wira y rahman, endang sarmini, herlina, hotman lubis, triyanto

~

batan

PROSIDING SEMINARPENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator don Proses BahanYogyakarta, Rabu, 11 September 2013

OPTIMASI WAKTU INKUBASI SINTESIS NUKLEOTIDABERTANDA [r_32p]ATP

Wira Y Rahman1*, Endang Sarmini1, Herlina1, Hotman Lubis1, Triyanto1, Hambali1Pusat Radioisotop Dan Radiofarmaka (PRR) - BATAN

wira@batan.go.id

ABSTRAK

OPTIMASI WAKTU SINTESIS NUKLEOTIDA BERTANDA Irtp]A TP. Nukleotidabertanda fosfor-32 (2 P) [y-32PI-adenosine triphosphate {[y- 2P]-A TP} salah satusenyawa yang banyak digunakan dalam penelitian biologi molekul. Untuk dapatmenunjang penelitian biologi molekul di Indonesia, telah dilakukan pembuatansenyawa nukleotida bertanda [y_32p]_ATP melalui reaksi enzimatis menggunakanprekursor DL-glyceraldehyde 3-phosphate, nukleotida adenosine di-phosphate (ADP)dan H/2p04, serta enzim gliseraldehid 3-phosphat dehidrogenase, 3-phosphogliserat­kinase dan laktat dehidrogenase. Optimasi waktu inkubasi proses sintesis nukleotidabertanda dilakukan untuk mencari kondisi yang optimum, dalam arti waktu yang palingmenguntungkan dalam proses sintesis tersebut. Dari proses sintesis tersebut berhasildiperoleh [y_32p]_ATP dengan rendemen pembentukannya 93,91% dengan waktuoptimum 5 menit. Dengan berhasilnya dilakukan sintesis dan optimasi waktu inkubasisintesis nukleotida bertanda [y_32p]_ATP maka Pusat Radiosiotop dan Radiofarmakaakan dapat menyediakan nukleotida bertanda dimaksud di atas untuk menunjangpenelitian biologi molekul di Indonesia.

ABSTRACT

OPTlMIZA TlON TIME SYNTHESIS OF NUCLEOTIDE LABELED ly·32P]_A TP.Adenosine triphosphate-labelled with y_32p([y_32p]_ATP) has been widely used in thebiotechnology research, usually as a tracer to study aspects of physiological andpathological processes. In order to support biotechnology research in Indonesia, a

process for production of [y-32P]-A TP with enzymatic reaction was used asBrecursorsDL-glyceraldehydde 3-phosphate, Adenosine Diphosphate (ADP) and H32p04, andenzyme glyceraldehid 3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerycphosphokinase and lactate dehydrogenase. Optimization of incubation time labelednucleotide synthesis process is performed to find the optimum conditions, in terms ofthe most advantageous time in the synthesis process. With the success of thesynthesis and optimization is done incubation time of synthesis labeled nucleotide, theresult suggested can be used for producing [y_32p]_ATP to support the provision ofradiolabeled nucleotide for biotechnology research in Indonesia.

PENDAHULUAN

Salah satu aplikasi teknologi nuklir dalam bidangkesehatan yang dikombinasikan dengan teknikbiologi molekul adalah mendeteksi virus, kumanatau bakteri penyebab penyakit atau yang telahbermutasi. Deteksi ini dilakukan melalui

penentuan urutan asam nukleat DNA virus, kumanatau bakteri tersebut menggunakan teknikpolymerase chain reaction (PCR) dan hibridisasidot blot. Teknik hibridisasi membutuhkan pelacak

(probe) yang berperan untuk mendeteksi tfagmenDNA-nya yang spesifik tersebut. Pelacakmerupakan asam nukleat rantai pendek beruntaitunggal (untai tunggal RNA atau DNA) yangmemiliki sekuen spesifik yang akan dideteksi danberlabel radioaktif P-32, salah satunya adalah [y­32p]ATP [4,5.6) Teknik penggunaan pelacakDNAIRNA untuk mendeteksi gen atau fragmenDNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon

Wira Y Rahman, dkk. ISSN 1410 - 8178 Buku I hat. ) 35

PRO SIDING SEMINARPENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR.

