LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOANALISIS

PERCOBAAN 4

PENETAPAN KADAR OBAT

DAN JUMLAH METABOLITNYA DALAM URIN

DISUSUN OLEH :

Ayu Mayangsari (G1F009022)

Rendi Nurhidayat (G1F009023)

Andardian WIdiniyah (G1F009024)

Kurnia Aulia K. (G1F009025)

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN

JURUSAN FARMASI

PURWOKERTO

2012

PERCOBAAN 4

PENETAPAN KADAR OBAT

DAN JUMLAH METABOLITNYA DALAM URIN

A. Tujuan

Melakukan penetapan kadar obat dalam urin dan menentukan jumlah

metabolitnya dalam urin.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah beaker glass, labu ukur, pipet

ukur, pipet tetes, gelas ukur, tabung reaksi, tabung sentrifuse, rak tabung reaksi,

jarum sonde, alat penampung urin tikus, plat KLT silika GF, Detektor UV 366

nm, spektrofotometer UV-Vis.

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah urin tikus, parasetamol tablet,

aquades, asam klorida 6 N, Natrium Nitrit 10%, Asam sulfanilat, dan NaOH 10%.

Fase gerak 1 = etil asetat-methanol-air-asam asetat (60:30:9:1), Fase gerak 2 = n-

butanol-asam asetat-air (4:1:1).

C. Prosedur Percobaan

a. Pembuatan Kurva Baku

Larutan baku paracetamol

dibuat seri konsentrasi (0,05;0,1;0,15;0,2;0,25)mg/ml

dilakukan preparasi sampel seperti pada penetapan kadar parasetamol

dibuat kurva baku hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi

HASIL

b. Penetapan Kadar parasetamol

sampel urin

diambil sebanyak 0,2 ml

dimasukkan dalam tabung reaksi

di add sampai 10 ml

disentrifuse selama 10 menit dgn kec. 2000

dipindahkan beningannya ke dalam tabung reaksi lain

ditambah HCl 6 N 0,5 ml dan NaNO3 10% sebanyak 1 ml

divortex selama 5 menit

ditambah 1 ml asam sulfanilat

ditambah 2,5 ml NaOH 10%

didiamkan selama 3 menit

diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum

HASIL

c. Penetapan Jumlah Metabolit dalam Sampel Urin

beningan Urin tikus yang diberi parasetamol hasil sentrifugasi

diambil

dilakukan uji KLT dua arah dengan kondisi percobaan :

fase diam silika gel G

fase gerak 1 = etil asetat-methanol-air-asam asetat (60:30:9:1), panjang elusi 6 cm

digunakan detektor UV 366 nm

diamati dan diukur bercaknya setelah proses elusi

digunting bercak larutan standarnya, dan diputar 90 ke kiri, dielusi dengan Fase gerak 2 = n-butanol-asam asetat-air (4:1:1).

digunakan detektor UV 366 nm

diamati dan diukur bercaknya setelah proses elusi

HASIL

D. Data Pengamatan

a. Pembuatan Kurva Baku

Panjang gelombang maksimum yang didapat = 424 nm

Larutan Baku

Konsentrasi Absorbansi

0,05 0,333

0,075 0,394

0,1 0,493

0,125 0,667

Dari hasil regresi linier

a= 0,0825

b= 4,44

r = 0,975

jadi, persamaan regresinya adalah Y = 0,0825 + 4,44 x

Hasil Kurva Baku

b. Penetapan Kadar Paracetamol

Sampel Urin

Kelompok absorbansi

A1 0,500

A2 0,209

A3 0,462

A4 0,425

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0,05 0,075 0,1 0,125

absorbansi

absorbansi

c. Penetapan Jumlah Metabolit dalam Sampel Urin

Jarak pelarut dari garis start ke garis finish = 6 cm

Jarak sampel dari garis start = 5,5 cm

Jarak standar paracetamol dari garis start = 5,5 cm

E. Perhitungan

a. Pembuatan larutan stok

Berat tablet 500 mg di add 50 ml

Konsentrasinya = 500 mg/50 ml

= 10 mg/ml

b. Dosis yang diberikan

150 mg/kg BB

BB tikus = 130 gram

c. Volume pemberian

= 2 ml

d. Larutan stok 10 mg/ml

Dibuat 0,06 mg/ml

M1xV1 = M2xV2

10xV1 = 0,25x25

V1 = 0,625 add 25 ml

e. Kadar sampel urin (larutan standar y=0,0864+4,404x)

