presentasi bahan alam

Profil Protein Bakteri Pendetoksifikasi Metilmerkuri Menggunakan

Elektroforesis Gel Native

AbstrakEnam isolat bakteri pendetoksifikasi metilmerkuri telah dikaji profil proteinnya menggunakan Elektroforesis Gel Native Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui profil protein spesifik yang diduga mempunyai aktivitas dalam mendetosifikasi metilmerkuri. Enam isolat bakteri : strain SDM 41,(Brevundimonas dimunata), strain SDM 78 (Bacillus cereus), strain SDM 81 (Empedobacter brevis), strain SDPM 8a (Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae), strain SDPM 8b (Pseudomonas aerogenosa) dan strain SDPM 24 (Spingomonas aucimobilis) serta bakteri kontrol positif (Pseudomonas putida IFO 14796) ditumbuhkan dalam medium Luria Bertani (LB) cair yang mengandung metilmerkuri dengan konsentrasi masing-masing : 2,5 g/mL, 2,0g/mL; 1,0g/mL; 2,0g/mL; 2,0 g/mL; 1,0g/mL. Sel diunduh setelah inkubasi selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan preparasi biomasa sel untuk deteksi protein dengan Elektroforesis Gel Native. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dua isolat bakteri berikut: isolat SDM 41 ,(Brevundimonas dimunata) dan isolat SDM 78 (Bacillus sp), menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 18,67 – 21,32 kDa dan 56,48 – 64,5 kDa yang diduga mempunyai aktivitas detoksifikasi terhadap metilmerkuri.

PendahuluanProses pemutusan ikatan CH3-Hg+

menjadi gugus -CH4 dan ion merkuri Hg2+ disebut demetilasi, dalam kasus ini disebut detoksifikasi atau degradasi metilmerkuri.

CH3Hg+ + H+ CH4 + Hg2+

Detoksifikasi dapat berlangsung secara biologi maupun fisik. Secara biologi reaksi demetilasi metilmerkuri melalui mekanisme enzimatis oleh mikrobia. Sedangkan secara fisik reaksi demetilasi dapat berlangsung melalui mekanisme fotodegradasi.

Bakteri yang resisten terhadap metilmerkuri mempunyai kemampuan untuk menurunkan toksisitas atau detoksifikasi metilmerkuri, karena bakteri tersebut menghasilkan enzim organomercurial lyase yang disandi oleh gen merB. Enzim ini selanjutnya akan mengkatalisis pemutusan ikatan H3C-Hg pada senyawa metilmerkuri menjadi ion Hg2+. Selanjutnya ion Hg2+ direduksi oleh enzim mercuric reductase (MerA) menjadi Hgo yang bersifat volatil.1-3

Beberapa strain bakteri yang resisten terhadap metilmerkuri antara lain Pseudomonas aeruginosa PU21, dan Escherichia coli PWS14, serta Pseudomonas putida FB1.2 Penelitian biologi molekular membuktikan bahwa bakteri yang resisten terhadap metilmerkuri mempunyai gen yang bertanggung jawab untuk menghasilkan kedua enzim tersebut yang tersandi pada plasmid.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui profil protein spesifik yang diduga mempunyai aktivitas dalam mendetoksifikasi metilmerkuri. Selain itu untuk menentukan kondisi pemisahan protein menggunakan elektroforesis Gel Native.

Bahan dan alat Isolat antara lain : strain SDM 41,(Brevundimonas

dimunata), strain SDM 78 (Bacillus cereus), strainSDM 81 (Empedobacter brevis), strain SDPM 8a (Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae), strain SDPM 8b (Pseudomonas aerogenosa) dan strain SDPM 24 (Spingomonas aucimobilis) serta bakteri kontrol pos

Bahan kimia yang digunakan untuk analisismetilmerkuri dengan GLC antara lain: tolune, aceton, isopropanol, Na2SO4., HCl, gas Argon.itif (Pseudomonas putida IFO 14796).

