ANALISIS SIDIK DNA (DNA Fingerprinting) RFLP (Restriction Fragmen Length Polymorphism)

Laurencius Sihotang

I. Tujuan

Mempelajari cara teknik RFLP(Restriction Fragmen Length Polymorphism)

Menganalisis pola pita DNA dengan tehnik RFLP

II. Kajian Pustaka RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) adalah sebuah metode

yang digunakan oleh ahli biologi molekuler untuk mengikuti urutan tertentu DNA

seperti yang disampaikan kepada sel-sel lain Sebuah RFLP adalah urutan DNA yang

memiliki pembatasan situs pada setiap ujungnya dengan "target" urutan di antara

keduanya. Dalam analisis RFLP, genomik DNA yang dipotong dengan enzim restriksi

dipisahkan melalui gel elektroforesis. Dasar dari transfer DNA dari gel ke pensupport

yang lebih solid adalah untuk mengawetkan posisi fragmen DNA dan menyebabkan

hibridisasi dapat dilakukan.

Restriction Fragment Length polymorphism (RFLP) merupakan penanda

molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan

semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim

yang mampu mengenal dan memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6

urutan basa). Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan dinamakan menurut spesies

bakteri yang menghasilkannya.

Contoh:

EcoR I adalah enzim RE yang dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain R I

(baca: R satu). Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan

dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini

memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian anatara G dan A.

Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas

ganda yang dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini

yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

BamH I diperoleh dari bakteri Bacillus americanus strain H I (H satu). Struktur

enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut mengenali double

strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′, yang selanjutnya

memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa

dua fragmen yang ujungnya sticky ends. Pada gambar tersebut warna hijau

dan biru menunjukkan subunit protein dimer yang identik

Deteksi RFLP dilakukan berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk

membandingkan profil pita-pita yang di hasilkan setelah di lakukan pemotongan

dengan enzim restriksi terhadap DNA target atau dari individu yang berbeda.

Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisme mempengaruhi molekul DNA

dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-fragmen dengan panjang yang

berbeda. Aplikasi tekhnik RFLP biasa di gunakan untuk mendeteksi diversitas genetik,

hubungan kekerabatan,sejarah domestikasi,asal dan evolusi suatu spesies, genetik

drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging gen, mengisolasi gen-gen

yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA.

Analisis pola restriction fragment dihasilkan ketika DNA dicerna oleh enzim

restriksi. Praktek dalam aplikasi analisis restriction fragment didasari dari fakta

bahwa tidak ada dua orang atau lebih yang kembar identik mempunyai sekuens basa

DNA yang persis. Walaupun perbedaan sekuens DNA diantara dua orang cukup kecil,

tetapi terdapat perubahan panjang

III. Alat dan Bahan Alat

Pipet mikro, tabung mikro, tips mikro, alat elektroforesis vertical, transimulator UV,

alat pemasok daya, dan sarung tangan

Bahan

Sampel DNA, kit PCR mix, oligonukleotida primer, deoksinukleotida fosfat, enzim

polymerase

IV. Cara Kerja Gel dikeluarkan dari paket dan cabut sisir gel, gel diletakkan kedalam tangki

elektroforesis dengan posisi yang benar. Secara perlahan buffer diisi kedalam tangki

elektroforesis dan isi hasil PCR dari setiap tabung sampel ke dalam sumur gel. Lalu

tabung elektroforesis ditutup dan beri aliran listrik. Setelah itu, mengamati sampel

yang akan bermigrasi dalam gel menuju elektroda merah, kemudian listrik dimatikan

ketika pewarna loading telah mendekati akhir gel dan lepaskan power supply. Tutup

elektroforesis dilepas dan tunggu kira-kira 10 detik. Dengan menggunakan sarung

tangan gel yang ada didalam tangki elektroforesis akan dipindahkan keatas

transiluminator UV lalu mengamati gel tersebut.

