TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN GENOM

Bagaimana anda mengidentifikasi dan mengklone gen yang diinginkan

Memotong dan menempel bagian dari DNA yang berbeda untuk menghasilkan DNA

rekombinan sudah menjadi teknik yang biasa dilakukan dalam biologi molekuler. Jenis

eksperimen dengan kloning menggambarkan mengenai kloning fragmen DNA berdasarkan

daerah pemotongan enzim restriksi, bukan mengkloning pada gen tunggal atau bagian DNA

tertentu yang diinginkan. Misalnya, jika kita menginginkan mengkloning gen insulin dengan

mengambil DNA dari pancreas, memotongnya dengan enzim, kemudian DNA dicerna

menjadi plasmid, anda akan mendapatkan ratusan ribu plasmid rekombinan dan bukan hanya

rekombinan plasmid yang berisi gen insulin.

Ahli biologi molekuler menyebut pendekatan ini dengan “Shotgun” kloning, karena

banyak fragmen secara acak dikloning sekaligus dan tidak ada gen individu secara khusus

yang ditargetkan untuk kloning. Bagaimana anda akan tahu mana rekombinan plasmid yang

mengandung gen insulin? Terlebih lagi, jika gen insulin tidak memiliki daerah restriksi untuk

enzim restriksi yang digunakan, anda mungkin tidak memiliki plasmid rekombinan yang

mengandung insulin. Bahkan jika anda tidak membuat plasmid dengan gen insulin bagaimana

anda akan memisahkan ini dari plasmid rekombinan lainnya? Jadi, bagaimana anda akan

menemukan gen tertentu yang dipilih dan dilakukan klone hanya pada urutan DNA yang

akan dipelajari? Pertanyaan ini sering tidak dapat dijawab dengan pendekatan kloning

menggunakan perpustakaan DNA.

Membuat perpustakaan DNA: Membangun koleksi gen kloning

Banyak strategi kloning dimulai dengan menyusun DNA perpustakaan - koleksi

fragmen DNA kloning dari organisme tertentu yang terkandung dalam bakteri atau virus

sebagai tuan rumah. Perpustakaan dapat disimpan untuk jangka waktu yang relatif lama dan

"disaring" untuk memilih gen. Jenis perpustakaan yang biasanya digunakan untuk kloning,

DNA perpustakaan genom dan perpustakaan DNA komplementer (cDNA perpustakaan).

Gambar 3.4 pada halaman berikutnya menunjukkan bagaimana perpustakaan genom dan

cDNA perpustakaan dibangun.

Gambar 3.4: Perbandingan sebuah perpustakaan DNA genom manusia dengan sebuah cDNA

Genomic dibandingkan cDNA perpustakaan

Dalam perpustakaan genom, kromosom DNA dari jaringan yang diinginkan diisolasi

kemudian dicerna dengan enzim restriksi. Proses ini menghasilkan fragmen DNA yang

mencakup genom seluruh organisme. Sebuah plasmid BAC, YAC, atau vector bakteriofage

dicerna dengan enzim yang sama, DNA ligase digunakan dalam mengikat genoming DNA

dan vector DNA secara acak. Secara teori, semua fragmen DNA dalam genom akan

dikloning ke vector. Vektor rekombinan kemudian digunakan untuk mengubah bakteri, dan

masing-masing klon sel bakteri akan berisi vektor rekombinan dengan plasmid yang

mengandung fragmen DNA genomik. Pertimbangkan setiap klon adalah "buku" dalam

"perpustakaan” dari fragmen DNA. Salah satu kelemahan dari perpustakaan jenis ini untuk

gen eucariotik adalah bahwa non - protein - coding ini pada DNA, yang disebut intron, diklon

menjadi ekson. Karena sebagian besar DNA dalam organisme eukariotik terdiri dari intron,

banyak klon dalam pustaka genom akan berisi potongan - non - protein coding DNA.

Dalam perpustakaan cDNA, mRNA dari jaringan bunga diisolasi dan digunakan

untuk membuat perpustakaan. Namun mRNA tidak dapat dipotong langsung dengan enzim

restriksi, sehingga harus dikonversi ke molekul DNA beruntai ganda. Sebuah enzim yang

disebut reverse transcriptase (RT) digunakan untuk mengkatalisis sintesis DNA beruntai

tunggal dari mRNA. Enzim ini adalah pasangan dari virus yang disebut retrovirus -

dinamakan demikian karena mereka adalah pengecualian untuk aliran biasa informasi

genetik. Alih-alih memiliki genom DNA yang dapat digunakan untuk membuat RNA,

retrovirus memiliki genom RNA. Setelah menginfeksi sel inang, mereka menggunakan RT