Bahan kimia untuk deteksi protein denganelektroforsesi terdiri dari : Acrylamide, bisacrylamide(N,N-methylenebisacrylamide), Tris (2- hydroximethyl-2-methyl-1,3-propanediol), SDS (sodium dodecyl sulfate atau sodium lauryl sulfate), TEMED (N,N,N,N-Tetramethyleneethylenediamine), amonium persulfat , 2-mercaptoethanol, glycerol, bromophenol blue, glycine, asam klorida, dithiothreitol.

Marker protein (Promega Mid- Ranger Protein MW Marker, V5234) yang digunakan antara lain : phosporylase B (97.400 Da), Bovine serum albumin (66.000 Da), Lglutamic dehydrogenase (55.000 Da), ovalbumin (42.700 Da), Aldolase (40.000 Da), Carbonic anhydrase (31.000 Da) dan Soybean trypsin inhibitor (21.500 Da).

Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah GLC merk Shimadzu model 14B, Elektorforesis Kit, Sentrifus, Shaker Incubator, Ultrasonikator dan sperangkat alat gelas.

Cara kerja Pembuatan inokulum. Medium pertumbuhan Luria-

Bertani (LB) sebanyak 50 Ml diinokulasi dengan 5 ose isolat bakteri strain SDM 41,(Brevundimonas dimunata), strain SDM 78 (Bacillus cereus), strainSDM 81 (Empedobacter brevis), strain SDPM 8a (Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae), strain SDPM 8b (Pseudomonas aerogenosa) dan strain SDPM 24 (Spingomonas aucimobilis) serta bakteri kontrol positif (Pseudomonas putida IFO 14796) dari medium agar miring. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang (30oC) selama 12-24 jam. Kultur dapat digunakan untuk percobaan setelah kekeruhannya telah mencapai OD ≤ 0,6.

Inokulasi kultur ke dalam medium pertumbuhan. Inokulasikan 50 mL kultur di atas ke dalam 450 mL medium LB yang mengandung metilmerkuri 2,5 μg/mL(isolat SDM 41), 2,0 μg/mL (isolat SDM 78/9a); 1,0 μ g/mL (isolat SDM 81); 2,0 μ g/mL (isolat SDPM 8a); 2,0 μ g/mL (isolat SDPM 8b); 1,0 μ g/mL (isolat SDPM 24, Pseudomonas p)dan medium LB tanpa metilmerkuri sebagai kontrol. Kultur diinkubasi diatas meja penggojog dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada suhu ruang (30⁰C) selama 24 jam.

Pengunduhan sel dan preparasi biomasa sel bakteri. Kultur bakteri yang telah mencapai OD600 nm ≥0,6 dimasukkan dalam 10 tabung conical 50 mL selanjutnya disentrifuse pada 3500 g suhu 4 oC selama 20 menit. Supernatan (ekstra sel) dipisahkan dari pelet dan tampung dalam satu wadah (erlenmeyer 500 mL). Pelet dicuci dua kali dengan Tris-HCl+EDTA pH 7,4 kemudian disonikasi pada 20 kHz 95 W 40 % siklus selama 5 x 10 detik. Supernatan yang telah disonikasi disentrifus kembali pada 10.000 g suhu 4oC selama 20 menit.

Hasil sentrifugasi terakhir berupa Supernatan fraksi sitoplasmik atau CFE (Cell Free Extract) untuk visualisasi protein dan pelet (dinding sel atau menbran). Pelet dari dinding sel/membran sel dicuci dua kali dengan Tris-HCl + EDTA pH 7,4 kemudian disentrifus pada 10.000 g suhu 4oC selama 20 menit. Hasil sentrifugasi berupa supernatan fraksi membran sitoplasmik atau sel debris (dinding + membran sel) digunakan untuk visualisasi protein dan pelet sisa dibuang.6-8Sebelum digunakan protein-protein tersebut disimpan pada suhu -20oC.

