analisis obat dalam cairan hayati

5/26/2018 Analisis Obat Dalam Cairan Hayati

1/34

ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

I. TUJUANAgar mahasiswa dapat memahami langkah - langkah analisis obat didalam cairanhayati.

II. DASAR TEORIFarmakologi adalah ilmu yang mempelajari interaksi obat dengan makhluk

hidup. Berdasarkan interaksi tersebut, maka farmakologi dibagi menjadi dua yaitu

farmakodinamik dan farmakokinetik. Dalam farmakodinamik dipelajari mengenai

pengaruh (efek) obat terhadap makhluk hidup. Sedangkan farmakokinetika adalah ilmu

yang mempelajari tentang kinetika absorbsi, distribusi, metabolisme, dan eliminasi obat

dalam tubuh.

Farmakokinetik menentukan kecepatan mulai kerja obat, lama kerja dan

intensitas efek obat. Farmakokinetik sangat tergantung pada usia, seks, genetik, dan

kondisi kesehatan seseorang. Ada 4 fase dalam proses farmakokinetik:

1. Penyerapan (absorbsi) obatAbsorbsi ditentukan oleh bentuk sediaan, bahan pencampur obat, cara pemberian

obat. Absorbsi obat sudah dimulai sejak di mulut, kemudian lambung, usus halus,

dan usus besar. Tapi terjadi terutama di usus halus karena permukaannya yang

luas, dan lapisan dinding mukosanya lebih permeabel. Bioavailability artinya

jumlah dan kecepatan bahan obat aktif masuk ke dalam pembuluh darah, dan

terutama ditentukan oleh dosis dari obat

2. Distribusi obatDistribusi artinya setelah obat masuk ke dalam sirkulasi darah, kemudian obat

diditribusikan ke dalama jaringan tubuh. Distribusi obat ini tergantung pada rata-

rata aliran darah pada organ target, massa dari organ target, dan karakteristik

dinding pemisah diantara darah dan jaringan. Di dalam darah obat berada dalam

bentuk bebas atau terikat dengan komponen darah albumin, gliko-protein dan

lipo-protein, sebelum mencapai organ target. Apabila obat telah terikat dengan

protein maka secara farmakologi obat tersebut tidak mempunyai efek terapetik

dan ditibusinya terbatas. Selain itu obat tidak dapat menembus membran sel

karena merupakan suatu komplek yang besar.


2/34

3. MetabolismeTempat utama metabolisme obat terjadi di hati, dan pada umumnya obat sudah

dalam bentuk tidak aktif jika sampai di hati, hanya beberapa obat tetap dalam

bentuk aktif sampai di hati. Obat-obatan di metabolisme dengan cara oksidasi,

reduksi, hidrolisis, hidrasi, konjugasi, kondensasi atau isomerisasi, yang tujuannya

supaya sisa obat mudah dibuang oleh tubuh lewat urin dan empedu. Kecepatan

metabolisme pada tiap orang berbeda tergantung faktor genetik, penyakit yang

menyertai(terutama penyakit hati dan gagal jantung), dan adanya interaksi

diantara obat-obatan. Dengan bertambahnya umur, kemampuan metabolisme hati

menurun sampai lebih dari 30% karena menurunnya volume dan aliran darah ke

hati.

4. EksresiTempat utama terjadinya eksresi adalah di ginjal. Sedangkan sistem billier

membantu ekskresi untuk obat-obatan yang tidak diabsorbsi kembali dari sistem

pencernaan. Sedangkan kontribusi dari intestine (usus), ludah, keringat, air susu

ibu, dan lewat paru-paru kecil, kecuali untuk obat-obat anestesi yang dikeluarkan

waktu ekshalasi. Metabolisme oleh hati membuat obat lebih polar dan larut air

sehingga mudah di ekskresi oleh ginjal. Obat-obatan dengan berat lebih dari 300

g/mol yang termasuk grup polar dan lipophilic di ekskresikan lewat empedu.

Secara lebih jelasnya Farmakodinamik menggambarkan bagaimana obat

bekerja dan mempengaruhi tubuh, melibatkan reseptor, post-reseptor dan interaksi

kimia. Farmakokinetik dan farmakodinamik membantu menjelaskan hubungan antara

dosis dan efek dari obat. Respon farmakologis tergantung pada ikatan obat pada

target. Konsentrasi obat pada reseptor mempengaruhi efek obat. Farmakodinamik

dipengaruhi oleh perubahan fisiologis tubuh seperti proses penuaan, penyakit atauadanya obat lain. Penyakit-penyakit yang mempengaruhi farmakodinamik contohnya

adalah mutasi genetik, tirotoksikosis (penyakit gondok), malnutrisi (salah gizi) dll.

Pada hakekatnya supaya bisa diserap oleh tubuh obat harus diubah menjadi

metabolit aktifnya. Biasanya obat-obat yang demikian disebut dengan Pro drug (Pra

obat). Prodrug bersifat labil, tidak mempunyai aktivitas farmakologis, tapi dalam

tubuh akan diubah menjadi aktif. Contoh : Bioavailabilitas parasetamol ditingkatkan

oleh ester propacetamol dan sumacetamol. Kemudian dengan atau tanpa


3/34

biotransformasi obat dieksresi dari dalam tubuh. Seluruh proses ini disebut proses

farmakokinetik dan berjalan serentak di dalam tubuh.

Darah merupakan tumpuan proses absorbsi, distribusi, dan eliminasi. Artinya

tanpa darah, obat tidak dapat menyebar ke lingkungan badan dan dikeluarkan dari

badan. Karena itu, logis bila adanya proses absorbsi dapat ditunjukkan dengan

peningkatan kadar obat dalam darah dan adanya proses distribusi serta eliminasi

ditunjukkan dnegan pengurangan kadar obat dalam darah. Dengan kata lain,

besarnya obat yang ada dalam darah mencerminkan besarnya kadar obat di tempat

absorbsi, distribusi, dan tempat eliminasi.

Penetapan kadar obat di dalam badan dapat dianalisis dari cairan hayati lain

seperti urin, saliva atau lainya. Namun, dalam praktik, uji dengan darah paling

banyak dilakukan. Di samping tempat dominan yang dilalui obat seperti yang

dijelaskan di atas, darah juga menjadi tempat yang paling cepat dicapai oleh obat.

Sedangkan urin merupakan cairan hayati yang biasanya digunakan dalam uji fase

farmakokinetik untuk mempelajari disposisi suatu obat dan menentukan kadar suatu

obat untuk obat-obatan yang dieksresikan lewat urin, minimal 10% nya terdapat

dalam urin dalam bentuk utuh yang belum dimetabolisme.

Hasil analisis dalam farmakokinetika dinyatakan dalam parameter

farmakokinetika. Parameter farmakokinetika didefinisikan sebagai besaran yang

diturunkan secara matematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya di

dalam cairan hayati (darah, urin,saliva dan lainnya). Parameter farmakokinetika obat

diperoleh berdasarkan hasil pengukuran kadar obat utuh dan metabolitnya.

Faktor-faktor penentu dalam proses farmakokinetika adalah :

a.Sistem kompartemen dalam cairan tubuh, seperti cairan intrasel, ekstrasel (plasma darah,

cairan interstitial, cairan cerebrospinal), dan berbagai fasa lipofil dalam tubuh.

b.Protein plasma, protein jaringan dan berbagai senyawa biologis yang mungkin dapat

mengikat obat.

c.Distribusi obat dalam berbagai system kompartemen biologis, terutama hubungan waktu

dan kadar obat dalam berbagai system tersebut, yang sangat menentukan kinetika obat.

d.Dosis sediaan obat,transport antar kompartemen seperti proses absorpsi, bioaktivasi,

biodegradasi dan ekskresi yang menentukan lama obat dalam tubuh


4/34

Terdapat tiga jenis parameter farmakokinetik yaitu parameter primer, sekunder,

dan turunan. Parameter farmakokinetik primer meliputi kecepatan absorbsi, Vd

(volume distribusi), Cl (klirens). Parameter farmakokinetik sekunder antara lain

adalah t 1/2 eliminasi (waktu paruh eliminasi), Ke (konstanta kecepatan eliminasi).

Sedangkan parameter farmakokinetik turunan harganya tergantung dari dosis dan

kecepatan pemberian obat Parameter farmakokinetik meliputi :

1. Parameter pokok Tetapan kecepatan absorbsi (Ka)

Menggambarkan kecepatan absorbsi, yaitu masuknya obat ke dalam

sirkulasi sistemik dari absorbsinya (saluran cerna pada pemberian oral,

jaringan otot pada pemberian intramuskular).