untuk mengubah RNA menjadi DNA, sehingga mereka dapat direplikasi. HIV, agen

penyebab de AIDS, adalah retrovirus. Seperti yang akan kita bahas, retrovirus juga memiliki

replikasi penting dalam bioteknologi sebagai terapi gen vektor (Bab 11). Karena RT

mensintesis DNA yang daftar salinan dari mRNA, hal itu disebut DNA komplementer

(cDNA). mRNA yang terdegradasi oleh pengobatan dengan larutan alkali atau pencerna

enzimatis: maka DNA polimerase digunakan untuk mensintesis untai kedua untuk membuat

double-stranded cDNA

Karena urutan cDNA tidak perlu memiliki situs yang mudah di setiap akhir, pendek,

double-stranded urutan DNA yang disebut urutan linker ditambahkan ke akhir cDNA. Linker

mengandung situs restriksi. Linker yang berbeda untuk situs yang berbeda pembatasan

tersedia secara komersial. Dengan menambahkan linker, cDNA sekarang dapat diikat ke situs

pembatasan nyaman dalam vektor pilihan, sering plasmid. Plasmid rekombinan ini kemudian

digunakan untuk mengubah bakteri.

Keuntungan utama perpustakaan cDNA daripada perpustakaan genom adalah karena

perpustakaan cDNA merupakan koleksi gen aktif yang diekspresikan dalam sel atau jaringan

dari mRNA yang diisolasi. Selain itu, intron tidak dikloning di perpustakaan cDNA.

Sebaliknya, ketika DNA genom dikloning, mengandung intron dan ekson yang dimasukkan

ke dalam bakteri, sel-sel tidak bisa menuliskan sambungan mRNA dari DNA dan menghapus

intron. Untuk alasan ini, perpustakaan cDNA biasanya lebih disukai daripada perpustakaan

genom ketika mencoba untuk mengkloning dan mengekspresikan gen yang diinginkan.

Keuntungan lain dari perpustakaan cDNA adalah dapat dibuat dan dipilih untuk

mengisolasi gen terutama yang diekspresikan hanya dalam kondisi tertentu dalam jaringan.

Sebagai contoh, jika gen diekspresikan hanya dalam jaringan yang dirangsang oleh hormon,

peneliti membuat perpustakaan dari sel hormon yang dirangsang untuk meningkatkan

kemungkinan hormon kloning gen sensitif. Perpustakaan telah menjadi aspek biologi

molekuler dimana banyak perusahaan menjual perpustakaan yang dibuat dari berbagai

jaringan dari spesies yang berbeda. Salah satu kelemahan perpustakaan cDNA adalah sulit

untuk membuat dan memilih jika jumlah sumber jaringan berlimpah mRNA untuk gen tidak

tersedia. Tapi seperti yang akan dipelajari, teknik yang disebut Polymerase Chain Reaction

(PCR) sering dapat memecahkan masalah ini.

Library Screening

Setelah pustaka genom atau perpustakaan cDNA dibuat, harus disaring untuk

mengidentifikasi gen yang menarik. Salah satu teknik perpustakaan skrining yang paling

umum disebut hibridisasi koloni (Gambar 3.5). Dalam hibridisasi koloni, koloni bakteri dari

perpustakaan yang mengandung DNA rekombinan ditumbuhkan pada plate agar. Nilon atau

membran nitroselulosa ditempatkan di atas plate, dan beberapa sel bakteri menempel pada

membran di lokasi yang sama di mana mereka ditemukan pada plate. Jika vektor bakteriofag

digunakan, fag ditransfer ke nilon. Nilon diperlakukan dengan larutan alkali untuk melisiskan

bakteri dan denaturasi DNA nya, yang mengikat nilon sebagai molekul untai tunggal.

Biasanya, nilon ini kemudian diinkubasi dengan probe DNA, fragmen DNA beruntai tunggal

melengkapi gen yang diinginkan karena dapat berpasangan dengan ikatan hidrogen pada

DNA target yang akan di kloning. Probe dilabeli menggunakan nukleotida radioaktif atau,

lebih umum, pewarna fluorescent atau senyawa lain yang dapat digunakan untuk

mengkatalisis reaksi-pelepasan cahaya disebut chemiluminescence. Zat warna ini

memungkinkan untuk melacak probe untuk menentukan di mana ia mengikat. Probe

mengikat urutan komplementer pada nilon - sebuah proses yang disebut hibridisasi.

Gambar 3.5 Koloni Hibridisasi; Perpustakaan skrining dengan DNA Probe untuk

mengidentifikasi kloning gen yang diinginkan.