A4 0,425 = 0,0864+4,404x

4,404x=0,425-0,0864

4,404x=0,3386

x=0,0769 . 5 . 2

x=0,769 mg/ml

f. Fase gerak 1

g. Fase gerak 2

Rata-rata Rf = 0,762

F. Pembahasan

Monografi Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

a. Paracetamol

Nama resmi : Acetaminophenum

Nama lain : Paaracetamol

RM / BM : C8H9NO2 / 151,56

Pemerian : Hablur atau hablur serbuk putih, tidak berbau,rasa

pahit.

Kelarutan : Larut dalam 70 bagian air, dlam 7 bagian etanol95 %

p, dalam 17 bagian aseton p, dalam 40 bagian gliserol.

Khasiat : Analgetikum antipiretikum.

Kegunaan : Sebagai sampel.

Persyaratan kadar : Mengandung tidk kurang dari 98 % dan tidak

lebih dari 101,0 % C8H9NO2 dihitung terhadapzat

yang telah dikeringhkan.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

(Anonim,1995)

b. Asam klorida

HCl ; BM 36,46;

Cairan tidak berwarna sampai dengan kuning pucat

murni pereaksi, mengandung 36% b/b HCl

c. Natrium Nitrit

Larutan natrium nitrit P10 % b/v yang dibuat segar (Anonim, 1995).

d. Asam sulfanilat

Sinonim

Asam 4-Aminobenzensulfonat; Asam p-Anilinsulfonat

Formula : (H2N)C6H4SO3H

Berat Molekul : 173,19

Toksisitas : LD50 pemberian secara oral pada tikus: 12300 mg/kg

Bentuk Fisik : Serbuk halus abu-abu

Titik Leleh : 288 C

Kelarutan dalam Air : 1 g / 100 ml

Aplikasi

Asam sulfanilat adalah serbuk halus atau kristal abu-abu; agak larut dalam

air, alkohol dan eter, larut dalam air panas dan HCl pekat, hangus pada suhu

288 - 300 C. Asam sulfanilat adalah hasil sulfonasi dari anilin. Anilin adalah

bahan baku dalam industri penghasil bahan pewarna celup. Asam sulfonat

dan garam-garamnya yang terkandung dalam bahan pewarna celup organik

memberikan fungsi yang berguna pada kelarutan dalam air dan atau

meningkatkan kecepatan pencucian bahan pewarna yang disebabkan karena

kemampuan keduanya mengikat lebih rapat dengan kain. Asam sulfanilat

dipakai sebagai perantara untuk pewarna (bahan pewarna celup, pewarna

makanan, bahan pencemerlang), obat dan sintesis organik lainnya. Asam

sulfanilat adalah komponen dari reagen Griess untuk menentukan HNO2.

Asam sulfanilat diubah menjadi sulfanilamid yang merupakan satu dari

bahan-bahan dasar untuk memproduksi obat-obat sulfa antibakteri. Asam

sulfanilat mempunyai isomer yaitu asam metanilat, gugus sulfonat terletak di

posisi 2. Senyawa tersebut digunakan dalam pembuatan bahan pewarna celup

azo dan sintesis obat-obat sulfa (Satrya, 2011)

e. Natrium Hidroksida (NaOH)

Rumus molekul : NaOH

Berat molekul : 40,0 g/mol.

