TEKNIK ELECTROSPINNING UNTUK MENGENDALIKAN DEPOSISI DAN PENYESUAIAN STRUKTUR WADAH NANOFIBROUS UNTUK

ORIENTASI SELULER DAN REORGANISASI SITOSKELETAL

Joke K. Wise, Michael Cho, Eyal Zussman, Constantine M. Megaridis, dan Alexander L. Yarin

2.1 PENDAHULUAN

Fibril sel dan matriks ekstraseluler (ECM), pada sebagian besar jaringan,

tidak random, tetapi yang jelas menunjukkan pola dan orientasi spasial tertentu.

Temuan terbaru menunjukkan bahwa biopolimer berorientasi berbasis wadah

nanofibrous memiliki potensi untuk pembuluh darah rekayasa [1], jaringan saraf

[2], dan jaringan ligamen [3]. Selain itu, telah terbukti bahwa sel adhesi dan

proliferasi [1] secara signifikan meningkat pada wadah berbasis nanofibrous.

Teori pedoman yang berhubungan menunjukkan bahwa sel memiliki probabilitas

migrasi terbesar dalam orientasi yang lebih disukai yang berhubungan dengan

sifat kimia, struktural, dan mekanis dari substrat [4-6]. Oleh karena itu, dapat

disimpulkan bahwa wadah berbasis nanofibrous akan memandu deretan sel

sepanjang nanofibers. Susunan sel ke nanofibrous wadah berorientasi bisa

disebabkan paduan yang berhubungan dan/atau reorganisasi sitoskeletal. Sel yang

selaras kemudian bisa digunakan untuk mengubah bentuk dan memodulasi

regenerasi dan lingkungan mikro ECM [7].

Tujuan khusus untuk pekerjaan ini adalah untuk merencanakan konsep

seperti jaringan yang akan meniru zona dangkal dari kartilago artikular. Diketahui

bahwa kartilago artikular secara garis besar terdiri dari setidaknya empat zona

berbeda, masing-masing dengan sel tertentu dan organisasi atau orientasi ECM [8-

10]. Zona ini dikenal sebagai zona dangkal atau tangensial, menengah atau

transisi, dalam atau radial, dan zona kalsifikasi. Penyusunan sel khusus dan ECM

dalam setiap zona kartilago dapat dikaitkan dengan riwayat perkembangan dan

masing-masing zona kartilago ini terkena daya mekanik, sehingga mendukung

fungsi keseluruhan jaringan artikular kartilago [12,13]. Beberapa laporan yang

diterbitkan telah difokuskan pada susunan zonal dari kondrosit dalam polimer

17

18

biokompatibel untuk rancangan rekayasa jaringan kartilago artikular [14-18].

Selanjutnya, jurnal yang baru-baru ini diterbitkan telah menggunakan kondrosit

dan sel induk mesenkimal manusia (hMSCs) dan tiga dimensi polimer wadah

secara acak untuk rancangan jaringan nanofibrous kartilago [19-23]. Namun,

upaya khusus untuk rancangan zona superfisial dari kartilago artikular

menggunakan hMSCs dan wadah berbasis nanofibrous belum dilaporkan. Zona

superfisial dari jaringan artikular kartilago alam tampak rata, kondrosit seperti

ellipsoid dan fibril kolagen skala nano, yang berorientasi sejajar terhadap bidang

permukaan artikular, dengan derajat signifikan dengan orientasi pada bidang [8-

1]. Meskipun hanya beberapa lapis tipis, pentingnya zona superfisial ini sering

ditekankan karena memberikan daya tarik tinggi yang dipertahankan oleh

orientasi sel dan fibril kolagen [12,13], dan karena itu sangat penting untuk fungsi

normal di artikular permukaan kartilago. Langkah pertama menuju rancangan

jaringan fungsional dari zona superfisial kartilago memerlukan evaluasi kuantitatif

dari adhesi dan orientasi sel.

Untuk berfungsi dengan baik, pembenihan sel dalam wadah harus mampu

berhubungan dengan lingkungan mereka melalui sinyal biokimia, bioelectrical,

dan topologi yang tepat. Topografi dan komposisi mikro (yaitu, ECM asli)

mempengaruhi fungsi seluler, seperti adhesi, pertumbuhan, motilitas, sekresi,

ekspresi gen, dan apoptosis. Hal ini juga diketahui bahwa struktur fisik dari ECM

asli memiliki dimensi nano. Permukaan luas-volume rasio tinggi dari wadah

nanofibrous dan diameter nano dari serabut cenderung memberikan kondisi yang

baik untuk perlekatan dan pertumbuhan sel. Sebagai contoh, karena kolagen

merupakan komponen ECM paling banyak, wadah berbasis kolagen terdiri dari

fibril dalam kisaran diameter 10-300 nm tidak hanya biokompatibel tetapi juga

bisa memberikan salah satu struktur nanofibrous paling ideal untuk merancang

jaringan [24]. Memang, sel telah diketahui untuk menempel padam dan tersusun

di sekitar serabut dengan diameter lebih kecil daripada sel tersebut [24,25].

Sel induk memiliki sifat unik untuk pembaruan diri tanpa diferensiasi

sampai dan setidaknya selama sinyal biologis dan fisik yang sesuai tersedia.

Dalam konteks rekayasa jaringan, penggunaan sel induk memiliki banyak

19

keuntungan. Tidak seperti konstruksi jaringan rekayasa menggunakan sel

didiferensiasi, sel induk (1) memiliki kapasitas proliferatif yang lebih tinggi, (2)

menyediakan kemampuan regeneratif yang sangat baik yang memungkinkan

integritas dan fungsi dari jaringan rekayasa yang diinginkan, (3) memungkinkan

untuk melihat konstruksi jaringan multifungsi (misalnya, jaringan osteochondral),

dan (4) mengurangi atau menghilangkan penolakan jaringan dan kegagalan.

