Praktikum Mata Kuliah Polusi Tanah dan Air TanahKinetika Biodegradasi Bakteri Petrofilik

Nama Mahasiswa: 1 NIM.

  2 NIM.

  3 NIM.

  4 NIM.

Lokasi Praktikum:  

Waktu Praktikum: Tanggal: Pukul:

Dosen Praktikum:  

1. Deskripsi

A. Pertumbuhan Bakteri

Istilah pertumbuhan bakteri lebih mengacu kepada peningkatan semua komponen di dalam sel sehingga menghasilkan peningkatan ukuran sel dan pembelahan sel (kecuali mikroba yang membentuk filamen), serta terjadi peningkatan jumlah individu di dalam populasi. Bakteri memiliki kemampuan untuk menggandakan diri secara eksponensial karena sistem reproduksinya melalui pembelahan biner melintang ketika tiap sel membelah diri menjadi dua sel melalui mekanisme proses:a. Peningkatan ukuran sel (pemanjangan sel). Proses ini memerlukan

pertumbuhan dinding sel, yaitu untuk menutup permukaan pada sisi tertentu.

b. Replika DNA. Proses ini memberikan indikasi pertumbuhan awal pada sel bakteri.

c. Pembelahan sel. Proses ini diawali dengan invaginasi lapisan di bagian tengah sel.

Umumnya, bakteri dapat memperbanyak diri dengan pembelahan biner sehingga pertumbuhan dapat diukur dari peningkatan jumlah sel. Waktu yang diperlukan untuk membelah diri dari satu sel menjadi dua sel sempurna disebut waktu generasi, sedangkan waktu yang diperlukan oleh sejumlah sel atau massa sel menjadi dua kali jumlah massa sel semula disebut doubling time atau waktu penggandaan. Waktu penggandaan tidak sama antara berbagai bakteri, dari beberapa menit, beberapa jam, sampai beberapa hari, tergantung kecepatan pertumbuhannya. Kecepatan pertumbuhan merupakan perubahan jumlah atau massa sel per unit waktu.

Apabila satu bakteri tunggal diinokulasikan pada suatu medium dan memperbanyak diri dengan laju yang konstan, maka pertumbuhannya akan berhenti pada suatu waktu karena sokongan nutrisi pada lingkungan tidak memadai sehingga terjadi kemerosotan jumlah sel. Pada titik ekstrim, kondisi ini menyebabkan terjadinya kematian total bakteri. Deskripsi tersebut dapat digambarkan dalam bentuk kurva pada Gambar 1. Dalam pertumbuhan bakteri, proses metabolik dimulai dari pengangkutan nutrien dari medium ke dalam sel, konversi bahan nutrien menjadi energi dan konstituen sel, replikasi kromosom, peningkatan ukuran dan massa sel, serta pembelahan sel secara biner dengan terjadinya penurunan genetik pada sel baru.

Gambar 1. Kurva pertumbuhan bakteri(Sumber: Prescott, 2002)

Kurva di atas disebut sebagai kurva pertumbuhan bakteri. Pengamatan jumlah sel dalam waktu yang cukup lama akan memberikan gambaran berdasarkan kurva pertumbuhan bahwa terdapat fase pertumbuhan. Ada empat fase pertumbuhan bakteri sebagaimana tampak pada kurva dideskripsikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Fase Pertumbuhan BakteriFasa Pertumbuhan CiriLag (lambat) Tidak ada pertumbuhan populasi karena sel

mengalami perubahan komposisi kimiawi dan ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri.

Logarithmic (eksponensial)

Sel membela diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat, keadaan pertumbuhan seimbang.

Stationary (stasioner/tetap)

Terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel dan kandungan nutrien mulai habis. Akibatnya, kompetisi nutrisi terjadi sehingga beberapa sel mati dan lainnya tetap tumbuh. Jumlah sel menjadi konstan.

Death (kematian) Sel menjadi mati akibat penumpukan racun dan habisnya nutrisi dan menyebabkan jumlah sel yang mati lebih banyak sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial.