NaOH mengandung : tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 100,5%

alkali jumlah, dihitung sebagai NaOH, mengandung Na2CO3 tidak lebih dari

3,0%.). NaOH dapat merusak jaringan dengan cepat.

Pemerian : putih atau praktis putih, massa melebur, berbentuk

pellet, serpihan atau batang atau bentuk lain, keras, rapuh dan menunjukkan

pecahan hablur. Bila dibiarkan di udara akan cepat menyerap karbon dioksida

dan lembap. NaOH mudah larut dalam air dan dalam etanol.

Kelarutan : mudah larut dalm air dan dalam etanol

Wadah dan penyimpanannya : dalam wadah tertutup rapat (Anonim, 1995).

f. Aquades

Rumus molekul :H2O

Berat molekul : 18,02 g/mol

Air murni adalah air yang dimurnikan yang diperoleh dengan destilasi,

perlakuan menggunakan penukar ion, osmosis balik atau proses lain yang

sesuai. Dibuat dari air yang memenuhi persyaratan air minum dan tidak

mengandung zat tambahan lain. Densitas 0,998 g/cm dalam fase cairan dan

0,92 g/cm dalam fase padatan. Titik leburnya 0 C (273,15 K) (32 F) dan

titik didihnya 100 C (373.15 K) (212 F).

Pemeriaan : cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau dengan pH

antara 5,0 - 7,0.

Wadah dan penyimpanannya : dalam wadah tertutup rapat ( Anonim, 1995).

g. Etil asetat

CH3COOC2H5; BM : 88,11; murni pereaksi. (Anonim, 1995)

Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus

CH3CH2OC(O)CH3. Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam

asetat. Senyawa ini berwujud cairan tak berwarna, memiliki aroma khas.

Senyawa ini sering disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan OAc

mewakili asetat. Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai pelarut.

Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatil (mudah

menguap), tidak beracun, dan tidak higroskopis. Etil asetat merupakan

penerima ikatan hidrogen yang lemah, dan bukan suatu donor ikatan hidrogen

karena tidak adanya proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat

pada atom elektronegatif seperti flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat

melarutkan air hingga 3%, dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu

kamar. Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih tinggi. Namun

demikian, senyawa ini tidak stabil dalam air yang mengandung basa atau

asam. Murni digunakan sebagai pereaksi.

h. Metanol

Metil alkohol P; CH3OH; BM 32,04; murni pereaksi (Anonim, 1995)

i. N-butanol

n-Butanol C4H9OH

j. Urin

Urin atau air kencing merupakan salah satu sisa metabolisme tubuh yang

dapat memberikan gambaran keadaan kesehatan tubuh kita. Mungkin tanpa

sadar kita sering memperhatikan bahwa urin yang kita keluarkan terkadang

jernih tetapi dilain waktu keruh atau bahkan berwarna gelap. Sebenarnya

perubahan yang terjadi menunjukkan keadaan sistem metabolisme didalam

tubuh kita. Pemeriksaan urin bisa memberikan gambaran tentang fungsi

ginjal, saluran kemih baik bagian atas maupun bagian bawah, fungsi hati,

infeksi pada saluran kemih dan lain-lain. Pemeriksaan urin lebih banyak

dilakukan sebagai pemeriksaan skrining suatu penyakit karena biaya

pemeriksaannya relatif lebih murah daripada pemeriksaan darah atau cairan

tubuh lainnya (Anonim, 2012).

Prinsip kerja Spektrofotometer UV-Vis dan KLT yang digunakan dalam analisis

adalah :

Prinsip Spektrofotometri UV/Vis

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu

sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan

spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan

spektrofotometri. Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer,

yaitu :

A = log ( Io / It ) = a b c

Keterangan : Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorptivitas

b = Panjang sel/kuvet

c = konsentrasi (g/l)

A = Absorban

Spektrofotometri dapat dibayangkan sebagai suatu perpanjangan dari

penilikan visual dimana studi yang lebih terinci mengenai pengabsorpsian energi

cahaya oleh spesies kimia memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam

pencirian dan pengukuran kuantitatif. Dalam penggunaan dewasa ini istilah

spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya pengabsorpsian energi cahaya

oleh suatu sistem kimia itu sebagai fungsi dari panjang gelombang radiasi,

demikian pula pengukuran pengabsorpsian yang menyendiri pada suatu panjang

gelombang tertentu ( Underwood, 1995).

Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV tampak. Oleh

karena mereka mengandung electron, baik yang dipakai bersama maupun tidak

yang dapat dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi (Underwood, 1986).

Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi

radiasi elektromagnet. Cahaya terdiri dari radiasi terhadap mana mata manusia

peka, gelombang dengan panjang berlainan akan menimbulkan cahaya yang

berlainan sedangkan campuran cahaya dengan panjang-panjang ini akan

menyusun cahaya putih. Cahaya putih meliputi seluruh spektrum nampak 400-

760 nm. Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode ini

memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang

sangat kecil (Anonim, 1979).

Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari

tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan

elektron tidak diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan

tereksitasi singlet. Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang

terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari

spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur

intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi,

spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif. Jika energi

tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spectrum

tampak yang kontinyu, monokromator. Sel pengabsorpsi untuk larutan sampel

atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan

blanko ataupun pembanding (Khopkar,1990).

Syarat syarat analisis dengan spektrofotometer UV Vis

a. Larutan harus berwarna atau mengandung senyawa organic tak jenuh

b. Sinar harus monokromatis

c. Larutan harus jernih (tidak keruh)

d. Pelarut tidak boleh bereaksi secara kimia dengan sampel yang dianalisis.

Pemilihan pelarut

a. Dapat melarutkan cuplikan

b. Dapat meneruskan sinar dari panjang gelombang yang dipakai (tidak boleh

menyerapnya.

c. Tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkojugasi pada struktur

molekulnya

d. Tidak berwarna

e. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisisf.

Kemurniannya harus tinggi

g. Polaritasnya disesuaikan dengan senyawa yang dianalisis.

Komponen dari spektrofotometer adalah :

a. Monokromator

Berfungsi untuk mendapatkan radiasi monokromatis. Terdiri dari :

- Celah masuk, berperan penting dalam terbentuknya radiasi monokromatis

dan resolusi panjang gelombang

- Filter, berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya

yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang

gelombang yang dipilih

- Prisma, berfungsi untuk mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar

mungkin supaya didapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis

- Kisi, fungsinya sama seperti prisma, namun karena bentuk kisi adalah

konkaf, maka dapat memberikan resolusi radiasi yang lebih baik.

Spektrofotometer UV Vis modern menggunakan prisma dan kisi

sekaligus

- Celah keluar, tempat keluarnya sinar monokromatis yang selanjutnya akan

diteruskan menuju sampel

b. Sel atau kuvet

Sel atau kuvet adalah tempat sampel, harus terbuat dari bahan yang tembus

radiasi pada panjang gelombang yang akan digunakan untuk pengukuran

absorbansi

1) Berdasarkan pemakaiannya ada dua kuvet:

Kuvet permanen dibuat dari bahan gelas atau leburan silika

Kuvet dispossable dibuat dari teflon atau plastik

2) Berdasarkan bahannya ada dua macam kuvet :

Kuvet dari silica, dapat dipakai untuk analisis kuantitatif dan kualitatif

pada daerah pengukuran 190 1100 nm

Kuvet dari gelas, dapat dipakai untuk analisis kuantitatif dan kualitatif

pada daerah pengukuran 380 1100 nm, karena bahan dari gelas dapat

mengabsorpsiradiasi UV

3) Berdasarkan penggunaannya ada dua macam kuvet :

kuvet bermulut sempit, untuk mengukur kadar zat alam pelarut yang

mudah menguap

Kuvet bermulut lebar, untuk mengukur kadar zat alam pelarut yang tidak

mudah menguap.