Nilon tersebut kemudian dicuci untuk menghilangkan kelebihan probe terikat dan

terkena film fotografi dalam proses yang disebut autoradiografi. Di mana saja probe telah

terikat pada filter, radioaktivitas dari probe radioaktif atau dirilis cahaya (fluoresensi atau

chemiluminescence) dari probe non radioaktif memperlihatkan butir perak dalam film.

Tergantung pada banyaknya gen yang diinginkan, mungkin ada hanya beberapa koloni (atau

plak) pada filter yang berhibridisasi dengan probe. Film dikembangkan untuk membuat

catatan permanen, disebut autoradiogram (atau autoradiograf), yang kemudian dibandingkan

dengan pelat asli koloni bakteri untuk mengidentifikasi koloni berisi plasmid rekombinan

dengan gen yang diinginkan. Koloni ini sekarang dapat tumbuh pada skala yang lebih besar

untuk mengisolasi DNA kloning. Sering kali, ketika hibridisasi dilakukan dengan

menggunakan probe neon atau chemiluminescent, instrumen pencitraan digital dapat

digunakan untuk mendeteksi mengikat probe dan kemudian foto selaras dengan lempeng

bakteri untuk mengidentifikasi koloni menarik.

Perpustakaan screening jarang menyebabkan isolasi klon yang mengandung gen full-

length. Hal ini lebih umum untuk mendapatkan klon dengan potongan-potongan kecil dari

gen yang diinginkan (salah satu alasan mengapa hal ini terjadi dengan cDNA perpustakaan

karena mungkin sulit untuk mengisolasi full-length mRNA atau mensintesis full-length

cDNA untuk gen yang diinginkan). Ketika potongan-potongan kecil gen dikloning, para

ilmuwan mengurutkan potongan-potongan ini dan mencari urutan tumpang tindih. Tumpang

Tindih fragmen DNA kemudian dapat disatukan seperti teka-teki dalam upaya untuk

merekonstruksi gen full-length. Hal ini sering membutuhkan skrining perpustakaan beberapa

kali, dengan sejumlah besar bakteri yang berlapis dan digunakan untuk hibridisasi koloni.

Mencari start dan kodon stop di bagian sequen adalah salah satu cara untuk memprediksi

apakah seluruh gen telah disatukan. Melalui proses ini, fragmen tumpang tindih dapat

disatukan untuk merakit seluruh gen.

Polymerase Chain Reaction

Meskipun perpustakaan sangat efektif dan biasanya digunakan untuk kloning dan

mengidentifikasi gen yang diinginkan, rantai reaksi polimerase (PCR) adalah pendekatan

yang jauh lebih cepat daripada menciptakan kloning dan skrining perpustakaan. PCR

merupakan teknik yang sering menjadi pilihan ketika kloning gen tetapi juga memiliki

banyak aplikasi lainnya. Dikembangkan pada pertengahan 1980-an oleh Kary Mullis, PCR

ternyata teknik revolusioner yang telah berdampak pada banyak bidang biologi molekuler.

Pada tahun 1993, Mullis memenangkan hadiah Nobel Kimia untuk penemuan ini. PCR

adalah teknik untuk membuat salinan atau memperkuat urutan DNA tertentu dalam waktu

singkat. Konsep di balik reaksi PCR adalah sangat sederhana. Target DNA harus diperkuat

ditambahkan ke tabung berdinding tipis dan dicampur dengan asam deoksiribonukleat

(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), buffer, dan DNA polimerase. Satu set pasangan primer

ditambahkan ke campuran. Primer adalah oligonukleotida DNA berantai-tunggal pendek

yang biasanya sekitar 20 sampai 30 panjang nukleotida. Primer ini melengkapi nukleotida

yang mengapit ujung berlawanan dari DNA target yang akan diperkuat (Gambar 3.6).

Gambar 3.6 Polymerase Chain Reaction

Tabung reaksi kemudian ditempatkan dalam thermal cycler. Dalam arti yang paling

sederhana, sebuah pengendara sepeda termal adalah blok pemanas canggih yang mampu

dengan cepat perubahan suhu selama interval waktu yang sangat singkat. The thermal cycler

mengambil sampel melalui serangkaian reaksi yang disebut siklus PCR (Gambar 3.6). setiap

siklus terdiri dari tiga tahap. Pada tahap pertama, yang disebut denaturasi, tabung reaksi

dipanaskan sekitar 940C untuk 960C, menyebabkan pemisahan dari DNA target ke dalam alur

tunggal. Pada tahap kedua, yang disebut hibridisasi (atau annealing), tabung kemudian

didinginkan sedikit antara 550C dan 650C, yang memungkinkan primer untuk ikatan hidrogen

untuk basa komplementer pada ujung-ujung urutan target. Selama perpanjangan (atau

elongasi), tahap terakhir dari siklus PCR, suhu biasanya sedikit terangkat (sekitar 700C

sampai 750C), dan salinan DNA polimerase target DNA dengan cara mengikat ujung 3 'dari

primer masing-masing dan menggunakan primer sebagai template. DNA polimerase

menambahkan nukleotida ke ujung 3 'dari masing-masing primer untuk mensintesis untai

komplementer.

