ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh :

Nama : Saefullah HabibiNIM : B1J0008010Rombongan : VIKelompok : 3Asisten : Zakiyyah

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONALUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2011

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan

pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin

dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki

struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T)

yang memiliki struktur cincin-tunggal. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan

materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah

set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi

menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun

pada tumbuhan.

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan

memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Hasil dari berbagai

manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis

yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan

meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforesis didasarkan

pada perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau kombinasi antara

keduanya. Karena elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan

listrik pada medan arus listrik maka molekul bermuatan negatif akan bergerak ke

elektroda bermuatan positif (kutub positif) dan molekul bermuatan positif akan

bermigrasi ke arah kutub negatif.

Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.

Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan

fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah

pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui

ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu,

elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk

mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari

fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis

dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang

dikandung suatu sekuen DNA tertentu.

Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA

menurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan

mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara

akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik

diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju

elektroda positif. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam

teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut

berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena

pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun

biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi,

sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.

B. Tujuan

Praktikum kali ini bertujuan untuk melihat cara kerja dan prinsip

elektroforesis gel agarosa.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi Gelas ukur 1000

ml, Labu erlenmeyer 50 ml, Mikropipet beserta tip, Sarung tangan, Kertas parafilm,

Seperangkat alat elektroforesis, UV transiluminator dan Kamera (Foto digital).

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi DNA produk

PCR (DNA No. 9), DNA marka (DNA λ yang dipotong dengan Hind III), Agarosa,

Larutan buffer TAE 1X (tris-base, asam asetat glacial dan EDTA), Akuades,

Loading dye (Bromophenol blue, xylene cyalol) dan Larutan Etidium Bromid

(EtBr).

B. Metode

1. 10 ml larutan buffer TAE 0,2M + 500 mL akuades dihomogenkan (larutan 500

mL TAE 1x).

2. Gel agarosa 0,2 g + TAE hingga 20 ml (agarosa 1%), dididihkan hingga larut

sempurna.

3. Disiapkan baki elektroforesis dan diletakkan selotip disetiap ujung baki

elektroforesis.

4. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki dengan posisi hampir

menyentuh dasar baki.

5. Dituang larutan agarosa 60°C ke dalam baki elektroforesis dan dibiarkan hingga

larutan berubah menjadi gel yang padat.

6. Sisir diambil dengan hati-hati kemudian selotip dilepaskan dari ujung-ujung

baki.

7. Baki yang telah berisi gel agarosa dimasukan ke dalam tangki elektroforesis

yang telah diisa dengan larutan buffer TAE 1x (dipastikan bahwa gel terendam

seluruhnya dalam TAE).

8. Disiapkan kertas parafilm, dimasukkan 10µL sampel DNA dan 2µL loading dye

6x ke dalam sumuran gel dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut

terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm.

9. Elektroforesis dinyalakan, diatur voltase dan waktunya (70 V, 35’), dirunning.

10. Hasil running diangkat menggunakan sarung tangan, gel agarosa dimasukkan ke

dalam EtBr selama 2 menit kemudian dipindahkan ke aquades selama 1’.

11. Gel dikeluarkan kemudian divisualisasikan pada UV transiluminator.

12. Didokumentasikan dengan kamera.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar 1. Visualisasi DNA Hasil Elektroforesis

B. Pembahasan

Berdasarkan hasil visualisasi DNA setelah dielektroforesis diperoleh bahwa

pita DNA marka tidak muncul, sedangkan DNA sampel menghasilkan pita-pita

DNA. Hal tersebut dapat terjadi karena DNA marka terdenaturasi sebelum

dielektroforesis, penyimpanan DNA marka setelah selesai digunakan tidak

disimpan kembali pada lemari pendingin. Menurut Standfield et al. (1996),

kemungkinan terjadinya kegagalan tersebut karena DNA telah mengalami

depolarisasi. Perlu diperhatikan bahwa pemberian arus listrik pada gel agarosa tidak

boleh sembarangan karena jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan

merubah bentuk pita DNA. Beberapa kemungkinan yang menyebabkan pita-pita

DNA tidak terbetuk seperti seharusnya, diantaranya adalah DNA dimasukan dalam

sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut, perendaman yang

terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis maka DNA gagal berada di gel

agarosa. DNA terus menembus gel tersebut hingga keluar dari gel. Akibatnya tidak

ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel. Waktu yang paling optimal dalam

elektroforesis yang sebenarnya adalah 30 – 50 menit dengan menggunakan arus 50

mA. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open

circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk

berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut

menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju

migrasinya (Sambrook & Russel 2001).

Menurut Pratiwi (2001), elektroforesis merupakan proses bergeraknya

molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak

pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Klug and

Cummings (1994) menambahkan bahwa elektroforesis adalah suatu teknik yang

mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam

suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan

partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak

menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation)

akan bergerak menuju kutub negatif (anode).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan

untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000

pasang basa (pb). Prinsip dasar tekhnik elektroforesis ini adalah DNA, RNA, atau

protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis gel biasanya dilakukan

untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai tekhnik preparatif

(Standfield 1996).