4) Cuvet harus memenuhi syarat- syarat sebagai berikut :

a. Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya.

b. Permukaannya secara optis harus benar- benar sejajar.

c. Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan- bahan kimia.

d. Tidak boleh rapuh.

e. Mempunyai bentuk (design) yang sederhana

c. Detektor

1) Syarat detektor yang baik :

- Harus punya kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang diterima

- Harus memberikan noise yang sangat minim, sehingga mampu mendeteksi

intensitas sinar yang rendah

- Harus mampu memberi respon terhadap radiasi pada daerah panjang

gelombang yang lebar

- Harus memberi respon terhadap radiasi dalam waktu yang serempak

- Harus memberikan jaminan terhadap respon kuantitatif

- Sinyal elektronik yang diteruskan oleh detektor harus dapat diamplifikasikan

oleh amplifier ke recorder

Spektrofotometer UV-Vis dibagi menjadi :

a. Spektrofotometer single beam (berkas tunggal)

Pada spektrofotometer ini hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan

melalui cuvet. Blanko, larutan standar dan contoh diperiksa secara bergantian.

b. Spektrofotometer double beam (berkas ganda)

Pada alat ini sinar dari sumber cahaya dibagi menjadi 2 berkas oleh cermin yang

berputar (chopper).

- Berkas pertama melalui cuvet berisi blanko

- Berkas kedua melalui cuvet berisi standar atau contoh Blanko

Blanko berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat perubahan voltase atau IO

dari sumber cahaya. Dengan adanya blanko dalam alat kita tidak lagi

mengontrol titik nolnya pada waktu-waktu tertentu, hal ini berbeda jika pada

single beam.

Prinsip Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi merupakan metode yang digunakan secara luas yang

memungkinkandilakukannya pemisahan, identifikasi dan determinasi dari

senyawa kimia dalam campuran yangkompleks. Metode kromatografi

menggunakan fase stasioner ( diam ) dan fase gerak. Komponensebuah campuran

dibawa melalui fase stasioner oleh aliran fase gerak, dan pemisahan

didasarkanpada perbedaan kecepatan migrasi diantara komponen-komponen fase

gerak ( Skoog et al.,1996 ).

Proses kromatografi lapis tipis dilakukan pada plat gelas yang dilapisi dengan

lapisanyang tipis dan adheren. Lapisan ini berfungsi sebagai fase stasioner. Fase

stasioner berupa silika memiliki permukaan yang bersifat polar,

karenapermukaannya memiliki gugus hidroksida. Keberadaan gugus hidroksida

ini menyebabkan platsilika dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-

senyawa yang bersesuaian ( bersifatpolar ) contohnya air. Pelarut yang digunakan

berfungsi sebagai fase gerak. Campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada

fase stasioner.Fase stasioner diletakkan dalam bejana yang berisi fase gerak.Fase

gerak akan bergerak melalui fase stasioner berdasarkan pada prinsip kapilaritas.

Komponen-komponen campuran akan dibawa melalui fase stasioner oleh fase

gerak. Setelah proses kromatografi selesai, fase stasioner dipindahkan dari bejana

berisi pelarut dan dikeringkan. Letak komponen-komponen dapat ditentukan

dengan berbagai macam cara. Proses menganalisa hasil kromatografi pada plat

tipisini disebut visualisasi ( Skoog et al., 1996 ). KLT digunakan secara luas untik

analisis solut-solut organik terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinik,

forensik, baik untuk analisis kualitatif dengan cara membandingkan nilai Rf solut

dengan nilai Rf senyawa baku atau untuk analisis kualitatif (Gandjar, 2007).

