1

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI FARMASI

PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI

Disusun Oleh :

Nova Gupita Dersonolo ( 08613034)

Ridho Fadhilah ( 09613174)

Novialy Putri (09613177)

Dwi Purnamasari ( 09613178)

Kelompok C6

Tanggal Praktikum : 20 Oktober 2011

Tanggal Dikumpulkan : 27 Oktober 2011

Asisten : Herninggar

Dosen Pembimbing:

Hady Anshory T, S.Si., Apt

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIPROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS ISLAM INDONESIA

YOGYAKARTA 2011

2

PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI

I. TUJUAN

Untuk mengetahui teknik perhitungan bakteri dan mampu melakukan

perhitungan bakteri secara viable count atau teknik standar plate count dengan

sampel air mineral.

II. LATAR BELAKANG

Pertumbuhan pada bakteri mempunyai arti perbanyakan sel dan

peningkatan ukuran populasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan

bakteri/kondisi untuk pertumbuhan optimum adalah:

1. Suhu

2. Sumber Nutrisi

3. pH

4. Zat-zat sisa metabolism

5. Konsentrasi garam

6. Zat kimia

Pertumbuhan mikroorganisme terdiri dari beberapa fase yaitu fase

adaptasi, pertumbuhan awal, pertumbuhan logaritmik, pertumbuhan lambat,

pertumbuhan tetap (stationer), menuju kematian, serta fase kematian.Faktor-

faktor yang mempengaruhi pertumbuhan adalah nutrient, air, pH, suhu dan

oksigen.Suatu sampel yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel

mikroba per ml, per g, atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan

pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri,

sehingga setelah dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah antara 30 – 300.

Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan

koloni yang besar dimana jumlah koloni dapat dihitung sebagai satu koloni dan

satu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung

sebagai satu koloni.

Untuk mendapatkan atau mengetahui jumlah mikroorganisme tertentu,

maka dilakukan teknik perhitungan jumlah bakteri. Teknik perhitungan bakteri

3

dilakukan secara viable count atau teknik standar plate count dengan

sampelyang digunakan yaitu air mineral.

III. DASAR TEORI

Perkembangan mikrobiologi yang pesat salah satunya pada bidang

produk makanan dan minuman tak lepas dari peran ilmu mikrobiologi. Para

produsen makanan dan minuman berusaha untuk sebisa mungkin produk dari

makanan dan minuman yang mereka produksi bebas dari pengaruh kontaminan

seperti mikroba dan jasa drenik yang dapat merugikan dan mengganggu

kesehatan konsumen. Namun tidak semua mikroba dapat merugikan kesehatan

manusia, dikarenakan ada beberapa mikroba yang justru dapat membantu

dalam proses pembuatan produk pangan, diantaranya produk hasil fermentasi

seperti pada pembuatan yoghurt yang dibantu oleh mikroba lactobacillus

bulgaricus. Sekaranginibanyaksudahprodukmakanansertaminuman yang pada

proses pembuatanya menggunakan proses fermentasi. Produk makanan dan

minuman penting untuk mengetahui ada tidaknya kandungan mikroba dalam

produk tersebut, agar kita dapat mengetahui produk tersebut layak dikonsumsi

atau tidak, hal ini juga akan berpengaruh pada kelayakan produk pangan dapat

dipasarkan atau tidak, dapat pula dijadikan parameter kadaluarsa dari suatu

produk. Pembiakan mikroba dalam laboratorium memerlukan medium yang

berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan

mikroorganisme. Zat hara yang digunakan oleh mikroorganisme untuk

pertumbuhan, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan

pergerakan. Lazimnya, medium biakan berisi air, sumber energi, zat hara

sebagai sumber sebagai sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen,

hidrogen serta unsur – unsur sekelumit (trace element). Dalam bahan dasar

medium dapat pula ditambahkan faktor pertumbuhan berupa asam amino,

vitamin atau nukleotida(3).

Tujuan penghitungan angka kuman anatara lain:

1. Membantu menegakan diagnosa

2. Mengetahui adanya cairan mikroorganisme pada makanan, minuman,

kosmetik atau sediaan obat.

