KLASIFIKASI MEDIA

Titi Lasmini, M.Sc

1. Medium berdasarkan sifat fisik• Medium padat > mengandung agar 15% • Medium setengah padat (semisolid) > mengandung agar

0,3-0,4% • Medium cair > tanpa agar

2. Medium berdasarkan Komposisi• Medium Sintesis > diketahui jenis dan takarannya

secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar• Medium Semi Sintesis > hanya sebagian bahan yang

komposisinya diketahui secara pasti. Contoh: PDA• Medium Non Sintesis > dibuat dengan komposisi yang

tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya. Contoh: Tomato Juice Agar

3. Media Berdasarkan Tujuan• Media Umum / untuk isolasi. Contoh: Nutrient

Broth, Blood Agar• Media Selektif/ penghambat bakteri yang tidak

diinginkan. Contoh: Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik

• Media Diperkaya (enrichment) > mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Contoh: Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar

• Media khusus. Contoh: Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon

• Media untuk karakterisasi. Contoh: Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

• Media diferensial. Contoh: TSIA (Triple Sugar Iron Agar) mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni, Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.

Bahan-Bahan yang diperlukan dalam media

• Air sebagai pelarut• Agar untuk memadatkan media• Gelatin > lebih mudah terurai• Silica Gel > khusus untuk mikroorganisme

autotrof obligat

1. Bahan Dasar

• Sumber karbon organik (karbohidrat, protein, lemak, dan asam organik) dan karbon anorganik

• Sumber nitrogen organik (protein, asam amino) dan nitrogen anorganik (urea)

• Vitamin• Unsur mikro: Fe dan Mg

2. Nutrisi

• Ditambahkan dengan tujuan tertentu• Contoh: phenol red, bromotimol blue >

sebagai indikator perubahan PH• Antibiotik > untuk menghambat

pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan

3. Bahan tambahan

• Pepton > sumber protein > terbuat dari hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai

• Meat extract > terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi

• Yeast extract > sumber asam amino dan vitamin > terbuat dari ragi

4. Bahan lain

Media Selektif dan diferensial

• Contoh: Media mengandung potassium tellurite, sodium azide atau thallium acetate (0.1 - 0.5 g/l) akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram-negatif.

• Media yang mengandung penicillin (5-50 units/ml) atau crystal violet (2 mg/l) akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif.

Manitol Salt Agar (MSA)

• Medium selektif untuk isolasi Staphylococci patogenik• MSA mengandung mannitol, indikator phenol red, dan

7.5% sodium chloride• Konsentrasi garam tinggi menghambat pertumbuhan

banyak bakteri selain staphylococci• Staphylococcus aureus dapat tumbuh membentuk

koloni kecil dikelilingi zona kuning• S. aureus dapat memfermentasi mannitol,

menghasilkan asam sehingga menyebabkan perubahan warna indikator dari merah menjadi kuning

• Bawah > Staphylococcus aureus > fermentasi mannitol +• Atas > S. epidermidis > fermentasi mannitol -

Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)

• Medium selektif dan differential digunakan untuk deteksi dan isolasi Gram-negative intestinal pathogens

• Kombinasi eosin dan methylene blue digunakan sebagai indikator dan menunjukkan perbedaan bakteri pemfermentasi laktosa dan non-fermenter

• Sakarosa ditambahkan karena beberapa anggota Enterobacteria atau coliform lebih mudah memfermentasi sakarosa dari pada laktosa

• Methylene blue sebagai penghambat Gram-positif

Pertumbuhan bakteri pada EMBA

• E. coli > koloni tampak gelap dibagian tengah dan tampak berkilau dengan warna hijau metalik

• Enterobacter aerogenes > koloni pink dan are mucoid dan lebih besar dari koloni E. coli

• Salmonella tidak memfermentasi laktosa atau sakarosa dan menghasilkan koloni tidak berwarna

Komposisi medium/Liter

• Enzymatic Digest of Gelatin .......................................10 g • Lactose.......................................................................10 g • Dipotassium Phosphate ............................................. 2 g • Eosin Y......................................................................0.4 g • Methylene Blue...................................................... 0.065 g • Agar............................................................................15 g • Final pH: 7.1 0.2 at 25°C