Penggunaan umum KLT adalah untuk :

- Menentukan banyaknya komponen dalam campuran

- Identifikasi senyawa

- Memantau berjalannya suatu reaksi

- Menentukan efektifitas pemurnian

- Menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom

- Untuk memantau kromatografi kolom

- Melakukan screening sampel untuk obat (Gandjar, 2007)

Penggunaan KLT pada beberapa macam analisis :

1. Analisis Kualitatif

KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada

KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatan

identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang

sama (Gandjar, 2007)

2. Analisis Kuantitatif

Ada 2 cara yang digunakan untuk analisis kuantitatif dengan KLT. Pertama,

bercak diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau

dengan teknik densitometri. Cara kedua dalah dengan mengerok bercak lalu

menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode

analisis yang lain, misalkan dengan spektrofotometri (Gandjar, 2007)

3. Analisis Preparatif

Analisis preparatif ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah yang

banyak lalu senyawa yang telah dipisahkan ini dianalisis lebih lanjut, misalkan

dengan spektrofotometri atau dengan teknik kromatografi lain (Gandjar, 2007).

Langkah langkah dalam menganalisis :

Praktikum kali ini adalah uji analisis parasetamol dalam cairan hayati. Hal

pertama yang kami lakukan adalah pemberian parasetamol pada tikus yang

dilakukan satu hari sebelum pelaksanaan praktikum. Pemberian parasetamol

dengan dosis 19,5 mg bertujuan untuk menginduksi tikus dengan BB 130 gram

agar bisa menghasilkan urine. Kemudian untuk keesokan harinya, urine tikus

yang dihasilkan ditampung guna dilakukannya analisis lebih lanjut. Urine tikus

tersebut dikumpulkan dalam tabung reaksi dan ditetesi dengan TCA yang

berfungsi sebagai antikoagulan. TCA digunakan untuk untuk menghentikan

jalannya reaksi hidrolisis dengan cara mendenaturasi enzim karena sifat TCA

adalah asam yang digunakan untuk mengendapkan protein dalam darah. Pada

praktikum kali ini, TCA tidak diberikan karena bahan yang tersedia di

laboratorium terbatas sehingga proses penghilangan protein tidak kami lakukan.

Selanjutnya dilakukan proses sentrifugasi. Sentrifugasi ini bertujuan untuk

memisahkan campuran heterogen dengan berat jenis berdekatan yang sulit untuk

dipisahkan.

a. Pembuatan kurva baku

Kurva baku dibuat dengan mengambil larutan stok dengan konsentrasi

10mg/ml sebanyak 0,625 ml dan di add dengan 25 ml aquades. Kemudian

dibuat dalam berbagai konsentrasi, yaitu : 0,05;0,075;0,1;0,125. Dan diukur

absorbansinya pada spektrofotometer. Hasilnya adalah :

Konsentrasi Absorbansi

0,05 0,333

0,075 0,394

0,1 0,493

0,125 0,667

Dari hasil regresi linier didapatkan :

a= 0,0825

b= 4,44

r = 0,975

jadi, persamaan regresinya adalah Y = 0,0825 + 4,44 x

b. Penetapan kadar parasetamol dalam urin

Tahapannya adalah proses pencampuran urin dengan HCl 6N sebanyak 0,5 ml

dan NaNO2 10% sebanyak 1 ml. Penambahan HCl ini berfungsi untuk mengubah

suasana menjadi asam dan penambahan NaNO2 berfungsi dalam proses

penetapan gugus amino aromatis untuk penetapan semua senyawa-senyawa yang

mengandung gugus amino aromatis dalam reaksi diazotasi (Harjadi,1986).

Reaksi yang terjadi antara HCl dan NaNo2 adalah:

HCl (aq) + NaNO2 (aq) HNO2 (aq) + NaCl (aq) (Lehninger, 1998)

Dengan persyaratan tertentu, reaksi di atas bersifat kuantitatif sehinggadapat

digunakan sebagai dasar penetapan kadar senyawa-senyawa yang mempunyai

gugus amina aromatis primer bebas atau senyawa-senyawa yang dapat

menghasilkan gugus tersebut. Persyaratan tersebut antara lain : suhu yang

digunakan harus rendah (dibawah 15C), sebab pada suhu yang lebih tinggi

garam diazonium yang terbentuk tidak stabil dan akan terhidrolisis menjadi fenol

dan gasnitrogen, disamping itu di khawatirkan pada suhu yang lebih tinggi asam

nitrit akan lebih cepat terurai (Mursyidi dan Rohman,2006).

