19

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 RANCANGAN PENELITIAN

Jenis penelitian adalah true eksperimental dengan desain penelitian

Rancangan Acak Lengkap (RAL). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui

apakah terdapat kesamaan kadar karbohidrat dan serat pada pakan standard AIN-

93 M dengan pakan modifikasi AIN-93 M. Sehingga didapatkan proporsi casein,

putih telur dan agar - agar terbaik dalam pembuatan pakan modifikasi AIN-93 M

dengan jumlah karbohidrat dan serat pangan yang sesuai dengan pakan standar

AIN-93 M. Pada penelitian ini akan digunakan 4 taraf perlakuan dengan

perbandingan kasein dan putih telur sebesar 100%:0%, 25%:75%, 50%:50%, dan

75%:25%.

Tabel 4.1 Perbandingan Komposisi Kasein dan Putih Telur per Kilogram Pakan

Taraf Perlakuan Kasein (gram) Putih telur (gram)

Kontrol 140 -

P1 70 70

P2 35 105

P3 105 35

20

Jumlah pengulangan yang digunakan pada penelitian ini dihitung

menggunakan rumus Federer (Alaydrus, 2015) yaitu dengan perhitungan :

(t-1) x (n-1) ≥ 15

(4-1) x (r-1) ≥ 15

3 x (r-1) ≥ 15

3r – 3 ≥ 15

3r ≥18

r ≥ 6

Keterangan :

t = jumlah perlakuan

r = jumlah pengulangan

Berdasarkan rumus tersebut jumlah pengulangan yang diperlukan adalah 6.

Namun jumlah pengulangan dapat dibuat menjadi seminimal mungkin selama

penelitian bisa dipertanggung jawabkan. Pengulangan minimal untuk penelitian

yang dilakukan di laboratorium adalah 3 kali (Hanafiah, 2012).

Maka, jumlah unit peletian dapat dihitung sebagai berikut:

Jumlah unit penelitian = taraf perlakuan x replikasi

= 4 x 3

= 12 unit penelitian.

Pembuatan desain penelitian dengan desain RAL dimulai dengan

pembuatan nomor unit penelitian yang dilakukan secara acak. Hasil dari

pengacakan unit penelitian disajikan dalam tabel 4.2

21

Tabel 4.2 Taraf Perlakuan dan Replikasi Unit Penelitian

Taraf Perlakuan

Replikasi

1 2 3

Kontrol 145 927 735

P1 611 248 505

P2 301 294 838

P3 369 432 666

4.2 VARIABEL PENELITIAN

4.2.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah komposisi kasein dan putih telur

yang berbeda pada setiap perlakuan.

4.2.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah kadar karbohidrat dan kadar

serat pangan total yang terkandung pada diet modifikasi AIN-93 M.

4.3 LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN

4.3.1 Lokasi Penelitian

Penelitian akan dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya untuk melakukan penimbangan bahan, kemudian di

Laboratorium Dietetik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya untuk mebuat

pakan modifikasi AIN-93 M, Analisa karbohidrat dilakukan di Laboraturium

Pengujian Mutu dan Keamanan Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas

22

Brawijaya, dan Laboratorium Chem-Mix Pratama Bantul Yogyakarta untuk analisa

serat pangan total

4.3.2. Waktu Penelitian

Penelitian akan dilaksanakan pada bulan Agustus 2016 hingga Oktober

2016

4.4 BAHAN DAN ALAT

4.4.1 Bahan Dan Alat Pembuatan Pakan AIN-93 M

Alat yang digunakan dalam pembuatan diet AIN-93 M adalah baki, kompor,

mixer, timbangan, beaker, plastik wrap, doughmaker, baskom, sendok, spatula,

sarung tangan plastik. Bahan bahan yang dibutuhkan saat pembuatan diet AIN-93

M dapat dilihat pada tabel dibawah ini :

Tabel 4.3 Daftar Bahan Pakan Standar dan Modifikasi AIN-93 M per 1 Kg Pakan

Bahan Modfikasi 1 (g) Modifikasi 2 (g) Modifikasi 3 (g)

Cornstarch 465 465 465

Dextrinise cornstarch 155 155 155

Sukrosa 100 100 100

Soybean oil 40 40 40

Kasein 70 35 105

Putih telur 70 105 35

Agar - agar 175 175 175

Mineral mix 35 35 35

Vitamin mix 10 10 10

23

4.4.2 Bahan dan Alat Analisa Serat Pangan

Alat yang digunakan untuk analisa serat pangan metode enzimatis adalah

sebagai berikut :