Elektroforesis Gel NATIVE. Untuk menentukan kondisi pemisahan protein terbaik, maka dilakukan variasi resolving gel (10, 12 dan 15%), sedangkan stacking gel dibuat tetap 3%. Persiapan running: sampel protein dilarutkan dalam sampel buffer dengan perbandingan 4 bagian sampel buffer dan 1 bagian sampel protein. Sampel direbus dalam air mendidih selama beberapa menit, setelah didinginkan sampel siap diaplikasikan dalam gel.

Marker protein sebanyak 5 μL ditambahkan 5 μL sampel buffer kemudian dimasukkan ke dalam sumuran. Sampel di running pada gel dengan voltase konstan 100 volt. Setelah proses running selesai sampel divisualisasi mengunakan larutan staining 0,1 % (b/v) coomasive brilian blue R-250 selama 12 jam pada suhu ruang dan diaduk di atas shaker pada kecepatan 40 rpm. Gel didestaining menggunakan larutan destaining dan disimpan dalam larutan asam asetat 10%.

Hasil dan Pembahasan Deteksi protein dengan elektroforesis. Isolat bakteri

yang ditumbuhkan dalam médium LB yang mengandung metilmerkuri akan mengalami stres akibat toksisitas senyawa tersebut. Stres atau cekaman metilmerkuri ini ditanggapi dengan cara adaptasi lingkungan yaitu pertumbuhan yang lambat antara 1 –5 jam. Selama proses adaptasi terjadi perubahan senyawa di dalam sel yang dilakukan oleh enzim. Selain itu akan terjadi perubahan kecepatan dan jalur metabolisme. Enzim adalah protein, oleh karena itu pengendalian metabolik dapat diketahui dengan mendeteksi perubahan profil protein yang terjadi.

M A B C D E F G

Profil protein isolat bakteri denganelektroforesis Gel Native dalam medium tanpa

MeHg

M A B C D E F G

Profil protein isolat bakteri denganelektroforesis Gel Native dalam medium MeHg.

(Ket gambar M = marker protein, A= bakteri kontrol (Pseudomonasputida), B= isolat SDM 41; C= SDM 78; D= SDM 81; E= SDPM 8a;F=SDPM 8b dan G=SDPM 24)

Profil protein pada Gambar 1 merupakan hasil pemisahan terbaik dari variasi Gel Native yang dilakukan (10%, 12% dan 15%). Penggunaan GelNative 12% dan 15% menunjukkan pita protein tidak terpisah sempurna dan pita marker terlihat menumpuk di atas. Keenam isolat ditumbuhkan pada medium yang mengandung metilmerkuri, ternyata menghasilkan dua protein spesifik dengan berat molekul yang berbeda, yang ditunjukkan pada Gambar 2.

Isolat 78 menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 59,22 dan 21,59 kDa, isolat 81 menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 55.97 dan 22,62 kDa, isolat 8a menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 59,22 dan 18,45 kDa, isolat 8b menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 63,43 dan 19,76 kDa, isolat 24 menghasilkan protein spesifik dengan berat molekul 55.97 dan 24,27 kDa, Protein tersebut mempunyai berat molekul yang mirip dengan enzim merkurireduktase (EC 1.16.1.1) yaitu 56 – 65 kDa7 dan organomerkuriliase (EC 4.99.1.2) yaitu 19 – 27 kDa. Protein spesifik yang dihasilkan oleh isolat tersebut diduga merupakan enzim yang berperan dalam proses degradasimetilmerkuri.

