VEKTOR

VEKTOR

Molekul DNA untuk “transpor” sekuens DNA.

Syarat:

o Mampu bereplikasi mandiri

o Mengandung penanda/marker

o Berat molekul kecil

o Memiliki situs restriksi unik

o Memiliki beberapa kopi pada setiap sel

o Tidak berkonjugasi.

Contoh: plasmid, bakteriofag lambda, YAC, BAC, cosmid.

PLASMID as VEKTOR

Double-stranded, circular, self-replicating, extra-

chromosomal DNA molecules.

Dalam satu sel bisa terdapat beberapa plasmid

Ditemukan pada bakteri dan yeast

Mengandung:

o ORI

o Selektif marker

o Multiple cloning site

ORI

Titik inisiasi replikasi

Tanpa ORI, DNA tidak akan dapat direplikasi.

MARKER SELEKTIF

Diperlukan untuk maintenance plasmid di dalam sel.

Kehadirannya membuat plasmid jadi berguna untuk sel.

Di bawah kondisi selektif, hanya sel yang mengandung

plasmid dengan marker selektif yang dapat survive.

MULTIPLE CLONING SITE

Disebut juga polylinker, merupakan situs yang dikenali oleh

restriksi endonuklease

Bersifat spesifik

Tempat penyisipan gen

MULTIPLE CLONING SITE

VEKTOR KLONING

VEKTOR KLONING

Media untuk memperbanyak dan mentransformasi fragmen

DNA

TIPE VEKTOR

Tiap tipe digunakan untuk tujuan eksperimen yang berbeda.

Dipilih berdasarkan :

o Ukuran fragmen

o Ukuran vektor

o Situs restriksi

o Jumlah kopi

o Efisiensi kloning

o Kemampuan utk

ditapiskan

o Tujuan eksperimen

PLASMID

PLASMID

Kloning DNA dengan ukuran >10kbp

Misal : pBR322, pUC18

Kelemahan: o Tidak untuk fragmen DNA besar

o Ukuran 0-10 kb

Kelebihan: o Berukuran kecil, mudah dihandle

o Cocok untuk kloning fragmen

kecil

o Transformasi efisien

JENIS PLASMID

F-plasmid R-plasmid

Col-plasmid Degradative plasmid

Virulence plasmid

BAKTERIOFAGA LAMBDA

Virus penginfeksi E.coli

Ukuran fragmen 5-25 kbp

dsDNA

Memiliki 5’ twelve-base-pair sticky end (cos site)

Replikasi di dalam inang

Harus membawa satu atau lebih marker selektif

Harus memiliki situs restriksi pada bagian dna nonesensial.

Contoh: λ gt 10 dan λZAP

BAKTERIOFAGA LAMBDA

VEKTOR BERKAPASITAS BESAR

Cosmid (<50kbp), PAC dan BAC (100-300kbp), YAC (20-

2000kbp)

Manfaat :

o Memperkecil jumlah klon pustaka DNA yang harus dibuat

o Memudahkan penyimpanan.

o Mempercepat proses seleksi transformant target

COSMID

Dikembangkan dari plasmid, dilengkapi dengan sekuens

cos dan gen ori

Ukuran fragmen yang diinsersi 35-57 kbp

Bersifat seperti plasmid dan faga

TRANSFEKSI COSMID

PAC

P1-derived Artificial

Chromosomes

sistem kloning untuk isolasi

DNA genomik berdasarkan F-

factor plasmid

mengandung beberapa elemen

dari klon bakteriofag P1

(recombination or packaging

site)

Dapat membawa sekuens

insersi hingga beratus kbp.

