3.3
Post on 20-Oct-2015
15 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN GENOM
Bagaimana anda mengidentifikasi dan mengklone gen yang diinginkan
Memotong dan menempel bagian dari DNA yang berbeda untuk menghasilkan DNA
rekombinan sudah menjadi teknik yang biasa dilakukan dalam biologi molekuler. Jenis
eksperimen dengan kloning menggambarkan mengenai kloning fragmen DNA berdasarkan
daerah pemotongan enzim restriksi, bukan mengkloning pada gen tunggal atau bagian DNA
tertentu yang diinginkan. Misalnya, jika kita menginginkan mengkloning gen insulin dengan
mengambil DNA dari pancreas, memotongnya dengan enzim, kemudian DNA dicerna
menjadi plasmid, anda akan mendapatkan ratusan ribu plasmid rekombinan dan bukan hanya
rekombinan plasmid yang berisi gen insulin.
Ahli biologi molekuler menyebut pendekatan ini dengan “Shotgun” kloning, karena
banyak fragmen secara acak dikloning sekaligus dan tidak ada gen individu secara khusus
yang ditargetkan untuk kloning. Bagaimana anda akan tahu mana rekombinan plasmid yang
mengandung gen insulin? Terlebih lagi, jika gen insulin tidak memiliki daerah restriksi untuk
enzim restriksi yang digunakan, anda mungkin tidak memiliki plasmid rekombinan yang
mengandung insulin. Bahkan jika anda tidak membuat plasmid dengan gen insulin bagaimana
anda akan memisahkan ini dari plasmid rekombinan lainnya? Jadi, bagaimana anda akan
menemukan gen tertentu yang dipilih dan dilakukan klone hanya pada urutan DNA yang
akan dipelajari? Pertanyaan ini sering tidak dapat dijawab dengan pendekatan kloning
menggunakan perpustakaan DNA.
Membuat perpustakaan DNA: Membangun koleksi gen kloning
Banyak strategi kloning dimulai dengan menyusun DNA perpustakaan - koleksi
fragmen DNA kloning dari organisme tertentu yang terkandung dalam bakteri atau virus
sebagai tuan rumah. Perpustakaan dapat disimpan untuk jangka waktu yang relatif lama dan
"disaring" untuk memilih gen. Jenis perpustakaan yang biasanya digunakan untuk kloning,
DNA perpustakaan genom dan perpustakaan DNA komplementer (cDNA perpustakaan).
Gambar 3.4 pada halaman berikutnya menunjukkan bagaimana perpustakaan genom dan
cDNA perpustakaan dibangun.
Gambar 3.4: Perbandingan sebuah perpustakaan DNA genom manusia dengan sebuah cDNA
Genomic dibandingkan cDNA perpustakaan
Dalam perpustakaan genom, kromosom DNA dari jaringan yang diinginkan diisolasi
kemudian dicerna dengan enzim restriksi. Proses ini menghasilkan fragmen DNA yang
mencakup genom seluruh organisme. Sebuah plasmid BAC, YAC, atau vector bakteriofage
dicerna dengan enzim yang sama, DNA ligase digunakan dalam mengikat genoming DNA
dan vector DNA secara acak. Secara teori, semua fragmen DNA dalam genom akan
dikloning ke vector. Vektor rekombinan kemudian digunakan untuk mengubah bakteri, dan
masing-masing klon sel bakteri akan berisi vektor rekombinan dengan plasmid yang
mengandung fragmen DNA genomik. Pertimbangkan setiap klon adalah "buku" dalam
"perpustakaan” dari fragmen DNA. Salah satu kelemahan dari perpustakaan jenis ini untuk
gen eucariotik adalah bahwa non - protein - coding ini pada DNA, yang disebut intron, diklon
menjadi ekson. Karena sebagian besar DNA dalam organisme eukariotik terdiri dari intron,
banyak klon dalam pustaka genom akan berisi potongan - non - protein coding DNA.