MacConkey

• Medium selektif dan diferensial untuk deteksi bakteri coliform dan enterik patogen

• Medium ini dapat juga digunakan sebagai medium diferensial untuk deteksi dan isolasi bakteri penyebab disentri, tipoid, dan paratipoid

• Umumnya digunakan untuk membedakan strain Salmonella typhosa dari anggota coliform lainnya

• Medium ini mendukung pertumbuhan seluruh strain Salmonella dan Shigella

• Koloni bakteri coliform berwarna merah bata dan dikelilingi zona endapan empedu yang terbentuk karena produksi asam dari fermentasi laktosa

• Dysenteri, tipoid dan paratpoid bacilli tidak memfermentasi laktosa tetapi memberi reaksi alkalin. Koloni bakteri tersebut tidak berwarna dan transparan

• Crystal violet dan garam empedu dalam medium menghambat Gram positif

• Garam empedu juga menghambat pertumbuhan bakteri non-intestinal

Lac +• Escherichia coli (most

strain)• Klebsiella pneumoniae• Enterobacter cloacae

Lac -• Salmonella enteria ssp.

Enterica• Shigella spp• Proteus spp• Citrobacter freundii (some

strain)• Morganella morganii• Providencia spp

Inhibition of growth • Staphylococci• Streptococci• Enterococci

Ciri pertumbuhan bakteri pada MacConkey

Bakteri Ciri pertumbuhan

E. Coli Pink sampai merah. Koloni mungkin dikelilingi zona endapan empedu

Enterobacter cloacae Pink, mucoid.

Klebsilla pneumoniae Pink, mucoid.

Proteus Tidak berwarna

Pseudomonas aeruginosa Tidak berwarna sampai pink.

Salmonella and Shigella Tidak berwarna

Gram-positive bacteria Tidak tumbuh atau sedikit tumbuh (pink pucat).

Koloni bakteri pada medium MacConkey Agar

Klebsiella pneumoniae on MacConkey (lactose +)

K. Pneumoniae dan Salmonella enterica on MacConkey (lac + and -)

Komposisi medium/Liter• Enzymatic Digest of Gelatin.................................................... 17 g • Enzymatic Digest of Casein ................................................... 1.5 g • Enzymatic Digest of Animal Tissue........................................ 1.5 g • Lactose ................................................................................... 10 g • Bile Salts Mixture ................................................................... 1.5 g • Sodium Chloride ....................................................................... 5 g • Neutral Red.......................................................................... 0.03 g • Crystal Violet...................................................................... 0.001 g • Agar ..................................................................................... 13.5 g • Final pH: 7.1 ± 0.2 at 25C

Endo agar

• Medium selektif dan diferensial untuk isolasi dan diferensiasi bakteri gram negatif

• Mengandung sodium sulfite dan basic fuchsin yang menghambat pertumbuhan Gram positif

Lac +

• Escherichia coli (most strains)

• Klebsiella pneumoniae• Entrobacter cloacae

Lac -• Salmonella

enterica ssp. enterica• Shigella spp.• Proteus spp.• Citrobacter freundii (some

strains)• Morganella morganii• Providencia spp.

Inhibition of growth• staphylococci• streptococci• enterococci

Bakteri Ciri pertumbuhan

E. Coli Colonies pink to rose-red with/without green metallic sheen

Enterobacter cloacae Pink to rose-red, mucoid.

Klebsilla pneumoniae Pink to rose-red, mucoid.

Proteus Colorless

Pseudomonas aeruginosa Colorless.

Salmonella and Shigella Colorless.

Gram-positive bacteria No growth to slight growth (pale pink to red).