4

3. Kontrol kualitas mikrobiologi(1).

Metode yang digunakan untuk menentukan jumlah bakteri ada 2, yaitu :

1. Jumlah bakteri secara keseluruhan ( Total Cell Count )

a) Menghitung langsung secara mikroskopik

Pada metode ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang

sangat kecil, untuk itu digunakan kaca obyek khusus yang bergaris

( Petroff – Hauster ) berbentuk bujur sangkar. Hitungan mikroskopik

dilakukan dengan pertolongan kotak – kotak skala, dimana dalam setiap

ukuran skalaseluas 1 mm2 terdapat 25 kotak besar dengan luas 0,04 mm2,

dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak – kotak kecil. Tinggi sampel

yang terletak diantara kaca bend dan kaca penutup adalah 0,02 mm.

Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dapat dihitung, kemudian dapat

dihitung jumlah setiap rata – rata dalam kotak besar.

Metode ini umumnya cepat dan murah namun memiliki kelemahan, sbb :

1. Sel – sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel

yang hidup,

2. Sel – sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop

sehingga bila tidak, teliti tidak akan terhitung,

3. Untuk mempertinggi penelitian jumlah sel dalam suspensi harus

cukup tinggi, minimal untuk bakteri 106 sel/ml. Hal ini disebabkan

dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat jumlah sel

yang dapat vdihitung, dan

4. Tidak dapat digunakan untuk bahan makanan yang mengandung

ekstrak makanan karena akan mengganggu perhitungan sel(3).

b) Menghitung dengan cara kekeruhan

Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar

teknik ini adalah bakteri merupakan suatu partikel sinar yang mengenai

sel bakteri sebagian akan diabsorpsi, dan sebagian lain akan diteruskan.

Jumlah sinar yang diabsorpsi jumlah sel bakteri/absorbansi (optical

density)– jumlah bakteri(1).

c). Menghitung dengan cara pengecetan

5

Sampel sebanyak 100 μl, lalu diletakkan pada sebuah kaca dan

dilakukan pengecetan.

d) Menghitung dengan cara sentrifuge

Syarat metode ini adalah sampel harus murni harus berisi bakteri

yang berasal dari satu jenis bakteri saja dan ukuran / volume untuk satu

sel bakteri yang akan ditentukan jumlahnya harus diketahui. Prosedur :

sampel dalam tabung reaksi disentrifuge dengan kecepatan tertentu.

Bakteri akan membentuk endapan, diukur volume endapan tersebut lalu

diperbandingkan dengan volume sati sel bakteri, sehingga diperoleh

nilai jumlah bakteri dalam sampel.

e) Menghitung dengan cara perbandingan dengan darah

Sejumlah darah diteteskan pada mikroskop. Diperbandingkan

jumlah/volume darah dengan jumlah bakteri. Jumlah normal darah

merah adalh 5 juta/ml. Misal, terdapat x bakteri dalam 100 ml darah ,

maka x/100 x 5 juta = y.

f) Menghitung dengan elektronik counter

Ukuran bakteri yang berkisar 0,1 – 1 μm dapat dihitung secara

otomatis dengan melewatkan sampel pada elektronik counter ( syarat

minimal ukuran partikel adalah 30 nm ).

2. Jumlah bakteri yang hidup ( Viable Count )

Perhitungan jumlah mikroorganisme dengan cara viable count

didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam

suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasi dalam media

biakkan dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi, jumlah koloni

yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah

mikroorganisme dalam suspensi tersebut(1).

Metode ini merupakan cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah

mikroorganisme, dengan alasan :

Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung,

Beberapa mikroorganisme dapat dihitung sekaligus, dan

6

Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena

koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikrobia yang

mempunyau penampakkan spesifik(3).

Selain keuntungan – keuntungan tersebut, metode ini juga memiliki

kelemahan – kelemahan sbb :

Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang serbenarnya,

karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membebtuk koloni.

Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan

jumlah yang berbeda pula.

Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat timbuh pada medium padat dan

membentuk koloni yang kompak, tidak menyebar.

Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama(3).

Metode Viable count dibedakan atas 2 cara, yakni metode tuang

(pour plate) dan metode permukaan (surface/spread plate). Pada metode

tuang, sejumlah sampel (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran yang

dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambah agar –

agar cair steril yang telah didinginkan (47 – 50°C) sebanyak 15 -20 ml dan

digoyangkan supaya sampelnya menyebar. Setelah pada penanaman dengan

metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar, kemudian sebanyak 0,1 ml

sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar – agar tersebut.

Kemudian diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril(3).

Laporan dari hasil menghitung dengan metode ini menggunakan suatu

standar yang disebut Standar Plate Counts (SPC), sebagai berikut :Cawan

yang dipilih dan yang dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni

antara 30 – 300 koloni,

Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan

koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung

sebagai satu koloni, dan

Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung

sebagai satu koloni(2).

