enzim & kinetika

36
ENZIM & KINETIKA ENZIM

Upload: agus-priyono

Post on 02-Jul-2015

1.738 views

Category:

Documents


27 download

TRANSCRIPT

Page 1: ENZIM & KINETIKA

ENZIM & KINETIKA ENZIM

Page 2: ENZIM & KINETIKA

• Molekul protein yang dihasilkan sel hidup• Katalis reaksi biookimia spesifik• Secara molekuler

merupakan protein yang tersusun atas serangkaian asam amino dalam komposisi dan sekuens yang teratur dan tetap

“SISI AKTIF ” (bag permukaan enzim yang berinteraksi dengan substrat)

• Tata Nama Enzim dan Klasifikasi

• Berdasarkan sumber enzim nama dagang (papain, bromelin)• Berdasarkan jenis reaksi, jenis substrat atau bentuk yang

dihasilkan (+)-ase (lipase, protease)• “International Union of Biochemistry”

E.C. (Enzyme Commision) + 4 bilangan (alkohol dehidrogenase E.C.1.1.1.1)

Contoh : alkohol dehidrogenase (E.C. 1.1.1.1)

Page 3: ENZIM & KINETIKA

• Reaksi Enzim

~ Model Lock & key (Emil Fisher)~ Model Induce Fit (Koshlan) Sisi aktif tidak kaku, substrat & asam amino enzim menginduksi

shg terbentuk struktur ruang yang tepat antara E dg S

Page 4: ENZIM & KINETIKA

• Struktur Enzim

Apoenzim (protein)Koenzim (non protein)

holoenzim

Gugus prostetik (terikat kuat : heme, flavin, biotin)

Kofaktor (terikat kurang kuat ):~ logam (Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, K+, Na+)

metaloenzim

~ turunan vitamin (NAD, FAD, thiamin pirofosfat)

Page 5: ENZIM & KINETIKA

• Aktifitas Enzim

Kerja enzim : mempercepat reaksi dengan menurunkan energi aktivasi (Ea)

Reaksi : E + S ES P + E (E-S) : kompleks aktif

Contoh : pemecahan H2O2 : 18.000 kalori/mol

~ katalis Pt : 11.700~ katalase : 5.500

→ waktu

Energi aktivasi

C (hasil)

B (E–S)

A

Ea

→ e

nerg

i

Page 6: ENZIM & KINETIKA

a. Pengaruh pHpH

pH optimum

Kec. maksimumK

ec. r

eaks

i

suhu

suhu optimum

Kec. maksimum

Kec

. rea

ksi

b. Pengaruh suhu

Kec

. rea

ksi

Kec. maksimum

2mV

Vm

Km

[substrat]

Vm: kec. Reaksi maksimumKm: konstanta Michaelis

c. Pengaruh [substrat]

Pem

bent

uka

n P

rodu

k

Waktu

d. Pengaruh aktivator

enzim

Enzim1 aktivator

Pem

bent

uka

n P

rodu

k

Waktu

d. Pengaruh inhibitor

enzim

Enzim1 inhibitor

Page 7: ENZIM & KINETIKA

Kinetika Enzim• Cabang Enzimologi : membahas faktor-faktor yang

mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis.• Mempelajari sifat-sifat enzim/mekanisme kerja

aplikasi (disain proses) → parameter kinetika

Page 8: ENZIM & KINETIKA

Persamaan Michaelis-Menten

E + S ES E + PK1 K2

K-1

Laju pembentukan produk/pengurangan substrat

1..................ESKdt

sd

dt

pd2

V

Vmaks = K2 [ES]

Konsentrasi enzim yang jenuh oleh S

Keadaan Setimbang

12

T1

TT

12

1

12

121

KK

SESEKES

ESEEESEE

KK

SEKES

ESKK

ESKESKSEK

Page 9: ENZIM & KINETIKA

S

KKK

SEKV T

1

12

2

2................................................SKKK

SEKES

112

T1

Substitusi (1) → (2)

Saat ET = ES Vmaks = K2[ES] = K2[ET]

1

12

K

KKKm

Bila Konstanta Michaelis-Menten

SK

SVV

m

maks

Persamaan Michaelis-Menten

Saat V = ½ Vmaks Km = [S]

Km →[S]

Vmaks

½ Vmaks

Page 10: ENZIM & KINETIKA

Line Weaver-Burk

maks

m

V

KSlope

V

1

mK

1

ba

• Unit Enzim Uadalah : jumlah enzim yang melakukan katalisis, sehingga terjadi perubahan 1 mol substrat per menit (kondisi tertentu)

• Aktivitas Enzim U/mL

• Aktivitas Spesifik U/mg protein enzim

ukuran kemurnian

maksV

1

maksmaks

m

VSV

K

V

11.