Dalam perpustakaan cDNA, mRNA dari jaringan bunga diisolasi dan digunakan
untuk membuat perpustakaan. Namun mRNA tidak dapat dipotong langsung dengan enzim
restriksi, sehingga harus dikonversi ke molekul DNA beruntai ganda. Sebuah enzim yang
disebut reverse transcriptase (RT) digunakan untuk mengkatalisis sintesis DNA beruntai
tunggal dari mRNA. Enzim ini adalah pasangan dari virus yang disebut retrovirus -
dinamakan demikian karena mereka adalah pengecualian untuk aliran biasa informasi
genetik. Alih-alih memiliki genom DNA yang dapat digunakan untuk membuat RNA,
retrovirus memiliki genom RNA. Setelah menginfeksi sel inang, mereka menggunakan RT
untuk mengubah RNA menjadi DNA, sehingga mereka dapat direplikasi. HIV, agen
penyebab de AIDS, adalah retrovirus. Seperti yang akan kita bahas, retrovirus juga memiliki
replikasi penting dalam bioteknologi sebagai terapi gen vektor (Bab 11). Karena RT
mensintesis DNA yang daftar salinan dari mRNA, hal itu disebut DNA komplementer
(cDNA). mRNA yang terdegradasi oleh pengobatan dengan larutan alkali atau pencerna
enzimatis: maka DNA polimerase digunakan untuk mensintesis untai kedua untuk membuat
double-stranded cDNA
Karena urutan cDNA tidak perlu memiliki situs yang mudah di setiap akhir, pendek,
double-stranded urutan DNA yang disebut urutan linker ditambahkan ke akhir cDNA. Linker
mengandung situs restriksi. Linker yang berbeda untuk situs yang berbeda pembatasan
tersedia secara komersial. Dengan menambahkan linker, cDNA sekarang dapat diikat ke situs
pembatasan nyaman dalam vektor pilihan, sering plasmid. Plasmid rekombinan ini kemudian
digunakan untuk mengubah bakteri.
Keuntungan utama perpustakaan cDNA daripada perpustakaan genom adalah karena
perpustakaan cDNA merupakan koleksi gen aktif yang diekspresikan dalam sel atau jaringan
dari mRNA yang diisolasi. Selain itu, intron tidak dikloning di perpustakaan cDNA.
Sebaliknya, ketika DNA genom dikloning, mengandung intron dan ekson yang dimasukkan
ke dalam bakteri, sel-sel tidak bisa menuliskan sambungan mRNA dari DNA dan menghapus
intron. Untuk alasan ini, perpustakaan cDNA biasanya lebih disukai daripada perpustakaan
genom ketika mencoba untuk mengkloning dan mengekspresikan gen yang diinginkan.
Keuntungan lain dari perpustakaan cDNA adalah dapat dibuat dan dipilih untuk
mengisolasi gen terutama yang diekspresikan hanya dalam kondisi tertentu dalam jaringan.
Sebagai contoh, jika gen diekspresikan hanya dalam jaringan yang dirangsang oleh hormon,
peneliti membuat perpustakaan dari sel hormon yang dirangsang untuk meningkatkan
kemungkinan hormon kloning gen sensitif. Perpustakaan telah menjadi aspek biologi
molekuler dimana banyak perusahaan menjual perpustakaan yang dibuat dari berbagai
jaringan dari spesies yang berbeda. Salah satu kelemahan perpustakaan cDNA adalah sulit
untuk membuat dan memilih jika jumlah sumber jaringan berlimpah mRNA untuk gen tidak
tersedia. Tapi seperti yang akan dipelajari, teknik yang disebut Polymerase Chain Reaction
(PCR) sering dapat memecahkan masalah ini.
Library Screening
Setelah pustaka genom atau perpustakaan cDNA dibuat, harus disaring untuk
mengidentifikasi gen yang menarik. Salah satu teknik perpustakaan skrining yang paling
umum disebut hibridisasi koloni (Gambar 3.5). Dalam hibridisasi koloni, koloni bakteri dari
perpustakaan yang mengandung DNA rekombinan ditumbuhkan pada plate agar. Nilon atau
membran nitroselulosa ditempatkan di atas plate, dan beberapa sel bakteri menempel pada
membran di lokasi yang sama di mana mereka ditemukan pada plate. Jika vektor bakteriofag
digunakan, fag ditransfer ke nilon. Nilon diperlakukan dengan larutan alkali untuk melisiskan
bakteri dan denaturasi DNA nya, yang mengikat nilon sebagai molekul untai tunggal.
Biasanya, nilon ini kemudian diinkubasi dengan probe DNA, fragmen DNA beruntai tunggal
melengkapi gen yang diinginkan karena dapat berpasangan dengan ikatan hidrogen pada
DNA target yang akan di kloning. Probe dilabeli menggunakan nukleotida radioaktif atau,
lebih umum, pewarna fluorescent atau senyawa lain yang dapat digunakan untuk
mengkatalisis reaksi-pelepasan cahaya disebut chemiluminescence. Zat warna ini
memungkinkan untuk melacak probe untuk menentukan di mana ia mengikat. Probe
mengikat urutan komplementer pada nilon - sebuah proses yang disebut hibridisasi.
Gambar 3.5 Koloni Hibridisasi; Perpustakaan skrining dengan DNA Probe untuk
mengidentifikasi kloning gen yang diinginkan.