7

III. ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. Autoklaf

2. Blue tip

3. Cawan Petri

4. Electronic counter

5. Erlenmeyer

6. Gelas beaker

7. Gelas ukur

8. Inkubator

9. Kapas

10. Kaertas alumunium

11. Kertas coklat

12. LAF

13. Lampu spiritus

14. Mikro pipet

15. Ose

16. Pipet volume

17. Pro pipet

18. Spatula

19. Spreader

20. Tabung reaksi

21. Timbangan analitik

22. Yellow tipe

Bahan :

1. Media Mc Conkey

2. APHA

3. Nutrient broth

4. Air mineral

8

A. Cara Kerja

Hari Pertama

Dibuat pengenceran 10-2 – 10-6 dari sampel dengan cara mengambil 0,1 ml sampel, masukkan ke tabung A ad 10 ml aquades

Ambil 0,1 ml dari tabung A, masukkan ke dalam tabung B ad 10 ml aquades

Ambil 0,1 ml dari tabung B, masukkan ke dalam tabung C ad 10 ml aquades

Encerkan 4 media Plate Count Agar @ 20ml pada labu erlenmeyer

Lakukan sterilisasi dengan autoklaf

Tuangkan ke dalam petri dish dan biarkan sampai membeku

Pipet cairan sampel dari masing-masing pengenceran sebanyak 1 ml dan 0,1 ml dari tabung B, 1 ml dan 0,1 ml dari tabung C ke dalam petri dish yang telah

berisi media padat

Ratakan sampel diatas media dengan menggunakan spreader/ penyebar

Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dengan posisi terbalik

9

Hari kedua

IV. HASIL

Gambar 1. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 10.000

Gambar 2. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 100.000

Dihiitung jumlah koloni pada lempengan agar. Gunakan lempengan agar yang mempunyai 30-300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang mempunyai kisaran

jumlah koloni tersebut gunakan lempengan agar yang mempunyai koloni sekitar 300 koloni

Ditentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran

10

Gambar 4. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 1.000.000

Gambar 5. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 10.000.000

Gambar 6. Biakan pada media Mc Conkey

11

Gambar Perhitungan Bakteri

media padat (APHA) 1 : 10.000

media padat (APHA) 1 : 100.000

media padat (APHA) 1 : 1.000.000

12

media padat (APHA) 1 : 10.000.000

Perhitungan Jumlah Koloni

Pengenceran Volume sampel Jumlah koloni CFU /ml

10.000 x 1 ml 531 8,31 x 10 2

100.000 x 0,1 ml 683 1,05 x 10 3

1.000.000 x 1 ml 618 9,46 x 10 2

10.000.000 x 0,1 ml 428 6,55 x 10 2

V. PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum ini adalah agar praktikan mampu melakukan

teknik perhitungan jumlah bakteri secara viable count atau lebih

khususnya menggunakan teknik standard plate count. Perhitungan dengan

teknik standard count merupakan perhitungan bakteri dengan

menggunakan suatu alat yang namanya elekronic counter yang otomatis

dapat menghitung jumlah bakteri yang hidup saja, jadi bakteri yang mati

tidak di hitung.

Pada praktikum kali ini, sampel yang kami gunakan adalah air

mineral, umunya bakteri yang terdapat dalam air mineral adalah bakteri E.

Coli, bakteri koliform. Metode yang digunakan pada praktikum ini adalah

metode viable count dengan menggunakan media agar membrane larutan

APHA yang merupakan media padat.

13

Fungsi memindahkan bakteri dari sampel menuju ke media pertumbuhan

agar membran APHA di LAF adalah agar steril karena di LAF tempatnya

steril dengan prinsip blower akan mengeluarkan udara dari atas LAF

tersebut dan dengan sinar ultra violet akan membunuh bakteri di sekitar

ruangan tersebut sehingga kerjanya terjamin sterilisasinya. Fungsi 4

petridish yang akan disterilisasi dengan autoklaf dibungkus dengan kertas

steril yaitu agar pada saat dikeluarkan dari autoklaf bakteri yang ada

diruangan hanya mengkonaminasi kertasnya jadi tidak sampai kecawan

petridis.

Alat-alat yang digunakan pada praktikum Mikrobiologi Dasar materi

perhitungan koloni bakteri dan isolasi antara lain :

Jarum Loop : untuk memindahkan/menginokulasi mikroba dari

media padat ke cair atau sebaliknya.