Pusat Teknologi Akselerator dan Proses BahanYogyakarta, Rabu 11 September 2013

~

batan

Gambar 1. Proses sintesis nukleotida bertanda

[y_32p]ATP

CliO

IH-C-QH OH

I ICH20P CH3CHC()()"

D-GLYCERALDEHYD,:'PHOSP~,,::~ _~LAcrATE

GL.;,.ca.ALDEF.YDE.1-PH~J'~aATE LACTATE DEHYDROGENASE

DDffDROG£N..uE~115jf'EH" (LDH)

Coo"p 0I IIH--C-OH CHC-COO'I P~RUVATE

CH20P

yang benar dikenal dengan nama teknik SouthernBlotting [7,8,9],

Kebutuhan pelacak [y_32p]ATP untukpenelitian biologi molekul di Indonesia saat ini sulitdalam pengadaannya, terutama dalam ijinimpomya. Maka dengan fasilitas yang ada di PusatRadioisotop dan Radiofarmaka (PRR-BAT AN)diharapkan kebutuhan pelacak tersebut dapatdisediakan. Penelitian ini bertujuan untuk membuatsenyawa nukleotida bertanda [y)2p]ATP yang akandigunakan untuk penelitian dalam bidang biologimolekul. Sintesis [y_32p]ATP dilakukanmenggunakan reaksi enzimatisllO,lIl. Dari penelitiansebelumnya telah berhasil disintesis nukleotidabertanda [y)2p]ATP, maka perlu dilakukanoptimasi waktu inkubasin~a sehingga diperolehwaktu optimalnya sehingga proses sintesis lebihefisien.

Proses sintesis nukleotida bertanda P-32

dimulai dari DL-gliseraldehid 3-fosfat, yangbereaksi dengan asam fosfat (H/2p04)

menghasilkan 1,3-disfosfogliseraldehid. Senyawa1,3-difosfogliseraldehid berubah menjadi asam 1,3­difosfogliserat dengan bantuan enzim gliseraldehid-

Air (aquabidest0,5 M Tris-HCI0,3 M Ma nesium Klorida

0,125 M Natrium oiruvat5 mM ADP

0,2 M Dithiothreitol

0,02 M DL I ceraldehide20 mM NAD

3-fosfat dehidrogenase, kofaktor ion Mg ++ sertakoenzim NAD+. Selama reaksi berlangsung molekulNAD+ akan berubah menjadi NADH. MolekulNADH ini dengan bantuan enzim laktat

TEORI DAN TATA KERJA

Bahan-bahan yang digunakan dalampenelitian ini adalah H/2p04 bebas pengembandengan kemumian radiokirnia diatas 97% yangdibuat oleh Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka(PRR). Enzim gliseraldehid-3-phosphatdehidrogenase (80 unit/mg) 10 mg/ml,phosphogliserat kinase (450 unit/mg) 10 mg/ml,dithiothreitol, tris-HCI, DL-gliseraldehid 3-fosfatdari Sigma Aldrich. Sedangkan laktatdehidrogenase (250 unit/mg) 5 mg/ml, adenosin di­fosfat (ADP), P-nicotinarnide adenine dinucleotide(NAD), magnesium klorida dari Merck.

Bahan penunjang yang digunakan dalampenelitian ini diantaranya kromatografi lapisan tipis(KL T), plastik polyethyleneimine (PEl) cellulosedari E.Merck, kertas indikator pH universal,peralatan gelas dan tabung mikro.