Selanjutnya, selama 5 menit maka asam sulfanilat sebanyak 1 ml

ditambahkan. Asam sulfanilat ini berfungsi untuk memberikan warna dalam

proses spektrofotometri. Reaksi yang terjadi adalah :

(Mursyidi & Rohman, 2006)

Dilakukan penambahan NaOH 10% sebanyak 2,5 ml untuk menambah suasana

alkali dan didiamkan selama 3 menit. Reaksi yang terjadi adalah:

2 H+

(aq) + NaOH (aq) Na+ (aq) + H2O (l)

Hasil absorbansi yang didapat dari penetapan kadar parasetamol adalah

Dari hasil regresi linier larutan baku :

a= 0,0825

b= 4,44

r = 0,975

jadi, persamaan regresinya adalah Y = 0,0825 + 4,44 x

Didapatkan nilai Absorbansi sampel (A4) = 0,425

0,425 = 0,0864+4,404x

4,404x=0,425-0,0864

4,404x=0,3386

x=0,0769 . 5 . 2

x=0,769 mg/ml

Jadi, kadar parasetamol yang ada pada sampel urin adalah 0,769 mg/ml.

c. Penetapan jumlah metabolit dalam sampel urin

Tahapan tahapan dalam penetapan kadar obat dan jumlah metabolitnya

dalam urin adalah sebagai berikut:

1. Persiapan Sampel

Urin tikus diambil,yang sebelumnya diberi parasetamol dengan dosis 150

mg/kg BB yang telah ditampung selama 24 jam. Lalu urin yang sudah ditampung

dipisahkan dari kotoran-kotoran yang ada termasuk pakannya ,kemudian

dilakukan pengenceran dan uji KLT dua arah.

2. Penotolan Sampel

Disiapkan lempeng KLT lalu dipotong dengan lebar 7 cm, panjang 7 cm,

garis start dibuat setinggi 0,5 cm dari tepi bawah dan garis front 0,5 cm dari tepi

atas. Bercak ditotolkan pada garis start (totolan pertama standar parasetamol dan

totolan kedua sampel urin) dan dilakukan 3 kali penotolan bercakyang

sebelumnya dikeringkan terlebih dahulu untuk setiap penotolannya.

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya

jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.

Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan

terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan

bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih dari pada penotolan secara

manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 l. Penotolan

sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak

ganda. (Mulya,1995).

3. Elusi Sampel (Fase Gerak I)

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan

mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling

sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua

pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi

secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan

mengoptimasi fase gerak :

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan teknik yang sensitif.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf

terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika

gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang

berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat

sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil

benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran

pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan

perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia

masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan

asam (Kealey ,2002)

Eluen pertama pada chamber yang berisi (etil asetat : metanol : air : asam

asetat = 60 : 30 : 9 : 1) dibuat dan ditunggu hingga jenuh. Kemudian, lempeng

KLT dimasukkan ke dalam ruang (chamber) dijenuhi dengan uap eluen dengan

arah elusi naik. Chamber ditutup dengan rapat dan eluen dibiarkan naik sampai

garis front. Jika eluen telah sampai pada garis front, maka lempeng KLT diangkat

dengan hati-hati dan dilakukan pengeringan menggunakan kipas angin. Setelah

kering dan proses elusi selesai, maka lempeng KLT dimasukkan kedalam kotak

flouresens dan bercak yang nampak diamati pada sinar UV 366 nm. Jarak masing-

masing bercak komponen sampel dan bercak standar diukur. Harga Rf dihitung

dan hasil data yang didapatkan dievaluasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

4. Elusi Sampel (Fase gerak II)

Jika Nilai Rf dari standar parasetamol dan sampel urin didapat,maka lempeng

KLT dipotong sedemikian rupa sehingga pada lempeng KLT hanya terdapat

bercak sampel urin,lalu lempeng diputar 900. Bercak sampel urin yang didapat

dielusi. Elusi dilakukan dengan dimasukkan bercak tersebut ke dalam chamber

yang beisi eluen ke-2 (n-butanol : asam asetat : air = 4 : 1 : 1) yang sudah jenuh.