1

S1

Page 11: ENZIM & KINETIKA

Contoh :

[S] (Mol) V(mol/L.min) 1/[S] 1/V

8.35 x 10-6 13.8 12 x 104 7.24 x 10-2

1.00 x 10-5 16.0 10 x 104 6.25 x 10-2

1.25 x 10-5 19.1 8 x 104 5.23 x 10-2

1.67 x 10-5 23.8 6 x 104 4.20 x 10-2

2.0 x 10-5 26.7 5 x 104 3.75 x 10-2

2.5 x 10-5 30.8 4 x 104 3.25 x 10-2

3.3 x 10-5 36.2 3 x 104 2.76 x 10-2

5.0 x 10-5 44.5 2 x 104 2.25 x 10-2

1.0 x 10-4 57.2 1 x 104 1.75 x 10-2

2.0 x 10-4 66.7 0.5 x 104 1.50 x 10-2

-6 -4 -2 0 8642 10 12

11/Vmaks = 1.25 x 10-2

Vmaks = 80 mol/L.min

-1/Km = -2.5 x 104

Km = 4 x 10-5 M

1/V( mol/L.min)-1.102

1/[S] (M-1x10-4)

Page 12: ENZIM & KINETIKA

Soal : Hitunglah perubahan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk meningkatkan laju reaksi dari 15 % menjadi 75 % dari laju reaksi maksimum, bila laju reaksi mengikuti HUkum Michaelis-Menten

Jawab

mm

mm

mm

maksmaks

m

maks

KSKS

KS

KS

SK

S

SK

S

VVVV

SK

SVV

31765.025.0

75.0

85.0

15.0

75.015.0

%75%15

.

21

21

2

2

1

1

21

Perubahan konsentrasi S yang dibutuhkan untuk meingkatkan laju reaksi dari V1→V2 = 3 Km/0.1765 Km

=16.9972 kali17 kali

Page 13: ENZIM & KINETIKA

Syarat Penelitian Kinetika Enzim :

1. Substrat, buffer, dll harus murni

2. Tidak boleh ada enzim lain

3. Enzim stabil pada kondisi yang digunakan

4. Harus dicek apakah laju reaksi ~ enzim yang ditambahkan

5. Laju reaksi produk vs t → linier ?

konsumsi substrat

Page 14: ENZIM & KINETIKA

Inhibisi EnzimInhibitor mengurangi laju reaksi yang dikatalisis enzim

Studi inhibisi enzim :• Bagian aktif enzim• Mekanisme kerja enzin• Gugus fungsi aktif• Fisiologi enzim

Jenis penghambatan :• Kompetitif• Non kompetitif• Unkompetitif

Penghambatan :Produk : amiloglukosidase oleh glukosa

invertase oleh glukosa dan fruktosa substrat

Page 15: ENZIM & KINETIKA

Inhibisi Bersaing (kompetitif)S dan I bersaing pada bagian aktif enzimE + S ES → E + PE + I EI Inhibitor dapat dihilangkan dengan S >>

→Km >

1/S

1/V

Tanpa inhibitor

dengan inhibitorAs. Malonat vs as. suksinat s. dehidrogenase as. fumarat

Inhibisi Tidak Bersaing (non kompetitif)S dan I berikatan dengan enzim pada tempat yang berbeda

1/S

1/V

Tanpa inhibitor

dengan inhibitor→Vmaks <

Ion logam berat vs gugus sulfohidril (SH) dari sistein

Page 16: ENZIM & KINETIKA

Inhibisi uncompetitiveterikat secara reversibel ke dalam kompleks ES sehingga dihasilkan ESI inaktif

Km, Vmaks

berubah

1/S

1/V

Tanpa inhibitor

dengan inhibitordenosil metionin vs ATP

KInetika Michaelis-Menten tidak dapat diterapkan pada inhibisi irreversibel I membentuk ikatan dengan mol enzim yang tidak dapat dipisahkan dengan dialisis atau cara sejenis.