Sekarang juga ditetapkan bahwa hMSCs dapat dibudidayakan dan dikembangkan

secara in vitro, dan dapat didorong untuk berkembang biak dan berdiferensiasi

menjadi jaringan sel fenotipe spesifik seperti khondrogenik, sel osteogenik,

adipogenik, dan myogenik dengan menggunakan rangsangan biologis dan fisik

[26-29], dan karena itu menyediakan potensi untuk perbaikan dan regenerasi

jaringan otot. Sementara potensi terapi hMSCs yang besar telah diakui untuk

pengobatan jaringan yang rusak atau sakit, kompleksitas peristiwa yang berkaitan

dengan transformasi sel-sel prekursor meninggalkan pertanyaan yang belum

terjawab tentang perubahan morfologi, struktur, proteomika, dan fungsional

dalam sel batang.

Pengetahuan yang lebih rinci mengenai sifat hMSC akan memungkinkan

pendekatan yang lebih baik dan lebih efektif untuk ekspansi sel in vitro, dan

regulasi keterkaitan mereka terhadap fenotip tertentu. Sebagai contoh, kontrol

orientasi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC telah terbukti memodulasi aspek

fungsional konstruksi jaringan rekayasa [30,31]. Rekayasa lingkungan yang

kondusif untuk orientasi, adhesi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC, oleh karena,

itu sangat penting dalam rekayasa jaringan.

Electrospinning [32-37] adalah teknik menjanjikan untuk menciptakan

arsitektur pola serabut untuk mengatur interaksi seluler dan molekuler dari adhesi,

proliferasi, diferensiasi, dan orientasi sel induk. Berbagai polimer alam atau

sintetis telah digunakan dalam rangka electrospinning untuk membuat dan

merancang wadah nanofibrous yang biokompatibel untuk aplikasi jaringan

rekayasa. Sebagai contoh, polikaprolakton (PCL) adalah bahan biodegradable

yang menunjukkan hampir tidak ada toksisitas, degradasi terkendali, dan tidak

mahal [38]. PCL adalah polimer yang semikristalin milik keluarga dari poliester

20

α-hidroksi (misalnya, PLA, PGA) dan secara signifikan dapat meningkatkan sifat

mekanik dari wadah karena modulus tarik yang tinggi (400 MPa; [39401]). Sifat

mekanik tersebut melebihi modulus elastisitas jaringan kartilago (~ l0 MPa) dan

di kisaran modulus elastis dari serat kolagen (~500 MPa), menunjukkan bahwa

wadah PCL nanofibrous menunjukkan kemungkinan yang sangat baik untuk

rekayasa jaringan kartilago. Selanjutnya, PCL baru-baru ini telah digunakan untuk

menunjukkan kompatibilitas untuk benih dan mengakomodasi hMSCs dan

mendukung diferensiasi multi-lineage [20,21,38].

Pada penelitian ini, pertama kita meninjau teknik berbeda yang digunakan

untuk menyelaraskan nanofibers selama electrospinning. Pada bagian berikutnya,

kami bertujuan untuk mengatur dan mengukur orientasi hMSC paling tidak pada

dua wadah PCL nanofibrous berbeda yang dibuat menggunakan electrospinning.

Dengan menggunakan analisis citra canggih, orientasi hMSC pada wadah

berorientasi nanofibrous acak dan dihitung selama periode kultur 18 hari. Selain

itu, kelangsungan hidup sel jangka panjang, reorganisasi cytoskeletal, dan adhesi

sel-nanofiber dieksplorasi dan berkaitan dengan kontak yang disebabkan orientasi

hMSC pada nanofibers. Terapi aplikasi stem sel dan jaringan rekayasa dapat

ditingkatkan dan difasilitasi oleh pendekatan fisik, seperti yang disajikan di sini,

untuk mengendalikan lingkungan mikro untuk pertumbuhan dan diferensiasi sel.

2.2 PEMBUATAN WADAH NANOFIBER DENGAN ELECTROSPUN

Teknik untuk baris pintalan nanofibers in situ menggunakan daya repulsi

elektrostatik untuk kembali bekerja [41,42] dimana lensa elektrostatik pertama

untuk electrospinning diperkenalkan. Ide dari lensa elektrostatik pada

electrospinning didapatkan dengan cepat dalam penelitian lain [43-46] dimana

beberapa pengaturan tambahan menggunakan prinsip ini digunakan. Sebuah

sketsa dari pengaturan eksperimental digunakan pada referensi [41.42] yang

ditunjukkan pada Gambar 2.1. Pancaran mengalir ke bawah dari permukaan

tetesan tambahan larutan polimer berhenti pada akhir jarum menuju roda kolektor

21

yang berputar dan ditempatkan pada jarak 120 mm di bawah tetesan itu. Roda

aluminium (dengan diameter

200 mm) memiliki tepi runcing dengan sudut setengah dari 26,6° untuk membuat

medan elektrostatik yang sangat konvergen. Sebuah perbedaan potensial listrik

sekitar 8 kV awalnya diterapkan antara permukaan tetesan cairan dan roda

berputar. Ketika beda potensial antara

tetesan dan roda meningkat, tetesan mengakuisisi bentuk kerucut seperti (kerucut

Taylor).

Pada beda potensial cukup tinggi, pancaran stabil muncul dari corong dan pindah

ke bawah

menuju roda. Pancaran mengalir jauh dari tetesan dalam garis hampir lurus dan

kemudian ditekuk ke dalam jalur kompleks yang berada dalam wilayah yang

berbentuk kerucut (sampul kerucut, [32]), dengan puncaknya di bagian atas.

Kemudian, pada suatu titik tertentu di atas roda, sampul kerucut mulai menyusut,

menghasilkan sebuah sampul kerucut terbalik dengan puncaknya di tepi roda.