Pada fase awal, bakteri masih dalam tahap penyesuaian diri dengan lingkungan yang baru sehingga sel belum membelah diri. Sel mikroba mulai membelah diri pada fase pertumbuhan yang dipercepat, tetapi waktu generasinya masih panjang. Fase awal hingga fase pertumbuhan dipercepat sering disebut lag phase. Kecepatan sel membelah diri paling cepat terdapat pada fase pertumbuhan logaritma atau pertumbuhan eksponensial, dengan waktu generasi pendek dan konstan. Selama fase logaritma, proses metabolisme sel paling aktif, sintesis bahan sel sangat cepat dengan jumlah konstan hingga nutrien habis atau terjadinya penimbunan hasil metabolisme yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan. Selanjutnya, kecepatan pembelahan sel berkurang dan jumlah sel yang mati mulai bertambah pada fase pertumbuhan yang mulai terhambat. Pada fase stasioner maksimum, jumlah sel yang mati semakin meningkat hingga tercapai jumlah sel hidup hasil pembelahan sama dengan jumlah sel yang mati sehingga jumlah sel hidup konstan, seolah-olah tidak terjadi pertumbuhan (pertumbuhan nol). Pada fase kematian yang dipercepat, kecepatan kematian sel terus meningkat hingga mencapai kondisi maksimal, sedangkan kecepatan pembelahan sel nol dan menurun dengan cepat seperti deret ukur hingga fase kematian logaritma.

Pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu:a. Temperatur. umumnya bakteri tumbuh baik pada suhu antara 25 - 35˚C.b. Kelembapan. Lingkungan lembap dan tingginya kadar air sangat

menguntungkan untuk pertumbuhan bakteri.c. Sinar Matahari. Sinar ultraviolet yang terkandung dalam sinar matahari

dapat mematikan bakteri.d. Zat kimia, antibiotik, logam berat dan senyawa-senyawa kimia tertentu

dapat menghambat bahkan mematikan bakteri.

B. Pertumbuhan Bakteri

Pada proses bioremediasi, penentuan parameter kinetika sangat penting untuk di analisa. Biodegradasi kinetik digunakan untuk memprediksi konsentrasi dari bahan kimia yang tersisa pada waktu yang diberikan selama proses bioremediasi ex-situ dan in-situ. Kunci proses tersebut terletak pada penurunan konsentrasi toksisitas dengan adanya bioessei. Oleh karena itu, keberhasilan biodegradasi didasarkan pada pengukuran senyawa kimia, contohnya kehilangan molekul induk, tampilan produk mineralisasi, atau hilangnya senyawa lainnya menggunakan stokiometri selama proses biodegradasi berlangsung, misalnya, akseptor elektron. Ada beberapa skenario ketika senyawa pencemar dapat ditransformasi secara biologi, yaitu ketika beberapa senyawa bekerja sebagai sumber karbon dan energi, akseptor elektron, dan sumber komponen sel lainnya (Okpokwasili, 2005).

Analisis laju pertumbuhan eksponensial dapat menggunakan grafik pertumbuhan atau perhitungan secara matematis. Rumus matematika pertumbuhan menggunakan persamaan diferensial:

d X

d t

=μ X (1)

Dari Persamaan 1, X adalah jumlah sel atau komponen jumlah sel spesifik (protein) dan μ adalah konstanta laju pertumbuhan spesifik. Dalam bentuk antilogaritma dengan bilangan dasar e, rumus yang menggambarkan aktivitas populasi mikroba dalam biakan sistem tertutup adalah:

X=X0 e(μt )(2)

Dari Persamaan 2, X0 adalah jumlah sel pada waktu nol, X adalah jumlah sel pada waktu t, dan t adalah waktu pertumbuhan yang diamati. Dalam bentuk logaritma menjadi:

ln X=ln X 0+μ (t−t 0 )(3)

Persamaan 3 dapat disederhanakan menjadi:

μ=ln X−ln X 0

(t−t 0 )(4)

Menurut Effendi (2006), sejak kurva tumbuh diperoleh dengan memasukkan data pada kertas semilog, maka µ dihitung menggunakan analisis korelasi least-square. Ketika persamaan linear digambarkan, maka kemiringan (slope) dari kurva tersebut merupakan koefisien laju pertumbuhan spesifik (µ).

Ide kinetika pertumbuhan mikroba telah didominasi oleh satu model empiris yang pada awalnya diusulkan oleh Monod. Persamaan Monod memperkenalkan konsep yang membatasi substrat pertumbuhan.