V. Hasil Pengamatan

Formulasi yang diberikan saat RFLP:

MspI = 2µL

10 x T.Buffer = 2µL

0,1 % BSA = 2µL

DNA Template = 5µL

H2O = 9 µL +

Jumlah = 20µL

Catatan :

Diinkubasi 370 C selama 1 jam

BSA : Bovaine Serum Albumin

Setelah selesai di inkubasi, dilakukan elektroforesis dan diperoleh hasil seperti

berikut:

Sumur Gel No. Sampel DNA Deteksi DNA

1 Marker

2 1 -

3 3 -

4 4 -

5 5 -

6 7 -

7 8 -

8 9 -

9 10 -

10 11 -

11 12 -

12 13 -

13 14 -

14 15 -

Karena kita punya sampel 17,

maka semuanya dikalikan 17.

15 Kontrol positif +

Tabel 6. Hasil Elektroforesis RFLP Keterangan: Agarose sebanyak 2 % Waktu : 20 menit Daya : 90 volt DNA yang diambil sebanyak 4,3 μL dan marker sebanyak 1 μL

Gambar 6. DNA Hasil PCR yang di RFLP

*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan

seterusnya

VI. Pembahasan

Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu

teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat

sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk

membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan

dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Meskipun

gen dalam keadaan normal bersifat stabil, akan tetapi dalam menghadapi perubahan

lingkungan, gen dapat bersifat sensitif atau rentan sehingga dapat menimbulkan

mutasi pada urutan basa nukleotidanya. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu

organisma mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan

fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini

dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi.

Gen ALAD (asam Amino Levulinat heme) terletak di kromosom 9q34130 pada

urutan nomor 1161148591 bp (base pairs) sampai dengan 116163617 bp. ALAD 1-1,

1-2, dan 2-2, adalah tiga isozym yang berasal dari dua macam aIel yaitu ALAD1 dan

ALAD2. Keberadaan gen ALAD polimorfik, patogenesis toksisitas Pb telah

mengimplikasikan bahwa secara genetik sangat potensial untuk menyebabkan

terjadinya perbedaan suseptabilitas terhadap Pb. Sintesis heme berasal dari molekul

suksinil-KoA, hasil siklus asam sitrat di mitokondria dan asam amino glisin. Produk

reaksi penggabungan antara suksinil-KoA dan glisinadalah asam α-amino-β-

ketoadipat, yang selanjutnya diderkaboksilasi untuk membentuk α- aminolevulinat

(ALA) melalui enzim ALA sintase. ALA Dehidratase merupakan suatu enzim yang

mengandung seng (Zn) dan peka terhadap inhibisi oleh plumbum(Pb), seperti yang

dapat terjadi pada keracunan plumbum di lingkungan. Penyebab polimorfisme pada

protein enzim ALAD adalah karena adanya transversion dari G- ke –C pada

nukleotida yang ada dalam region kodon 59 sehingga menyebabkan terjadinya

substitusi asam amino lisin oleh asparagin. Adanya substitusi ini akan menyebabkan

terjadinya perbedaan afinitas Pb terhadap gen polimorfik tersebut.

Setelah melakukan elektroforesis terhadap sampel yang sudaag di uji dengan

RFLP, tidak ada gen yang terdeteksi. Sehingga tidak dapat diamati pada sampel

gtersebut, apakah ada perubahan gen atau tidak. Hal ini mungkin terjadi dimana

kasus seperti di awal, dapat seperti itu karena faktor kesalahan prosedur saat isolasi

genom karena praktikan kurang terbiasa dengan praktikum mikro. Selain itu, hasil

elektroforses saat PCR juga tampak negatif, sehingga jika pada saat RFLP juga negatif

merupakan hal yang wajar. Praktikan ini tidak memungkinkan diulang kembali

karena keterbatasan waktu.

VII. Kesimpulan

Gen ALAD pada manusia terdapat pada kromosom 9 lengan q, jika terpapar Pb dapat

mengakibatkan polimorfisme. Dari hasil yang diuji, tidak dapat dipastikan apakah ada

yang terkena Pb karena hasil elektroforesis negatif.

Daftar Acuan

Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics. Second ed. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA.

Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2012. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj. Erlangga. Jakarta

Cohn Robert m., Roth Karl s. 1996. Biochemistry and Disease. William and Wilkins, Inc. Maryland

Jamilah. 2005. Pengaruh pemberian macam deterjen, penambahan enzim dan ekstrak nanasterhadap hasil isolasi DNA berbagai macam buah. Universitas Negeri malang. Malang

McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group. Madison Avenue, NY, US.

Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.