- Aluminium Foil

- Erlenmeyer

- pH meter

- Termometer

- Shaker Water Bath

- Refigerator

- Alat Pengeringan Beku

- Timbangan Analitik

- Cawan Alumunium

- Desikator

- Oven

- Krusibel

Sedangkan bahan yang digunakan untuk analisa serat metode enzimatis

adalah sebagai berikut :

- Buffer Na2PO4

- HCl

- NaOH

- Etanol

- Aseton Puriss

- Petroleum Eter

- Enzim Termanyl

- Pepsin

- Pankreatin

4.5 DEFINISI OPERASIONAL

4.5.1 Kandungan Karbohidrat

Kandungan karbohidrat yang terdapat dalam diet standar modifikasi AIN –

93 M dengan perbandingan kasein dan putih telur yang berbeda. Dianalisis

menggunakan metode Carbohydrate by Difference dengan hasil data rasio dan

satuan berupa % jumlah karbohidrat.

24

4.5.2 Kandungan Serat Pangan

Kandungan serat pangan total yang terdapat dalam diet standar modifikasi

AIN – 93 M dengan perbandingan kasein dan putih telur yang berbeda. Dianalisis

menggunakan metode Enzimatis dengan hasil data rasio dan satuan data berupa

% jumlah serat.

4.5.3 Pakan Standar AIN-93 M_Dyets Inc

Pakan standar AIN-93 M yang digunakan pada penelitian ini berdasarkan pakan

normal standar AIN-93 M yang dikeluarkan oleh American Institurte of Nutrition

dengan komposisi terdiri dari cornstarch, sucrose, dextrin cornstarch, casein,

soybean oil, fiber (FCC), mineral mix, vitamin mix, L-cystine, choline bitartrate, dan

tert-Butylhydroquinone (TBHQ) (Reeves et al., 1993). Pakan Standar AIN-93 M

ini diimpor dari Dyets Incorporation U.S./Canada. Skala data yang digunakan yaitu

nominal.

4.5.4 Pakan Modifikasi AIN-93 M

Pakan modifikasi AIN-93 M yang digunakan pada penelitian ini adalah modifikasi

dari pakan normal standar AIN-93 M yang dikeluarkan oleh American Institurte of

Nutrition memiliki komposisi terdiri dari cornstarch, casein, putih telur, dextrin

cornstarch, sucrose, soybean oil, bubuk agar-agar, mineral mix, vitamin mix, L-

cystine, choline bitartrate, dan tert-Butylhydroquinone (TBHQ).

25

4.6 PROSEDUR PENELITIAN

4.6.1 Alur Penelitian

Pencatatan kebutuhan penelitian

Pembelian Diet

Standard AIN 93M

Pembuatan Pakan

Modifikasi AIN 93M

AnalisaKarbohidrat menggunakan metode

Carbohydrate by Difference dan analisa

serat menggunakan metode Enzimatis

Analisis data menggunakan uji beda One

Way ANOVA dilanjutkan dengan Uji Post

Hoc Tukey

Persiapan bahan baku serta

alat dan bahan

1 Kasein 70 gram

Putih telur 70 gram

Agar-agar 175 gram

2 Kasein 35 gram Putih telur 105

gram Agar-agar 175

gram

3 Kasein 105 gram

Putih telur 35 gram

Agar-agar 175

gram

Pembelian bahan baku serta

peralatan dan bahan

Gambar 4.1 Diagrim Alir Penelitian

26

4.6.2 Prosedur Pembuatan Pakan Modifikasi AIN-93 M

Salah satu bahan kering yang digunakan dalam pembuatan pakan

modifikasi AIN-93 M adalah dextrin cornstarch yang dibuat dari tepung jagung.