Page 17: ENZIM & KINETIKA

Sumber Enzim1. Tanaman (papain, bromelin, ficin)2. Hewan (renin)3. Mikroba

• Perkembangbiakan t <• Rendemen ekonomis• stabil

Enzim Komersial amilase : Aspergillus aryzae

Bacillus subtilis

• Selulase : Aspergillus spTricoderma reesei

• Glukoamilase : A. nigerRhizopus sp

• Lipase : Aspergillus sp.Rhizopus sp.Candida cylindraceae

• Protease : Aspergillus niger]A. oryzaeRhizopus sp.Bacillus sp.

Page 18: ENZIM & KINETIKA

Aplikasi Enzim di Industri1. Industri Non Pangan

• Analisis di Lab glukosa oksidase• Medis penisilin asilase, L-asparaginase, amilase, selulase,

lipase, protease• Kertas amilase• Deterjen protease, amilase, lipase

2. Industri Pangan• Gula Cair amilase, glukoamilase, glukosa isomerase• Keju rennin, lipase• Sari Buah pektinase

3. Biosensor• Biokimia+mikroelektronika

Biosensor (enzim imobil→sinyal fisikokimia) transducer (sinyal elektrokimia) amplifier pengubah sinyal dan pemroses data pencetak data

Page 19: ENZIM & KINETIKA

Golongan Aditif Enzim yang Distabilkan

Substrat dan Senyawa yang sejenis

Mg ATP Glutamat deaminase

Aspartat Glutamat deaminase

NAD, NADP Laktat dehidrogenase

Senyawa Organik dengan BM

Diamin Amilase, protease

Metanol Ribonuklease

Etilen Glikol -Laktanase

Dioksan Tripsin

Gliserol Ribonuklease, katalase, endonuklease

Sukrosa Khimotripsin

Laktosa Ribonuklease

Glukosa Lisozim

As. Askorbat Katalase

Senyawa Karbon Polimer Ca Protease

Na Sitrat Lisozim, Katalase

PEG Invertase

Hidroksi Etil Selulosa -glukosidase

Matil Selulosa Glukosa Oksidase

Page 20: ENZIM & KINETIKA

ENZIM

1. Larut dan tidak stabil Hanya dapat digunakan satu kali dalam larutan bebas

2. Enzim sangat mahal dan merupakan bahan yang sulit diperoleh dalam jumlah memadai

Harus digunakan cara yang ekonomis dan dapat memperpanjang

aktivitas biologisnya

Imobilisasi(membuat konformasi aktif enzim tahan terhadap lingkungan)

Struktur granula enzim padat yang stabil dan tidak larut air.

DEFINISI (Chibata, 1978) : Enzim yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu daerah/ruang tertentu, sehingga dapat menahan aktivitas katalitiknya serta dapat digunakan secara berulang-ulang dan kontinyu.

Page 21: ENZIM & KINETIKA

Metode Imobilisasi :1. “Carrier Binding

• Teknik paling lama dan umum• Enzim diikat pada “carrier” (matriks) yang tidak larut air

luas permukaan diemeter pori→ muatan enzim

• Jenis :a. Adsorbsi fisik

Mudah dilakukan dan ekonomis Enzim diadsorbsi pada permukaan “carrier”

Kelebihan : Kondisi lunak → aktivitas enzim tetap tinggi Dapat diregenerasi

Kelemahan : Kekuatan ikatan lemah

pH atau kekuatan ion berubah → bocor! Enzim dirusak oleh m.o/enzim proteolitik

E

Page 22: ENZIM & KINETIKA

Contoh “Carrier” untuk adsorbsi fisik :

• Karbon aktif • hidroksil apatit• Gelas porous • gel Ca-fosfat• Tanah liat • pati• Kaolinit • gluten• Alumina • butil sepharosa• Silika gel • concana valin A• Bentonit

Karbon aktif

-amilase

Aduk 10 0C, 1 jam Saring

Enzim Imobil

Lar. Pati

Amilase imobil

Gula

Page 23: ENZIM & KINETIKA

b. Ikatan Ionik • Terjadi ikatan ionik antara enzim dengan “carrier” yang tidak larut air dan

mengandung residu penukar ion (R)

R R R R

E

Substrat (camp. a.a.)