Selama proses elektrospinning, roda diputar pada kecepatan konstan untuk

mengumpulkan nanofibers yang berkembang ke tepi yang tajam. Ketika pintalan

nanofiber mencapai tepi roda, mereka akan bersinggungan di sekitar roda. Sebuah

meja kecil (5 x 4 mm) yang terbuat dari aluminium juga dapat ditempelkan pada

tepi roda untuk memudahkan pengumpulan berikutnya dari nanofibers. Meja ini

dapat diputar pada sumbu Z (lihat Gambar 2.1) ketika rotasi roda berhenti untuk

sementara, maka, arah nanofibers dikumpulkan dapat dikendalikan. Nanofibers

dikumpulkan biasanya selama 10 detik. Susunan nanofiber dua dimensi yang khas

dibuat dari poli(etilena oksida) (PEO) dengan metode ini ditunjukkan pada

Gambar 2.2. Kecepatan linear di ujung kolektor disk adalah 11 rn/s dalam kasus

ini. Diameter nanofibers pada Gambar 2.2A tidak seragam dan bervariasi 250-400

nm, dan 200-500 nm. Pemisahan antara nanofibers paralel bervariasi dari 1

sampai 2 µm di kedua gambar.

22

Gambar 2.1 Skema proses electrospinning menunjukkan pancaran sampul

kerucut ganda. Roda kolektor dapat dilengkapi dengan meja yang membantu

untuk mengumpulkan nanofibers. Lempengan ini dapat diputar mengelilingi

sumbu Z-ketika rotasi roda untuk sementara berhenti untuk memungkinkan

pengambilan lapisan demi lapis pada sudut yang diinginkan antara susunan

lapisan nanofiber. (dari Zussman, E., Theron, A., dan Yarin, AL, Appl Phys Lea.,

82, 973, 2003. dengan izin.)

Sebuah bagian dari nanofiber yang panjang disimpan di meja tetap

dihitung untuk periode singkat. Karena itu, ketika putaran baru nanofiber

mengendap ke meja, nanofiber itu sebelumnya ditolak oleh bagian yang

mengendap, yang mana masih tetap dihitung. Mekanisme ini memungkinkan

pembentukan susunan dua dimensi di meja yang sama dengan yang ditunjukkan

pada Gambar 2.2. Kecepatan rotasi linier roda memainkan peran penting dalam

peregangan dan penyesuaian bagian nanofiber pada meja setelah pendaratan

mereka (lihat Gambar 2.3). Pada kecepatan rotasi roda linear 5-10 m / s,

keselarasan nanofiber cukup bisa dicapai (Gambar 2.3c dan e). Sudut (terhadap

arah rotasi roda) distribusi yang ditunjukkan pada Gambar 2.3b, d, dan f

mengungkapkan bahwa pada kecepatan rendah tidak ada serabut yang diinginkan

23

yang tercapai (Gambar 2.3b); pada kecepatan yang lebih tinggi, distribusi sudut

menunjukkan serat yang diinginkan menjadi sempit dengan kecepatan rotasi

meningkat linier (Gambar 2.3d dan f). Mekanisme yang sama pada dasarnya

bekerja ketika electrospun nanofibers pada Mandril berputar [46-48]. Namun,

ketika tidak ada pembatasan lateral yang dikenakan oleh tepi tajam roda (lensa

elektrostatik), ekskursi lateral dari serat yang cukup signifikan dan tingkat lebih

rendah dari keselarasan mungkin terjadi. Sebuah varian menengah sesuai dengan

pita logam (yang setara dengan meja sempit memanjang) dipasang di atas tepi

roda yang tajam. Akumulasi strip nanofiber seperti pada pita juga bisa

disesuaikan. Ini merupakan alasan mengapa tikar nanofiber terorientasi yang

digunakan dalam bagian berikutnya dari buku ini adalah nanofiber electrospun

pada pita yang ditempatkan di atas roda tajam yang berputar.

(a)

(b)

24

Gambar 2.2 Pengamatan gambar nanofibers dengan elektron mikroskop (SEM)

dengan PEO yang dikumpulkan pada pita karbon yang menempel pada tepi roda

kolektor. Dalam (a), diameter serat bervariasi 250-400 nm. Pada (b), diameter

serat bervariasi 200-500 nm. Lemparan (pusat ke pusat) bervariasi dari 1 sampai 2

guci di kedua gambar. (Dari Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL.,

Nanorechnology, 12, 384, 2001 Dengan izin..)

Ditekankan bahwa tarikan pada bagian nanofiber setelah pendaratan

pertama pada kolektor yang berputar, di samping meningkatkan kekuatan tarik,

juga diharapkan untuk sejumlah aplikasi biomedis [46-48].

Susunan tiga dimensi nanofiber yang khas (lintang) digambarkan pada

Gambar 2.4. Kumpulan nanofiber PEO menunjukkan derajat tinggi kesesuaian.

Diameter nanofibers dalam hal ini juga seragam dan bervariasi di kisaran 100-800

nm. Ketika nanofibers yang electrospun ke tepi tajam roda tanpa meja, diperoleh

bundel (tali) nanofiber. Gambaran khas dari tali nanofiber dilepaskan dari tepi

roda ditunjukkan pada Gambar 2.5. Lamanya proses pengumpulan pada kasus ini

adalah 60 detik. Tali itu secara manual terlepas dari tepi roda [41]. Dua detail tali

serat polimer SEM yang dihasilkan dengan cara ini diperlihatkan pada Gambar

2.6. Para nanofibers berada dalam kontak, dan hampir tetap paralel hingga jarak

jauh.

25

Gambar 2.3 Orientasi nanofiber pada berbagai kecepatan rotasi roda linear: (a)

2,9 m / s; (b) orientasi distribusi serabut yang sesuai dinyatakan dalam sudut

sehubungan dengan arah rotasi roda (standar deviasi, SD = 23,44°) ; (c) 5,3 m/s ;

(d) distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 3,7°); (e) 7,7 m/s (f)

distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 1,8°). Bagian gelombang

serabut pada (e) tersebut diberikan merupakan bagian terakhir dari filamen yang

dikumpulkan saat medan listrik telah dimatikan. Nanofiber electrospun dari 4 wt

% polietilen oksida, PEO (MW = 1000 kDa) dalam etanol / air.