Prosedur pembuatannya adalah sebagai berikut:

1. Memanaskan oven pada suhu 120° C

2. Meletakkan tepung jagung di atas loyang

3. Meratakan tepung jagung di atas loyang dengan ketebalan kurang lebih

1 cm

4. Memasukkan tepung jagung yang sudah diratakan di atas loyang ke

dalam oven

5. Setelah 20 menit tepung jagung dikeluarkan kembali untuk diaduk dan

diratakan secara berulang agar panas dapat tersebar merata ke

seluruh tepung jagung

6. Tepung jagung dimasukkan kembali ke dalam oven

7. Mengulangi proses pengovenan dan pengadukan selama kurang lebih

2 jam

8. Dextrin diuji dalam larutan 200 ml air putih yang ditambahkan dengan

5 droplet Iodin. Jika terjadi perubahan warna maka proses pengovenan

masih harus dilanjutkan, jika tidak terjadi perubahan warna maka

proses pengovenan telah selesai.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh tim peneliti Rovida, 2015

pembuatan diet modifikasi AIN-93 M adalah sebagai berikut:

1. Menimbang semua bahan sesuai jenis modifikasi

27

2. Mencampurkan semua bahan kering yang sudah ditimbang dan

mengaduknya hingga merata

3. Mengocok putih telur yang telah ditimbang sampai berbusa

4. Setelah adonan rata, ditambahkan putih telur, soybean oil, dan uleni

hingga kalis

5. Setelah itu ditambahkan air pada adonan. Pada modifikasi 1 diberikan

300 ml air, modifikasi 2 diberikan 240 ml air, dan modifikasi 3 diberikan

350 ml air. Penambahan air ini dilakukan secara bertahap sampai

adonan menjadi kalis

6. Setelah adonan kalis, adonan dibentuk dengan alat cetakan untuk

mendapatkan bentuk yang seragam

7. Oven adonan yang sudah memiliki bentuk seragam dengan suhu 60oC

dengan mengontrolnya setiap 15 menit sekali hingga berat konstan.

4.6.3 Prosedur Analisa Karbohidrat

Setiap sampel berdasarkan perlakuan yang berbeda dianalisis kadar

karbohidratnya menggunakan metode Carbohydrate by Difference (Food and

Agriculture Organization, 2003). Analisa kadar karbohidrat dilakukan di

Laboraturium Pengujian Mutu dan Keamanan Pangan Fakultas Teknologi Pangan

Univesitas Brawijaya.

Tahapan analisis :

1. Dilakukan analisa pendahuluan untuk mendapat kadar protein melalui

metode kjehdal, kadar lemak melalui metode soxhlet, serta kadar air, abu

dan alkohol pada sampel

28

a. Analisa kadar protein metode kjehdal

1) 1 gram bahan yang telah dihaluskan ditimbang dan dimasukkan ke

dalam labu kjehdal. Kemudian ditambahkan 7,5 gram K2S2O4 dan

0,35 g H2O dan akhirnya ditambahkan H2SO4 pekat

2) Semua bahan dalam labu kjehdal dipanaskan dalam almari asam

samai berhenti berasap. Teruskan pemanasan dengan api besar

sampai mendidih dan cairan menjadi jernih. Teruskan pemanasan

dengan api lebih kurang satu jam. Matikan api dan biarkan menjadi

dingin

3) Kemudian 100 ml aquades ditambahkan dalam labu kjehdal yang

didinginkan dalam air es dan lempeng Zn, juga ditambahkan 15 ml

larutan K2S2O4 % (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahan-

lahan larutan NaOH 50% sebanyak 50 ml yang sudah didinginkan

dalam almari es. Labu Kjehdal dipasang dengan segera pada alat

detilasi

4) Labu kjehdal dipanaskan perlahan-lahan sampai dua cairan

tercampur kemudian dipanaskan dengancepat sampai mendidih

5) Destilat ini ditampung dalam erlenmeyer yang telah diisi dengan 50

ml larutan standar HCl (0,1N) dan 5 tetes indikator metil merah.

Distilasi dilakukan sampai distilat yang tertampung sebanyak 75 ml

6) Distilat yang diperoleh ditritasi dengan standar NaOH (0,1N)

sampai warna kuning. Larutan blanko dibuat dngan mengganti

bahan dengan aquades kemudian dilakukan destruksi. Destilasi

dan titrasi seperrti pada bahan contoh

7) Perhitungan :

29

% Nitrogen = (𝑚𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝑚𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑜ℎ) 𝑥 𝑁𝐻𝐶𝑙 𝑥 100 𝑥 14,08