Cl (Klirens)Klirens adalah volume darah yang dibersihkan dari kandungan obat

persatuan waktu (Neal, 2006).

Volume distribusi (Vd)Volume distribusi adalah volume yang menunjukkan distribusi obat (Neal,

2006).

2. Parameter Sekunder Waktu paro eliminasi (t 1/2)

Merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mengubah jumlah obat

di dalam tubuh menjadi seperdua selama eliminasi (atau selama infus

yang konstan) (Katzung, 2001).

Tetapan kecepatan eliminasi ( Kel )Kecepatan eliminasi adalah fraksi obat yang ada pada suatu waktu yang

akan tereliminasi dalam satu satuan waktu. Tetapan kecepatan eliminasi

menunjukkan laju penurunan kadar obat setelah proses kinetik mencapai

keseimbangan (Neal, 2006).

3. Parameter Turunan Waktu mencapai kadar puncak ( tmak )

Nilai ini menunjukkan kapan kadar obat dalam sirkulasi sistemik mencapai

puncak.

Kadar puncak (Cp mak)


5/34

Kadar puncak adalah kadar tertinggi yang terukur dalam darah atau serum

atau plasma. Nilai ini merupakan hasil dari proses absorbsi, distribusi dan

eliminasi dengan pengertian bahwa pada saat kadar mencapai puncak

proses-proses tersebut berada dalam keadaan seimbang.

Luas daerah di bawah kurva kadar obat dalam sirkulasi sistemik vs waktu(AUC)

Nilai ini menggambarkan derajad absorbsi, yakni berapa banyak obat

diabsorbsi dari sejumlah dosis yang diberikan. Area dibawah kurva

konsentrasi obat-waktu (AUC) berguna sebagai ukuran dari jumlah total

obat yang utuh tidak berubah yang mencapai sirkulasi sistemik .

Agar nilai parameter obat dapat dipercaya ,metode penetapan kadar harus

memeuhi berbagai criteria yaitu meliputi perolehan kembali,presisi dan akurasi

.Persyaratan yang dituntut adalah jika metode tersebut dapat memperoleh nilai

perolehan kembali yang tinggi(75-90% atau lebih ) ,kesalahan acak dan sistemik

kurang dari 10 %.

Parameter farmakokinetika sangat penting karena dapat menggambarkan

seberapa besar obat diabsorbsi, seberapa tepat obat dieliminasi, seberapa besar efek

terapeutik dan ketoksisikan suatu obat. Oleh karena itu agar parameter dapat

dipercaya, metode yang digunakan dalam menentukan kadar obat yang digunakan

harus memenuhi criteria sebagai berikut:

1. Selektif atau spesifikSelektifitas metode adalah kemampuan suatu metode untuk membedakan suatu

obat dari metabolitnya, obat lahir(dalam kasus tertentu yang berkaitan) dan

kandungan endogen cuplikan hayati. Selektifitas metode menempati prioritasutama karena bentuk obat yang akan ditetapkan dalam cuplikan hayati adalah

dalam bentuk tak berubah atau metabolitnya. Metode analisis yang digunakan

harus memiliki spesifitas yang tinggi terhadap salah satu obat yang akan

ditetapkan tersebut. Spesifik hendaknya diterapkan dengan percobaan melalui

bukti kromatografi bahwa metode spesfik untuk obat.Sebagai tambahan, standar

internal hendaknya dapat dipisahkan secara lengkap dan menunjukkan tidak

adanya gangguan senyawa-senyawa lain. Penetapan kadar secara kalorimetrik dan


6/34

spektrofotometrik biasanya kurang spesifik. Gangguan dari zat lain dapat

memperbesar kesalahan hasil (Shargel, 1998).

2. Sensitif atau pekaSensitifitas metode berkaiatan dengan kadar terendah yang dapat diukur oleh

suatu metode analisis yang digunakan. Pemilihan metode analisis tergantung pada

tingkat sensitifitas yang dimiliki oleh metode tersebut. Hal ini dapat dipahami

karena dalam menghitung parameter farmakokinetika suatu obat, diperlukan

sederetan kadar dari waktu ke waktu. Sehingga metode analisis yang dipilih harus

dapat mengukur kadar obat tertimggi sampai yang terendah yang ada dalam

badan.

Perlu diperhatikan bahwa terdapat keterkaitan antara kespesifikan dan kepekaan

suatu metode analisis. Dalam berbagai kasus,kespesifikan suatu metode dapat

ditingkatkan dengan menurunkan kepekaan, karena dengan cara gangguan

komponen lain dalam sampel dapat ditekan. Akan tetapi, penurunan kepekaan

kadang-kadang mengakibatkan kekeliruan negative yang merugikan dalam

analissi kualitatif. Oleh karena itu, sebelum memilih suatu metode, perlu

dipertimbangkan dengan seksama manakah yang lebih dibutuhkan,kepekaan yang

maksimum atau kespesifikan yang tinggi.

3. Ketelitian (accuracy) dan ketepatan(precision)Ketelitian(accuracy) ditunjukan oleh kemampuan suatu metode untuk

memberikan hasil pengukuran sedekat mungkin dengan true value (nilai

sesungguhnya). Ketelitian suatu metode dapat dilihat dari perbedaan anatara harga

penetapan kadar rata-rata dengan harga sebenarnya atau konsentrasi yang

diketahui.

Jika tidak ada data nilai sebenarnya atau nilai yang dianggap benar tersebut maka

tidak mungkin untuk menentukan berapa akurasi pengukuran tersebut.Presisi

menyatakan seberapa dekat nilai hasil dua kali atau lebih pengulangan

pengukuran. Semakin dekat nilainilai hasil pengulangan pengukuran maka

semakin presisi pengukuran tersebut.

=

100% =%


7/34

Metode yang baik memberikan hasil recovery yang tinggi yaitu 75-90% atau

lebih. Ketelitian berkaian dengan purata. Bila suatu hasil itu teliti (accurate) berarti

purata sama dengan harga sebenarnya, walaupun penyebarannya lebar (luas). Dalam

hubungan ini, adalah lebih baik hasil yang kurang teliti tapi tepat daripada teliti

namun kurang tepat. Ketepatan(precision) menggambarkan hasil yang berulang-ulang

tidak mengalami perbedaan hasil (reprodusibilitas data). Dengan kata lain, ketepatan

menunjukkan kedekatan hasil-hasil pengukuran berulang. Ketepatan pengukuran

hendaknya diperoleh melalui pengukuran ulang(replikasi) dari berbagai konsentrasi

obat dan melalui pengukuran ulang kurva konsentrasi standar yang disiapkan secara

terpisah pada hari yang sama. Ketepatan berhubungan dengan penyebaran harga

terhadapa purata kecil meskipun karena kesalahan sistematik, purata berbeda agak

besar dengan harga sebenarnya. Kemudian dilakukan perhitungan statistik yang sesuai

dengan penyebaran data, sperti datndar deviasi atau koefisien variasi.

4. CepatKecepatan berkaitan dengan banyaknya cuplikan hayati yang harus dianalisis

dalam suatu macam penelitian farmakokinetika

5. EfisienMetode tidak terlalu panjang karena dikhawatirkan akan menimbulkan suatu

kesalahan sistematik.

