BAB III

METODOLOGI

A. Waktu dan Tempat

Waktu: Pukul 07.00 10.00 WIB.

Tanggal: 25 28 Maret 2015

Tempat: Laboratorium Media dan Laboratorium Bakteriologi

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Ose Bulat Ose Jarum Rak Tabung

Korek Api

Lampu Spirtus

Inkas

Inkubator

Tabung Khan

Tabung Durham

Tabung Reaksi

Pipet Ukur 10 ml

Pipet Ukur 1 ml

Plate 12 cm

2. Bahan

Sampel Air Kran di Bandar Kidul yang sudah dimasak 200ml Media Pelarut PDF (Pepton Dilution Fluid) Media MCB (Mac Conkey Broth)

Media BGLB (Brilliant Green Bile Lactosa Broth)

Media EMB (Eosin Methylen Blue)

Media IMVIC (Indol, MR-VP, Citrat) C. Prosedur dan Skema

Prosedur :

1. Hari Pertama

Pembuatan media (PDF, MCB, BGLB, EMB dan IMVIC)

Pensterilan botol (wadah) sampel air kran dan pipet ukur

2. Hari Kedua (Presumtive Test)

Sampel dipipet 10ml, dimasukkan dalam 90ml pelarut PDF (P = 10-1), dari PDF 90ml dipipet masing masing 1ml untuk 3 tabung media MCB

Dipipet 1ml dari PDF 90ml (P = 10-1), dimasukkan dalam 9ml PDF (P = 10-2), dari PDF 9ml (P = 10-2) dipipet masing masing 1ml untuk 3 tabung media MCB

Dipipet 1ml dari PDF 90ml (P = 10-2), dimasukkan dalam 9ml PDF (P = 10-3), dari PDF 9ml (P = 10-3) dipipet masing masing 1ml untuk 3 tabung media MCB

Semua pencampuran dikocok sampai homogen

Media MCB diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam

3. Hari Ketiga (Confirmed Test and Completed Test)

Dilihat hasil dari media presumtive test (MCB) dan dipilih yang menghasilkan gas (+) dan paling keruh untuk diteruskan pada media confirmed test and completed test (BGLB, EMB, dan IMVIC)

Dimasukkan semua alat dan bahan yang diperlukan kedalam inkase

Dipanaskan ose bulat sampai merah membara, dinginkan sebentar

Diambil satu masa ose dari hasil gas (+) media MCB pada media BGLB (sesuai nomor urut)

Dambil satu mata ose dari MCByang memiliki gas terbanyak dan paling keruh distreak pada media plate EMB sesuai zona yang sudah dibagi dan diinokulasi pada media IMVIC (Indol, MR-VP, dan Citrat)

Dipanaskan kembali ose bulat

Diinkubasi 37( C selama 24 jam.

4. Hari Keempat

Penambahan reagen pada media Indol, MR dan VP.

Media Indol ditambahkan reagen Kovac sebanyak 1 3 tetes.

Media MR ditambahkan indikator MR 1 tetes.

Media VP ditambahkan reagen KOH 40% dan Naftol dengan perbandingan 1 : 2.

Pembacaan hasil dari media BGLB, EMB, dan IMVIC .

Skema :

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Media MCB

Media BGLB

Media EMB

Media IMVIC

B. PembahasanBakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang gram negative, tidak membentuk spora, aerob, dan fakultatif anaerob yang memfermentasi laktosa dengan mneghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35oC.

Bakteri Escherichia coli atau coliform digunakan untuk kualitas air karena Escherichia coli merupakan flora normal dalam air, flora normal dalam pencernaan, dapat memfermentasi laktosa, dan bersifat pathogen. Escherichia coli adalah genus dan spesies dari kelompok coliform.Untuk mengetahui jumlah sel bakteri golongan coliform yang terdapat dalam sampel air, dilakukan pemeriksaan MPN (Most Probable Number) 333, yaitu jumlah perkiraan kuman Escherichia coli atau coliform terdekat dalam 10ml sampel yang telah diolah.

Penggunaan media selektif dan media diferensial sangat membantu mempercepat usaha pemeriksaan air guna mendeteksi coliform. Pemeriksaan tersebut terdiri dari 3 tahap, yaitu :1. Tahap pendahuluan (Presumtif Test)

Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri coliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas yang disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coli. Media yang digunakan pada tahap ini adalah media MCB.

2. Tahap penegasan (Confirmed Test)

Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan atau penegasan untuk memastikan kuman membentuk asam dan gas karena fermentasi laktosa oleh kuman. Media yang digunakan pada tahap ini adalah media ECB atau BGLB.

3. Tahap pelengkap (Complete Test)

Pengujian selanjutnya dilakukan dengan uji kelengkapan untuk mengidentifikasi kuman apa yang mencemari sampel air. Media yang digunakan pada tahap ini adalah media EMB dan IMViC (Indol, MR, VP, Citrat).

BAB V

PENUTUP

A. KESIMPULAN

Jadi, berdasarkan hasil dari pemeriksaan MPN tak langsung terhadap sampel air kran yang telah diolah, dapat disimpulkan bahwa didapat kuman coliform sebanyak 15 MPN per 10ml sampel.B. SARAN

1. Sebaiknya praktikan menggunakan APD (Alat Pelindung Diri) sebelum melakukan pemeriksaan.

2. Pemeriksaan dilakukan sesuai prosedur yang ada.

3. Jagalah kebersihan.

DAFTAR PUSTAKAAnonym. 2010. Hitung Jumlah Kuman Metode MPN. (online) (http://kumpulan-makalah-baru.blogspot.com/2010/12/v-behavioururldefaultvml-o.html ) diakses pada 5 juni 2015.

Kaniawati, Fitri. 2012. Makalah MPN. (online) (http://fitrikaniawati16.blogspot.com/2012/05/makalah-mpn.html?m=1 ) diakses pada 5 juni 201510ml

1ml

1ml

@1ml

@1ml

@1ml

PDF 9ml (P10-2)

PDF 90ml (P10-1)

PDF 9ml(P10-3)

Sampel

Presumtive Test (Tes Pendahuluan)

MCB 9ml

Inkubasi 37o C 24 Jam

Media yang memiliki gas terbanyak ditanam pada media BGLB (sesuai nomor urut). Media yang paling keruh ditanam pada media EMB dan IMVIC

2. Confirmed Test (Tes Penegasan)

BGLB 4 ml

3. Completed Test (Tes Pelengkap)

EMB

Indol, MR VP, Citrat

Inkubasi 37o C 24 Jam

Identifikasi dan Pembacaan Hasil

Escherechia coli : Metallic sheen. IMVIC : ++--

Coliform : Berlendir, Banyak. IMVIC : --++

Bentuk : BulatUkuran : Kecil

Warna : Keruh, Berlendir Tepi : Rata

Permukaan : CembungSifat: Mucoid

Fermentasi: Laktosa -

Indol, MR VP, Citrat

- + +