μ=μmaxS

K S+S(5)

Gambar 2. Hubungan antara nilai laju pertumbuhan spesifik maksimum (µmax) dankonsentrasi substrat (S) pada kultur sel

(Sumber: Doran, 1995)

Dari Persamaan 5 di atas, 𝜇 adalah nilai laju pertumbuhan spesifik, µmax

adalah nilai laju pertumbuhan spesifik maksimum, dan KS merupakan

konstanta saturasi substrat pada saat µ mencapai nilai dari 0,5 µmax. Tipikal nilai KS sangat kecil berdasarkan mg per liter untuk substrat karbohidrat dan µg per liter untuk senyawa lain seperti asam amino. Tingkat pertumbuhan yang membatasi substrat dalam media tercampur biasanya jauh lebih besar dari KS. Akibatnya, laju pertumbuhan tidak mempengaruhi konsentrasi substrat (S) hingga S mencapai nilai yang sangat rendah. Nilai KS biasanya sangat kecil dibandingkan dengan konsentrasi awal substrat sehingga Doran (1995) mengatakan bahwa S yang tersisa lebih besar dari 10KS selama periode kultur. Hal ini menjelaskan mengapa µ tetap konstan atau sama dengan µmax dalam kultur batch hingga substrat di dalam media habis. Ketika S akhirnya turun di bawah 10 KS, transisi dari fase pertumbuhan stasioner dengan cepat dikonsumsi dalam jumlah besar oleh sel terbaru.

Untuk memperoleh nilai µmax dan KS pada persamaan Monod, ada beberapa metode plotting melalui proses linearisasi data. Metode tersebut adalah Lineweaver-Burk Plot, Eadie-Hofstee Plot, dan Langmuir Plot (Doran, 1996).a. Lineweaver-Burk Plot

Metode ini menggunakan prosedur linierisasi untuk memberikan plot garis lurus sehingga µmax dan KS dapat ditentukan. Inversi dari Persamaan 5 menghasilkan:

1μ=

KS

μmax

1S+ 1

μmax

(6)

Gambar 3. Lineweaver-Burk Plot untuk mendapatkan nilai KS dan µmax

Plot 1/µ versus 1/S memberikan garis lurus dengan kemiringan (slope) KS/µmax dan perpotongan (intercept) pada sumbu y adalah 1/µmax. Double-reciprocal plot ini dikenal sebagai Lineweaver-Burk Plot dan sering juga ditemukan dalam literatur kinetika enzim. Namun, proses linearisasi yang digunakan dalam metode ini dapat mendistorsi kesalahan (error) dalam eksperimental penentuan µ sehingga kesalahan ini dideskripsikan sebagai substrat dalam konsentrasi rendah. Akibatnya, Lineweaver-Burk Plot terkadang memberikan hasil yang tidak akurat.

b. Eadie-Hofstee Plot

Jika Persamaan 6 dikalikan dengan faktor µ(µmax/KS) dan disusun kembali, bentuk lain dari Persamaan Monod akan diperoleh.

μS=

μmax

KS

− μK S

(7)

Gambar 4. Eadie-Hofstee Plot untuk mendapatkan nilai KS dan µmax

Berdasarkan Persamaan 7, plot µ/S versus µ akan memberikan garis lurus dengan kemiringan -1/KS dan perpotongan dengan sumbu y sebagai µmax/KS

sehingga disebut Eadie-Hofstee Plot. Seperti Lineweaver-Burk Plot, linearisasi Eadie-Hofstee Plot mendistorsi kesalahan dalam data sehingga mengurangi akurasi hasil perhitungan.

c. Langmuir PlotHasil perkalian Persamaan 6 dengan koefisien S menghasilkan bentuk lain dari Persamaan Monod berdasarkan Langmuir Plot.

Sμ=

KS

μmax

− Sμmax

(8)

Gambar 5. Langmuir Plot untuk mendapatkan nilai KS dan µmax

Oleh sebab itu, Langmuir Plot dari S/µ versus S akan memberikan garis lurus dengan kemiringan sebagai 1/µmax dan perpotongan dengan sumbu y

sebagai KS/µmax. Linearisasi data pada Langmuir Plot meminimalisasi tingkat distorsi kesalahan ekperimental.