= 100% %

=

100%

=

100%


8/34

III. ALAT DAN BAHANALAT

Labu takar 100 ml Pipet volume 0,1; 0,2; 1,0; 2,0 ml Tabung reaksi 15 buah Pipet ukur 5 ml Speltrofotometer Kuvet Scalpel/ silet Sentrifuge Stopwatch Kertas grefik numeric dan semilog

BAHAN

Asam trikloroasetat (TCA) Natrium nitrit 0,1 % Ammonium sulfamat 0,5 % N (1-naftil) etilebdiamin 0,1 % Sulfadiazine (Na) Antikoagulan: heparin Darah tikus

IV. CARA KERJA Ditetaapkanan prosedur kadar Bratton Marshall

Dibuat larutan stok Na sulfadiazine

Dibuat kurva baku internal

Sampel darah invivo diproses

Stok Na sulfadiazine ditambahkan darah sampel di campurkan dan

dipusingkan (sentrifuge)

Diambil beningan dan diencerkan

Ditambahkan NaNO2 didiamkan

Ditambahkan larutan N (1-naftil) etilendiamin dan dicampur dengan baik

Dipindahkan larutan kedalam kuvet dan dibaca intensitas warna pada

spektrofotometer


9/34

Dicari waktu larutan sulfadiazineDigunakan larutan sulfadiazine

Diukur resapan

Dibuat kurva resapan versus

Ditetapkan waktu resapan

Dicari panjang gelombang Dibuat kurva baku sulvadiazin menggunakan regersi Ditentukan perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistemik

Disediakan larutan dalam darah 50, 100, 300 g/ml

Diambil 0,1 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi dengan 3,9 ml air

Dianalisis sulfadiazine

Ditentukan kadar masing-masing

Dihitung kadar rata-rata dan simpangan baku

Dibuat 2 replikasi

V. HASIL PERCOBAAN1. Kurva baku

Kadar 0; 25; 50; 100; 200; 400 g/ lVolume pengambilan:

Kadar 25 g/ mlV1.M1 = V2.M2

1000.V1 = 1000.25

V1 = 25 l

V Aquadest = 1000-25 l

V Aquadest = 975 l


10/34


1000.V1 = 1000.50

V1 = 50 l

V Aquadest = 1000-50 lV Aquadest = 950 l


1000.V1 = 1000.100

V1 = 100 l


V Aquadest = 900 l


1000.V1 = 1000.200

V1 = 200 l


V Aquadest = 800 l


1000.V1 = 1000.400

V1 = 400 l


V Aquadest = 600 l

Kadar (g/ ml) Absorbansi

25 0,180

50 0,325

100 0,199

200 0,412

400 0,929


11/34

2. Volume pengambilan (Recovery)Kadar 75; 150; 300 g/ l

Volume pengambilan:


1000.V1 = 1000.150V1 = 150 l


V Aquadest = 1850 l


1000.V1 = 1000.300

V1 = 300 l

V Aquadest = 2000-300 lV Aquadest = 1700 l


1000.V1 = 1000.600

V1 = 600 l


V Aquadest = 1400 l

y = 0.0018x + 0.1527

R = 0.9366

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 100 200 300 400 500

Absorbansi

Kadar (g/ml

)

Kurva Baku Sulfametoksazol dalam

Darah Tikus


12/34

Kadar (g/ ml) Replikasi Absorbansi

75 I 0,515

II 0,386

III 0,319

150 I 0,831

II 0,817

III 0,834

300 I 0,877

II 0,783

III 0,828

VI. ANALISIS DATADiamati perubahan yang terjadi

Dicatat hasilnya

Dihitung kadar rata-rata , recovery, kesalahan acak dan kesalahan sistemik

VII. PERHITUNGAN

Y = 1,830.10-3x + 0,153

X = Y - 0,153

1,830.10-3

X75= 0,4070,153 = 138,797 g/mL

1,830.10-3

X150 = 0,8270,153 = 368,306 g/mL

1,830.10-3

X300 = 0,8290,153 = 369,398 g/mL

1,830.10-3


13/34

Perolehan kembali

%PK75 = 138,797 x 100% =185,063%

75

%PK150 = 368,306 x 100% =245,537%

150

%PK300 = 369,398 x 100% =123,13%

300

Kesalahan Acak

%KA75= 0,0996 x 100% = 24,477%

0,407

%KA150= 9.10-3x 100% = 1,097%

0,827

%KA300= 0,047 x 100% = 5,671%

300

Kesalahan sistematik

%KS75 = 100% - 185,073% = -85,073%

Kadar terukur

Perolehan kembali = x 100%Kadar diketahui

Simpangan baku

Kesalahan acak = x 100%

Harga rata-rata

Kesalahan sistemik = 100% - %PK


14/34

%KS150 = 100% - 245,537% = -145,537%

%KS300 = 100% - 123,130% = -23,130%

ONEWAY DATA RECOVERY

ONEWAY /VARIABLES= absorbansi BY kadar

Descriptives

95% Confidence Interval

for Mean

MeanStd.

Deviation

Std.

Error

Lower

Bound

Upper

BoundMinimum Maximum

absorbansi 75 3 .41 .10 .06 .16 .65 .32 .52

150 3 .83 .01 .01 .80 .85 .82 .83

300 3 .83 .05 .03 .71 .95 .78 .88

Total 9 .69 .22 .07 .52 .86 .32 .88

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.

absorbansi 3.49 2 6 .10

ANOVA

Sum of Squares d Mean Square F Sig.

absorbansi Between Groups .36 2 .18 43.66 .00

Within Groups .02 6 .00

Total .38 8

Uji Anova pada prinsipnya adalah melakukan analisis variabilitas data menjadi dua

sumber variasi yaitu variasi didalam kelompok (within) dan variasi antar kelompok

(between). Bila variasi within dan between sama (nilai perbandingan kedua varian mendekati

angka satu), maka berarti tidak ada perbedaan efek dari intervensi yang dilakukan, dengan


15/34

kata lain nilai mean yang dibandingkan tidak ada perbedaan. Sebaliknya bila variasi antar

kelompok lebih besar dari variasi didalam kelompok, artinya intervensi tersebut memberikan

efek yang berbeda, dengan kata lain nilai mean yang dibandingkan menunjukkan adanya

perbedaan.

Hasil uji Anova diketahui besarnya nilai F hitung adalah 43,66 dengan degree of

freedom/derajat bebas (df) regression sebesar 2 dan nilai df dari residual sebesar 6, maka

dapat diketahui besarnya nilai dari F-tabel pada tingkat signifikansi 5% (a = 0,05) yaitu

sebesar 5,14 (Lihat Tabel F).

Untuk pengujian yaitu dengan membandingkan besarnya nilai F hitung dan F tabel,

memberikan hasil bahwa nilai F hitung lebih besar dari F tabel atau 43,66 > 5,14. Diperkuat

dengan nilai p = 0.00 lebih kecil daripadanilai kritik =0,05.H0 ditolak sehingga kesimpulan

yang didapatkan adalah ada perbedaan yang bermakna rata-rata absorbansi berdasarkan

ketiga kelompok kadar tersebut.

Karena hasil uji Anova menunjukan adanya perbedaan yang bermakna, maka uji

selanjutnya adalah melihat kelompok mana saja yang berbeda. Untuk menentukan uji lanjut

mana yang digunakan, maka kembali kita lihat tabel Test of Homogeneity of Variances.

Hasil uji Homogeneity of Variances menunjukkan nilai sig. (p-value) sebesar 0,10, ini

mengindikasikan bahwa kita gagal menolak H0, dengan kata lain H0 diterima. Berarti tidak

cukup bukti untuk menyatakan bahwa mean dari tiga kadar kelompok tidak sama. Hasil yang

didapatkan 0,10 > 0,05 dapat disimpulkan bahwa data absorbansi berdasarkan kadar

mempuyai varian yang sama.

VIII. PEMBAHASANTujuan praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat memahami langkah-langkah

analisis obat didalam cairan hayati. Obat yang dianalisis dalam percobaan kali ini adalah

sulfametoksazol. Dalam percobaan ini digunakan metode bratton-marshall. Metode bratton-

marshall merupakan cara umum untuk menentukan kadar senyawa yang mempunyai senyawa

amin primer didalamnya. Metode ini berdasarkan kolorimetri, yaitu terbentuknya senyawa

berwarna yang intensitasnya dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer uv-

visibel.

Analisis ini bertujuan untuk menguj seberapa besar ketepatan dan ketelitian metode

yang digunakan, maka ditetapkan beberapa parameter farmakokinetika yang berhubungan

dengan metode penetapan kadar suatu obat dalam cairan hayati, seperti recovery (P%), dan

kesalahan sistematik (100%-P%) sebagai parameter ketelitian serta perhitungan SD dan

kesalahan acak (CV) sebagai parameter ketepatan. Parameter farmakokinetik merupakan

tolak ukur yang digunakan untuk mengevaluasi pola absorbsi, distribusi, metabolisme,


16/34

ekskresi suatu obat. Parameter farmakokinetik merupakan besaran yang diturunkan secara

sistematis dari hasil pengukuran kadar obat atau metabolitnya dalam darah atau urin. Analisis

ini dilakukan dengan membuat seri kadar obat tertentu dalam darah dan urin yang kemudian

diproses lebih lanjut sehingga dpaat dibaca absorbannya dan dibuat kurva bakunya.

