bab ii tinjauan pustaka - repository.ump.ac.idrepository.ump.ac.id/2875/3/bab ii_radika afiko...

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Landasan Teori

1. Propranolol HCl

Propranolol hidroklorida mengandung tidak kurang dari 99,0% dan

tidak lebih dari 101,0% C16H21NO2.HCl, dihitung terhadap zat yang telah

dikeringkan. Khasiat dan penggunaan sebagai anti adrenergikum dengan

dosis maksimum sehari 320 mg (Depkes, 1979).

Rumus struktur Propranolol HCl :

Gambar 2.1 Rumus struktur propranolol hidroklorida (Depkes, 1979)

Nama Kimia : [1- isopropilamino-3-(1-naftiloksi)-propan-2-ol

Rumus Molekul : C16H21NO2.HCl

Berat Molekul : 165,6 g/mol

Pemerian : serbuk, putih atau hampir putih, tidak berbau, rasa

pahit

Kelarutan : Larut dalam 20 bagian air dan dalam 20 bagian

etanol (95%) P, sukar larut dalam kloroform P

Penyimpanan : wadah tertutup

Propranolol HCl merupakan obat antihipertensi yang bekerja

terhadap reseptor β-non selektif, dengan menghambat respon stimulans

adrenergic. Propranolol hidroklorida larut dalam air dan alkohol, sukar

larut dalam kloroform, praktis tidak larut dalam eter, propranolol dalam

bentuk larutan sangat stabil pada pH 3 dan rusak dengan cepat ketika

suasana alkali, juga diabsorbsi dengan sempurna pada saluran cerna

(Fitriana, 2010).

Validasi Metode Analisis…, Radika Afiko Pradesti, Fakultas Farmasi UMP, 2017

4

Propranolol HCl memiliki waktu eliminasi yang pendek serta

sifatnya yang tidak stabil pada cairan usus tetapi sangat stabil pada cairan

lambung.

2. Floating system

Floating system, pertama kali diperkenalkan oleh Davis di tahun

1968 yang merupakan sistem dengan densitas yang kecil, yang memiliki

kemampuan mengambang kemudian mengapung dan tinggal dilambung

untuk beberapa waktu. Pada saat sediaan mengapung dilambung, obat

dilepaskan perlahan pada kecepatan yang dapat ditentukan, hasil yang

diperoleh adalah peningkatan Gastro Retention Time (GRT) dan

pengurangan fluktuasi konsentrasi obat dalam plasma (Rosmawati,

2016). Keuntungan dari sistem penghantaran obat floating dibanding

dengan sistem konvensional, adalah ( Kare et al., 2010) :

a. Meningkatkan bioavailabilitas sehingga cocok digunakan untuk obat

yang bioavailabilitasnya kurang baik.

b. Menurunkan fluktuasi konsentrasi obat dalam plasma sehingga efek

farmakologis lebih stabil.

c. Menurunkan performa transit variabiitas obat sehingga obat segera

diabsorbsi dan dapat menurunkan dosis obat hingga 2 kali lipatnya.

d. Peningkatan keberhasilan terapi, sangat berguna untuk obat larut

asam dan sukar larut atau tidak stabil dalam cairan usus.

Bentuk floating system banyak diformulasikan dengan

menggunakan beberapa jenis matriks. Dalam penelitiannya, Rosmawati

(2016) melakukan 6 trial untuk beberapa komposisi formula. Dari

evaluasi komposisi matriks tersebut didapat formula optimum tablet

floating propranolol HCl dengan menggunakan HPMC 180 mg dan

NaCMC 0 mg yang kemudian dilanjutkan dengan uji penetapan kadar

menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan didapat %kadar untuk 3

replikasi yaitu sebesar 101,30%; 102,54%; 100,37% dimana kadar

tersebut memenuhi persyaratan pada tablet floating propranolol HCl

dengan prasyarat mengandung tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari

110%.