Selain Persamaan Monod, ada beberapa pendekatan persamaan lain dalam memperhitungkan kinetika biodegradasi untuk mengamati pertumbuhan mikroorganisme yang dibatasi oleh substrat. Persamaan tersebut yaitu (Schuler, 2002): Persamaan Tessier:

μ=μmax(1−e

−SKS )(9)

Persamaan Moser:

μ=μmaxSn

K S+Sn (10)

Persamaan Contois:

μ=μmax S

K S X+S(11)

KS menunjukkan afinitas sel terhadap konsentrasi substrat pada saat μ setara ½ μmax. Apabila sel mikroba memiliki afinitas tinggi terhadap substrat yang ditunjukkan dengan nilai KS yang rendah, maka energi aktivasi yang dibutuhkan mikroba untuk tumbuh juga rendah. Menurut Helmy (2006), laju pertumbuhan maksimum dari mikroba tidak akan tercapai jika mikroba ditumbuhkan pada konsentrasi dibawah nilai KS. Sebaliknya, jika mikroba ditumbuhkan pada konsentrasi di atas nilai KS, maka sebanyak apapun substrat yang ditambahkan tidak akan menaikkan laju pertumbuhan maksimum dari mikroba tersebut. Oleh karena itu substrat yang diberikan pada mikroba untuk tumbuh sebaiknya sama atau lebih tinggi dari nilai KS.

Dalam Persamaan Monod, tingkat pertumbuhan berkaitan dengan konsentrasi sebagai pembatas tunggal substrat pertumbuhan melalui parameter 𝜇max dan KS. Selain itu, Persamaan Monod juga terkait koefisien hasil produksi sintesis sel (Y) terhadap nilai spesifik pertumbuhan biomassa (𝜇) dan nilai pemanfaatan (utilisasi) substrat (q). Hubungan tersebut dapat dituliskan dalam bentuk persamaan berikut:

Y= dxdS

(12)

q= μY

(13)

Ketika substrat digunakan dalam konsentrasi maksimum, bakteri akan tumbuh pada nilai maksimum pula (Metcalf dan Eddy, 2003) dan nilai µ akan selalu berhubungan dengan nilai q dan dituangkan ke dalam bentuk Persamaan 14.

qmax=μmax

Y(14 )

Menurut Pirt (1975) dalam Tribuwono (2006), substrat pembatas pertumbuhan suatu kultur akan mencapai konsentrasi biomassa maksimum (Xmax) saat mendekati akhir fase pertumbuhan menurun (declaining-growth phase). Pada titik ini, konsentrasi substrat pembatas pertumbuhan dapat diasumsikan nol (S~0) sehingga perbandingan Xmax

dengan S0 akan menghasilkan garis linier dengan kemiringan (slope) adalah koefisien produksi sintesis sel (Y). Koefisien ini dapat diartikan sebagai nilai produksi biomassa yang terbentuk per unit substrat yang tersisa ketika seluruh energi digunakan untuk sintesis (Grady dkk, 1999).

Dalam sistem biodegradasi, tidak semua sel berada pada fase pertumbuhan, melainkan terdapat pula bakteri yang mati atau melakukan proses respirasi. Faktor ini menyebabkan menurunnya massa sel dan proporsional terhadap penurunan konsentrasi mikroorganisme yang ada (Wahjuni dkk, 2007) sehingga laju kematian endogenous mikroba, kd (jam-

1) dapat diperoleh melalui persamaaan:

μ=μmaxS

K S+S−k d(15)

Gambar 6. Plotting data untuk mendapatkan nilai Kd

2. Metode dan Prinsip Pengukuran

Bakteri akan memperbanyak diri saat dimasukkan ke dalam medium baru yang sesuai. Jika hubungan antara jumlah bakteri dengan waktu diketahui, maka grafik atau kurva pertumbuhan akan diperoleh. Ada dua cara untuk mengetahui populasi bakteri yaitu melalui metode tidak langsung berdasarkan tingkat kekeruhan (turbiditas) dengan menggunakan spektrofotometer, dan metode langsung dengan metode Total Plate Count (TPC) melalui perhitungan jumlah sel-sel yang viabel sesuai dengan tingkat pengenceran yang telah ditentukan.

Praktikum ini menggunakan metode tidak langsung melalui pengukuran turbiditas. Pengukuran turbiditas dilakukan setiap beberapa interval waktu sesuai dengan kondisi populasi bakteri di dalam contoh uji hingga fase stasioner diperoleh. Alat spektrofotometer menggunakan panjang gelombang 610 nm. Meningkatnya nilai optical density (OD) kekeruhan diharapkan akan meningkatkan massa sel. Nilai konstanta laju pertumbuhan (µ) didapat dengan memplotkan nilai OD pada fase ekponensial sehingga dengan menggunakan analisis least square correlation dihasilkan kemiringan (slope) sebagai nilai µ. Kekurangan metode ini adalah peningkatan massa sel yang hidup dapat pula terhitung sebagai jumlah massa sel yang mati sehingga sehingga TPC sebagai metode langsung perlu dilakukan pada saat kurva menunjukkan fase eksponensial. Nilai µ berfungsi sebagai parameter dasar untuk mengetahui nilai kinetika biodegradasi lainnya. Umumnya, nilai kinetika tersebut diperoleh berdasarkan hasil regresi linear data.