Escherichia coli laktosa positif pada Endo agar

Lactose positive colonies of Klebsiella pneumoniae on Endo agar

Escherichia coli on Endo agar(lactose positive, metallic sheen)

Salmonella entericaon Endo agar (Lac -)

Shigella flexneri on Endo agar(lactose negative)

Shigella flexneri on Endo agar (lactose negative)

Komposisi medium/Liter

• Dipotassium Phosphate...........................................3.5 g • Peptic Digest of Animal Tissue ..............................10.0 g • Agar ......................................................................15.0 g • Lactose .................................................................10.0 g • Sodium Sulfite ........................................................2.5 g • Basic Fuchsin ..........................................................0.5 g

Blood Agar

• Mengandung darah domba 5–10%. • Media diperkaya dan diferensial untuk isolasi bakteri yang sulit

tumbuh pada media dan mendeteksi aktivitas hemolisis • β-hemolytic > menunjukkan adanya lisis dan pencernaan

komponen sel darah merah secara sempurna disekeliling koloni: Streptococcus haemolyticus.

• α-hemolysis > hanya menyebabkan partial lysis dari sel darah merah (membran sel tetap utuh) dan akan tampak hijau atau coklat, karena adanya konversi hemoglobin menjadi methemoglobin: Streptococcus viridans

• γ-hemolysis (nonhemolytic) > tidak ada aktivitas hemolisis• Blood Agar mengandung meat extract, tryptone, sodium chloride,

dan agar.

Hemolisis pada Streptococcus Spp.

• Kiri > α-hemolysis oleh S. mitis > koloni berwarna kehijauan• tengah > β-hemolysis S. pyogenes > terbentuk zona jernih

disekeliling koloni• kanan > γ-hemolysis (nonhemolytic) pada S. salivarius

Hemolysis on blood agar

Komposisi Blood Agar/Liter

• Enzymatic Digest of Casein ............................................. 15 g • Enzymatic Digest of Animal Tissue.................................... 4 g • Yeast Extract...................................................................... 2 g • Corn Starch........................................................................ 1 g • Sodium Chloride ............................................................... 5 g • Agar ................................................................................ 14 g • Final pH: 7.0 ± 0.2 at 250 C

Salmonella Shigella Agar (SSA)

• Medium selektif dan diferential isolasi Salmonella spp. Dan beberapa strain Shigella spp.

• Sumber C: Laktosa• Bile Salts, Sodium Citrate dan Brilliant Green menghambat Gram-

positif, mayoritas coliform, dan Proteus spp.,• Sodium Thiosulfate dan Ferric Citrate untuk mendeteksi adanya

hydrogen sulfide ditandai oleh koloni berwarna hitam dibagian tengahnya

• Neutral Red > pH indikator. Neutral red turns red in the presence of an acidic pH, thus showing fermentation has occurred.

• Sodium thiosulfate > sumber hydrogen sulfide • ferric citrate > indikator adanya produksi hydrogen sulfide

• Salmonella spp. dan Shigella spp. > non-lactose fermenters > koloni tidak berwarna

• H2S positif Salmonella spp. > warna hitam ditengah koloni

• Beberapa Shigella spp. Pertumbuhannya terhambat pada SSA

• E. coli > koloni pink sampai merah dan kadang memiliki presipitasi empedu

Pertumbuhan koloni bakteri pada SSA

Komposisi SSA• Formula / Liter Beef Extract ................................................. 5 g • Enzymatic Digest of Casein ................................................... 2.5 g • Enzymatic Digest of Animal Tissue........................................ 2.5 g • Lactose ................................................................................... 10 g • Bile Salts ................................................................................ 8.5 g • Sodium Citrate ....................................................................... 8.5 g • Sodium Thiosulfate ................................................................ 8.5 g • Ferric Citrate ............................................................................. 1 g • Brilliant Green ................................................................ 0.00033 g • Neutral Red........................................................................ 0.025 g • Agar ..................................................................................... 13.5 g • Final pH: 7.0 ± 0.2 at 25C

LJ Medium (Loweinstain-Jensen Medium)

• Medium pertumbuhan mengandung telur dan glierol khususnya untuk isolasi dan membedakan anggota Mycobacterium >> M. tuberculosis

• Suspensi Glicerol dan telur menyediakan asam lemak dan protein yang dibutuhkan untuk metabolisme Mycobacteria.