Kadar protein isolat SDM 81 dan SDPM 8b lebih tinggi dibanding isolat lain. Tingginya kadar protein pada kedua isolat berpengaruh pada kadar enzim yang dihasilkan oleh isolat tersebut. Kuantitas maupun kualitas enzim yang dihasilkan akan berpengaruh pada aktivitas detoksifikasikedua isolat tersebut. Bakteri yang resisten terhadap metilmerkuri akan memproduksi enzim organomerkuriliase yang berfungsi memutus ikatan CH3-Hg+ menjadi CH4 dan Hg2

Isolat SDPM 8b danisolat SDM 81 mempunyai kemampuan detoksifikasi lebih tinggi dibanding isolat lain. Hal ini berkaitan erat dengan protein enzim yang dihasilkan oleh bakteri tersebut. Kadar protein enzim isolat SDPM 8b adalah 7,69 μg/mL dan isolat SDM 81 sebesar 9,78 μg/mL

Kadar protein lima isolat bakteri resisten metilmerkuri

No KodeIsolat

KadarProtein CFE(μg/mL)

Kadar ProteinDebris(μg/mL)

12345

SDM 41SDM 78SDM 81SDPM 8aSDPM 8bSDPM 24

0,17 ± 0,010,98 ± 0,019,70 ± 0,190,84 ± 0,017,69 ± 0,157,15 ± 0,18

0,74 ± 0,020,38 ± 0,011,03 ± 0,020,43 ± 0,011,90 ± 0,041,03 ± 0,02

Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan

sebagai berikut bahwa rotein-protein isolat bakteri pendetoksifikasi metilmerkuri dapat terpisah dengan baik dengan Elektroforesis 10% Gel Native. Protein spesifik yang divisualisasikan melalui Elektroforesis Gel Native diduga merupakan protein enzim yang berperan dalam detoksifikasi metilmerkuri.

DAFTAR PUSTAKA1. Summers, A.O. Organization, expression, and evolotionof genes for mercury resistance. Annu. Rev.Microbiol., 1986, 40, 607-634

2. Baldi, F.; Semplici, F.; Filippeli, M. EnviromentalApplications Resistant Bacteria. Wat. Air Soil Pollut. , 1991, 56, 465-475.

3. Misra, T.K. Heavy Metals, Bacterial Resistance.Encyclopedia of Mycrobiology 2nd Ed. AcademicPress, 618-626, 2000.

4. Chang, J.S.; Chao, Y.; Law, W.S. Repeated fedbatchoperations for microbial of mercury using wild-type and recombinant mercury-resistant bacteria. J. Biotechnol. , 1998, 64, 219-230

5. Suheryanto; Soetarto, E.S; Sugiharto, E.; Djohan, T.S. Bakteri Resisten Metilmerkuri dari Sedimen Sungai Sangon Kulonprogo, Daerah Istimewa Yogyakarta. Berkala Ilmiah Biologi, 2008, 7(2), 43- 51.

6. Manz, A.; Pamme, N.; Lossifidis, D. Bioanalytical Chemistry. Imperial Colleges Press: London, p.29-63, 2004.

7. Bollag, D.M.; Rozycki, M.D.; Edelstein,S.J. Protein Methode 2nd Edition. John Wiley and Sons Publication: New York1996.

8. Schottel, J.L. The mercuric and organomercurialdetoxifying enzymes from a plasmide-bearing strain of Escherichia coli. J.Biol.Chem., 1978, 253(12), 4341-4349.

9. Laemmli, U.K. Cleavage of Structural Proteins During The Assembly of The Head of Bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685

10. Ogunseitan, O.A. Protein Methode for Investigating Mercuric Reducatse Gene Expression in AquaticEnvironments. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64(2), 695-702

11. Nakamura, K.; Sakamoto, N.; Uchiyama,H.; Hagi, O. Organomercurial-Volatilizing Bacteria in The Mercury Polluted Sediment of Minamata Bay Japan. Appl. Environ. Microbiol ,1990, 56(4), 304-305

12. Suheryanto; Soetarto, E.S.; Sugiharto, E.; Djohan, T.S. Biodegradasi metimerkuri oleh bakteri tanah yang diisolasi dari sedimen sungai Sangon Kulonprogo Yogyakarta, Jurnal Pengelolaan Lingkungan dan Sumber Daya Alam Program Pascasarjana Universitas Sriwijaya, 2006

13. Liese, A.; Seelbach, K.; Wandrey, C. Industrial Biotransformations 2nd ed., Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KgaA, Weinheim, p. 24-29, 2006.