ACARA I

STERILISASI PERALATAN DAN MEDIA

A. Pendahuluan

Dalam metode kultur jaringan diperlukan lingkungan yang steril. Suatu contoh yang paling baik adalah ruang bedah dirumah sakit. Ada beberapa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pemanasna kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi.

Pemanasan kering adalah cara sterilisasi dengan suhu tinggi menggunakan oven. Cara ini hanya digunakan untuk alat-alat gelas, peralatan logam, atau bahan lain yang tidak mudah pecah karena suhu tinggi. Bahan yang mengandung kapas, kertas, atau plastik tidak dapat disterilkan. Pisau potong dan scalpel jangan disterilkan dengan cara ini karena akan menyebabkan tumpul.

Pemanasan basah adalah cara sterilisasi menggunakan autoklaf. Alat tanam seperti pinset, gunting dapat disterilkan dengan cara ini. khusus untuk pisau sterilisasi dianjurkan dengan cara pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petridish, botol kosong, jarum dan pipet. Kertas aluminium umum digunakan sebagai pembungkus, walaupun tidak dianjurkan karena uap tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Suhu sterilisasi adalah 1210C pada tekanana 17,5 psi selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Akuades juga perlu disterilkan dalam autoklaf dengan waktu, suhu dan tekanan sama seperti sterilisasi alat.

Media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang tidak tahan panas, dapat disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C tekanan 17,5 psi selama 20-30 menit, tergantung volume wadah dan media.

Setelah waktu sterilisai dicapai tekanan dibiarkan turun perlahan sampai mencapai tekanan atmosfer. Penurunan tekanan secara mendadak akan menyebabkan media dan akuades mendidih dan meluap. Memperpanjang waktu sterilisasi harus dihindarkan karena dapat menyebabkan terurainya bahan kimia yang ada dalam medium. Setelah bahan kertas disterilkan dengan autoklaf bahn harus diletakkan dalam oven pengering sebentar untuk menguapkan air yang mengembun. Hal lain yang harus diperhatikan adalah ketersediaan aiar dalam autoklaf. Setiap kali pemakaian autoklaf harus menambah air dan dianjurkan menggunakan akuades.

Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk mensterilkan permukaan tempat kerja biasanya menggunakan etanol atau isopropanol 70%. Etanol dengan konsentrasi lebih tinggi (80%) secara berkala digunakan untuk mensterilkan peralatan.

Sterilisasi permukaan bahan tanaman dapat dilakukan dengan mencelup dalam larutan natrium hipoklorit (NaOCl) atau kalsium hipoklorit (Ca(Ocl)2). Pada umumnya laboratorium menggunakan larutan pembersih rumah tangga seperti korox atau bayclin.

B. Tujuan

Tujuan : untuk mengetahui bagaimana cara sterilisasi alat sebelum melakukan kultur.

C. Alat dan Bahan

Pinset, pipet, gagang scalpel, erlemeyer, gelas ukur, botol untuk media, cawan petri, kertas filter / aluminium, tabung, autoklaf.

D. Cara Kerja

1) Alat yang akan disterilkan dicuci bersih dan dikering anginkan.

2) Siapkan kertas aluminium yang telah dipotong segi empat dengan ukuran sesuai dengan alat yang akan dibungkus.

3) Botol atau tabung yang berisi atau media tanam yang akan disterilkan, mulut botol ditutup tutup botolnya atau dengan kertas aluminium. Penutupan jangan terlalu rapat karena uap air dalam tabung dapat mengembang dan menyebabkan botol pecah.

4) Bila menggunakan kertas aluminium sebagai penutup, kertas diletakkan diatas mulut botol persis ditengah. Buat lingkaran dengan menekan ujung ibu jari dengan jari kelingking bersama sama, dan dengan gerakan ke bawah sambil menekan kertas aluminium melekat pada leher botol/ tabung. Kertas aluminium harus lebih panjang 2-3 cm dari mulut botol/ tabung.

5) Masukkan alat/ bahan yang akan disterilkan dalam autoklaf yang sudah diisi air. Atur suhu 1210C dengan tekanan 17,5 psi. untuk alat dan botol waktu sterilisasi 1 jam sejak tekanan yang diinginkan telah tercapai. Sedangkan untuk media cukup 20-30 menit.

6) Setelah waktu sterilisasi yang diperlukan telah tercapai, biarkan tekanan autoklaf turun sampai sama dengan atmosfir, baru dibuka.

E. Pelaksanaan

Dalam praktikum sterilisasi peralatan dan media, sterilisasi yang digunakan adalah dengan cara sterilisasi pemanasan basah yaitu menggunakan autoklaf. Alat-alat seperti pinset, pipet, gagang scalpel, erlemeyer, gelas ukur, botol untuk media, cawan petri, dan juga aquades disterilkan dengan autoklaf. Sebelumnya dibungkus dulu dengan kertas aluminium. Suhu sterilisasi adalah 1210C pada tekanana 17,5 psi selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Setelah waktu sterilisasi tercapai, biarkan tekan autoklaf turun sampai sama dengan atmosfir lalu baru dibuka. Kemudian disimpan ditempat yang steril agar tidak terjadi kontaminasi.

