Metode validasi

Metode yang dikembangkan divalidasi berdasarkan pada ICH Q2(R1), sehubungan dengan kelinearan, presisi, akurasi, limit of detection(LOD), dan Limit of Quantification(LOQ) dan robustnes.

1. KelinearanKurva standar diplot dengan 6 konsentrasi yang berbeda dengan rentang 1-10

µg/mL-1. Dengan setiap konsentrasi dianalisis 3 kali pengulangan, data yang diperoleh diolah secara statistik dengan menggunakan analisis regresi kuadrat terkecil.

2. PresisiPresisi dari pengujian kadar logam yang telah diselidiki baik dari segi kemungkinan

pengulangan dan presisi intermediet.presisi keterulangan telah ditunjukan dengan injeksi berulang secara teratur dengan komsentrasi obat yang sama,(10 ug/mL), untuk larutan homogen yang sama dengan 6 waktu berbeda,rata- rata area yang ditunjukan dan persen relatif standar deviasi( %RSD) dihitung untuk mengulang presisi, hasil yang diperoleh maksimal kurang dari 1 % RSD..presisi intermediet ditunjukan dengan penggabungan 2 pengujian kadar logaam dalam 3 hari berbeda, hasil yang diperoleh harus kurang dari 2% RSD.

3. AkurasiAkurasi ditunjukan oleh recoveryyang telah diketahui standar kurkumin dalm 3 kali

pengulangan. Persen recovery ditentukan dari kemiringan dan Y-intercept, kecuali jika kurva kalibrasi yang didapat dalam kelinearan.

4. Limit of detection (LOD)Limit of detection ditentukan dengan memperkirakan keanehan instrumen dengan

penginjeksian fase gerak dalam 3 lapisan. Didapat Area puncak waktu retensi dari obat*. Konsentrasi berpengaruh pada nilai luas pncak dan memberikan perkiraan batas deteksi(LOD).

5. Limit of quantification(LOQ)Puncak dari instrumen ditentukan diantara keduanya, nilai area puncak dengan

konsentrasi dalam 10 waktu berbeda(10 menit) memberikan perkiraan limit kuantifikasi( LOQ).

Concentration added(µg/mL)

Concentration recovered(µg/mL)

% recovery %RSD

2 ± ±

4 ± ±

6 ± ±

Gambar2. Kromatogram larutan standar kurkumin (10 ug/mL) 420 nm

Gambar 3.kromatogram larutan standar kurkumin (10 ug/mL) 280 nm

6. RobustnessRobustness(ketahanan) dari pengembangan metode kromatografi cair ditentukan oleh

beberapa, seperti variasi yang dilakukan dalam beberapa parameter eksperimental.robustness menunjukan keandalan metode yang dikembangkan selama dalam keadaan(penggunaan) normal.parameter (faktor yang mempengaruhi yang diubah adalah pH fase gerak, laju alir fase gerak dan volum injeksi. pH fase gerak diubah dengan penambahan 0,1. Laju alir diubah dengan penambahan 0,2 mL/menit , dan volum injeksi ditambahkan 100 µL.Ketika parameter 1 diubah parameter lainnya dibuat tetap, yang telah digambarkan dalam kondisi instrument dan analytical.

Uji kadar kapsul kurkumin komersial

Kandungan dari 20 kapsul kurkumin komersial(yang tertera di label mengandung 475 mg per kapsul) yang diambil dan ditimbang dengan hati-hati dan dicampurkan. Ketepatan penimbangan bubuk kapsul ekuivalen dengan kandungan kapsul dalam satu kapsul yang diambil dari labu ukur(n-3) dan dilarutkan dalam metanol.kandungan zat terlarut dalam larutan mempunyai konsentrasi 10 µg/mL. Larutan itu telah disaring dalam syringe filter 0,45 µm, sebelum diinjeksi ke dalam sistem kromatografi untuk pengujian(analisis) kandungan obat.

Recover study

Penelitian uji kembali dilakukan dengan teknik penambahan standar; dengan penambahan kurkumin standar 50, 100, dan 150% tingkatan yang ada pada label. Serbuk obat yang dihasilkan diproses dengan cara yang sama dengan yang diikuti selama uji kadar dari formulasi. Persen pengujian (n = 3) ditentukan dari kemiringan dan Y-intercept dari kurva kalibrasi yang diperoleh dalam penelitian kelinearan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Metode optimasi

Metode optimasi ini memberikan puncak kurkumin, tanpa pengekoran, dengan waktu retensi sekitar 5,6 menit. Selain itu metode yang dikembangkan mampu menyelesaikan kurkumin dari berbagai produk degradasi yang diperoleh oleh kurkumin dalam berbagai tekanan, sehingga menunjukan suatu kestabilan. Panjang gelombang yang digunakan adalah 425 nm untuk kurkumin dan 280 nm untuk berbagai produk degradasi lain. Gelombang panjang kerja ganda telah dilaporkan sebelumnya untuk mendeteksi produk degradasi alkali kurkumin lain,dimana kurkumin dipisahkan pada kolom terikat amino dengan 96% Etanol sebagai fase gerak (panjang gelombang= 420 nm) sementara elusi gradien menggunakan metanol dan 1% asam asetat digunakan untuk memisahkan produk degradasi alkalin kurkumin (panjang gelombang = 280 nm)

Gambar4.Kromatogram dari kurkumin yang ditujukan untuk 1N HCl. Sekitar 63% analit diobservasi.