DEAE-sephadex + air

+ Aminoasilase + buffer fosfat (pH 7)

Jaket air

Terjadi interaksi antara gugus amine (carrier) yang bermuatan (+) dengan gugus karboksil (enzim) yang bermuatan (-)Setelah 32 hari → keaktifan masih 60 %

Page 24: ENZIM & KINETIKA

c. Ikatan Kovalen• Terbentuk ikatan kovalen antara enzim dengan “carrier” tidak larut dalam air

ikatan kuat & tdk bocor• Gugus fungsional enzim yang berperan :

1 atau -amino2 , , atau -karboksil3) Sulfohidril4) Hidroksil5) Imidazol6) Fenolik

• “Carrier” mengandung gugus reaktif : Diazonium Asam azida Isosianat Halida

• Kelemahan : konformasi berubah → aktivitas hilang

“carrier”

E

Page 25: ENZIM & KINETIKA

2. Cross Linking (Ikatan Silang)• Terjadi ikatan kimia, tetapi tidak digunakan carrier tidak larut air

Pembentukan ikatan melintang inter molekuler antara moleklul enzim dengan pereaksi bifungsional atau multifungsional.

• Pereaksi : glutaraldehid paling banyak digunakan diazobenzidine (atau turunannya) Etil chloroformate N-N-hexamethilene bisiodoasetat dll

Untuk meningkatkan stabilitas cross linking + adsorbsi

• Kopolimerisasi

Epolimer

Page 26: ENZIM & KINETIKA

3. Entrapping (penjeratan)• Lokalisasi enzim dalam kisi matriks atau mikrokapsul (membran

semipermeabel) Enzim tidak terikat pada matriks gel atau membran

dapat digunakan secara luas

tipe kisi

• Kennedy gel entrapmentfibre entrapmentmicrocapsulation

• tipe mikrokapsul

Tipe kisi

1 – 300 m

Membran polimer permanen

Mikrokapsul tidak permanen

Bahan :• Nilon• Poliurea• Etil selulosa• Polistiren• Kolodion• Nitroselulosa• Butil asetat selulosa

Page 27: ENZIM & KINETIKA

Cara Penjeratan Tipe Kisi

ENZIM enzim

Lar. Na-alginat 2 %

Makropipet 2 mL

CaCl2 0.1 M

Skala 4.5

Gel kalsium alginat yang berisi enzim

Page 28: ENZIM & KINETIKA

GEL* Na-alginat 50 mL, 4 % b/v

+50 mL suspensi sel

(25 g bobot sel basah)

dicampur

diteteskan

Lar. CaCl2 0.05 M(pH 6 – 8), 370C

Beads 2 – 8 mm

Diamkan 200C, 1 jam

Bilas dengan air

Rendam dalam CaCl2 0.05 M (semalam) 40C

Siap digunakan

Page 29: ENZIM & KINETIKA

Entrapment Enzim dengan Poliakrilamida (Gel Entrapment)E + CH2=CH + CH2=CH | | CONH2 C=O

|NH |CH2

|NH |C=O |CH=CH2

akrilamidaN,N’-methylene bis-acryl amide

polimerisasi

|NH |CO CONH2

| |-CH2-CH -CH2-CH -CH2-CH -CH2-CH -CH2-

| | CO CO | |NH NH | |CH2 CH2

| |NH NH | |CO CO

| |CH-CH2 - CH-CH2-C - CH2 –CH-CH2-

| |CONH2 CO

Matriks polimer merupakan ikatan silang akrilamida

poliakrilamida

Page 30: ENZIM & KINETIKA

Perubahan Sifat Enzim Terimobilisasi

1. Aktivitas

V1 tidak deaktivasi enzim akibat imobilisasiV2 kemungkinan untuk mengimobilisasi enzim lebih banyak/sedikkit per unit volume katalis