5

3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau high performance

liquid chromatography (HPLC) merupakan jenis kromatografi yang

penggunaannya paling luas. Hampir semua laboratorium analisis kimia

memiliki instrumen KCKT. KCKT secara umum berfungsi untuk

pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif

senyawa obat dalam sediaan farmasetika. KCKT juga dapat digunakan

untuk identifikasi kualitatif senyawa obat dengan mendasarkan pada

parameter waktu retensi senyawa obat standar dan senyawa obat dalam

sampel. Keterbatasan penggunaan KCKT adalah jika sampelnya sangat

kompleks, karena resolusi atau daya pisah yang baik sulit diperoleh.

Kelebihan metode KCKT antara lain mampu memisahkan molekul -

molekul dari suatu campuran, kecepatan analisis dan kepekaan yang

tinggi, mudah pengoperasiannya, dapat dihindari terjadinya

dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis, menghasilkan resolusi

yang baik, dapat digunakan bermacam-macam detektor, kolom dapat

digunakan kembali dan mudah melakukan perolehan kembali (Gandjar

dan Rohman, 2014). Komponen dari KCKT yaitu terdiri dari :

Gambar 2.2. Komponen KCKT (Putra, 2008)

a. Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing

(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan

berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor

sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2014).


6

b. Pompa pada KCKT

Pompa yang digunakan untuk KCKT yaitu pompa harus inert

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah

gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang

digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi

dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir

3 mL/menit. Pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase

gerak dengan kecepatan 20 mL/menit jika digunakan untuk tujuan

preparatif (Gandjar dan Rohman, 2014).

c. Injektor sampel pada KCKT

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke

dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom

menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat

dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel internal atau

eksternal. Pada saat pengisian sampel, sampel dialiri melewati keluk

sampel dan lebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat

penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati

keluk sampel dan mengalirkan sampel ke kolom (Gandjar dan

Rohman, 2014).

d. Kolom pada KCKT

Kolom merupakan bagian sangat terpenting dari kromatografi.

Bahan yang sering digunakan sebagai fase diam adalah Oktadesil

Silika (ODS) yang mengandung rantai C1. Kolom yang digunakan

pada KCKT pada umumnya memiliki panjang 5-25 cm dengan

diameter bagian dalam sebesar 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm dan

mengandung 40.000 – 70.000 plat/meter (Skoog et al., 2007). Kolom

berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom

yang baik memiliki HETP yang kecil dan N yang besar. Untuk suatu

puncak yang simetris, tailling faktor (Tf) besarnya satu, harga Tf

akan bertambah jika kromatogram makin tampak berekor (Stella,

2011). Kolom dibagi menjadi dua yaitu (Gandjar dan Rohman,

2014). :


7

1) Kolom analitik : Diameter 2-6 mm, panjang kolom ini

bergantung pada jenis material dari pengisi kolom, pada

kemasan polikular panjang yang digunakan 50-100 cm, pada

kemasan poros mikropartikulat 10-30 cm.

2) Kolom preparatif : Diameter 6 mm atau lebih besar, panjang

kolomnya 25-100 cm.

e. Oven

Pada KCKT sistem terbalik, temperatur kolommenentukan

waktu retensi dan mempengaruhi selektivitas. Temperatur yang

digunakan dalam analisis berkisar antara 30-50 °C penggunaan suhu

lebih dari 60 °C berpengaruh padastabilitas analit dan masa kerja

kolom (Ahuja dan Dong, 2005).

f. Fase Diam pada KCKT

Fase diam pada KCKT umumnya berupa silika yang

dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau

polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Oktadesil silika (ODS

atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan

karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran

yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang

lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Solut-solut

yang polar, terutama yang bersifat basa, akan memberikan puncak

yang mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam silika fase

terbalik (Gandjar dan Rohman, 2014).

g. Detektor

Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen

sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan untuk menghitung

kadarnya (analisis kuantitatif). Suatu detektor yang baik mempunyai

sensitifitas yang tinggi, kisar respon linier yang luas, gangguan

(noise) yang rendah, dan memberi respon untuk semua tipe senyawa.

detektor-detektor yang sering digunakan adalah detektor

spektrofotometri UV-Vis, detektor photodiode-array (PDA),

detektor fluoresensi, detektor indeks bias, dan detektor elektrokimia

(Putra, 2008).