Cairan hayati yang digunakan sebagai media obat adalah darah dan urin. Darah yang

digunakan untuk analisis obat karena darah merupakan tempat yang paling cepat dicapai oleh

obat dan merupakan tempat dominan yang dilalui oleh obat, baik ketika proses metabolisme

maupun organ eliminasi, sehingga kadar obat dalam darah paling mencerminkan kadar obat

sebenarnya dalam tubuh. Proses absorbsi ditunjukan dengan adanya peningkatan kadar obat

dalam darah. Sedangkan proses distribusi dan eliminasi ditunjukan dengan adanya penurunan

kadar obat dalam darah pada waktu tertentu.

Sedangkan penggunaan urin dalam analisis kadar obat memiliki beberapa persyaratan,

antara lain bentuk obat dalan keadaan unchanged, teknik penetapan harus spesifik,

frekuensi cuplikan harus besar, dan cuplikan yang diambil harus ketika semua obat telah

diekskresi atau sekitar 7-10 kali waktu paruhnya. Keterbatasan penggunaan cuplikan urin

diantaranya karena pengosongan kandung kemih sulit utnuk dikerjakan, banyak obat

mungkin mengalani dekomposisi selama penyimpanan, dan kemungkinan terhidrolisisnya

konjugat metabolit yang tidak stabil dalam urin. Pada akhirnya keterbatsan tersebut dapat

mempengaruhi jumlah total obat dalam bentuk unchanged yang diekskresikan pada waktu

tak hingga.

Berikut bahan bahan yang digunakan dalam praktikum ini:

1. sulfametoksazol:

Rumus molekul : C10

H11N

3O

3S

Berat molekul : 253,28

Pemerian : serbuk hablur, putih sampai hampir putih, praktis tidak berbau


17/34

Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam kloroform, mudah

larut dalam aseton dan dalam larutan natrium hidroksida encer, agak

sukar larut dalam etanol.

Sulfametoksazol mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0%

C10H11N3O3S, dihitung terhadap zat yang etlah dikeringkan.

Pemerian : Serbuk hablur, putih sampai hampir putih; praktis tidak berbau

Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, dalam eter, dan dalam kloroform; mudah

larut dalam aseton dan dalam natrium hidroksida encer; agak sukar

larut dalam etanol.

Sulfametoksazol merupakan derivat dari Sulfisoxasol yang mempunyai absorbsi dan

ekskresi yang lebih lambat. Bersifat tidak larut dalam air, tetapi larut dalam NaOH encer.

Dari sifat-sifat itu, larutan obat ini dibuat dengan melarutkan terlebih dahulu SMZ dalam

NaOH kemudian diencerkan dengan menggunakan aquadest hingga konsentrasi yang

dikehendaki. Obat ini biasa digunakan dalam bentuk sediaan tablet, injeksi, suspensi, tetes

mata, dan salep mata.

Waktu paruh plasma Sulfametoksazol adalah 11 jam

Sulfametoksazol merupakan sulfonamid turunan dari sulfanilamid dan mempunyai

peranan sebagai obat anti bakteri. Sulfametoksazol merupakan sulfonamid yang mempunyai

kecepatan absorpsi dan ekskresi cepat. Pasangan elektron bebas yang dimiliki

Sulfametoksazol terdapat pada atom-atom N-primer, N-sekunder, N-tersier, O pada SOdan

rantai siklik serta S pada SO, dimungkinkandapat mengikat tembaga(II) pada protein azurin

yang dibutuhkan oleh bakteri untuk proses fotosintesis.

Sulfametoksazol dalam dewasa ini hampir selalu digabungkan dengan trimetropin

dalam penggunaanya. Trimetoprim dan sulfametoksazol menghambat reaksi enzimatik

obligat pada dua tahap yang berurutan pada mikroba, sehingga kombinasi kedua obat

memberikan efek sinergi. Penemuan sediaan kombinasi ini merupakan kemajuan penting

dalam uasaha meningkatkan efektivitas klinik antimikroba. Kombinasi ini lebih dikenal

dengan kotrimoksazol.

Mikroba yang peka terhadap kombinasi trime toprim-sulfametoksazol ialah ; S.

pneumoniae, C. diphtheria, dan N meningitis, 50-59 % strain S. aureus, S. epidermidis, S.

pyogenes, S. viridians, S. faecalis, E. coli, P. mirabilis, P. morganii, P. rettgeri,

Enterobacter, Aerobacter spesies, Salmonela, Shigela, Serratia dan Alcaligenes spesies dan

Klebsiela spesies. Kedua komponen memperlihatkan interaksi sinergistik. Kombinasi ini

mungkin efektif walaupun mikroba telah resisten terhadap tirmetropim.


18/34

Aktifitas antibakteri kotrimoksazol berdasarkan atas kerjanya pada dua tahap yang

berurutan dalam reaksi enzimatik untuk membentuk asam tetrahidrofolat. Sulfonamide

menghambat masuknya molekul PABA ke dalam molekul asam folat dan trimetoprim

menghambat terjadinya reaksi reduksi dari dihidrofolat menjadi tetrshidrofolat.

Tetrahidrofolat penting untuk reaksi-reaksi pemindahan satu atom C, seperti pembentukan

basa purin (adenin, guanin, dan timidin) dan beberapa asam amino (metionin, glisin). Sel-sel

mamalia menggunakan folat jadi yang terdapat dalam makanan dan tidak mensintensis

senyawa tersebut. Trimetoprim menghambat enzim dihidrofolat reduktase mikroba secara

sangat selektif. Hal ini penting, karena enzim tersebut juga terdapat pada sel mamalia.

2. HEPARINHeparin adalah sediaan steril mengandung polosakarida sulfat seperti yang terdapat

dalam jaringan hewan yang menyusui, mempunyai sifat khas menghambat pembekuan darah.

Potensi tiap mg tidak kurang dari 110 IU dan tidak lebih dari 13 Iu dihitung terhadap zat yang

telah dikeringkan dan tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang

tertera dalam etiket.

Struktur heparin:

Pemerian: Serbuk, putih atau putih daging agak higroskopis

Kelarutan: Larut dalam 2,5 bagian air

Heparin merupakan anti-koagulansia langsung, yang mengandung gugus karboksil

dan sisa sulfat, sehingga heparin merupakan salah satu asam terkuat dalam tubuh. Heparin

bekerja dengan menghambat pembekuan darah yang kerjanya bergantung adanya Anti-

trombin III (suatu 2-globulin dan kofaktor dari heparin dan memperkuat kerja heparin)

sehingga membentuk kompleks heparin-antitrombin yang ammpu mengaktifkan faktor-faktor

Ixa, Xa, XIa, XIIa sehingga menghambat pembentukan trombin. Pqdq konsentrasi tinggi,

heparin menghambat juga agregasi trombosit.


19/34

Heparin juga mempunyai kerja menjernihkan plasma yang berlipid (membebaskan

lipoproteinlipase dari endotelium pembuluh yang mampu melarutkan khilomikron). Heparin

mempercepat penguraian histamin dengan membebaskan diaminoksidase yang mengoksidasi

histamin dan mereduksi pembentukan aldosteron.

Mekanisme anti koagulan :

Heparin + Anti trombin III + Faktor penggumpalan Kompleks terner

Protrombin X Trombin

Heparin beraksi dengan mengikat anti trombin III membentuk kompleks yang berafinitas

lebih besar daripada anti trombin III itu sendiri terhadap beberapa faktor pembekuan darah

aktif (trombin dan faktor Xa/faktor stuart power). Heparin juga menginaktivasi faktor

VIIIa/AHG dan mencegah terbentuknya fibrin yang stabil. Oleh karena itu heparin

mempercepat inaktivasi faktor pembekuan darah. (Ian Tahu, 1995).

3. ASAM TRIKLORO ASETAT(TCA)

Rumus molekul : C2HCl3O2

BM : 163,39

Pemerian : massa hablur, sangat rapuh, tidak berwarna, rasa lemah dan

khas.

Kelarutan : sangat mudah larut dalam air, dalam etanol, dan dalam eter P.

Asam trikloroasetat (nama sistematis:asam trikloroetanoat) adalah analog dari asam

asetat, dengan ketiga atom hidrogen dari gugus metil digantikan oleh atom-atom

klorin.Senyawa ini merupakan asam yang cukup kuat (pKa = 0.77, lebih kuat dari

disosiasi kedua asam sulfat). Senyawa ini dibuat melalui reaksi klorin dengan asam

asetat bersamakatalis yang cocok.