26

Gambar 2.4 Gambaran khas SEM susunan silang dari PEO berbasis nanofibers

dikumpulkan di meja aluminium. Struktur crossbar diperoleh dalam proses

perakitan berurutan dengan arah penempatan tabel ortogonal. (a) kumpulan dua

lapisan dan (b) kumpulan empat lapisan. (dari Zussman, E., Theron, A., dan

Yarin, AL, Appl Phys Len.., 82, 973, 2003. dengan izin.)

Gambar 2.5 Sebuah bundel (tali) dari nanofibers manual terlepas dari kolektor.

Hampir semua nanofibers dikumpulkan di tepi roda kolektor yang tajam. (dari

Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL., Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan

izin.)

27

Gambar 2.6 Gambaran khas SEM dua bundel (tali) nanofibers dengan PEO.

Kepadatannya sekitar 100 nanofibers per mikrometer persegi. (Dari Theron, A.,

Zussman, E., dan Yarin, AL, Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan izin.)

2.3 METODE DAN MATERIAL

2.3.1 Elektrospinning dari Wadah Nanofiber PCL

Nanofibers dengan diameter beberapa ratus nanometer diproduksi dengan

menggunakan electrospinning seperti yang telah dijelaskan sebelumnya

[32,33,41,42] (lih. Bagian 2.2). Semua wadah polimer nanofiber electrospun

dibuat dari PCL dengan berat molekul 80 kDa (Sigma-Aldrich) electrospun dari

10wt% dari larutan metilen klorida / dimetilformamida dengan perbandingan 75/2

(volume). Dua jenis wadah nanofiber PCL electrospun yang berbeda diperoleh

dan ditandai sebagai random atau terarah. Wadah acak diproduksi oleh

electrospinning polimer nanofibers ke sebuah substrat aluminium datar,

menghasilkan wadah nonwoven tanpa orientasi nanofiber yang terpilih. Wadah

terarah diproduksi dengan mengumpulkan nanofibers pada pita logam sempit di

tepi sebuah roda yang berputar [41,42] (lih. Bagian 2.2), menghasilkan wadah

nanofibrous dengan orientasi yang jelas. Cairan electrospun polimer dari

semprotan 5 ml melekat pada jarum hipodermik (diameter bagian dalam 0,1 mm)

dan menggunakan laju aliran 1 mL / jam. Sebuah elektroda tembaga ditempatkan

dalam larutan polimer dan akhirnya electrospun menuju tepi yang tajam dari

kolektor listrik beralas (Gambar 2.1). Kekuatan medan listrik adalah 1,1 kV / cm.

28

Kecepatan linier dari tepi kolektor roda adalah 10 rn/s. Semua percobaan

dilakukan pada suhu kamar (~25° C) dengan kelembaban relatif udara 40%. SEM

digunakan untuk mendapatkan gambar dari setiap jenis wadah nanofibrous PCL.

Pengamatan SEM dari wadah PCL dibuat dengan mikroskop S-3000N variabel

tekanan elektron hitachi. Instrumen ini memiliki sumber elektron tungsten dan

mampu mencitrakan spesimen dalam tekanan variabel mulai 1-270 Pa. Di bawah

tekanan variabel, spesimen nonconducting dapat dicitrakan tanpa lapisan film

konduktif. Tegangan mempercepat dapat bervariasi selama rentang 0,3-30 kV

dengan resolusi 5 nm pada 25 kV. Diameter nanofiber diperkirakan dengan

menggunakan prosesor gambar (MetaMorph, Device Molekuler Corp.,

Downingtown, Pennsylvania).

2.3.2 Kulturasi Sel Stem Mesenkimal Manusia dan Pembibitan dalam

Wadah Nanofibrous PCL

hMSCs diperoleh dari Sumber Sel Stem Mesenkimal Dewasa (Tulane

University, New Orleans, Louisiana). Sel dikultur dalam medium pertumbuhan

lengkap yang terdiri dari medium Dulbecco eagle yang dimodifikasi (DMEM)

ditambah dengan 15% serum janin sapi (FBS), 2 mM L-glutamin, 1%antibiotik,

antimikotik (konsentrasi akhir: penisilin 100 µg/mL, streptomisin 100 g/mL, dan

amfoterisin B 0,25 µg/mL). Sel pada tahap 6 yang digunakan dalam percobaan

yang ini. Dari material anyaman dan strip nanofibrous electrospun dalam jumlah

besar, piringan wadah kecil dengan luas sekitar 0,3 cm2 cocok untuk kultur sel dan

percobaan penyemaian. Wadah awalnya direndam dalam etanol 70% selama 1

jam, kering, dan disterilkan di bawah sinar UV selama 6 jam di setiap sisi, dan

sebelumnya dibasahi dengan merendam dalam medium kultur sel lengkap dengan

serum selama 48 jam untuk meningkatkan adsorpsi protein. Untuk pembenihan

hMSCs ke wadah nanofiber PCL, sel dipipet langsung ke wadah dengan

kepadatan sel 7,5 x 104 sel/cm2. Medium kultur ditambahkan dan untuk

pembiakan jangka panjang, diganti setiap 2 sampai 3 hari.

29

2.3.3 Pengamatan Microscopy Laser Confocal dan Analisis Orientasi

Sampel diamati pada hari pertama (24 jam setelah pembibitan awal sel

induk ke wadah), dan kemudian pada hari-hari 4, 8, 12, 15, dan 18. Untuk analisis

sel orientasi, satu set sampel diwarnai dengan CellTracker CMFDA (15 µM, 5-

chloromethylfluorescein diasetat, Probe Molekuler Invitrogen, Carlsbad,

California) untuk pengamatan fluoresensi dan difiksasi dalam cairan formalin

fosfat buffered saline 3,7% (PBS) untuk memastikan bahwa arah dan morfologi

sel berada tetap stabil selama pencitraan. Rasio sinyal-suara yang kuat

memungkinkan analisis gambaran kuantitatif terpercaya dari orientasi sel.

