementara kecepatan mutasi adalah satu titik dalam 33 generasi maka

kemungkinan terjadinya kasus homologi dua individu yang merasa tidak memiliki

hubungan maternal relatif tinggi. Hal ini yang menyebabkan mtDNA tidak dapat

menjadi alat bukti tunggal atau yang utama dalam pengadilan (Melton, 2001).

Pemilihan mtDNA didasarkan pada pertimbangan bahwa mtDNA memiliki

jumlah molekul yang sangat banyak dalam tiap sel, sehingga sekalipun sampel

dalam keadaan rusak tetapi kemungkinan keberhasilan amplifikasi akan lebih

tinggi dibandingkan DNA inti.

II. 6. Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan teknik in vitro untuk mengamplifikasi daerah spesifik suatu

DNA yang dibatasi oleh sepasang primer (oligonukleotida pendek) menggunakan

enzim DNA polimerase dan dNTP sebagai monomernya (Newton dan Graham,

1997; Innis dan Gelfand, 1990). Komponen PCR terdiri dari master mix dan

templat. Komposisi master mix PCR terdiri dari ddH2O sebagai pelarut, buffer

PCR untuk mempertahankan pH yang sesuai bagi kerja DNA polimerase, MgCl2

sebagai koenzim DNA polimerase, dNTP (dinukleosida trifosfat) sebagai

penyedia nukleotida-nukleotida yang akan digunakan untuk memperbanyak DNA,

primer M1 dan HV2R sebagai komponen yang akan mengenali daerah

amplifikasi, templat merupakan urutan DNA yang akan diamplifikasi, dan enzim

Taq DNA polymerase sebagai biokatalis yang membantu proses PCR (Noer et al.,

1994; Wilson et al., 1995)

14

Pada umumnya PCR berlangsung dalam tiga tahap yaitu: (1) Denaturasi, yaitu

pemisahan DNA untai ganda menjadi tunggal karena terjadi pemutusan ikatan

hidrogen basa-basanya pada suhu tinggi (94-96oC); (2) Annealing, yaitu tahap

penempelan primer pada templat DNA. Suhu annealing dapat dihitung

berdasarkan nilai melting temperature (Tm) dari primer-primer yang digunakan;

(3) Extension, yaitu tahap reaksi polimerasi oleh enzim DNA polimerase

menggunakan dNTP sebagai monomernya dan dimulai dari ujung 3’ primer

sepanjang DNA templatnya hingga terbentuk untai DNA baru. Tahap ini

berlangsung pada temperatur saat enzim polimerase bekerja optimum. Waktu

yang dibutuhkan pada tahap ekstensi tergantung pada panjang fragmen yang

diamplifikasi dan kecepatan reaksi dari enzim DNA polimerase yang digunakan

(Barnes, 1994; Cheng et al., 1994; Cheng dan Kolmodin, 1997).

Ketiga tahap tersebut merupakan siklus yang berlangsung secara terus menerus.

Untuk menghasilkan produk yang banyak dibutuhkan sekitar 25-30 siklus. Secara

teori jumlah fragmen DNA yang dihasilkan selama n siklus PCR, dirumuskan

dengan (2n – 2n)x, dimana n = jumlah siklus, dan x = jumlah templat DNA

(Newton dan Graham, 1997; Innis dan Gelfand, 1990).

II. 7. Direct Sequencing dengan Metode Dideoksi -Sanger

Direct sequencing adalah suatu proses sekuensing menggunakan templat DNA

hasil PCR secara langsung tanpa melalui proses kloning. Dideoksi Sanger adalah

metode penentuan urutan nukleotida yang didasarkan pada terminasi basa spesifik

saat dilakukan sintesis DNA secara in vitro oleh enzim DNA polimerase

menggunakan satu primer. Basa spesifik yang digunakan adalah ddNTP yaitu

dideoksinukleosida trifosfat yang tidak memiliki gugus hidroksil pada karbon 3’

nya. Hilangnya gugus hidroksil ini menyebabkan DNA polimerase tidak dapat

mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester dengan dNTP atau ddNTP

berikutnya, sehingga tidak terjadi proses sintesis rantai DNA setelah reaksi

dengan ddNTP. Terminasi berlangsung secara acak sehingga dihasilkan untai

DNA yang panjangnya berbeda-beda (Newton dan Graham, 1997).

15

Beberapa faktor yang mempengaruhi kualitas hasil sekuensing adalah jumlah

templat DNA, kemurnian DNA, kualitas primer, serta kontaminan seperti EDTA,

fenol, dan kadar garam yang tinggi. EDTA pada konsentrasi diatas 0,5 mM dapat

mengganggu ion Mg2+ sebagai kofaktor enzim DNA polimerase. Adanya fenol

dapat mengganggu dye fluorescent. Konsentrasi garam yang tinggi dapat

menginhibisi enzim (Robertson, 1996).