Di akhir dari satu siklus lengkap, sejumlah DNA target telah digandakan.

Pengulangan suhu pada ketiga tahap ini tergantung pada jumlah dari siklus yang ditentukan

oleh peneliti, biasanya 20-30 siklus. Keuntungan utama dari PCR adalah kemampuan untuk

memperbanyak hingga jutaan salinan dari DNA target dari jumlah yang yang sangat sedikit

pada materi awal pada waktu yang singkat. Karena target DNA digandakan pada setiap siklus

PCR, setelah 20 siklus PCR, kira-kira 1 juta kopi (220) dari target DNA akan dihasilkan dari

reaksi yang dimulai dengan satu molekul target DNA.

Satu kunci dari PCR adalah tipe dari DNA polimerase yang digunakan pada reaksi.

Pemanasan yang diulang dan pendinginan yang dibutuhkan untuk PCR akan mendenaturasi

dan menghancurkan sebagian besar DNA polimerase setelah beberapa siklus. Bebeapa bahan

dari PCR yang cocok untuk DNA polimerase telah tersedia. Salah satu enzim dan paling

populer untuk PCR dikenal dengan nama Taq DNA polimerase. Taq diisolasi dari domain

Archaea, Thermus aquaticus, spesies yang dapat hidup di mata air panas. Karena T. aquaticus

dapat beradaptasi untuk dapat dapat hidup pada air panas (pertama kali ditemukan di mata

air panas di Yellowstone National Park), telah mengevolusi DNA polimerase yang dapat

tahan pada suhu tinggi. Karena Taq stabil pada suhu tinggi, ia dapat tahan pada perubahan

suhu yang penting untuk PCR tanpa terdenaturasi. Thermosable polymerase seperti Taq

diutuhkan untuk PCR.

Ada banyak variasi dan perbedaan penerapan pada teknologi PCR. Sebagai contoh,

real-time atau kuantitatif PCR (qPCR), digunakan penyiklus suhu khusus yang memberikan

peneliti untuk mengukur reaksi amplifikasi sesuai yang diinginkan peneliti. Kita akan

mendiskusikan qPCR nanti pada bab ini. Petunjuk tepat pada PCR dapat dilihat pada Cold

Spring Harbor DNA Learning Center website pada Companion Website.

Aplikasi PCR telah tersebar luas pada penelitian dan obat-obatan, seperti membuat

penyelidikan DNA, mempelajari ekspresi gen, memperbanyak jumlah menit dari DNA untuk

meneteksi patogen viral dan infeksi bakteri, memperbanyak DNA untuk mendiagnosis

kondisi genetik, mendeteksi jejak DNA dari jaringan pada kejadian perkara, dan bahkan

memperbanyak DNA purba dari jaringan fosil dinosaurus (gambar 3.7). Banyak penerapan

PCR dideskripsikan diseluruh buku.

Produk Kloning PCR

PCR sering digunakan oleh pendekatan kepustakaan untuk kloning gen karena sangat

cepat dan efektif. Kekurangan kloning PCR adalah untuk mendesain primer, anda harus tahu

sesuatu tentang sekuens DNA yang diinginkan. Kloning dengan PCR mudah jika gen telah

diklon dari spesies lain-sebagai contoh, penggunaan primer untuk gen yang diklon

sebelumnya pada tikus untuk mengklon gen yang sama pada manusia.

Ada banyak cara untuk mengklon gen dengan PCR. Satu pendekatan modern untuk

kloning PCR memberikan manfaat dari thermosable polymerase. Saat DNA dikopi, Taq dan

polimerase lain digunakan secara normal menambahkan satu nukleotida adenin pada ujung 3’

dari seluruh produk PCR. Setelah memperbanyak gen target, produk PCR yang telah diklon

dapat disambung pada Plasmid yang disebut vektor T. vektor T terdiri dari satu unting

nukleotida timin pada setiap ujung yang dapat melengkapi pasangan basa dengan nukleotida

adenin pada produk PCR yang menggantung. Setelah disambung pada vektor T, rekombinan

plasmid yang berisi produk klon PCR dapat dikenalkan kepada bakteri dan sekuen nukleotida

dapat ditentukan.

Sekarang anda telah mempelajari beberapa dari banyak strategi yang digunakan untuk

kloning gen, pada seksi selanjutnya, kita akan mempelajari berbagai pendekatan yang peneliti

gunakan untuk mempelajari kloning gen.