CH3COOH + 3Cl2 CCl3COOH + 3HCl

(anonim,1979)
http://id.wikipedia.org/wiki/Tatanama_IUPAChttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Atomhttp://id.wikipedia.org/wiki/Hidrogenhttp://id.wikipedia.org/wiki/Metilhttp://id.wikipedia.org/wiki/Klorinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_sulfathttp://id.wikipedia.org/wiki/Katalishttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Klorinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Klorinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Klorinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_kloridahttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_kloridahttp://id.wikipedia.org/wiki/Klorinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Katalishttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_sulfathttp://id.wikipedia.org/wiki/Klorinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Metilhttp://id.wikipedia.org/wiki/Hidrogenhttp://id.wikipedia.org/wiki/Atomhttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Asam_asetathttp://id.wikipedia.org/wiki/Tatanama_IUPAC


20/34

4. NATRIUM NITRIT 0,1%

Nama lain : sodium nitrit, nitrous acid sodium salt, orinitrit.

Pemerian : putih atau sedikit kuning, granul higrokopis, batang atau serbuk.

Kelarutan : larut dalam 1,5 bagian air dingin, o,6 bagian air mendidih

(windohlz, 1976).

5. AMONIUM SULFAMAT

Nama lain : sulfamic acid monoamonium salt, AMS, amcide, ammate.

Pemerian : kristal higroskopis.

Kelarutan : sangat mudah larut dalam air, sedikit larut dalam etanol, cukup larut

dalam gliserol,glikol,formalmida.

(windohlz, 1976)

Dalam percobaan ini digunakan metode Bratton-Marshall. Metode Bratton-Marshall

merupakan cara umum untuk menentukan kadar senyawa yang mempunyai senyawa amin

primer didalamnya. Metode ini berdasarkan kolorimetri, yaitu terbentuknya senyawa

berwarna yang intensitasnya dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-

visibel. Metode Bratton-Marshall meiliki 3 tahap, yaitu :1. Hidrolisis gugus asetil

Salah satu syarat reaksi diazotasi adalah senyawa harus memiliki gugus amina aromatik

primer. Apabila senywa gugus aminanya terikat pada molekul lain, maka senywa harus

dihidrolisis terlebih dahulu.

2. DiazotasiReaksi antara senyawa amina aromatik primer dengan asam nitrit ( HNO2) membentuk

suatu garam diazonium. Asam nitrit merupakan senyawa yang tidak stabil dalam keadaan

normal sehingga untuk mendapatkan asam nitrit perlu dilakukan reaksi anatara natrium


21/34

nitrit dengan HCl. Asam nitrit akan membentuk ion nitronium dan akan bereaksi dengan

amina membentuk garam diazonium. Reaksi diazotasi p-aminofenol :

NaNO2 + HCl

3. KoplingMula-mula dilakukan pengambilan darah hewan uji yaitu tikus.. Digunakan

tikus putih karena tikus memiliki sistem faal mirip dengan manusia. Pengambilan darah

dilakukan dengan menyayat vena lateralis dari ekor tikus.Vena disayat sejajar dengan

arah aliran darah (bukan melintang) karena dapat memutus vena tersebut sehingga

darah yang keluar tidak kontinyu. Pengambilan pada daerah tersebut karena di tempat

itu banyak terdapat pembuluh darah vena sehingga darah yang keluar lebih banyak

selain itu karena pada bagian ekor pembuluh darahnya dekat dengan permukaan kulit,

sehingga pengambilannya lebih mudah dan dapat mencegah dari kematian. Sebelum

diambil darahnya,bulu pada daerah ekor tikus dicukur terlebih dahulu agar darah tidak

menempel dan tertinggal pada bulu tikus. Dengan pencukuran diharapkan darah dapat

menetes keluar tanpa hambatan. Ekor yang telah disayat diurut untuk mendilatasi untuk

pembuluh darahsehingga darah dapat keluar dengan lebih mudah dan cepat. Apabila

darah sudah tidak keluar lagi maa ekor tikus lagi atau dapat pula luka goresan tadi

sigores sedikit lagiagar luka dapat terbuka kembali dan darah dapat mengalir keluar.

Jika darah yang terkumpul tidak cukup banyak,maka dapat dilakukan dengan

pengambilan darah dari pembuluh darah tepi mata dari tikus. Namun pada percobaan

kali ini darah diambil hanya melalui vena lateralis.

Pada praktikum ini diambil darah dari pembuluh vena pada ekor tikus dengan skalpel.

Pengambilan darah dilakukan dengan cara memasukkan tikus kedalam holder dan dilewatkan

ekornya pada lubang holder lalu holder ditutup sehingga yang berada di luar holder hanya

bagian ekor tikus. Kemudian dipegang ekor tikus dengan posisi menurun dan dicukur bulu

tikus pada ekor dengan menggunakan skalpel sehingga tampak daerah kebiruan yang

merupakan vena. Lalu skalpel digoreskan pada pembuluh vena sehingga darah bisa menetes,

darah yang menetes tersebut ditampung dengan eppendorf yang telah diberi heparin sebanyak

5,0 ml sebagai koagulan. Maksud penambahan antikoagulan adalah agar darah tidak

membeku. Jika darah mengalami koagulasi maka pada proses sentrifugasi akan diperoleh

supernatan berupa serum sedangkan yang digunakan dalam pemeriksaan adalah plasma darah

sebagai cairan hayati. Jika darah mulai tidak menetes, diusap bagian luka dengan kapas lalu

diurut bagian ekor dari atas ke bawah sehingga darah keluar. Darah yang ditampung dari


22/34

seluruh kelompok memenuhi syarat yaitu minimal 4 ml. Darah yang keluar ditampung dalam

efendorf 1 mL tiap kelompok.

Sulfametoksazol akan berikatan dengan protein plasma membentuk kompleks obat

makromolekul yang disebut kompleks protein-obat. Protein dalam plamsa darah antara lain

albumin danglobulin. Albumin bertangggung jawab terhadap ikatan obat, sedangkan

globulinmerupakan bagian terkecil dari keseluruhan protein plasma. Obat akanberikatan

dengan protein plasma jika plasma darah memebentuk suatu agregat besar. Oleh karena itu,

digunakan plasma darah yang tidak terkoagulasi. Kelompok kami menyayat sampai 3 kali

dan jumlah darah yang didapat hampir memenuhi eppendorf.

Setelah itu dibuat larutan baku yang bertujuan agar kita dapat menghitung persamaan

regresi linier hubungan kadar sulfametoksazol dengan absorbansi sehingga dapat menghitung

kadar sulfametoksazol dalam darah tikus. Untuk kurva baku dibuat masing-masing seri kadar

larutan baku dengan mengencerkan larutan sulfametoksazol dengan kadar1, mg/mL

menggunakan aquadest lalu dimasukkan dalam tabung reaksi berisi sampel hingga didapat

konsentrasi sulfametoksazol dalam sampel 25, 50, 100, 200, 400. Untuk blangko digunakan

aquadest dengan tujuan untuk mengoreksi absorbansi senyawa yang terbentuk.

Lalu dilakukan pembuatan kurva baku internal, karena menggunakan darah pada

sampel bukan aquadest. Caranya dengan blanko (250 mikro liter) yang mengandung

koagulan ditambahkan 250 mikro liter larutan stok sulfametoksazol sehingga kadarnya 0, 25,

50, 200, dan 400 mikrogram/mL darah, campur homogen.

Selanjutnya adalah pemrosesan sampel darah invivo dengan cara masukan 250

mikroliter darah yang mengandung anti koagulan. Maksud penambahan antikoagulan adalah

agar darah tidak membeku. Campuran tersebut ditambahkan dengan 250 mikroliter aquadest

lalu campur homogen. Setelah homogen ditambahkan dengan 2 mL TCA 5% dengan

votexing. Maksud penambahan TCA adalah agar protein terdeprotonasi. TCA mendenaturasi

struktur sekunder dan tersier protein melalui ikatan disulfida yang merupakan pembentuk

kedua struktur tersebut sehingga bagian nonpolar dari protein akan keluar serta protein

mengendap. TCA juga berfungsi sebagai donor proton pada reaksi berikutnya. TCA juga

berfungi sebagai pemberi suasana asam pada reaksi diazotasi sehingga dapat menghentikan

kerja enzim pemetabolisme obat sekaligus menyebabkan denaturasi protein plasma tanpa

memecah protein menjadi asam amino penyusunnya. Lalu maksud dari votexing adalah agar

terjadi pencampuran antara TCA dengan darah yang mengandung anti koagulan secara

merata sehingga proses denaturasi protein berjalan lebih cepat.