𝑔𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 1000

% kadar protein = %N x faktor konversi (6,25)

b. Analisa kadar lemak metode soxhlet

1) Menimbang dengan teliti 1-2 gram contoh kemudian memasukkan

ke dalam labu piala lalu menambahkan 30ml HCL 25% dan 20ml

air dan beberapa butir batu didih lalu metutup dengan kaca arloji

dan mendidihkan sampai mengarang (sampai 15 menit) kemudian

panas-panas disaring dan zat padatan yang terkandung di

dalamnya dimasukkan ke dalam kertas saring pembungkus (Huls)

diseduh dengan eter selama 2-3 jam dengan menggunakan alat

soxhlet

2) Sesudah menyuling eter dan mengeringkan seduhan lemak lebih

dahulu dengan alat peniup, kemudian mengeringkan dengan alat

pengering listrik selama 0,5-1 jam pada suhu 102̊C - 105̊C, dan

menimbang dengan bobot tetap

3) Berat seduhan (ekstra) adalah jumlah lemak dengan perhitungan :

Kadar lemak = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑆𝑒𝑑𝑢ℎ𝑎𝑛

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑜ℎ 𝑥 100%

c. Analisa kadar air metode oven

1) Keringkan krusibel / wadah dalam oven selama 15 menit, kemudian

dinginkan di dalam desikator. Setelah itu timbang krusibel / wadah

2) Timbang sampel sebanyak 2 – 5 gram dan keringkan selama 3 jam,

kemudian dinginkan di dalam desikator. Setelah itu timbang

kembali sampel

30

3) Panaskan kembali sampel selama 30 menit dalam oven, kemudian

dinginkan di dalam desikator. Setelah itu timbang kembali sampel

4) Pemanasan kembali dilakukan berulang sehingga diperoleh berat

konstan yaitu selisih penimbangan berturut – turut adalah 0,2

miligram

5) Kadar air dihitung dengan rumus

Kadar air (% bb) = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)−𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔) 𝑥 100

Kadar air (% bk) = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)−𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔) 𝑥 100

d. Analisa kadar abu

1) Keringkan krusibel / wadah dalam oven selama 15 menit, kemudian

dinginkan di dalam desikator. Setelah itu timbang krusibel / wadah

2) Timbang sampel sebanyak 2 – 5 gram dan keringkan selama 3 jam,

kemudian dinginkan di dalam desikator. Setelah itu timbang

kembali sampel

3) Panaskan kembali sampel selama 30 menit dalam oven, kemudian

dinginkan di dalam desikator. Setelah itu timbang kembali sampel.

4) Pemanasan kembali dilakukan berulang sehingga diperoleh berat

konstan yaitu selisih penimbangan berturut – turut adalah 0,2

miligram

5) Samoel diarangkan dengan kompor listrik hingga sampel tidak

mengeluarkan asap

6) Sampel dimasukkan ke dalam tanur dengan suhu 600oC

7) Sampel dimasukkan ke dalam oven selama 1 am dengan suhu

105oC

31

8) Sampel dimasukkan ke dalam desikator untuk didinginkan selama

1 jam, kemudian ditimbang

9) Pemanasan dalam oven, pendinginan dalam desikator dan

penimbangan dilakukan berulang hingga berat sampel konstan.

e. Analisa kadar alkohol

1) Dilakukan distilasi pada sampel untuk memisahkan alkohol dari zat

– zat tambahan lainnya

2) Pikonometer yang telah diketahui beratnya diisi dengan sampel

pada suhu 20oC

3) Berdasarkan berat jenisnya, cari kadar alkohol pada daftar bobot

jenis dan kadar alkohol pada suhu 20oC. Berat jenis dihitung

menggunakan rumus

Berat Jenis Destilat = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑡 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑢ℎ𝑢 20 C

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑞𝑢𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑢ℎ𝑢 20 C

2. Hasil dari analisa pendahuluan dimasukkan ke dalam rumus.

% karbohidrat = [100 – (berat dalam gram [protein + lemak + air +

abu + alkohol] dalam 100 g pakan)] x 100 %

4.6.4. Prosedur Analisa Serat Pangan Total

Setiap sampel berdasarkan perlakuan yang berbeda dianalisis kadar serat

menggunakan metode Gravimetri Enzimatik (Food and Agriculture Organization,

2003). Analisa kadar serat dilakukan di Laboratorium Chem-Mix Pratama Bantul

Yogyakarta.