Penyebab penurunan aktivitas :• Konfigurasi enzim menghalangi substrat• Grup reaktif pada sisi aktif enzim ikut terikat pada matriks• Terbentuk konfigurasi tidak aktif• Kondisi reaksi denaturasi

V1(aktivitas relatif) Perbandingan aktivitas enzim imobil vs enzim larut

dalam jumlah sama

V2 (aktivitas spesifik absolut) Kecepatan reaksi per unit berat atau unit volume

seluruh katalis

Page 31: ENZIM & KINETIKA

2. pH optimum enzim imobilPenyebab perubahan pH : distribusi yang tidak seragam dari ion H+, ion OH- dan substrat

bermuatanCarrier bermuatan negatif pH optimum bersifat basa

CMCMaleac anhydride/ethyleneAsam galakturonatAsam poliaspartatAsam porous

Carrier bermuatan positif pH lebih asamDEAE-selulosaPolimer polyornithyl

c a b

Akt

ivita

s R

elat

if (%

)

→ pH4 7

a : enzim chymotripsin larutb : kopolimer chym – anhydride ethylene (-)c : chym – polyornithyl (+)

Page 32: ENZIM & KINETIKA

3. Stabilitas Stabilitas operasi = t1/2 (half-life) = waktu dimana terjadi kehilangan 50 % dari aktivitas enzim semula

E

Elog

t

2.303k

k

0.693t 0

21

k = konstanta kerusakan enzimt = waktu operasiE0 = aktivitas enzim mula-mulaE = aktivitas enzim pada wktu t

Page 33: ENZIM & KINETIKA

Pengukuran Efisiensi Imobilisasi

(Aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga)

• Larutan enzim : aktifitas : 591 U/mLvolume larutan : 40 mL

Total aktifitas : 40 x 591 : 23600 U

• Berat Penyangga : 11 gram

Setelah mobilisasiAktifitas enzim terimobilisasi : 381 U/g penyangga Total aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga = 11 x 381 U = 4191 U

Persentase aktifitas enzim teradsorbsi = 4191/23600 x 100% = 17,8 %

Page 34: ENZIM & KINETIKA

Imobilisasi Sel :• Meningkatkan konsentrasi biomassa produktivitas >• Decoupling konsentrasi sel dengan waktu tinggal• Operasi kontinyu pada residence time pendek, tidak terjadi wash out• Biomassa dapat digunakan kembali• Dapat digunakan tipe bioreaktor lain (fixed bed dan fluidized bed)• Pemisahan biomassa lebih mudah

Metode :1. Carrier biding : E. coli

A. oryzae, dll2. Entraping paling banyak diteliti

Matrik yang digunakan :• Kolagen → tipe membran• Gelatin• Agar• Selulosa triasetat → serat-serat selulosa• Alginat• Poliakrilamida• polistiren

3. Cross linking : e. coli

Page 35: ENZIM & KINETIKA

Aplikasi Enzim Imobil

• Produksi Glukosa dari Pati

Pati Jagung glukosa glukoamilase

imobil

Carrier : keramik SiO2

Bioreaktor : plug flow (sinambung) t1/2 : 40 0C = 900 hari

50 0C = 100 hari 60 0C = 13 hari

• Produksi Fruktosa dari Glukosa

Glukosa FruktosaGlukoisomerase imobil

Intraseluler mahal

Page 36: ENZIM & KINETIKA

• Produksi Asam AminoCampuran DL asan amino (metionin) D + LEnzim L-amino acid : acylaseCarrier : DEAE-Sephadex → kestabilan 2 th.Ukuran reaktor : 1000 mLBiaya 60 % proses batch konvensional

• Aplikasi Analitis→ elektrode enzim

enzim imobil

Bia

ya r

elat

if (%

)

imobil

: DEAE-sephadex: bahan bakar: tenaga kerja: enzim: substrat

Sistem Monitoring Glukosa

Kolom kapiler

Glu.oksidase

Elektroda O2

Recording elektrometer

Contoh (glukosa)

Glukosa O2

Glukoksidase Glukonolakton + H2O2

O2 diukur dengan elektroda