Peralatan yang digunakan yaitu sentrifugaberpendingin ( refrigerated centrifuge) (AllegraBeckman Coulter), penangas air (Memmert), MiniTLC Scanner (Bioscan AR-2000), dan LiquidScintilation Counter (LSC) (MicroBeta Trilux).

Cara Kerja

1. Preparasi campuran yang digunakanPembuatan larutan campuran A: 100 J.lLcampuran berikut ini dibuat dalam satu tabungrnikro

2. Preparasi pereaksi campuran untuk buffer peletenzim

Pembuatan larutan campuran B: 50 J.lL larutanberikut disiapkan dalam satu tabung rnikro

dehidrogenase akan berubah kembali menjadiNAD+ disertai pengubahan asam piruvat menjadiasam laktat. Senyawa 1,3-difosfogliseratselanjutnya berubah menjadi 3-fosfogliserat denganbantuan enzim fosfogliserat kinase, disertai denganperubahan ADP menjadi ATP. Kemudian dilakukanpemumian dengan menggunakan kromatografipenukar anion DEAE-Sephadexl12,Q .

Salah satu faktor yang menentukan hasilsintesis nukleotida bertanda [y_32p]ATP melaluireaksi enzimatis adalah waktu inkubasi. Untuk

mendapatkan hasil yang optimal perlu ditentukanlamanya waktu sintesis yang dibutuhkan sehinggadidapatkan hasil yang optimal. Optimasi waktusintesis dilakukan dengan rentang waktu satu jam,setiap 15 menit reaksi enzimatis dilakukanpencuplikan dan dianalisa dengan KLT.

Seiring dengan perkembangan biologimolekul di Indonesia maka kebutuhan akan

senyawa nukleotida bertanda untuk perunut menjadisangat penting. Untuk itu penguasaan teknik sintesisnukleotida bertanda akan sangat mendukungpeningkatan kemampuan di bidang biologi molekul.

LEGEND

P = pol'32pi=32pO .•J-

]·PHOSPHOGL YCERA TE

I.]-DIPIIOSPIIOGI.YCERA TE

~(O'OI""'NDP)

PHOSPItOGL YCERATE KINASE (pGK)\1 ):?).:\TP(Ote-lk~NTI'}

COOIH-C-OHICH,OP

Buku I hal. 136 ISSN 1410 - 8178 Wira Y Rahman, dkk

~

batan

PRO SIDING SEMINARPENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator don Proses BahanYogyakarta, Rabu, 11 September 2013

Preparasi campuran enzimPembuatan campuran enzim : 12 ilL campuranenzim berikut dibuat didalam satu tabungmikro

3.

0,5 M

0,3 M

0,2 M

42,5 ul

2,5

2,5

2,5

H332P04 dengan kemurnian radiokimia yang tinggidan layak digunakan untuk pembuatan nukleotidabertanda [y_32p]ATP. Analisa kemurnian radiokimiaH/2p04 dilakukan dengan sistim KLT, denganmenggunakan PEl Cellulose sebagai fasa diam danlarutan KH2P04 0,5 M pH 3,5 sebagai fasa gerak,Dari proses pemurnian radioisotop H/2p04 tersebutdiperoleh kemurnian radiokimianya - 97%, denganRf 0,690 seperti terlihat pada radiokromatogramberikut :

Glyceraldehydes 3-phosphate I 50 ~I I (40 units)

dehydrogenase Lactate dehydrogenase

50 ~I(62,5units3-phosphoglycerate

50 ~I(225oSDhokinase

units

(tni't't:) (1:'1'111) (mM)R-o $tart ~ Ctl:O.~ RF~ 1 uta 30<$ 2$.1 iU:HR9A:2 111.1 14a..$ 132~1' ():,6$~~

RhOkm R~ % qf % DIC~ •• CPM Tokd R01

i93.o 3,M,O Q,03 0...04

$3604.7;0 10120tw,g 95,1$$ gU)8.$36240.0 1072480~O K.:I$9 100.00

100Position (mID)