Chamber ditutup dengan rapat dan eluen dibiarkan naik sampai garis front. Jika

eluen telah mencapai garis front, lempeng KLT diangkat dengan hati-hati dan

dilakukan pengeringan dengan menggunakan kipas angin.Setelah kering dan

proses elusi usai, lempeng KLT dimasukkan kedalam kotak flouresens .

Selanjutnya dilakukan pengamatan bercak tampak pada sinar UV 366 nm.. Jarak

masing-masing bercak komponen sampel dan bercak standar diukur. Pada

identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah bewarna dapat langsung

diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada

pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi

dengan jarak tempuh oleh eluen ( fase gerak ) Harga Rf dihitung dan

dibandingkan dengan pustaka.Jumlah metabolit dapat diketahui dari analisis

metode KLT dengan standar paracetamol dan sampel urin.

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak

bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis.Saat

membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang

sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi

dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.Nilai Rf dapat dijadikan

bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai

yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang

sama atau mirip.Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat

dikatakan merupakan senyawa yang berbeda (Rudi,2010).

Hasil dari pengujian ini adalah :

Fase gerak 1

Fase gerak 2

Rata-rata Rf = 0,762

Dari hasil tersebut bisa disimpulkan bahwa sampel urin mengandung parasetamol.

Sedangkan sampel urin sendiri memiliki 3 metabolit. Metabolit ini bisa berupa

protein ataupun zat pengganggu lainnya yang tidak terpisah pada sampel ini. Hal

ini dikarenakan bahan TCA yang tidak digunakan pada praktikum ini.

G. Kesimpulan

- Kadar paracetamol dalam sampel urin tersebut adalah 0,769 mg/ml.

- Sampel urin mengandung parasetamol. Sedangkan sampel urin sendiri

memiliki 3 metabolit. Metabolit ini bisa berupa protein ataupun zat

pengganggu lainnya yang tidak terpisah pada sampel ini. Hal ini dikarenakan

bahan TCA yang tidak digunakan pada praktikum ini.

H. Daftar Pustaka

Anonim, 1979. Farmakope Indonesia Ed. III. Jakarta : Departemen Kesehatan

Republik Indonesia.

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta : Depkes RI

Anonim.2012. Sekilas Tentang Pemeriksaan Lab Urin.

http://ndiel2.wordpress.com/2012/03/01/sekilas-tentang-pemeriksaan-lab-

urin/. Diakses tanggal 9 April 2012

Gandjar, I. G., Rohman A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar :

Yogyakarta

Harjadi, W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar . Gramedia : Jakarta

Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS

Scientific Publishers Limited, New York

Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press

Lehninger.A.L, 1995. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta

Mulya, M., dan Suherman, 1995, Analisis Instrumen, Airlangga University Press,

Surabaya.

Mursyidi & Rohman, A. 2006. Anilisis Obat dan Makanan. Pustaka Pelajar: Yogyakarta.

Rudi, L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Kendari: Universitas

Haluoleo.

Satrya, Yogi. 2011. Asam Sulfanilat.

http://yogisatrya.blogspot.com/2011/11/asam-sulfanilat.html. diakses tanggal

9 April 2012

Skoog, DA, West, DM, Holler, FJ, Crouch, SR. 1996. Fundamentals of Analytical

Chemistry 7th

edition. New York: Saunders College Publishing

Underwood, A. L & R. A. Day, JR. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta :

Erlangga