Pengamatan confocal mikroskop multiphoton/laser (Radiance 2000, Bio-Rad,

Hercules, California) dan Nikon TE2000-S mikroskop inversi dengan 20x sasaran

Plan Apo (NA = 0,75) digunakan untuk menghasilkan gambar. Sementara

fluoresensi sel yang diwarnai dengan CMFDA terdeteksi, nanofibers PCL sendiri

digambarkan dalam modus refleksi [49]. Bergantian antara mode fluorosensi dan

refleksi, sel dan nanofibers dari area yang sama pada sampel dapat dicitrakan.

Gambar diambil dari setidaknya lima gambaran yang berbeda dan dipilih secara

acak pada setiap sampel pada titik kultur sel yang berbeda dari hari 1 sampai hari

18. Dengan menggunakan analisis pencitraan, orientasi dan serabut sel dengan

mengikuti petunjuk (misalnya, sumbu horisontal) dihitung untuk setiap tampilan

pencitraan. Pengukuran orientasi sel difasilitasi oleh bentuk memanjang dari

hMSCs, yang menampilkan sumbu utama yang jelas.

2.3.4 Viabilitas dan Visualisasi Fluoresensi hMSC

Sampel diwarnai menggunakan uji viabilitas sel (Probe Molekuler). Secara

singkat, calcein AM (2 µM) berdifusi melintasi membran sel hidup dan bereaksi

dengan esterase intraseluler untuk memancarkan fluoresensi hijau, sementara

etidium homodimer-1 (4µM) hanya dapat masuk ke sel mati dengan membran sel

yang rusak dan memancarkan fluoresensi merah ketika berikatan dengan asam

nukleat. Untuk setiap sampel, jumlah sel dan persentase sel hidup dan mati

ditentukan dari setidaknya tiga area yang dipilih secara acak.

30

Mikrofilamen diwarnai menggunakan rhodamine-phalloidin (170 nM, Probe

Molekuler). Sampel dari hari 4 dan 18 dipilih untuk pewarnaan microfilament dan

difiksasi dalam larutan formaldehida PBS 3,7%. Untuk permeabilisasi membran

sel, sampel ditempatkan pada Triton X-100 0,5% dalam larutan PBS selama 5

menit pada suhu 4° C dan dicuci tiga kali dengan PBS. Untuk menahan daerah

ikatan non spesifik, sampel sebelumnya diinkubasi dengan BSA 1% selama 30

menit dan dicuci tiga kali dengan PBS. Filamen aktin diwarnai semalaman dengan

rhodamine-phalloidin dalam BSA 1%. Adhesi struktur khas hMSC-nanofiber

ditemukan dan selanjutnya diperiksa menggunakan mikroskop perbesaran tinggi.

2.3.5 Statistik

Untuk setiap gambaran sel yang disemai pada sampel wadah berorientasi

nanofibrous hari 1, 4, 8, 12, 15, dan 18, arah sudut rata-rata sel dan arah sudut

rata-rata serabut sehubungan dengan arah petunjuk dihitung. Perbedaan antara dua

kuantitas menentukan sudut relatif sel-nanofiber. Selain itu, distribusi sudut relatif

sel yang mengikuti sudut rata-rata arah serabut rata-rata yang diperoleh untuk tiga

gambaran pada setiap sampel wadah. Ketiga distribusi dianalisis secara statistik

dengan uji dua sisi t dan varians Student’s tidak ditentukan signifikan secara

statistik (p> 0,05). Oleh karena itu, dengan menggabungkan data dari tiga

gambaran terpisah, distribusi secara keseluruhan dibentuk setiap hari. Sudut rata-

rata sel-serat relatif diperoleh bersama dengan standar deviasi yang sesuai untuk

setiap hari. Rata-rata sudut relatif sel-serat 10o atau kurang mengisyaratkan

keselarasan paralel sel dengan arah nanofibers di dasarnya. Mengenai wadah

nanofibrous acak, semua nilai dalam distribusi sudut sel-nanofiber memiliki

probabilitas yang sama dan karena itu nilai sudut rata-rata tidak dapat ditentukan.

Meskipun demikian, distribusi sel-nanofiber sudut dalam wadah nanofibrous acak

dapat secara kualitatif dibandingkan dengan wadah nanofibrous yang terorientasi.

31

2.4 HASIL DAN PEMBAHASAN

2.4.1 Karakterisasi Wadah Nanofibrous PCL Electrospun

Pencitraan SEM dilakukan untuk mengamati struktur morfologi nanofibers

masing-masing pada dua jenis wadah (acak atau terarah). Wadah acak (Gambar

2.7a) terbukti terdiri dari nanofibers yang tidak memiliki arah yang ditentukan.

Sebaliknya, wadah terarah (Gambar 2.7b) menunjukkan nanofibers dengan arah

yang ditentukan (pada kasus ini utara-selatan). Mayoritas nanofibers dalam wadah

yang berorientasi selaras satu sama lain. Diameter rata-rata nanofiber diperkirakan

sekitar 820 ± 340 nm. Berdasarkan gambaran SEM, porositas wadah jenis ini

yang cocok untuk adhesi, proliferasi, dan kelangsungan hidup sel.

(a)(b)

Gambar 2.7 SEM gambar nanofibers PCL dalam (a) acak dan (b) wadah PCL

terarah. Gambaran putih terlihat di kedua frame fragmen PCL yang berasal dari

pembentukan kerak polimer di pintu keluar nosel aparat electrospinning.