Gambar 2. Radiokromatogram larutan H/2p04setelah proses pemurnian

Sintesis dimulai dari DL- Glyceraldehyde3-phosphate dengan menggunakan tiga campuranenzim yaitu lactate dehydrogenase,Glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase serta3-phosphoglycerate phosphokinase. Setelah itudilakukan proses sintesis nukleotida bertanda [0­32p]ATP menggunakan radioisotop P-32 denganaktivitas 3,76 mCi, sebanyak 200 ilL. Pembentukan[y_32p]ATP diamati dengan cara mencupliksejurnlah tertentu sampel setiap 15 menit reaksiyang kemudian dianalisis dengan sistem KLTdengan menggunakan PEI Cellulose sebagai fasadiam dan larutan KH2P04 0,5 M pH 3,5 sebagaifasa gerak. Rendemen pembentukan nukleotidabertanda P-32 pada saat 15 menit inkubasimencapai 76,66%, RfO,275.

Campuran enzim tersebut disentrifugasi padakecepatan 15000 rpm selama 20 menit. Setelahdiambil supematannya, endapan enzimkemudian dilarutkan dengan 50 ilL larutancampuran B.

4. Proses sintesis [y-32P]ATPKe dalam tabung mikro bervolume 1,5 mldimasukk~~ 40 III H/2p04 (aktivitas terukur)diatur pH· 7-9 dengan larutan . 5M NaOH.Selanjutnya ke dalam larutan tersebutditambahkan berturut-turut 40 III larutancampuran A dan 10 III campuran enzim.Inkubasi dilakukan selama (t) menit dandicuplik setiap waktu tertentu selama 1 jam.Reaksi dihentikan dengan memasukkan tabungmikro ke dalam penangas air bersuhu 70°Cselama 3 menit untuk menghentikan reaksienzimatis. Kemudian dilakukan prosespemisahan dengan menggunakan kolompenukar ion DEAE-Sephadex.

5. Analisa hasil sintesis [y_32p]ATPHasil sintesis dianalisa kemurnian

radiokimianya menggunakan KLT PElCellulose sebagai fasa diam dan KH2P04 0,5 MpH 3,5 sebagai fasa gerak. Kemudianditentukan Rrnya dengan Bioscanner.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam proses penyiapan [y_32p]ATPdibutuhkan 32p dalam bentuk H/2p04, maka halpertama yang dilakukan adalah melakukan ujikualitas H/2p04 yang akan digunakan dalam prosessintesis yang dimaksud di atas. Hal ini dilakukankarena radionuklida 32p berupa larutan H/2p04(dalam bentuk orto-fosfat) cenderung tidak stabildalam penyimpanan dan mudah berubah menjadisenyawa polifosfat. Pemurnian radioisotop P-32menggunakan kolom kromatogafi penukar kationDowex AG 50 (l x 8) yang telah dikondisikandengan HCI O,IM, sehingga diperoleh larutan

10000

o

o 150 200

Wira Y Rahman, dkk. ISSN 1410 - 8178 Bukulhal. 137

PROSIDING SEMINARPENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator dan Proses BahanYogyakarta, Rabu 11 September 2013

@>batan

(mm)(mm) (ft\rn) RoQlbt>R~~%Of,",ofRq

8mn$OOf1 C~'!f'Pk1

'IFC($Uobt"PMTot ••1RO'

""",41.7702$1>.1on.2t2120,O"254.0,074.M7S","

R•••'(f'.'10"090.$0.-4$310142.0U2e,f,O4L7tS.90

R ••• ~'05'"t4~.a122 .•0.4UC5tU 2.0'1224,0•Utiis.,''''

•....•.27'1474.0554M8,0.1.25 100,00

(mm)(mm)(m"'l R_R:.gion% ••......Ro.