Menurut Rachmaniar (1998), agarosa merupakan polimer dari 3,6-Anhidro-

L-galaktosa dengan b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak

bermuatan. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut,

rumput laut yang digunakan yaitu Evchema spinosum atau bisa juga dari jenis

golongan Phaephycophyta. Agarosa akan membentuk gel padat jika dilarutkan

dengan pemanasan pada konsentrasi antara 0,5% dan 2%. Agarosa yang digunakan

untuk elektroforesis lebih murni bila dibandingkan denga agar yang digunakan

untuk kultur bakteri. Agarosa akan membentuk pori yang besar sesuai dengan

konsentrasi agarosa.

Sambrook and Russel (2001), menambahkan bahwa gel ini mengandung

larutan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik

untuk DNA. Gel agarosa mempunyai laju pemisahan lebih cepat, dapat

memisahkan fragmen DNA antara 100 bp–50 kb tergantung dari konsentrasi gel

agarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal.

Fungsi dari masing-masing alat dan bahan yang digunakan pada praktikum

elektroforesis adalah:

1. Sarung tangan, digunakan untuk mencegah keringat dari tangan pada medium

karena keringat mengandung DNAase dan melindungi toksik dari EtBr. Selama

pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin

(Faatih, 2009).

2. Mikropipet, digunakan untuk mengambil sampel DNA.

3. Transiluminator, digunakan untuk mengvisualisasi DNA yang sudah dirunning.

4. Kertas parafilm, digunakan untuk mencampur atau menghomogenkan sampel

DNA dengan loading dye.

5. Sisir elektroda, digunakan untuk membuat sumur untuk melekatkan DNA.

6. EtBr, digunakan sebagai pewarna yang menyisip pada pasang basa yang akan

menunjukan posisi fragmen-fragmen dengan ukuran berbeda.

7. Loading dye, digunakan sebagai pemberat (Bromophenol blue sebagai penanda

jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannya

elektroforesis.

8. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat glasial

sebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim perusak

DNA yaitu DNAase).

9. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.

10. Seperangkat elektroforesis, sebagai alat untuk elektroforesis DNA dengan 70 V

selama 35 menit.

Fachiyah (2006) pun mengemukakan beberapa faktor yang mempengaruhi

Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarosa, sebagai

berikut:

1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier

lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah

laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.

2. Konsentrasi gel agarosa

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai

dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Rumusnya adalah:

logµ=logµο-KrT dimana µο adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah

retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta µ adalah electrophoretic

mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarosa dan ukuran molekul DNA

No Konsentrasi Gel

Agarosa (%)

Effisiensi range Pemisahan

pada DNA linier (kb)1 0.3 60-52 0.6 20-13 0.7 10-0.84 0.9 7-0.55 1.2 6-0.46 1.5 4-0.27 2.0 3-0.1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu

bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II),

dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju

migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

• Konsentrasi gel agarosa

• Kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

• Densitas kembaran superheliks pada bentuk I

• Pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III

• Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,

pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh

untuk bentuk I

• Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1µg/ml-0.5µl/mg.

Semakin padat gel agarosanya maka akan semakin lambat laju migrasinya

dan semakin basar berat molekul DNA maka laju migrasinya pun semakin lambat.

Berdasarkan ukuran, semakin berat molekul DNA maka semakin lambat laju

migrasinya, begitu juga sebaliknya. Menurut Pramono (2011), berdasarkan struktur

molekulnya, DNA yang paling cepat lajunya adalah DNA bentuk covalently closed

circular (CCC) disusul oleh bentuk linier, dan yang paling lambat adalah bentuk

open circular (OC).

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.

Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarosa bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang

elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan

berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh,

mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30°C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan

pada suhu kamar

6. Keberadaan pewarna DNA

Iintercalating agent Ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen

untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa

DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit

DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media

UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-

stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk

single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum.

III.KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut:

1. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul-molekul bermuatan

listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya.

2. DNA bermuatan negatif sehingga DNA akan bergerak menuju kutub positif

(anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak

menuju kutub negatif (anode).

3. Semakin padat gel agarosa dan berat molekul DNA maka akan semakin lambat

laju migrasinya.

B. Saran

Pelaksanaan praktikum lebih bekerja secara aseptis dan teliti. Penggunaan

sampel DNA yang digunakan lebih diperhatikan agar tidak terjadi denaturasi.

Selanjutnya dalam pelaksanaan praktikum tidak hanya demo dalam penggunaan alat

agar semua praktikan dapat mengetahui secara detail penggunaan alat.

DAFTAR REFERENSI

Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, 10(1):61 – 67.

Fatchiyah. 2006. Electroforesis Migration Rate. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler & Seluler Universitas Brawijaya Malang, Malang.

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs.

Pramono, H. 2011. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto.

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta.

Rachmaniar. 1998. Pemisahan Agarosa dari Polisakarida Agar. Buku Produk Alam Laut I. Puslit Oseanografi LIPI, Jakarta.

Sambrook, J., Russel D. W. 2001. Ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Stanfield, W. D., Jaime S. C., Raul J. C. 1996. Molecular and Cell Biology. Mc Graw-Hill, New York.