Perkembangbiakan di dlm sel

E.coli

BAC

Bacterial Artificial Chromosomes

Sistem kloning utk isolasi DNA berdasarkan F-faktor plasmid dengan jumlah kopian rendah

Dapat diklon seperti plasmid dalam sel bakteri dan dapat membawa sekuens insersi beberapa ratus kbp (300kbp)

lebih sedikit mengandung khimera dan efisiensi transformasi 100x dibanding YAC

YAC

Tool untuk kloning pada sel eukaryotik

Hasil perkembangan plasmid pBR322 dengan komponen gen yeast: SUP4, 7RP1, HIS3, URA3

Yeast Artificial Chromosome mengandung:

o Yeast ORI/ARS

o Centromer

o Telomer pada tiap ujung

o Marker selektif

Ukuran fragmen yang dapat diinsersi 500-2000 kbp

Sering ditemukan khimaera (DNA yang disisipkan dalam vektor kloning berasal dari 2 sumber/ area kromosom yang berbeda)

YAC

VEKTOR EKSPRESI

VEKTOR EKSPRESI

Plasmid atau virus yang didesain untuk ekspresi protein.

Digunakan misalnya untuk menghasilkan protein, misalnya

insulin.

Vektor ekspresi harus memiliki element ekspresi seperti:

o Promotor, RBS, terminator, start codon.

SISTEM EKSPRESI

Ekpresi dari vektor menyebabkan segmen DNA dapat ditranslasikan di sel inang. Berikut tipe vektor dan inang yang sesuai:

Bakteri: plasmid, faga.

Yeast: plasmid, YACs

Sel serangga: Baculovirus, plasmid

Mamalia:

o SV40

o Vaccinia virus

o Adenovirus

o Retrovirus

o CHO, HEK293

SISTEM EKSPRESI PROKARIOT

E. coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans

Prokaryotic promoter—ribosome binding site—MCS—transcription termination site

Prokaryotic selectable marker

BEBERAPA MASALAH YANG TIMBUL PADA

SISTEM EKSPRESI BAKTERIAL Tingkat ekspresi rendah:

o Perubahan promoter

o Perubahan plasmid

o Perubahan tipe sel

Degradasi protein

Hilangnya post-translational modification

Misfold protein

Terbatasnya oksigen

Pembentukan biofilm

SISTEM EKSPRESI PADA EUKARIOT

• Yeast, Aspergillus niger, Baculovirus-Insect Cells, Mammalian Cells (e.g. Chinese Hamster Ovary cells)

• Eukaryotic promoter-MCS-transcription termination site

• Eukaryotic selectable marker

Dapat dilakukan post

translational

modification.

- Glikosilasi

- Fosforilasi

- Hidroksilasi

APLIKASI VEKTOR EKSPRESI

Jurnal “Subkloning α-L- arabinofuranosidase (abfA) dalam

vektor ekspresi pYES2” (Wirajana dkk 2010: 149—157).

LATAR BELAKANG

Semakin melimpahnya limbah hemiselulosa dari

pertanian. Oleh karena itu diperlukan suatu teknik bioproses

yang ramah lingkungan guna mengubah limbah pertanian

berupa hemiselulosa tersebut menjadi produk yang

bermanfaat, misalnya etanol, xilitol, dan lain-lain.

APLIKASI

Hemiselulosa terdiri atas utamanya berupa xilan,

arabinan, arabinogalaktan. Penelitian menggunakan enzim α-

L-arabinofuranosidase yang gennya diperoleh dari Geobacillus

thermoleovoans IT-08 termofilik yang telah diklon ke plasmid

pTP510 dalam E.coli DH5α.

BAHAN: E.coli DHα pembawa plasmid pTP510, E.coli Top10,

plasmid ekspresi pYES2.

Cara kerja Perbanyakan plasmid pTP510 dan pYES2

Isolasi pTP510 dan pYES2

Analisis restriksi pTP510 dan pYES2

Desain primer pFSacI-Af dan pXohoI-Af

Amplikon dielektroforesis agarosa

Cara kerja Pemotongan fragmen DNA dan plasmid pYES2 SacI dan XhoI

Elektroforesis hasil restriksi

Ligasi dengan T4ligase

Transformasi hasil ligasi ke E.coli Top10

Kultivasi , isolasi, dan purifikasi

Analisis restriksi

Jurnal

3/30/2015

SELESAI

ANY QUESTIONS?