StartS10p CentroidRF"""nls CPMTotalROIRon ,

42.611.1!$G.2 0.2113M70.0"0.411.0DO.e313."Ron •

...•'00'"".10'""70S150.o7500.01.021.05Ron •

121.2'''".8132,'0.•••1~O.O~!taoo.Q4.&7....3 h.ka

•••••••••1128",0&e,72 100..00

30000 •

~ 20000 ..

,i:Ii

"

1\

i \, \

[>-

Gambar 3. Radiokromatogram pembentukan [y­

32p]ATP setelah inkubasi 15 menit

Dari kromatograrn yang sarna juga dapatdilihat masih terdapat 16,44% H/2p04 (Rf 0,613)bebas atau yang tidak terikat pada ATP. Inkubasidilakukan selama 60 menit dan dicuplik setiap 15menit, rendemen pembentukan nukelotida bertanda[y_32p]ATP dapat dilihat pada gambar berikut :

100.00 I ,

Garnbar 5. Radiokromatogram pembentukan [y­32p]ATP setelah inkubasi 5 menit

Dari kromatogram ini dapat dilihatpersentase rendemen hasil sintesis [y_32p]ATPsebesar 93,91 %, (RfO,281). Dari kromatograrn yangsarna juga dapat dilihat masih terdapat 5,04%H/2p04 (RfO,663) bebas.

100.00 ,

90,00

~ 80,00c:OJ

E.:: 70,00"!

60,00 ..,

•• •

70,00

o

•

5

•

10

•

15 20 25

Gambar 4. Rendemen pembentukan nukleotidabertanda P-32 [y_32p]ATP denganwaktu inkubasi selama 60 menit

Dari Gambar 4. terlihat bahwa pada menitke-30 terjadi sedikit kenaikkan rendemennya, padamenit ke-45 cenderung tetap, tetapi sampai menitke-60 tidak terjadi kenaikkan yang cukupsignifikan, malah terjadi sedikit penurunan, makaproses sintesis diulang lagi dengan memperpendekwaktu sintesis menjadi 20 menit dengan selangwaktu pencuplikan setiap 5 menil. Aktivitas yangdigunakan untuk proses sintesis ini 3,99 mCisebanyak 200 ilL, temyata dalam waktu 5 menitrendemen pembentukan nukleotida bertanda [y­

32p]ATP mencapai 93,91 %, terlihat darikromatogram berikut :

i ...__. ~~u(menit)

Gambar 6. Rendemen hasil inkubasi setiap 5 menitpencuplikan

Rendemen hasil sintesis pada menit ke-IO,ke-15 dan ke-20 cenderung berkurang, daribeberapa literatur kemungkinan [y_32p]ATP yangsudah terbentuk terurai kembali karena reaksinya

bersifat reversible, dengan memf:ercepatmenghentikan reaksi enzimatik kondisi [y- 2p]ATPyang terbentuk dapat dipertahankan. Dari Gambar6. waktu yang optimal untuk inkubasi pembentukannukleotida bertanda P-32 [y_32p]ATP adalah 5menit, karena dengan bertambahnya waktu tidakmenarnbah rendemen pembentukannya.

Buku I hal. 138 ISSN 1410 - 8178 Wira Y Rahman, dkk

©>batan

PRO SIDING SEMINARPENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator dan Proses BahanYogyakarta, Rabu, 11 September 2013

KESIMPULAN

Sebelum larutan H/2p04 digunakan untukproses sintesis [y_32p]ATP terlebih dahuludilakukan pemumian dengan cara melewatkanH/2p04 ke dalam kolom penukar kation DowexAG 50 (1 x 8) yang telah dikondisikan dengan HCIO,lM. Diperoleh kemurnian radiokimia H332P04­

99% setelah proses pemurnian ini. Dari hasil

sintesis yang dilakukan diEeroleh waktu inkubasioptimum proses sintesis [y- 2p]ATP adalah 5 menit,dengan memberikan rendemen 93,91% pada Rf0,281.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis mengucapkan terimakasih kepadasejawat yang terkait dengan penelitian ini terutamadari Bidang Keselamatan PRR dan kepada BapakDr Abdul Mutalib yang telah mempercayakanpenelitian ini kepada saya.