Kelinearan

Kurva standar kurkumin yang didapat adalah linier melebihi rentang konsentrasi 1- 10 µg/mL. Hubungan yang terjadi adalah 0,999 yang menunjukan kelinearan melebihi rentang konsentrasi yang diujjikan(dipilih). A % RSD didapat kurang dari 2 % yang menunjukan kebagusan.

Presisi dan akurasi

% RSD untuk larutan standar kurkumin (10 µg/mL) diuji pada hari yang sama adalah 0,147,sehingga mengindikasikan (dalam satu hari )sistem presisi yang baik. Hasil % RSD yang didapat <2% , ini sudah cukup untuk membuktikan presisi dari metode. Hasil akurasi dapat dilihat dalam tabel 1. Akurasinya terjadi pada rentang 97,59-103,15%, ini mengindikasikan bahwa nilai yang sebenarnya sesuai dengan nilai(hasil percobaan)

LOD dan LOQ

Untuk metode kromatografi cair hasil pengembangan, LOD ditemukan yaitu 0,06 ± 0,01 µg/mL, dan dimana LOQ didapat 0,21± 0,045 ,01 µg/mL.

Selektivitas

Kromatogram larutan kurkumin standar (10 µg/mL) pada panjang gelombang 425 nm

dan 280 nm yang digambarkan pada gambar 2,3,4,5,6,7,dan 8. Kromatogram larutan kurkumin dengan berbagai macam kondisi degradasi seperti degradasi asam, degradasi basa, dedradasi oksidatif, degradasi termal dan tentunya degradasi cahaya.

Molekul kurkumin tidak stabil pada degradasi asam, basa, oksidatif, termal, dan cahaya dengan maksimum degradasi alkali. Tidak ada degradasi ketika pengujian molekul saat kondisi degradasi termal. Puncak dari degradasi produk ditemukan dengan jelas pada terpisahkannya dua puncak 2 kromatogram larutan obat standar.

Robustness

Tidak ada perubahan yag signifikan pada dua puncak kromatogram yang diuji dengan berbagai parameter(pH, laju alir, dan volum injeksi) pada volum injeksi area puncak terjadi saat penggabungan dengan nilai teoritis smapai 5 kali, puncak terjadi saat volum injeksi 20 µL, dan pengubahan terhadap parameter lain. %RSD terjadi saat

<2% dan faktor USP adalah <0,87, hasil ini membuktikan robustness(ketahanan) metode pengembangan.

Uji kadar dari Kapsul yang dijual bebas dan Curcumin dan Studi Pemulihan

Hasil analisis kurkumin dalam kapsul komersial(di jual bebas) telah dinyatakan dalam Tabel 2. Hasilnya memuaskan dan sesuai dengan yang ada di label. Hasil penelitian menunjukkan penerimaan kembali validitas dan akurasi dari metode yang dikembangkan membuktikan bahwa tidak ada gangguan dari eksipien kapsul. Kromatogram sampel dianalisis telah digambarkan dalam Gambar. 9.

Table 2. penentuan kurkumin dalam kapsul and recovery studies

Parameter Result

Mean (% content) ± SD (n = 3) 98.80 ± 0.08% RSD 0.08% Recovery (50% level) ± SD (n = 3) 99.56 ± 1.96% RSD 1.97% Recovery (100% level) ± SD (n = 3) 99.73 ± 1.58% RSD 1.59% Recovery (150% level) ± SD (n = 3) 98.50 ± 0.93% RSD 0.95

a Turmeric curcumin herbal supplement (Lot No. 5064KG1812)

Gambar9.kromatogram hasil analisis sampel kurkumin bahwa tidak ada gangguan dari eksipien kapsul

kesimpulan

Metode pengembangan dan validasi dengan KCKT untuk analisis kuantitatif merupakan metode yang mudah dan cepat. Didapatkan waktu retensi dari obat*yaitu pada 5,6 menit dengan waktu pengelusian selama 10 menit. Metode ini terbukti selektif untuk percobaan.

Hasil percobaan(kromatogram) memberikan 2 puncak yang berbeda antara obat* dan produk degradasi dalam berbagai tekanan. Dengan demikian metode ini akan terbukti bermanfaat untuk mengetahui masa simpan produk dosis obat-maceutical yang mengandung kurkumin.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis berterima kasih kepada herbal Konark dan Kesehatan Pvt. Ltd, Mumbai, India untuk menyediakan sampel kurkumin. Prajakta Dandekar berterima kasih kepada Universitas Hibah Komisi, Delhi, India untuk kerja sama yang diperlukan untuk melaksanakan percobaan.