3. Tujuan

Tujuan praktikum ini:a. Membuat kurva pertumbuhan bakteri petrofilikb. Menentukan nilai kinetika biodegradasi untuk melihat efektivitas bakteri

dalam proses remediasi tanah.

4. Alat dan Bahan

Praktikum ini menggunakan alat dan bahan sebagai berikut:a. Spektrofotometerb. Rotary shakerc. Pipet volumetrid. Neraca analitike. Bakteri Bacillus sp. dalam media cair. f. Oli bekas

5. Metode Kerja

a. Masukkan oli bekas sebagai substrat dengan konsentrasi 0,5-4,5% ke dalam wadah penampung (erlenmeyer/botol vial, dan lain-lain). Pemilihan konsentrasi akan ditentukan pada saat praktikum berlangsung.

b. Masukkan kultur tercampur media cair Bacillus sp. Sekitar 10-20 ml.c. Hitung nilai optical density kultur tercampur bakteri Bacillus sp.

menggunakan alat spektofotometri dengan panjang gelombang 610 nm.d. Lakukan setiap 10 menit selama 3 jam.e. Buatlah kurva pertumbuhan berdasarkan data yang telah diperoleh untuk

menentukan laju pertumbuhan bakteri (µ). Nilai dipilih hanya berdasarkan pada kondisi fase ekponensial.

f. Tentukan nilai kinetika biodegrasi sesuai dengan persamaan-persamaan yang telah dijabarkan sebelumnya. Untuk mempermudah pemahaman, runtutan proses perhitungan dapat dilihat pada Gambar 7.

g. Bahasan di dalam laporan: Jabarkan secara sistematis proses perhitungan parameter kinetika

biodegrasi. Untuk kurva tumbuh, bahas penyebab berfluktuasinya nilai optical

density. Bahas hasil perhitungan melalui tinjauan literatur. Hasil analisis dan pembahasan harus relevan dan saling terkait. Simpulan menjawab tujuan praktikum. Jenis sumber literatur berupa jurnal harus disitir maksimal 10 tahun

terakhir.

Gambar 7. Diagram alir perhitungan parameter kinetika biodegradasi

Daftar PustakaDoran, P. M. (1995) : Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, Oxford.Effendi, A. J. (2006) ; Treatibilty Test of Oil-Contaminated Soil Using Bio-Augmented

Bacteria, Jurnal Infrastruktur dan Lingkungan Binaan, Vol. II (2).Grady Jr., C. P. L., Daigger, G. T., Lim, H. C. (1999) : Biological Wastewater Treatment,

Marcel Dekker, New York.Helmy, Q. (2006) : Pengaruh Penambahan Surfaktan Terhadap Biodegradasi Sludge

Minyak Bumi Oleh Konsorsium Bakteri Petrofilik, Teknik Lingkungan ITB, Bandung (Tidak Dipublikasikan).

Metcalf & Eddy Inc. (2003) : Wastewater Engineering, Treatment and Reuse, McGraw-Hill, New York.

Okpokwasili, G. C., Nweke C. O. (2005) : Microbial Growth and Substrate Utilization Kinetics, African Journal of Biotechnology, Vol. 5 (4), 305-317.

Prescott, L. M. (2002): Microbiology, Ed. 5, McGraw-Hill, New York.Schuler, M. L., Kargi F. (2002) : Bioprocess Engineering Basic Concepts, Prentice Hall,

New Jersey.Tribuwono, B. R. (2006) : Kinetika Biodegradasi Limbah Minyak Bumi Menggunakan

Reaktor Batch Bioslurry, Teknik Lingkungan Universitas Trisakti, Jakarta (Tidak Dipublikasikan).

Wahjuni, N. S., Purnomo, S. H., Kusumaningrum, W. B. (2007) : Kinetika Proses Biodegradasi Anaerob Air Sampah Menggunakan Alat Bioreaktor Berpenyekat Anaerob, Ekuilibrium, Vol. 6 (1), 21-25.

-- ALK 2014 --