23/34

Berikut ini adalah proses denaturasi protein oleh TCA:

Pada reaksi diazotasi yang biasa, digunakan HCl (suatu asam mineral kuat) sebagai

pemberi suasana asam. Tetapi pada percobaan ini tidak digunakan HCl karena HCl berefek

memecah protein menjadi asam amino-asam aminonya sehingga pada saat sentrifugasi asam

amino-asam amino tersebut tidak akan memisah dari plasmanya karena terlalu kecil untuk

bisa diendapkan. Asam amino tertentu memiliki ikatan rangkap terkonjugasi akan

memberikan serapan pada UV-Vis sehingga akan mengganggu pembacaan absorbansi.

Sedangkan bila digunakan TCA akan mengikat protein sehingga protein dapat terdenaturasi

dalam suasana asam tanpa terpecah menjadi fragmen-fragmennya.

Lalu larutan kurva baku internal yang telah dibuat digabung dengan sampel darah in vivo

yang telah di votexing dicampur lalu dipusingkan selama 5 menit dengan kecepatan 2500

rpm. Maksud dari dipusingkan adalah agar terpisah antara zat padat dalam hal ini protein

terdenaturasi dengan cairan yang berupa supernatan. Sentrifugasi juga menyempurnakan danmempercepat pemisahan endapan protein dari supernatan yang mengandung sejumlah


24/34

sulfametoksazol yang tidak ikut mengendap bersama protein. Sulfametoksazol yang berada

pada supernatan merupakan obat bebas yang tidak terikat protein, sedangkan obat yang

terikat dengan prtein tidak aktif scara farmakologis dan tidak memberikan efek terapeutik.

Setelah dipusingkan maka diambil beningan sebanyak 1,50 mL dengan menggunakan

mikropipet secara hati hati agar endapan protein tidak diambil, sehingga didapatkan obat

bentuk bebas pada sampel. Lalu diletakkan di tabung reaksi setelah itu diencerkan dengan

aquadest sebanyak 2,0 mL. Lalu disetiap tabung reaksi ditambahkan larutan NaNO2 0,1%

sebanyak sebanyak 0,1 mL lalu diamkan selama 3 menit agar terjadi reaksi secara sempurna.

Maksud dari penambhan natrium nitrit adalah agar terjadi reaksi diazotasi reaksi diazotasi

merupakan reaksi antara amina aromatik primer dengan natrium nitrit akan menghasilkan

garam diazonium. Kondisi yang paling baik untuk reaksi diazotasi pada pH sekitar 0-3. Suhu

harus rendah bertujuan untuk mengubah natrium nitrit menjadi asam nitrit yang akan bereaksi

dengan sulfametoksazol. Digunakan natrium nitrit sebab natrium nitrit lebih stabil

dibandingkan asam nitrit yang mudah rusak.

Lalu setelah itu ditambahkan larutan ammonium sulfamat 0,5% sebanyak 0,2 mL lalu

diamkan selama 2 menit agar proses reaksi berlangsung dengan sempurna. Maksud dari

penambahan dari ammonium sulfamat agar sisa nitrit dari reaksi diazotasi dapat ditangkap

oleh ammonium sulfamat. Asam nitrit yang bersifat sebagai oksidator dapat mengoksidasi

senyawa hasil reaksi kopling diazo sehingga dapat lepas menjadi gas nitrogen dan fenol. Oleh

karena itu kelebihan asam nitrit harus dihilangkan. Pada saat penambahan ammonium

sulfamat harus dilakukan secara hati hati karena akan timbul gelembung gas.


25/34

Selanjutnya larutan yang telah didiamkan selama 2 menit ditambah N(1-

naftil)etilendiamin 0,1% sebanyak 0,2 mL campur baik baik lalau diamkan selama 5 menit

ditempat gelap. N(1-naftil)etilendiamin sebagai pengompling lebih disukai untuk analisis

kuantitatid karena produk biasanya berupa larutan dalm air dan punya absortivitas yang

tinggi. N(1-naftil)etilendiamin bekerja dalam suasana asam.

Setelah didiamkan selam 5 menit, larutan dibaca absorbansinya pada panjang

gelombang 545 nm menggunakan spektrofotometer visibel terhadap blanko pereaksi yang

telah dibuat. Digunakan panjang gelombang 545 nm karena merupakan panjang gelombang

tersebut merupakan panjang gelombang maksimum untuk senyawa yang terbentuk.

Digunakan panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum

absorbansi yang dihasilkan maksimal dan kesalahan pembacaan pada panjang gelombang

maksimal paling kecil. Hal ini disebabkan karena pada panjang gelombang maksimal terdapat

keseimbangan antara energi yang dibutuhkan untuk eksitasi dengan energi yang diberikan

untuk eksitasi.

Sebelum dilakukan pengkuran absorbansi sampel harus terlebih dahulu dipersiapkankurva baku sebagai kalibrasi. Manfaatnya kita dapat mengetahui kisaran absorbansi untuk

sampel agar masuk dalam kisaran kurva baku. Sebelum dilakukan pembacaan absorbansi,

perlu dilakukan terlebih dahulu penentuan operating time, yang merupakan waktu yang

menunjukkan nilai absorbansi yang konstan terhadap larutan yang dianalisis. Hal ini perlu

dilakukan, karena pada percobaan ini terjadi suatu reaksi kopling dengan penambahan NED

pada suatu senyawa yang berupa garam diazonium sebagai hasil reaksi diazotasi suatu

senyawa aromatik primer dalam suasana asam. Reaksi tersebut memerlukan waktu hingga

terbentuk seyawa kopling yang stabil, yang ditunjukkan dengan diperolehnya nilai / angka

yang konstan pada beberapa kali pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer. Akan

tetapi, pada percobaan ini tidak dilakukan penentuan nilai max dan operating time-nya,

namun sebelum pembacaan absorbansi dilakukan pendiaman terhadap campuran yang telah

ditambahkan NED selama + 5 menit. Dengan waktu 5 menit, diperkirakan merupakan

operating time untuk campuran tersebut dan kemungkinan dalam waktu 5 menit tersebut

reaksi kopling sudah berjalan dengan sempurna.


26/34

Hasil absorbansi yang diperoleh kemudian digunakan untuk menghitung kadar

terukur obat dalam sampel, lalu dihitung beberapa paranmeter fisika:

1. AkurasiAkurasi dianggap baik jika kesalahan sistematik tidak lebih dari 10%. Harga

kesalahan sistematik menunjukan kemampuan metode ini memberikan hasil

pengukuran sedekat mungkin dengan nilai sebenarnya.

2. PresisiPresisi dianggap baik jika kesalahan acak tidak lebih dari 10%. Ketepatan

menunjukan hasil pengukuran yang berulang pada sediaan hayati yang sama.

3. EfisiensiNilai recovery atau perolehan kembali hasil yang didapat. Recovery merupakan

tolak ukur efisiensi analisis. Analisis memenuhi syarat jika recovery berkisar

antara 75-90%. Jika diluar rentang kadar tersebut maka percobaan dianggap

kurang efisien. Recoverymenunjukan kemapuan suatu metode memberikan hasil

sedekat mungkin dengan hasil sesungguhnya.

Sedangkan syarat yang harus dipenuhi oleh metode analisis yang digunakan yaitu:

1. Selektif dan spesifik2. Akurat dan teliti3. Sensitif4. Efisien, cepat, dan mudah digunakan.Pada praktikum kali ini didapatkan data berupa nilai absorbansi. Dari berbagai seri

kadar sulfametoksazol, akan didapatkan hasil berupa nilai absorbansi untuk masing-masing

kadar. Data yang diperoleh kemudian dilakukan regresi linier, dimana kadar sulfametoksazol

sebagai nilai X dan absorbansi yang diperoleh sebagai nilai Y, sehingga didapatkan

persamaan kurva baku.

Pembuatan seri kadar larutan baku sulfametoksazol dengan cara mengencerkan stok larutan

sulfametoksazol 1,0 mg/ml menggunakan pelarut aquadest dengan rumus yaitu:

V1.M1=V2.M2, dimana V1menunjukan volume sulfametoksazol yang diambil dalam satuan

mililiter, serta nilai V2menunjukan nilai volume dari labu takar. Lalu nilai M1 menunjukan

nilai kadar sulfametoksazol yang tersedia dengan M2 menunjukan konsentrasi yang kita

inginkan. V1.M1=V2.M2. Sehingga didapatkan konsentrasi sulfametoksazol : 25; 50; 100;

200; 400 g/ml. Sulfametoksazol dan aquadest diambil menggunakan mikropipet karena

jumlah yang dibutuhkan sedikit. Dengan kadar sulfametoksazol sebesar 25g/mL didapatkan

volume sulfametoksazol yang harus diambil sebesar 25 mikroliter. Dengan kadar sebsar 50


27/34

g/mL didapatkan kadar sulfametoksazol yang harus diambil sebesar 50 mikroliter.