• Sodium Citrate dan Malachite Green adalah selective agents untuk mencegah pertumbuhan kontaminan

• Bentuk koloni M. tuberculosis > kering, berkeriput, kasar, krem kekuningan

• Inkubasi memerlukan waktu 4-6 minggu karena doubling time M. tuberculosis lambat (15-20 jam)

Komposisi LJ medium

• Formula / Liter • L-Asparagine ..........................................................................3.6 g • Monopotassium Phosphate....................................................2.5 g• Magnesium Sulfate...............................................................0.24 g• Sodium Citrate........................................................................0.6 g• Malachite Green .....................................................................0.4 g• Potato Flour.............................................................................30 g

Suplement:• Gliserol……………………………... 12 ml• Suspensi telur ………………….. 1000 ml

Medium untuk karakterisasi (Uji)

• Digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula

• Medium TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa,

• Indikator fenol merah, serta FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam

• Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja yang terlihat

• Medium TSIA diinokulasikan dengan menusukkan ose sedalam ¾ medium lalu menggoreskannya pada bagian slant media

Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

• Bila mikroorganisme hanya dapat memfermentasikan glukosa > butt media akan berwarna kuning (bersifat asam) dan bagian slant-nya akan berwarna merah (bersifat basa)

• Memfermentasikan laktosa atau sukrosa atau keduanya, maka bagian slant dan butt media akan berwarna kuning (bersifat asam) serta bagian butt media kadangkala terpecah akibat pembentukan gas seperti H2 dan CO2

Simmon citrat agar• Untuk membedakan bakteri berdasarkan kemampuannya menggunakan

citrate• Fecal coliform tidak mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon

tunggal • Non-fecal coliform (Enterobacter aerogenes) > mampu menggunakan

sitrat sebagai sumber karbon tunggal

Christensen's Urea Agar

• Membedakan bakteri yang mampu memetabolisme urea • Penghasil urease (lemah) seperti Klebsiella, Enterobacter dll.

Juga dapat dibedakan. • Membedakan Yersinia pseudotuberculosis (urea positive) dari

Yersinia pestis (urea negative)

Metode penyimpanan kultur bateri

• Bakteri di tanam pada media cair atau agar, kemudian disimpan

• Dapat disimpan sampai 10 tahun• Kerugian: harus selalu dipindah ke media

baru, resiko kontaminasi tinggi, bakteri dapat bermutasi

1. Metode subkultur

2. Penyimpanan pada suhu rendah

• Bakteri ditanam pada medium agar plate/slant kemudian disimpan pada suhu 4-8o C

• Penyimpanan jangka panjang• ¾ Kultur cair bakteri 24-48 jam dicampur ¼

gliserol steril > simpan pada suhu -20o C• Penyimpanan pada nitrogen cair

3. Freeze-Drying

• Suspensi mikroorganisme dibekukan kemudian diletakkan dalam sebuah vakum untuk mensublimasi cairan sehingga terbentuk bubuk

• Bubuk kering kemudian disimpan dalam vial yang disegel di dalam vakum

• Kultur dapat disimpan sampai 20 tahun• Pembuatan media untuk freeze-drying biasanya

ditambah 10% skim milk

4. Penyimpanan dalam air destilasi

• Metode untuk menyimpan bakteri: Pseudomonas fluorescens, Erwinia spp., Xanthomonas campestris, Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus.17 ., dan fungi

• Bakteri yang berada pada fase stasioner dimedium agar kemudian disuspensi dalam 10 mL air steril kemudian di sealed (segel) dengan parafilm lalu simpan pada suhu ruang dalam gelap

• Stabilitas kultur akan lebih baik jika disimpan dengen mensuspensi bakteri dalam tabung bertutup ulir berisi phosphate buffered saline (PBS) pH 7.2.

5. Metode pengeringan (drying)

• Penyimpanan kultur dengan tanah atau pasir steril

• Untuk bakteri pembentuk spora• Suspensi bakteri dituangkan ke tanah/pasir

lalu dikeringkan pada suhu ruang • Atau dengan mencampur suspensi bakteri

dengan gelatin dan dikeringkan dalam desikator