Tahapan analisis :

32

1. Sampel digiling pada suhu kamar selama 15 menit dengan penambahan

40 ml petroleum eter setiap gramnya

2. Sampel yang telah digiling diambil sejumlah 1 gram dan dimasukkan ke

dalam erlenmeyer

3. Sampel ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer Na2PO4 pH 6 kemudian diaduk

hingga merata

4. Campuran ditambahkan dengan 0.1 ml enzim Termanyl, kemudian

erlenmayer ditutup dengan aluminium foil

5. Erlenmayer diinkubasi dalam Shaker Water Bath selama 15 menit dalam

suhu 100 derajat celcius

6. Campuran dibiarkan mendingin kemudian ditambahkan 20 ml air destilata

7. pH campuran diatur menjadi 1,5 dengan menggunakan HCl

8. Campuran ditambahkan dengan 100 mg pepsin, kemudian erlenmeyer

ditutup kembali dan diinkubasi dalam Shaker Water Bath selama 60 menit

dalam suhu 40 derajat celcius

9. Campuran dibiarkan mendingin kemudian ditambahkan 20 ml air destilata

10. pH campuran diatur menjadi 6,8 dengan menggunakan NaOH

11. Campuran ditambahkan dengan 100 mg pankreatin, kemudian erlenmeyer

ditutup kembali dan diinkubasi dalam Shaker Water Bath selama 60 menit

dalam suhu 40 derajat celcius

12. pH campuran disesuaikan menggunakan HCl

13. Crucible ditimbang dan diberi 0,5 celite kering, lalu digunakan untuk

menyaring campuran untuk mendapat residu (serat tidak larut) dan filtrat

(serat larut)

33

14. Residu kemudian diberikan perlakuan untuk persiapan penghitungan, yaitu

berupa:

- Bilas residu menggunakan etanol 95 % sejumlah 2x10 ml dan aseton

sejumlah 2x10 ml

- Residu dikeringkan untuk mencapai berat konstan dengan suhu 105

derajat celcius

- Hasil pengeringan residu didinginkan di dalam desikator kemudian

ditimbang (D1)

- Residu diabukan selama 5 jam dalam suhu 550 derajat celcius

- Hasil pengabuan residu didinginkan di dalam desikator kemudian

ditimbang (I1)

15. Filtrat kemudian diberikan perlakuan untuk persiapan perhitungan, yaitu

berupa:

- Volume filtrat disesuaikan hingga menjadi 100 ml

- Filtrat ditambahkan dengan etanol 95% sebanyak 400 ml dengan

suhu 60 derajat celcius, kemudian dibiarkan mengendap selama 1

jam

- Crucible ditimbang dan diberi 0,5 celite kering, lalu digunakan untuk

menyaring campuran

- Hasil penyaringan atau residu kemudian dibilas dengan etanol 78%

sejumlah 2x10 ml, etanol 95% sejumlah 2x10 ml, dan aseton

sejumlah 2x10 ml

- Residu dikeringkan untuk mencapai berat konstan dengan suhu 105

derajat celcius

34

- Hasil pengeringan residu didinginkan di dalam desikator kemudian

ditimbang (D2)

- Residu diabukan selama 5 jam dalam suhu 550 derajat celcius

- Hasil pengabuan residu didinginkan di dalam desikator kemudian

ditimbang (I2)

16. Serat pangan tidak larut air, serat pangan larut air, dan serat pangan total

dihitung menggunakan rumus

% 𝐬𝐞𝐫𝐚𝐭 𝐩𝐚𝐧𝐠𝐚𝐧 𝐭𝐢𝐝𝐚𝐤 𝐥𝐚𝐫𝐮𝐭 =𝐃𝟏 − 𝐈𝟏 − 𝐁𝟏

𝑾 𝒙 𝟏𝟎𝟎

% 𝐬𝐞𝐫𝐚𝐭 𝐩𝐚𝐧𝐠𝐚𝐧 𝐥𝐚𝐫𝐮𝐭 =𝐃𝟐 − 𝐈𝟐 − 𝐁𝟐

𝑾 𝒙 𝟏𝟎𝟎

% 𝐬𝐞𝐫𝐚𝐭 𝐩𝐚𝐧𝐠𝐚𝐧 𝐭𝐨𝐭𝐚𝐥 =𝐃 − 𝐈 − 𝐁

𝑾 𝒙 𝟏𝟎𝟎

4.7 ANALISA DATA

Pengolahan dan analisa data dilakukan untuk tes perbedaan

karbohidrat dan serat pangan pada tiap pakan modifikasi AIN – 93 M dan

pakan standar AIN – 93 M menggunakan uji statstik One Way Anova pada

tingkat kepercayaan 95% dan tingkat signifikansi 0,05 karena data

terdistribusi normal dan homogen. Setelah itu pengujian dilanjutkan

dengan uji Post Hoc Tuckey untuk mengetahui letak perbedaan pada tiap

pakan modifikasi AIN – 93 M dan diet standar AIN – 93 M.