Berikutnya dengan kadar 100 mg/mL didapatkan kadar yang harus diambil sebesar 100

mikroliter. Dengan kadar sebsar 200 mg/mL didapatkan jumlah volume sebesar 200

mikroliter. Serta yang terakhir dengan kadar sebsar 400mg/mL didapatkan volume 400 mikro

liter yang harus diambil.

Pembuatan kurva baku bertujuan untuk menghitung persamaan regresi linier

hubungan kadar sulfametoksazol pada sampel darah tikus dengan nilai absorbansinya.

Pembuatan kurva baku membutuhkan 6 sampel darah yang dimasukkan ke dalam tabung

reaksi. Lima dari sampel darah tersebut ditambahkan sulfametoksazol sebanyak 250 l

dengan kadar yang berbeda untuk setiap tabung reaksi. Satu sampel darah yang tersisa

ditambahkan 250 l aquadest sebagai blanko dalam perhitungan absorbansi. Penggunaan

blanko bertujuan untuk mengoreksi absorbansi senyawa yang terbentuk. Tabung berisi

sampel darah dan sulfametoksazol digojog ringan agar homogen. Kemudian ke dalam 5

tabung reaksi berisi darah dan sulfametoksazol serta 1 tabung reaksi berisi blanko

ditambahkan TCA (Trikloroasetat) 5 % sebanyak 2,0 ml. Tujuan penambahan TCA adalah

untuk mendenaturasi protein plasma tanpa memecah protein menjadi asam amino dan

penyusunnya sehingga pada proses sentrifugasi protein bisa mengendap dan memisah dari

plasma darah. TCA juga digunakan untuk memberikan suasana asam yang dibutuhkan untukproses reaksi kimia diazotasi sehingga dapat diketahui kadar sulfametoksazol sebenarnya.

Kondisi asam yang diberikan TCA juga mampu menghentikan enzim pemetabolisme obat

dalam darah. Untuk memaksimalkan kerja TCA, TCA perlu dihomogenkan terlebih dahulu

dengan vortex. Setelah dilakukan vortex maka keenam tabung disentrifugasi selama 5 menit

dengan kecepatan 2500 rpm. Sentrifugasi bertujuan memisahkan bagian padat (protein dan

sel-sel darah) dengan bagian cair yang merupakan plasma darah. Plasma tampak sebagai

supernatan bening di lapisan atas. Plasma darah mengandung sejumlah sulfametoksazol yang

tidak ikut mengendap bersama protein.

Setelah sentrifugasi, plasma darah diambil sebanyak 1,50 ml, jangan sampai endapan

ikut terambil karena bisa memengaruhi hasil absorbansi pada spektrofotometer UV-Vis.

Plasma darah berisi obat bebas, sedangkan obat yang berikatan dengan protein plasma tidak

aktif secara farmakologis dan tidak memiliki efek terapetik. Plasma lalu dimasukkan dalan

tabung reaksi ditambah 0,1 ml larutan NaNO20,1 % dan didiamkan selama 3 menit. Ion NO2

dari NaNO2 dan H+

dari TCA akan membentuk asam hipotetik HNO2 yang akan bereaksi

dengan amina aromatis yang dimiliki sulfametoksazol sehingga membentuk garam


28/34

diazonium dan menyebabkan perpanjangan ikatan rangkap terkonjugasi (kromofor) sehingga

dapat diketahui absorbansinya. Selanjutnya, ditambahkan 0,2 ml larutan ammonium sulfamat

0,5 % ke masing-masing tabung reaksi lalu didiamkan selama 2 menit. Ammonium sulfamat

akan menghilangkan kelebihan HNO2, karena HNO

2 berlebih akan merusak senyawa yang

terbentuk. Hilangnya HNO2 ditandai dengan tidak adanya gelembung N2 yang dapat

mengganggu analisis. Reaksinya adalah sebagai berikut.

HNO2+ HSO3NH2 H2SO4+ H2O + N2

Setelah 2 menit, ditambahkan N(1-naftil)etilendiamin (NED) 0,1 % ke dalam

campuran sebanyak 0,2 ml. Penambahan NED bertujuan untuk menimbulkan reaksi kopling

yang menyempurnakan reaksi diazotasi sebelumnya. Campuran ini diletakkan di tempat

gelap selama 5 menit untuk menyempurnakan reaksi. Setelah 5 menit, absorbansi masing-

masing campuran dibaca menggunakan spektrofotometer. Panjang gelombang yang

digunakan adalah 545 nm dan digunakan blanko darah dengan kadar 0 %. Panjang

gelombang 545 nm dipilih karena memiliki sensitivitas tinggi, dimana dengan perubahan

sedikit kadar dapat menyebabkan perubahan absorbansi yang besar.

Kemudian didapatkan nilai absorbansi dari kadar 25 g/ml menunjukkan absorbansi

sebesar 0,180; kadar 50 g/ml menunjukkan absorbansi sebesar 0,325; kadar 100 g/mlmenunjukkan absorbansi sebesar 0,199; kadar 200 g/ml menunjukkan absorbansi sebesar

0,412; dan kadar 400 g/ml menunjukkan absorbansi sebesar 0,929. Nilai absorbansi pada

kadar 100 g/ml lebih kecil dari kadar 50 g/ml. Hal ini tidak sesuai teori, seharusnya

semakin besar kadar semakin besar pula absorbansi karena semakin banyak partikel dalam

campuran sehingga cahaya yang dapat diserap partikel semakin banyak. Kesalahan ini

kemungkinan disebabkan kurang sempurnanya pengenceran atau terjadi reaksi yang kurang

sempurna. Nilai absorbansi yang menyimpang dari teori yaitu 0,199 dapat diabaikan dalam

pembuatan regresi linier.

Nilai absorbansi yang didapat kemudian dibuat persamaan kurva baku menggunakan

regresi linier. Berdasarkan data yang didapat, diperoleh persamaan kurva baku sebagai

berikut:

y = 1,830.10-3x + 0,153


29/34

Berdasarkan pengukuran dan hasil perhitungan pada data kadar Sulfametoksazol di

dalam darah tikus, kita bisa menghitung nilai kesalahan sistemik, kesalahan acak, dan

perolehan kembali. Nilai-nilai ini berguna dalam menentukan keakuratan dan presisi data.

Nilai perolehan kembali (recovery) merupakan parameter atau tolak ukur efisiensi analisis

yang menggambarkan akurasi (ketelitian) metode yang digunakan. Ketelitian ditunjukan oleh

kemampuan metode untuk memberikan hasil sedekat mungkin dengan nilai yang

sesungguhnya. Ketelitian suatu metode dapat diketahui dari harga perolehan kembali atau

recoveryyang dinyatakan sebagai % error. Perolehan kembali merupakan tolak ukur efisiensi

analisis, sedangkan kesalahan sistemik merupakan tolak ukur inakurasi penetapan kadar.

Kesalahan ini dapat berupa kesalahan konstan atau proporsional.

Persyaratan yang dituntut bagi suatu metode tersebut dapat memberikan nilai

perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau lebih), kesalahan acak dan sistematik kurang

dari 10% (Pasha dkk., 1986).

Kadar terukur

Perolehan kembali = x 100%

Kadar diketahui

y = 0.0018x + 0.1527

R = 0.9366

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 100 200 300 400 500

Absorbansi

Kadar (g/ml)

Kurva Baku Sulfametoksazol dalam

Darah Tikus


30/34

Nilai perolehan kembali untuk sampel dengan kadar 75, 150, dan 300 g/mL pada

sampel darah tikus, sebagai berikut:

1. Nilai recovery rata-rata darah tikus dengan kadar 75 g/mL sebesar 185,063%2. Nilai recovery rata-rata darah tikus dengan kadar 150 g/mL sebesar 245,537%3. Nilai recovery rata-rata darah tikus dengan kadar 300 g/mL sebesar 123,130%

Dari ketiga nilai tersebut, tidak ada nilai yang memenuhi syarat sebuah data dapat

dinyatakan akurat. Untuk memenuhi tingkat akurasi yang baik, range nilai recovery yang

ditentukan adalah 75-90%. Untuk nilai recovery yang lebih besar dari 100% dapat

disebabkan:

Ada senyawa endogen atau metabolit yang ikut terukur, seperti, molekul-molekulpengganggu atau protein dalam darah yang dapat meningkatkan nilai absorbansi.