Nilon tersebut kemudian dicuci untuk menghilangkan kelebihan probe terikat dan
terkena film fotografi dalam proses yang disebut autoradiografi. Di mana saja probe telah
terikat pada filter, radioaktivitas dari probe radioaktif atau dirilis cahaya (fluoresensi atau
chemiluminescence) dari probe non radioaktif memperlihatkan butir perak dalam film.
Tergantung pada banyaknya gen yang diinginkan, mungkin ada hanya beberapa koloni (atau
plak) pada filter yang berhibridisasi dengan probe. Film dikembangkan untuk membuat
catatan permanen, disebut autoradiogram (atau autoradiograf), yang kemudian dibandingkan
dengan pelat asli koloni bakteri untuk mengidentifikasi koloni berisi plasmid rekombinan
dengan gen yang diinginkan. Koloni ini sekarang dapat tumbuh pada skala yang lebih besar
untuk mengisolasi DNA kloning. Sering kali, ketika hibridisasi dilakukan dengan
menggunakan probe neon atau chemiluminescent, instrumen pencitraan digital dapat
digunakan untuk mendeteksi mengikat probe dan kemudian foto selaras dengan lempeng
bakteri untuk mengidentifikasi koloni menarik.
Perpustakaan screening jarang menyebabkan isolasi klon yang mengandung gen full-
length. Hal ini lebih umum untuk mendapatkan klon dengan potongan-potongan kecil dari
gen yang diinginkan (salah satu alasan mengapa hal ini terjadi dengan cDNA perpustakaan
karena mungkin sulit untuk mengisolasi full-length mRNA atau mensintesis full-length
cDNA untuk gen yang diinginkan). Ketika potongan-potongan kecil gen dikloning, para
ilmuwan mengurutkan potongan-potongan ini dan mencari urutan tumpang tindih. Tumpang
Tindih fragmen DNA kemudian dapat disatukan seperti teka-teki dalam upaya untuk
merekonstruksi gen full-length. Hal ini sering membutuhkan skrining perpustakaan beberapa
kali, dengan sejumlah besar bakteri yang berlapis dan digunakan untuk hibridisasi koloni.
Mencari start dan kodon stop di bagian sequen adalah salah satu cara untuk memprediksi
apakah seluruh gen telah disatukan. Melalui proses ini, fragmen tumpang tindih dapat
disatukan untuk merakit seluruh gen.
Polymerase Chain Reaction
Meskipun perpustakaan sangat efektif dan biasanya digunakan untuk kloning dan
mengidentifikasi gen yang diinginkan, rantai reaksi polimerase (PCR) adalah pendekatan
yang jauh lebih cepat daripada menciptakan kloning dan skrining perpustakaan. PCR
merupakan teknik yang sering menjadi pilihan ketika kloning gen tetapi juga memiliki
banyak aplikasi lainnya. Dikembangkan pada pertengahan 1980-an oleh Kary Mullis, PCR
ternyata teknik revolusioner yang telah berdampak pada banyak bidang biologi molekuler.
Pada tahun 1993, Mullis memenangkan hadiah Nobel Kimia untuk penemuan ini. PCR
adalah teknik untuk membuat salinan atau memperkuat urutan DNA tertentu dalam waktu
singkat. Konsep di balik reaksi PCR adalah sangat sederhana. Target DNA harus diperkuat
ditambahkan ke tabung berdinding tipis dan dicampur dengan asam deoksiribonukleat
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), buffer, dan DNA polimerase. Satu set pasangan primer
ditambahkan ke campuran. Primer adalah oligonukleotida DNA berantai-tunggal pendek
yang biasanya sekitar 20 sampai 30 panjang nukleotida. Primer ini melengkapi nukleotida
yang mengapit ujung berlawanan dari DNA target yang akan diperkuat (Gambar 3.6).
Gambar 3.6 Polymerase Chain Reaction
Tabung reaksi kemudian ditempatkan dalam thermal cycler. Dalam arti yang paling
sederhana, sebuah pengendara sepeda termal adalah blok pemanas canggih yang mampu
dengan cepat perubahan suhu selama interval waktu yang sangat singkat. The thermal cycler
mengambil sampel melalui serangkaian reaksi yang disebut siklus PCR (Gambar 3.6). setiap
siklus terdiri dari tiga tahap. Pada tahap pertama, yang disebut denaturasi, tabung reaksi
dipanaskan sekitar 940C untuk 960C, menyebabkan pemisahan dari DNA target ke dalam alur
tunggal. Pada tahap kedua, yang disebut hibridisasi (atau annealing), tabung kemudian
didinginkan sedikit antara 550C dan 650C, yang memungkinkan primer untuk ikatan hidrogen
untuk basa komplementer pada ujung-ujung urutan target. Selama perpanjangan (atau
elongasi), tahap terakhir dari siklus PCR, suhu biasanya sedikit terangkat (sekitar 700C
sampai 750C), dan salinan DNA polimerase target DNA dengan cara mengikat ujung 3 'dari
primer masing-masing dan menggunakan primer sebagai template. DNA polimerase
menambahkan nukleotida ke ujung 3 'dari masing-masing primer untuk mensintesis untai
komplementer.