8

h. Fase Gerak pada KCKT

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut

yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya

elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh

polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat

komponen-komponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991).

Fase gerak yang baik harus memiliki beberapa sifat

diantaranya harus murni, tidak bereaksi dengan kolom, sesuai

dengan detektor, selektif terhadap komponen, dapat melarutkan

cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan

memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, harganya wajar, dapat

memisahkan zat dengan baik. Elusi pada KCKT ada 2 cara yaitu cara

isokratik dan cara gradien. Cara isokratik yaitu dimana komposisi

fase gerak tetap selama elusi, sementara untuk cara gradien

komposisi fase gerak berubah-ubah.

4. Parameter Kromatografi

a. Waktu retensi atau waktu tambat

Waktu tambat atau waktu retensi (retention time ) adalah

selang waktu yang diperlukan oleh analit mulai saat injeksi sampai

keluar dari kolom. Waktu retensi analit dapat dinyatakan sebagai

berikut :

tR = (Vs Kd + 1 ) tM

Vm

Keterangan :

tR = Waktu retensi analit

tM = Waktu tambat fase gerak

Kd = Koefisien distribusi

Vm = Volume fase gerak

Vs = Volume fase diam

Campuran zat yang diinjeksikan untuk dianalisis dengan

KCKT tentu mempunyai harga tR yang berbeda-beda karena tiap-

tiap analit memiliki harga Kd yang spesifik ( Mulja dan Suharman,

1995)

...... Persamaan 1


9

b. Resolusi (Rs )

Resolusi (Rs) didefinisikan sebagai rasio antara waktu retensi

yang berbeda t1 dan t2 dari dua peak dan rata-rata lebar area W1 dan

W2 dari dua peak pada garis dasarnya yang dapat ditunjukan sebagai

berikut :

Rs = t2 – t1

0,5 (W1 + W2 )

Rs dengan nilai 1 dapat diartikan bahwa sekitar 4% dua peak

yang berdekatan overlap dan mampu untuk analisa beberapa

kromatogram. Untuk pemisahan yang baik, harga Rs mendekati atau

lebih dari 1,5 (Cazes, 2004)

c. Jumlah Lempeng (N)

Jumlah lempeng atau plate number (N) yang didasarkan pada

konsep lempeng teoritis pada kolom digunakan sebagai ukuran

efisiensi. Dengan menganggap profil puncak kromatogram adalah

sesuai kurva Gaussian, maka N dapat didefinisikan :

N = (tR)2

at

Dimana tR adalah waktu retensi dan at adalah standar deviasi

lebar puncak. Suatu ukuran alternatif adalah tinggi lempeng (H) atau

biasa disebut tinggi setara plat teori (HETP = Height Equivalent

Theoritical Plate). Hubungan antara HETP dengan N serta panjang

kolom dirumuskan :

H = L

N

Kolom yang memberikan jumlah lempeng (N) yang besar dan

nilai HETP yang kecil akan mampu memisahkan komponen-

kompnen dalam suatu campuran yang lebih baik yang berarti bahwa

efisiensi kolom adalah besar (Gandjar dan Rohman, 2014)

d. Puncak Asimetri

Penentuan asimetri puncak dapat ditentukan dengan

menggunakan persamaan faktor asimetri (af) = b/a. Persamaan (af) =

...... Persamaan 2

...... Persamaan 3

...... Persamaan 4


10

b/a menunjukan bahwa a adalah waktu paruh awal puncak yang

diukur pada 10% tinggi puncak, sementara b adalah paruh pengikut

pada puncak yang diukur pada 10% tinggi puncak. Idealnya nilai

faktor asimetri ini dalam rentang 0,95 – 1,15 (Watson, 2013)

Gambar 2.3 Profil-profil puncak yang dihasilkan pada KCKT.(a) linier (b)

Puncak Tailling (c) Puncak Fronting (Kealey dan Haines, 2002 )