Ketidaktelitian praktikan dalam menggunakan alat praktikum seperti mikropipetyang mempengaruhi pemberian volume analit ataupun larutan pereaksi, alat votex

yang mempengaruhi homogenitas antara pereaksi dan analis, dan juga

spektrofotometer yang mempengaruhi nilai serapan analit.

Perbedaan dalam penentuan operating timesehingga pembacaan absorbansi padapembuatan kurva baku dan pembacaan pada percobaan tidak sama selang

waktunya.

Berikut beberapa cara untuk menghindari kesalahan pada parameter nilai perolehan

kembali:

Sentrifugasi yang dilakukan harus mampu mengendapkan protein plasma dantidak menyebabkan hemolisis pada sampel darah, yaitu pecahnya sel darah merah

sehingga komponen-komponen intrasel keluar tercampur dengan plasma sehingga

tidak mengganggu proses absorbansi sampel.

Saat pengambilan supernatant hasil sentrifugasi, jangan sampai endapan ikutterambil.

Pengukuran sampel dan latutan pereaksi harus tepat. Pemakaian alat yang baik dan benar sesuai prosedur kerja. Mengkondisikan sampel dan pereaksi tidak terkontaminasi.

Selain akurasi, suatu ketepatan metode analisis dapat ditinjau dari segi presisinya. Dikatakan

presisi atau tepat apabila mampu menunjukan kedekatan hasil pada pengukuran berulang atau


31/34

replikasi pada sampel hayati yang sama. Tolak ukur dari ketepatan suatu metode analisis

adalah kesalahan acak atau koefisien variansi (CV). Kesalahan acak identik dengan

variabilitas pengukuran dan dicerminkan oleh tetapan variasi.

Ketentuan dari sebuah metode dikatakan mencapai ketepatan yang tinggi apabila nilai

CV kurang dari 10%. Pada percobaan ini, diperoleh kesalahan acak pada sampel darah tikus

sebagai berikut:

1. Nilai kesalahan acak rata-rata darah tikus dengan kadar 75 g/mL sebesar 24,477%2. Nilai kesalahan acak rata-rata darah tikus dengan kadar 150 g/mL sebesar 1,097%3. Nilai kesalahan acak rata-rata darah tikus dengan kadar 300 g/mL sebesar 5,671%

Dari nilai kesalahan rata-rata yang diperoleh, hanya nilai kesalahan rata-rata pada

konsentrasi 150 dan 300 g/mL yang kurang dari 10%, sehingga dapat disimpulkan pada

pengukuran konsentrasi 150 dan 300 g/mL memiliki presisi yang baik. Ini menandakan

dalam upaya tiga kali replikasi pengukuran absorbansi, nilai yang didapatkan tidak serupa

satu sama lain.

Penyebab dari inpresisi dalam pengukuran adalah kesalahan acak yang tidak diketahui

penyebab pastinya, namun selalu ada di dalam setiap percobaan atau penelitian.

Kemungkinan faktor-faktor penyebabnya variasi perlakuan sampel oleh setiap praktikan yang

berbeda, seperti pemakaian mikropipet atau alat vortex. Untuk mengatasinya, alat yang

digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu, dan sebelum digunakan, alat harus dalam kering

dan diusahakan kering.

Parameter lain untuk menilai suatu percobaan adalah nilai kesalahan sistemik yang

mempunyai syarat nilainya kurang dari 10% agar metode yang digunakan mencapai akurasi

yang tinggi. Kesalahan ini bersifat konstan dan mengakibatkan penyimpangan tertentu dari

rata-rata.

Nilai kesalahan sistemik untuk sampel dengan kadar 75, 150, dan 300 g/mL pada

sampel darah tikus, adalah sebagai berikut:

Simpangan baku

Kesalahan acak = x 100%

Harga rata-rata

Kesalahan sistemik = 100% - %PK


32/34

1. Nilai kesalahan sistemik darah tikus dengan kadar 75 g/mL sebesar -85,073%2. Nilai kesalahan sistemik darah tikus dengan kadar 150 g/mL sebesar -145,537%3. Nilai kesalahan sistemik darah tikus dengan kadar 300 g/mL sebesar -23,130%

Dari data kesalahan sistemik darah tikus di atas, seluruh nilainya adalah kurang dari 10%.

Artinya, secara keseluruhan hasil percobaan memiliki akurasi yang baik. Jika ada nilai

kesalahan sistemik yang lebih dari 10%, dapat diakibatkan oleh beberapa faktor berikut:

Kesalahan praktikan dan proses analisis. Dalam percobaan ini dimungkinkankesalahan ada pada ketidaktelitian praktikan dalam pengukuran volume sampel

maupun pereaksi. Hal ini dapat diatasi dengan peningkatan keterampilan

praktikan.

Kesalahan alat dan peraksi, dapat disebabkan oleh pereaksi yang kurang valid atautelah terkontaminasi atau pemakaian alat yang kurang tepat.

Kesalahan metode, dapat disebabkan pada kesalahan pengambilan sampel danreaksi kimia yang belum sempurna.

Dari perhitungan ketiga parameter di atas, didapatkan hasil yang jauh dari persyaratan

parameter yang baik, terutama pada ketepatan metode. Faktor kesalahan tersebut seperti

keterampilan praktikan, proses analisis, alat, dan metode yang digunakan. Secara umum,

dapat disimpulkan metode Bratton-Marshall ini memiliki ketelitian yang rendah untuk

analisis obat daam darah. Salah satunya disebabkan oleh terlalu banyak langkah yang harus

dilakukan, padahal dalam analisis semakin banyak langkah maka semakin besar kesalahan

terjadi.

IX. KESIMPULAN Metode Bratton-Marshal dapat digunakan untuk menganalisis obat-obat yang

memiliki gugusamina aromatik primer dengan pembentukan

senyawacoupling berwarna dari garam diazonium.

Metode pengukuran harus memenuhi beberapa kriteria, diantaranya efiesiensi(perolehankembali atau recovery), presisi dan akurasi.

Berdasarkan teori, metode Bratton-Marshal dapat digunakan untuk menetapkankadar sulfametoksazol, karena sulfametoksazol memiliki gugus amina aromatis

primer.


33/34

Berdasarkan percobaan diperoleh nilai bahwa nilai perolehan kembalinya adalah180,063 %, 245,2537%, 123,13 %. Hasil perolehan kembali ada diluar kisaran

range yaitu 75125 %.

Berdasarkan percobaan diperoleh nilai kesalahan acak nilai adalah24,477%,1,097%, 5, 671%.

Berdasarkan percobaan diperoleh nilai kesalahan sistemik adalah -85,073 %, -145,537%, -23,13 %.

Berdasarkan hasil percobaan, metode Bratton-Marshal tidak memenuhi syarat(tidak spesifik dans elektif) karena tidak memenuhi parameter, yaitu tidak efisien,

akurat dan presisi dalam penetapan kadar sulfametoksazol dalam darah tikus.

X. DAFTAR PUSTAKAAnonim, 1979, Farmakope Indonesiaedisi III, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia edisi IV, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta.

Anonim, 1996, The Merck Index, Vol. X, Merck Research Laboratories: Division

of Merck & Co, INC.

Bertram G, Katzug, 2002, Farmakologi Dasar dan Klinik, Edisi 8, Salemba

Medika, Jakarta.

Goodman & Gilman, 1996, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th

Edition, The McGraw-Hill Companies, USA.

Imuno Argo, Donatus, Drs., Apt, 1989,Analisis Farmakokinetika, Bagian I,

Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.

Mutschler, Ernest, 1991, Dinamika Obat, Buku Ajar Farmakologi & Toksikologi,

edisi V, Penerbit ITB, Bandung.

Yogyakarta, 13 Mei 2014

1. Sufi Pertiwi FA/097362. Rizki Rahmadani FA/097383. Anissa Sri Rejeki FA/097414. Ratna Wulan K FA/097475. Cherra Ayu FA/09749


34/34

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

FARMAKOLOGI EKSPERIMENTAL I

ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

Asisten :

1

2

Disusun oleh :

Golongan IV/ Kelompok III

Kelas C2013

Nama NIM TTD

1.Sufi Pertiwi FA/097362.Rizki Rahmadani FA/097383.Anissa Sri Rejeki FA/097414.Ratna Wulan K FA/097475. Cherra Ayu FA/09749

Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi

Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik

Fakultas Farmasi UGM

2014

analisis obat dalam cairan hayati

Documents