Cawan petri : sebagai wadah untuk penanaman bakteri dan jamur.

Bunsen : untuk pengkondisian aseptis.

Incase : untuk menginkubasi media pada suhu kamar.

Colony Counter : untuk menghitung jumlah koloni bakteri.

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum Mikrobiologi Dasar materi

perhitungan kolonii bakteri dan isolasi antara lain :

NA : sebagai media untuk bakteri.

Alkohol : untuk pengkondisian steril alat/lingkungan.

Kapas : untuk menutup lubang pangkal pipet serologis saat akan

diinkubasi.

Pada hari pertama, bakteri dikembangbiakkan pada 4 media

nutrient agar APHA dengan pengenceran 1:10.000 dan 1:100.000 dari

tabung B, 1:10.000.000 dan 1:1000.000 dari tabung C, yang digunakan

untuk pengembang biakkan bakteri yang kemudian dapat dihitung jumlah

bakteri pada media tersebut, dan 1 media McConkey sebagai pengembang

biakkan bakteri Gram negatif yang kemudian dapat diambil beberapa

koloni untuk ditumbuhkan kedalam nutrient broth dalam tabung reaksi

yang dilakukan pada hari kedua. Hasil koloni bakteri yang tumbuh pada

14

nutrient broth tersebut yang kemudian digunakan pada praktikum

selanjutnya.

Bakteri yang terhitung pada pengenceran 1:10.000 adalah sebesar

618, dan pada pengenceran 1 : 1.000.000 adalah 683. Sedangkan

pengenceran 1:10.000 didapatkan jumlah koloni 531 dan pada

pengenceran 1 : 1.000.000 didapatkan 428 koloni bakteri. Pada umunya,

bakteri yang terdapat pada air mineral khusunya pada sampel kami, yaitu

Aqua terdapat sedikit bakteri, teapi pada praktikum kali ini, pada saat

perhitungan jumlah bakteri dengan alat electronic counter, banyak sekali

bakteri yang terhitung. Ini disebabkan banyaknya kontaminan yang

mengkontaminasi dikarenakan pada saat akan memasukkan sampel ke

petridish, tidak memanaskan seluruh sisi permukaan petri dish pada

setelah menyebarkanya dan sesudahnya. Dan kapas yang digunakan untuk

menutup tabung reaksi yang berisi sampel terbakar pada saat akan

memanaskan ujung mulut tabung reaksi. Akibatnya terdapat banyak

kontaminan.

Pada pengembang biakan bakteri dengan media McConkey, kultur

bakteri digoreskan pada media dengan sistem quadrant. Pengambilan

dilakukan setelah diinkubasi pada hari kedua dan pada media

menunjukkan bintik-bintik merah dan putih. Pengambilan diambil koloni

merah yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri Gram

negatif. Pada saat pengambilan pun juga harus diperhatikan teknik aseptis

supaya pengembang biakan bakteri pada nutrient broth tidak terjadi

kontaminasi dengan mikroorganisme yang tidak diharapkan.

IV. PERTANYAAN

a. Teknik perhitungan bakteri ada dua cara perhitungan langsung dan

perhitungan tidak langsung

Perhitungan bakteri langsung : perhitungan bakteri yang langsung

dilakukan di bawah mikroskop atau dengan perhitungan dengan

alat penghitung elektronik

15

Perhitungan bakteri secara tidak langsung : dengan

mengkonsentrasikan mikroorganisme dalam sampel dan kemudian

di tanam pada media yang sesuai yang kemudian akan tumbuh

koloni pada media tersebut missal pada plat agar

Metode perhitungan bakteri secara tidak langsung meliputi

1. Pengukuran dengan bilik hitung

2. Pengukuran dengan elektronik counter

3. Pengukuran dengan plating takhnique

4. Pengukuran dengan teknik filtrasi membrane

b. Teknik membuat pengenceran 1:10

Dibuat sampel dengan mengambil 1 ml sampel dan di larutkan dengan

NaCl isotonis

Diambil 1 ml, dan di add NaCl 9 ml maka didapatkan pengenceran 1:10

VI. DAFTAR PUSTAKA

1. Mulyaningsih, Sri. 2004. Diktat Analisis Mikrobiologi. Jurusan

Farmasi. FMIPA UII,Yogyakarta. Hal : 36.

2. Lay, Bibiana W. 1994.Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja

Grafindo Persada, Jakarta. Hal : 48-49.

3. Waluyo, Lud. 2005.Mikrobiologi Umum. UMM-Press, Malang. Hal :

84-85.