2.4.2 Arah Sel dan Nanofibers pada Wadah Acak dan Terarah

hMSCs dan nanofibers dicitrakan secara bersamaan oleh pengamatan

microskopi laser confocal (LSCM) untuk mengetahui pengaruh arah electrospun

nanofiber PCL pada barisan sel. Gambar 2.8 menampilkan gambar superimpose,

pseudocolored dari hMSCs (hijau) dan nanofibers (merah) pada (a1) acak dan

(b1) wadah nanofibrous berorientasi PCL setelah kultur sel 1 hari. Ketika gambar

superimpose jelas terlihat bahwa hanya setelah 24 jam inkubasi, ada perbedaan

32

yang signifikan dalam orientasi hMSCs dikultur di atas wadah acak dibandingkan

dengan bahwa pada wadah berorientasi. Sudut orientasi hMSCs terhadap sumbu

horisontal ditentukan untuk sampel wadah acak dan berorientasi. Histogram

mewakili distribusi sudut orientasi hMSC setelah kultur sel 1 hari ditampilkan di

bar hijau grafik Gambar 2.8. Sebagaimana yang dijabarkan oleh distribusi terbatas

sudut sel ditunjukkan pada histogram Gambar 2.8b2 (standar deviasi 16°), hMSCs

diinduksi agar sesuai pada wadah nanofibrous berorientasi. Selanjutnya, deretan

sel pada wadah berorientasi hampir serupa dengan wadah nanofiber terarah

(Gambar 2.8b3), dimana standar deviasi dari distribusi sudut nanofiber adalah

15°. Di sisi lain, penyemaian sel di wadah nanofibrous acak selama 24 jam tidak

menunjukkan arah sel yang diharapkan (Gambar 2.8a1), dipastikan oleh besarnya

sudut distribusi di histogram 2.8a2 Gambar. Demikian juga, di wadah nanofibers

acak juga menunjukkan distribusi sudut yang besar (Gambar 2.8a3).

Arah hMSCs dan nanofibers pada setiap jenis wadah setelah kulturasi yang

lebih lama dari 18 hari sangat mirip dengan yang ditemukan setelah kulturasi sel

hari pertama. Hasil hari ke-18 ditampilkan dalam Gambar 2.9. hMSCs yang

dikultur pada wadah nanofibrous terarah (Gambar 2.9b1) selama 18 hari terus

mempertahankan tingkat yang sangat baik dari deretan sel berbentuk bola. Hal ini

ni dikonfirmasi lagi oleh histogram untuk deretan sel spasial pada wadah terarah

(Gambar 2.9b2) dan nanofiber terarah (Gambar 2.9b3); keduanya menunjukkan

distribusi sudut yang terbatas (standar deviasi 20° dan 32°, masing-masing) dan

korespondensi yang baik satu sama lain. hMSCs yang dikultur pada wadah terarah

menunjukkan morfologi yang lebih tipis dan lebih memanjang secara kualitatif

dibandingkan sel yang dikultur pada wadah acak, menunjukkan bahwa bentuk sel

mungkin telah terpengaruh oleh susunan struktur nanofiber. Mirip dengan hasil

yang diperoleh setelah 1 hari masa inkubasi, hMSCs yang dikultur di wadah acak

setelah 18 hari (Gambar 2.9a1) tidak menunjukkan arah sel yang signifikan dan

mempertahankan distribusi sudut orientasi sel yang lebih luas, lebih dari 180°

(Gambar 2.9a2), yang berkorelasi dengan distribusi dari sudut orientasi nanofiber

acak (Gambar 2.9a3). Harus dicatat, bahwa bagaimanapun,setelah 18 hari kultur

sel, hMSCs muncul untuk menunjukkan beberapa bidang self-alignment "Lokal"

33

di wadah acak. Seperti yang terlihat di bagian kiri bawah Gambar 2.9a, beberapa

sel tampaknya menunjukkan orientasi sesuai arahan, seperti ditegaskan oleh

bagian berbentuk lonceng dari distribusi sudut sel yang sesuai di Gambar 2.9a2.

Temuan ini berkaitan dengan proliferasi dan konfluen kultur sel daripada deretan

sel diarahkan oleh nanofibers di dasarnya. Kumpulan hMSCs lokal ini, yang

terjadi meskipun keacakan dari serabut yang mendasari, tidak memiliki ciri

susunan berbentuk bola yang dilihat pada wadah berorientasi (Gambar 2.9b1).

Tetapi, kurangnya kontrol atas sel orientasi-meskipun dengan skala lokal-

menyebabkan efek lokal ini berarti mempengaruhi keseluruhan hasil dari

percobaan ini, yaitu, untuk menyesuaikan sel secara global dan terkendali.

Gambar 2.8 (Lihat sisipan warna halaman 206.) Gambar superimpose dan

pseudocolored hMSCs (hijau) dan nanofibers (merah) dalam (al) dan acak (b1)

wadah nanofibrous PCL terarah setelah 24 jam kultur sel. Histogram mewakili

34

distribusi sudut arah sel dengan terhadap sumbu horisontal hMSCs pada (a2)

wadah acak dan (b2) terarah. Histogram menggambarkan distribusi sudut orientasi

nanofiber dengan arah horisontal untuk (a3) wadah acak (b3) dan berorientasi.

Histogram pada (a2) dan (a3) dibangun berdasarkan ukuran 127 sel dan 234

nanofibers, sedangkan 124 sel dan 242 nanofibers digunakan untuk membuat

histogram dalam (b2) dan (b3), masing-masing.

Gambar 2.9 Gambar superimpose dan pseudocolored hMSCs (terang) dan

nanofibers (gelap) dalam (al) wadah nanofibrous PCL acak (bi) dan beriorentasi

setelah 18 hari kultur sel. Histogram mewakili distribusi sudut orientasi sel

35

dengan terhadap sumbu horisontal untuk hMSCs pada wadah (a2) acak (b2) dan

berorientasi. Histogram menunjukan distribusi sudut orientasi nanofiber dengan

terhadap sumbu horisontal untuk wadah (a3) acak (b3) dan berorientasi.

Histogram di (a2) dan (a3) dibuat berdasarkan pengukuran dari 132 sel dan 194

nanotibers, sedangkan 138 sel dan 258 nanofibers digunakan untuk membangun

histogram dalam (b2) dan (b3), masing-masing.