DAFT AR PUST AKA

1. FATCHIYAH DAN ESTRI LARASARUMNINGTYAS. "Kromosom, Gen, DNA,Synthesis Protein dan Regulasi", LaboratoriumBiologi Molekuler dan Selluler UniversitasBrawijaya, Malang, 2006

2. NUNUK PRIYANI, "Sifat Fisik dan KimiaDNA", Program Studi Biologi dan IlmuPengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara,2004

3. DWI SURY ANTO, "Melihat Keaneka-ragamanOrganisme Melalui Beberapa Teknik GenetikaMolekuler", Program Studi Biologi, FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,Universitas Sumatera Utara.

4. SUHARSONO, "Struktur dan Ekspresi Gen",Jurusan Biologi FMIP A, Institut PertanianBogor.

5. LEHRINGER, A.L, "Dasar-Dasar BiokimiaJilid I", Erlangga, Jakarta, 1982

6. ARIS TJAHJOLEKSONO, "Teknologi DNARekombinan", Jurusan Biologi FMIPA, InstitutPertanian Bogor, hall - 16.

7. MUKH. SYAlFUDIN DAN DEVITATETRIANA, "Analisis Mutasi Gen inhA untuk

Uji Resistensi M.Tuberculosis terhadapIsoniazid dengan Metode SSCP radioaktif',Pusat Teknologi Keselamatan dan MetrologiRadiasi, BAT AN, Jakarta.

8. MARIA UNA R, BUDIMAN BELA DANANDI YASMON, "Deteksi Mutasi Gen KATG(MyobacteriumTuberculosis) dengan MetodePCR (Polymerase Chain Reaction) - HibridisasiDot Blot menggunakan Pelacak OligonukleotidaBertanda 32p", Jurnal Aplikasi Isotop danRadiasi, 2000.

9. BUDIAWAN, "Pengembangan Teknik 32p_Postlabelling untuk Mendeteksi Dini ResikoKanker", Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitiandan Pengembangan Teknologi Isotop danRadiasi, 2000.

10.F. SAKAMOTO, M. IZUMO, K.HASHIMOTO, Y. FUJI, "Study of OptimumCondition for Synthesis of [y}2p]ATP withHigh Specivic Radioactivity", Journal ofRadioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol.239,1998, No.2 (1999) 423-427.

11.PAUL F. SCHENDEL AND ROBERT D.

WELLS, "The Synthetic and Purification of [y­

32p] Adenosine Triphosphate with High SpecificActivity", The Journal of Biology Chemistry,Vol. 248, No. 23, (8319 - 8321) Issue ofDecember 10.

12. JHONSON, ET AL, "Enzymatic Process forPreparing [y-32P]-Labeled Nucleotides", UnitedState Patent, June, 1980.

13. WIRA Y RAHMAN, ENDANG SARMINI,HERLINA, DKK, " Sintesis ATP Bertanda P­32 sebagai Perunut Biologi Molekul",Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmakadan Siklotron, 2010.

TANYA JAWAB

Giarno

> Apa manfaat pospor32 untuk kesehatan?> Bagaimana proses pembuatannya?

Wira Y R~ Dalam kesehatan digunakan untuk pengobatan

leukemia, sebagai pelacak dalam biologimolekul dalam bentuk{ t32P1ATP, untukidentifikasi virus human papiloma (HPV)penyebab kanker serviks.

~ Proses pembuatan pospor 32 denganmengiradiasi sulfur di reactor dengan reaksi328 (n,p/2p.

Wira Y Rahman, dkk. ISSN 1410 - 8178 Bukulhal.139