Di akhir dari satu siklus lengkap, sejumlah DNA target telah digandakan.
Pengulangan suhu pada ketiga tahap ini tergantung pada jumlah dari siklus yang ditentukan
oleh peneliti, biasanya 20-30 siklus. Keuntungan utama dari PCR adalah kemampuan untuk
memperbanyak hingga jutaan salinan dari DNA target dari jumlah yang yang sangat sedikit
pada materi awal pada waktu yang singkat. Karena target DNA digandakan pada setiap siklus
PCR, setelah 20 siklus PCR, kira-kira 1 juta kopi (220) dari target DNA akan dihasilkan dari
reaksi yang dimulai dengan satu molekul target DNA.
Satu kunci dari PCR adalah tipe dari DNA polimerase yang digunakan pada reaksi.
Pemanasan yang diulang dan pendinginan yang dibutuhkan untuk PCR akan mendenaturasi
dan menghancurkan sebagian besar DNA polimerase setelah beberapa siklus. Bebeapa bahan
dari PCR yang cocok untuk DNA polimerase telah tersedia. Salah satu enzim dan paling
populer untuk PCR dikenal dengan nama Taq DNA polimerase. Taq diisolasi dari domain
Archaea, Thermus aquaticus, spesies yang dapat hidup di mata air panas. Karena T. aquaticus
dapat beradaptasi untuk dapat dapat hidup pada air panas (pertama kali ditemukan di mata
air panas di Yellowstone National Park), telah mengevolusi DNA polimerase yang dapat
tahan pada suhu tinggi. Karena Taq stabil pada suhu tinggi, ia dapat tahan pada perubahan
suhu yang penting untuk PCR tanpa terdenaturasi. Thermosable polymerase seperti Taq
diutuhkan untuk PCR.
Ada banyak variasi dan perbedaan penerapan pada teknologi PCR. Sebagai contoh,
real-time atau kuantitatif PCR (qPCR), digunakan penyiklus suhu khusus yang memberikan
peneliti untuk mengukur reaksi amplifikasi sesuai yang diinginkan peneliti. Kita akan
mendiskusikan qPCR nanti pada bab ini. Petunjuk tepat pada PCR dapat dilihat pada Cold
Spring Harbor DNA Learning Center website pada Companion Website.
Aplikasi PCR telah tersebar luas pada penelitian dan obat-obatan, seperti membuat
penyelidikan DNA, mempelajari ekspresi gen, memperbanyak jumlah menit dari DNA untuk
meneteksi patogen viral dan infeksi bakteri, memperbanyak DNA untuk mendiagnosis
kondisi genetik, mendeteksi jejak DNA dari jaringan pada kejadian perkara, dan bahkan
memperbanyak DNA purba dari jaringan fosil dinosaurus (gambar 3.7). Banyak penerapan
PCR dideskripsikan diseluruh buku.
Produk Kloning PCR
PCR sering digunakan oleh pendekatan kepustakaan untuk kloning gen karena sangat
cepat dan efektif. Kekurangan kloning PCR adalah untuk mendesain primer, anda harus tahu
sesuatu tentang sekuens DNA yang diinginkan. Kloning dengan PCR mudah jika gen telah
diklon dari spesies lain-sebagai contoh, penggunaan primer untuk gen yang diklon
sebelumnya pada tikus untuk mengklon gen yang sama pada manusia.
Ada banyak cara untuk mengklon gen dengan PCR. Satu pendekatan modern untuk
kloning PCR memberikan manfaat dari thermosable polymerase. Saat DNA dikopi, Taq dan
polimerase lain digunakan secara normal menambahkan satu nukleotida adenin pada ujung 3’
dari seluruh produk PCR. Setelah memperbanyak gen target, produk PCR yang telah diklon
dapat disambung pada Plasmid yang disebut vektor T. vektor T terdiri dari satu unting
nukleotida timin pada setiap ujung yang dapat melengkapi pasangan basa dengan nukleotida
adenin pada produk PCR yang menggantung. Setelah disambung pada vektor T, rekombinan
plasmid yang berisi produk klon PCR dapat dikenalkan kepada bakteri dan sekuen nukleotida
dapat ditentukan.
Sekarang anda telah mempelajari beberapa dari banyak strategi yang digunakan untuk
kloning gen, pada seksi selanjutnya, kita akan mempelajari berbagai pendekatan yang peneliti
gunakan untuk mempelajari kloning gen.
top related