5. Validasi

Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada

prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter

tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Validasi metode analisis adalah proses untuk menjamin bahwa prosedur

uji yang dilakukan memenuhi standar yang dapat diterima dan sesuai

dengan tujuan yang telah ditetapkan. Metode uji yang berbeda

membutuhkan validasi yang berbeda pula. Tingkatan yang diuji dalam

validasi diantaranya yaitu ketepatan, ketelitian, linieritas, limit deteksi

dan limit kuantitas (LOD/LOQ), dan selektivitas (Riyanto, 2014)

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk memastikan bahwa

parameter kerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,

karenanya suatu metode harus divalidasi ketika :

a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis

tertentu

b. Metode yang sudah baku direvisi umtuk menyesuaikan

perkembangan atau karena munculnya suatu masalah yang

mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi

c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah

berubah seiring dengan berjalannya waktu

Gaussian Tailling Fronting

(a) (b) (c)


11

d. Metode baku yang dilakukan di laboratorium yang berbeda,

dikerjakan oleh analis yang berbeda atau dikerjakan dengan alat

yang berbeda

e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antara dua metode seperti

metode baru dan metode baku.

(Gandjar dan Rahman, 2014).

USP XXXVII tahun 2014 membagi metode-metode analisis

kedalam beberapa kategori, yaitu :

a. Kategori I merupakan prosedur analisis untuk mengkuantifikasi

komponen utama atau bahan aktif pada produk farmasi.

b. Kategori II merupakan prosedur analisis untuk menentukan cemaran

atau senyawa hasil degradasi pada produk akhir farmasi. Metode ini

meliputi perhitungan kembali secara kuantitatif dan uji batas

c. Kategori III merupakan prosedur analisis untuk menentukan

performa karakteristik (disolusi, pelepasan obat)

d. Kategori IV uji identifikasi.

Tabel 2.1 Data yang diperlukan untuk uji validasi (USP, 2014)

Karakteristik

Analisis

Kategori

I

Kategori II Kategori

III Kategori IV

Kuantifikatif Limit tes

Akurasi Ya Ya * * Tidak

Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak

Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya

LOD Tidak Tidak Ya * Tidak

LOQ Tidak Ya Tidak * Tidak

Linieritas Ya Ya Tidak * Tidak

* Mungkin diperlukan, tergantung pada spesifikasi tes yang dilakukan.

Menurut USP Edisi Ketiga puluh, ada 8 karakteristik yang

digunakan dalam validasi metode yaitu akurasi, presisi, spesifisitas, batas

deteksi, batas kuantitasi, linearitas dan rentang. Karakteristik utama yang

digunakan dalam validasi dapat dilihat pada tabel 2.2.


12

Tabel 2.2 Karakteristik utama dalam validasi metode analisis.

Karakteristik Pengertian

Akurasi Kedekatan antara nilai hasil uji yang diperoleh lewat metode

analitik dengan nilai sebenarnya

Presisi Ukuran keterulangan metode analitik, termasuk diantaranya

kemampuan instrument dalam memberikan hasil analitik yang

reprodusibel.

Spesifitas Kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat

dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks

sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan

komponen matriks.

Batas Deteksi Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat

dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.

Batas Kuantitasi Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat

ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima

pada kondisi operasional metode yang digunakan.

Linieritas Kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang

secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada

kisaran yang diberikan

Rentang Konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode

analitik menunjukan akurasi, presisi dan linieritas yang

cukup.

(USP, 2006)

a. Ketepatan (Akurasi)

Ketepatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan

hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan

sebagai persen perolehan kembali (%recovery) analit yang

ditambahkan dan dapat ditentukan melalui dua cara yaitu metode

simulasi (spiked placebo recovery) dan metode penambahan bahan

baku (standard addition method). Jika metode simulasi tidak dapat

dilakukan maka akurasi dapat diukur dengan metode penambahan

baku (Riyanto, 2014). Terdapat tiga cara yang dapat digunakan

dalam menentukan akurasi suatu metode analisis, yaitu :

1) Membandingkan hasil analisis dengan CRM (Certified reference

material) dari organisasi internasional

2) Uji perolehan kembali dengan memasukan analit kedalam

matriks blanko (Spiked placebo)

3) Penambahan baku pada matriks sampel yang mengandung analit

(Standard addition method). Dalam metode adisi, sampel

dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa

ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis kembali.

Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya


13

(hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen

perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang

diperoleh dengan hasil yang sebenarnya nilai akurasi adalah

kurang lebih 80-120%. Jika nilai akurasi diluar kisaran, maka

analisis harus diinvestigasi (Gandjar dan Rohman, 2014).

b. Ketelitian (Presisi)

Ketelitian dari suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian

diantara masing-masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan

berulang kali pada sejumlah cuplikan yang diambil dari sampel

homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi standar atau deviasi

standar relatif (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan pula sebagai

derajat reprodusibilitas atau keterulangan dari prosedur analisis

(Harmita, 2004).

Presisi dibagi menjadi tiga, yaitu keterulangan (repeatability),

ketertiruan (reproducibility), dan presisi antara (intermediate

precision). Keterulangan adalah ukuran kemampuan metode untuk

memberikan hasil yang mirip pada beberapa kali preparasi dan atau

pengukuran untuk sampel yang sama. Keterulangan dapat diukur

dengan menetapkan 6 sampel pada konsentrasi 100% atau dengan

preparasi sampel pada tingkat konsentrasi 80; 100; 120% dari target

konsentrasi analit (Riyanto, 2014).

Presisi antara adalah ukuran kemampuan metode untuk

memberikan hasil yang reprodusibel dengan analis yang berbeda,

peralatan yang berbeda, atau hari yang berbeda (Riyanto, 2014).

Tujuan dilakukannya uji presisi antara adalah untuk menetapkan

presisi suatu metode pada kondisi laboratorium yang berbeda. Suatu

metode dikatakan mempunyai presisi yang baik apabila nilai RSD

lebih kecil dari 2% (<2%). Rumus SD dapat dinyatakan :

...... Persamaan 5


14

c. Selektivitas (Spesifisitas)

Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk

mengukur analit secara akurat dan spesifik bila analit berada

bersama dengan komponen lain dalam matriks sampel seperti

pengotor, produk degradasi dan komponen matriks. Spesifisitas

dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) (Harmita,

2004). Spesifisitas dapat ditentukan melalui nilai resolusinya (R).

Resolusi dikatakan memenuhi syarat jika nilai R ≥ 2,00 (Snyder et

al., 1997).

d. Linieritas

Linieritas suatu metode analisis adalah kemampuan untuk

menunjukkan bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah

secara matematika, proporsional dengan konsentrasi analit dalam

sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu. Rentang suatu

metode analisis adalah interval antara batas konsentrasi tertinggi dan

konsentrasi terendah analit masih menggunakan ketelitian, ketepatan

dan linieritas (Gandjar dan Rohman, 2014). Data linearitas

dievaluasi menggunakan metode statistik, metode yang paling umum

digunakan adalah persamaan garis regresi antara respon detektor

(sumbu y) versus konsentrasi sampel (sumbu x). Dalam suatu

metode analisis, kriteria nilai r yang didapat harus lebih besar dari

0,99 (Miller dan Miller, 2005).

e. Sensitivitas (LOD/LOQ)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang

dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan

dibandingkan dengan blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji

batas. Pendekatan yang paling umum adalah menetapkan jumlah

sampel yang dapat memberikan perbandingan sinyal terhadap

gangguan (S/N) 2:1 atau 3:1, dan yang sering digunakan adalah 3:1

(Snyder et al., 1997).

...... Persamaan 6


15

Batas kuantifikasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam

sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama

(Harmita, 2004). Batas kuantifikasi sering digunakan sebagai batas

bawah untuk pengukuran nilai kuantitatif yang tepat. Batas

kuantifikasi seringkali didasarkan pada nilai signal to noise (S/N) =

10 (Snyder et al., 1997).


bab ii tinjauan pustaka - repository.ump.ac.idrepository.ump.ac.id/2875/3/bab ii_radika afiko...

Documents