2.4.3 Kesejajaran hMSC Konsisten Jangka Panjang dalam Wadah

Nanofibrous Terarah

Efektivitas wadah nanofibrous PCL terarah dalam meningkatkan barisan sel

dari penyemaian hMSCs ini dianalisis secara kuantitatif pada waktu yang berbeda.

Distribusi sudut relatif sel ditentukan untuk wadah berorientasi dengan

mengurangi sudut rata-rata nanofiber dari distribusi sudut, sel dan menentukan

sudut rata-rata relatif sel-serat pada setiap titik waktu. Hasil untuk sampel yang

dibiakkan dari hari ke-1 sampai hari ke-18 yang digunakan sebagai ukuran untuk

menilai efikasi dan pengaruh waktu terhadap perubahan deretan hMSC. Seperti

ditunjukkan dalam Gambar 2.10, untuk semua sampel wadah nanofibrous

berorientasi dari hari 1 sampai hari ke-18, sudut sel relatif sekitar ± 10°. Oleh

karena itu, keakuratan dan konsisten keselarasan sel pada wadah nanofibrous

berorientasi ditetapkan untuk kulturasi awal dan jangka panjang. Dari hari ke-1

hingga hari ke-18, standar deviasi distribusi sudut relatif sel-serat untuk wadah

nanofibrous berorientasi tetap pada kisaran 15° - 30 °, dengan semua nilai rata-

rata harian dalam satu standar deviasi dari sudut referensi umum dari 0 °

(keselarasan sempurna). Hal ini menunjukkan bahwa lampiran hMSC awal untuk

wadah nanofibrous bertahan untuk periode inkubasi 18 hari.

36

Gambar 2.10 Kesesuaian hMSC sementara pada wadah nanofibrous berorientasi.

Analisis uji t (dua-sisi, tidak berpasangan) menunjukkan bahwa setidaknya tiga

gambaran dari setiap wadah nanofibrous setiap hari secara statistik tidak

signifikan (p> 0,05), dan sudut rata-rata orientasi relatif sel dan deviasi standar

yang ditentukan untuk yang sampel wadah nanofibrous berorientasi pada hari ke-

1, 4, 8, 12, 15, dan 18. Rata-rata sudut relatif sel-serat pada wadah nanofibrous

berorientasi setiap hari nya berkisar ± 10 °, menunjukkan keselarasan yang sangat

baik dengan nanofibers didasarnya. Garis kekeliruan menunjukkan dua standar

deviasi (± o).

2.4.4 Viabilitas hMSC dalam Wadah Nanofibrous PCL

Kelangsungan hidup jangka pendek dan jangka panjang dari kultur hMSCs

pada wadah acak dan terarah diuji dengan menggunakan alat tes fluoresensi

hidup/mati. Untuk setiap jenis wadah, jumlah sel-sel hidup dan mati dihitung dari

setidaknya tiga bidang sel biakan yang berbeda setelah 4 dan 18 hari. Persentase

sel hidup dari jumlah total sel dihitung dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 2.1.

Selanjutnya, dari jumlah total sel yang diamati, kepadatan rata-rata sel dihitung

dengan mengukur bidang dan ekstrapolasi data dalam satuan sel per sentimeter

persegi. Sebagian besar sel yang ditanam pada kedua jenis wadah yang hidup (>

70%), tetapi viabilitas mereka lebih rendah daripada yang sel dikultur diamati

dalam percobaan kontrol (misalnya, pada piring petridis). Persentase viabilitas sel

yang lebih rendah dapat dikaitkan dengan fakta bahwa kami menggunakan

37

hMSCs yang tidak berdiferensiasi tetapi tinggi proliferasi. Sebagai contoh,

meskipun kerapatan penyemaian awal hMSC sedang (7,5 x cells/cm2), hMSCs

cepat berkembang biak dan mengumpul. Seperti terlihat pada Tabel 2.1,

kepadatan sel pada kedua wadah nanofibrous, acak dan terarah, meningkat secara

signifikan dari hari ke hari ke-4 hingga ke-18, sedangkan persentase sel hidup

relatif tetap konstan. Karena PCL adalah bahan yang dikenal biokompatibel,

mungkin pengaruh untuk kelangsungan hidup hMSC lebih rendah. Sebaliknya,

dicurigai bahwa kepadatan penyemaian sel yang optimal bisa meningkatkan

viabilitas sel. Sebagai contoh, kepadatan awal penyemaian sel pada wadah

nanofibrous PCL telah terbukti menjadi faktor penting untuk viabilitas,

proliferasi, dan diferensiasi hMSC awal dan jangka panjang [20,21,38,50].

Diharapkan, bagaimanapun, bahwa ketika hMSCs diinduksi untuk berdiferensiasi

keturunan sel tertentu, penurunan proliferasi hMSC akan menghasilkan viabilitas

sel lebih baik. Selain tu, meskipun wadah nanofibrous electrospun yang

digunakan dalam percobaan ini disterilisasi dengan udara kering dan berikutnya

direndam dalam medium kultur sel, tidak ada wadah yang ditempatkan dalam

ruang vakum sebelum sterilisasi. Melakukan langkah ini dalam penelitian

selanjutnya harus menghilangkan pelarut organik sisa dari proses electrospinning

yang dapat merugikan kelangsungan hidup sel.

TABEL 2.1

Viabilitas hMSC yang Dinyatakan sebagai Persentasi Sel

Hidup dan Jumlah Total Sel yang Diperiksa

Hari Sampel % Hidup Sel yang dilihat /cm2

4 Acak

Terarah

76

80

7,0 x 104

11,6 x 104

8 Acak

Terarah

73

76

32,9 x 104

20,2 x 104

38

2.4.5 Reorganisasi Sitoskeletal dan Adhesi hMSC-Nanofiber

Elongasi sel yang disebabkan oleh nanofibers PCL diharapkan untuk

mengubah struktur sitoskeletal yang mengatur morfologi, adhesi, dan pergerakan

sel. Mikrofilamen dari hiMSCs dibiakan selama 4 hari pada wadah nanofibrous

PCL acak dan berorientasi pada kaca diwarnai fluoresens terang dengan

rhodamine-phalloidin dan dicitrakan menggunakan LSCM. hMSCs dikultur pada

substrat kaca menunjukan penyebaran morfologi sel yang khas dan diharapkan

(Gambar 2.lla). Serabut aktin yang besar terlihat dan bertanggung jawab untuk

adhesi hMSC yang lebih kuat pada substrat datar (2D) [51]. Banyak serat yang

tegang muncul untuk berkumpul dan berakhir pada satu titik yang sama pada

membran sel, dapat membentuk daerah titik kontak. Dibandingkan dengan

mikrofilamen yang ditemukan di kultur hMSCs pada substrat datar,susunan aktin

sitoskeletal diamati pada kultur hMSCs di atas wadah nanofibrous PCL acak dan

berorientasi jauh berbeda. Sebagai contoh, hMSCs yang ditanam pada wadah

nanofibrous acak dan berbudaya selama 4 hari (Gambar 2.11 ib) menunjukan

elongasi morfologi sel dan actins berkonsentrasi padat. Menariknya, struktur aktin

tipis berserat antara hMSCs dan nanofibers sekitarnya jelas, dan mudah terlihat

pada daerah yang dilingkari pada Gambar 2.l1b dengan panah menunjuk ke

nanofiber PCL berdekatan. Ketika hMSCs adalah disemai di wadah nanofibrous

PCL berorientasi, sel lebih memanjang dan sejajar di samping bundel nanofiber,

yang digambarkan juga dengan anak panah pada Gambar 2.llc. Actins pada

bderetan sel tersebut juga berkonsentrasi padat, dan bundel filamen aktin ada yang

sebagian besar berderet dalam arah yang sama dengan nanofibers berdekatan.

Bagaimanapun, lapisan tipis fibrous seperti struktur aktin menghubungkan hMSC

dengan bundel nanofiber disebelahnya juga diamati, terutama pada daerah yang

dilingkari dari Gambar 2.llc. Temuan ini mengarah pada gagasan mengenai

karakteristik unik ikatan hMSC ke nanofibers. Hasil kami, konsisten dengan

sebelumnya, menyatakan bahwa kultur sel otot polos pembuluh darah pada wadah

polimer nanofibrous juga mengembangkan hubungan fibrous yang serupa [1].

Perlu diingat, bagaimanapun, bahwa gambar yang dilaporkan memberikan bukti

kemungkinan adhesi Celi-nanofiber diperoleh dengan menggunakan SEM.

39

Sebaliknya, temuan kami menunjukkan bahwa tidak hanya koneksi fibrous yang

serupa yang ditemukan di interaksi hMSC-nanofiber, tetapi juga kemungkinan

keterlibatan filamen aktin dalam perkembangan unik struktur seperti adhesi ini.

Menarik juga untuk dicatat bahwa jaringan aktin padat diamati pada kultur MSCs

terelongasi pada wadah nanofibrous acak dan berorientasi yang muncul mirip

dengan sitoskeleton yang diamati dalam kondrosit artikular yang matang,

terutama pada permukaan artikular [52], menunjukkan bahwa penggunaan wadah

polimer nanofibrous berorientasi bisa menguntungkan untuk meniru jaringan

tulang rawan artikular lebih baik [19-21]. Karena rekayasa jaringan yang sukses

akan memerlukan bahwa konstruksi jaringan rekayasa meniru struktur mikro dan

nano, keselarasan spasial, dan fungsi dari jaringan alami, penggunaan wadah

nanofibrous yang optimal dikombinasikan dengan manipulasi hMSCs dapat

menghasilkan wadah biomimetik yang paling kompatibel.

Gambar 2.11 Gambaran fluorescent dari mikrofilamen hMSCs setelah 4 hari

kultur sel pada (a) permukaan kaca datar, dan (b) dalam wadah PCL acak (c) atau

40

berorientasi. Tidak ada adhesi fibrous seperti batas ditemukan ketika sel-sel

ditempatkan pada substrat khusus, tetapi perbatasan yang mengandung aktin

tampak, dibentuk oleh hMSC untuk melekat pada nanofibers. Struktur unik ini

akan diteliti lebih lanjut untuk menguji keberadaan adhesi protein seperti integrin

dan protein intraseluler lainnya.

2.5 KESIMPULAN

Dalam penelitian ini, teknik untuk penyelarasan nanofiber di electrospinning

telah dibahas dan digunakan dalam kultur sel induk. hMSCs berhasil dikultur pada

dua jenis wadah nanofibrous PCL electrospun. Orientasi sel terhadap jaringan

pendukung nanofiber dihitung. Efektivitas hMSCs untuk menyesuaikan arah

nanofibers terarah diamati. Kultur hMSCs pada wadah nanofibrous PCL

berorientasi menunukan deretan sel yang paling akurat dan konsisten. Viabilitas

sel diuji untuk memastika bahwa hMSCs yang layak dan berproliferasi pada

wadah nanofibrous PCL selama 18 hari kulturasi sel. Selain itu, perubahan aktin

sitoskeletal hMSC pada wadah nanofibrous diamati, dan keberadaan

mikrofilamen itu terungkap dalam adhesi serabut yang menyerupai batas yang

menghubungkan hMSCs dengan nanofibers yang berdekatan. Penelitian lebih

lanjut sedang dilakukan untuk menguji diferensiasi chondrogenic dari hMSCs

pada wadah nanofibrous PCL berorientasi dan efek dari berbagai diameter

nanofiber dan porositas wadah. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan

bahwa rekayasa lingkungan ECM yang terorientasi untuk mengatur keselarasan

jaringan dapat dioptimalkan oleh nanofibers electrospun oriented, dan bahwa

aplikasi rekayasa jaringan tertentu seperti membuat zona dangkal kartilago

artikular dapat meningkat secara signifikan dengan menggabungkan sel batang

dan nanomaterials.