F. Kesimpulan

Dari praktikum diatas dapat disimpulkan bahwa sebelum melakukan kultur hal yang perlu diperhatikan adalah sterilisasi peralatan dan media. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pemanasan kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi. Dalam praktikum digunakan cara yang kedua yaitu pemanasan basah dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang harus digunakan disterilisasi terlebih dahulu selama 1 jam dengan suhu 1210C dan tekanan 17,5 psi dalam autoklaf.

ACARA II

PENYIAPAN MEDIA TANAM

A. Pendahuluan

Organ tanaman mempunyai tugas berbeda dalam metabolisme. Sangat sedikit pengetahuan tentang kebutuhan hara untuk organ tanaman dibandingkan apa yang diketahui tentang kebutuhan tanaman utuh. Tanaman yang tumbuh di tanah memerlukan pemberian unsur mineral dari luar agar dapat tumbuh baik. Akar yang dipotong tidak persis sama kebutuhannya untuk tumbuh dan berkembang normal. Selain mineral essensial akar yang dipotongjuga memerlukan tambahan senyawa organik pada medium tumbuhnya, karena ketika akar masih melekat pada tanaman mineral ini disediakan atau disintesis di tempat lain dan di transportasikan ke akar.

Keberhasilan teknik yang menggunakan kultur sel, jaringan atau organ tanaman berkaitan dengan beberapa faktor. Faktor utama adalah pemilihan komponen hara, dan zat pengatur tumbuh. Komponen medium kultur meliputi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, vitamin, asam amino dan tambahan senyawa organik, karbohidrat, air dan medium.

Garam anorganik

Selain karbon, hidrogen dan oksigen, unsur yang diperlukan dalam jumlah banyak adalah unsur makro. Sebagai sumber nitrogen dapat digunakan nitrat atau ammonium, atau kombinasi keduanya. Magnesium sulfat dapat menyediakan baik kebutuhan magnesium maupun sulfur. Fosfor diberikan dalam bentuk Na2H2PO4.H2O atau KH2PO4. Kalium merupakan kation dengan jumlah terbesar, diberikan berupa KCl, KNO3, atau KH2PO4, CaCl2.2H2, Ca(NO3)2.4H2O atau bentuk garam anhydrous, dapat digunakan sebagai sumber kalsium. Natrium, walaupun umumnya tidak dibutuhkan oleh tanaman tingkat tinggi, unsur ini mungkin merupakan kebutuhan untuk kultur jaringan halofit, tanaman C4, dan tanamna CAM (Crassulacean acid metabolism).

Selain unsur makro, juga dibutuhkan unsur mikro seperti Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, dan Mo.

Zat Pengatur Tumbuh

Kebutuhan zat pengatur tumbuh untuk kebanyakan kultur kalus adalah auksin dan sitokinin. Auksin merupakan senyawa yang dibutuhkan untuk menginduksi pembelahan sel, pemanjangan sel, dan seringkali untuk pengakaran. Senyawa auksin sering digunakan bersamaan dengan sitokinin. Pada umumnya sitokinin merupakan turunan adenin (aminopurin), yang mempunyai peranan menginduksi tunas, mendorong pembelahan sel jaringan tanaman, mengatur pertumbuhan dan perkembangan seperti kinetin. Auksin yang sering digunakan adalah IAA, α-NAA, dan 2,4 D. sedangkan sitokinin yang banyak digunakan adalah kinetin, benzyladenin dan zeatin. Bentuk alami dan lebih murah dari zeatin adalah 6-(γ, γ-dimetyl allyl-amino)purin atau n6-[d2-isopentyl]-adenin. Diphenyl-urea yang terdapat dalam air kelapa, dapat memperlihatkan tanggapan seperti sitokinin.

Vitamin

Vitamin mempunyai fungsi katalisator dalam sistem enzim dan dibutuhkan hanya dalam jumlah sangat sedikit. Tiamin (vit B1) dipandang sebagai satu-satunya vitamin penting untuk hampir semua kultur jaringan tanaman, sedangkan niacin dan pyridoxine (vit B6) dapat memacu pertumbuhan. Thiamin yang diberikan berupa Thiamin –HCl.

Penambahan Asam Amino dan Senyawa Organik

Asam amino biasanya tidak ditambahkan pada media kultur tanaman, kecuali glisin. Asam amino dapat mendorong pertumbuhan sel dan regenerasi tanaman. Apabila suatu campuran nitrogen organik diperlukan, medium dpat diperkaya dengan casein hidrosilat. Asam amino khusus kadang-kadang diperlukan untuk menginduksi respon fisiologis.

Penggunaan ekstrak alami tidak dapat diabaikan apabila campuran bahan kimiawi tertentu gagal mendapatkan hasil yang diinginkan, misalnya penggunaan aiar kelapa dari kelapa segar. Cairan buah juga penting sebagai tamabahan senyawa organik.

Karbohidrat

Semua media memerlukan gula sebagai sumber karbon dan energi. Hampir semua kultur menghasilkan pertumbuhan optimum dengan penambahan disakarida sukrose, namun akan diperoleh keragaman pertumbuhan apabila ditambahkan disakarida yang lain atau monosakarida sebagai pengganti sukrose.

Air

Air yang digunakan pada semua kultur jaringan, termasuk air yang digunakan selama pembuatan kultur harus didestilasi. Tidak dianjurkan menyimpan air destilasi dalam wadah polietilen atau gelas pyrex karena dapat terkontaminasi dalam ruang penyimpanan yang tidak steril.

Medium

Kultur dapat ditumbuhkan pada medium padat atau semi padat atau sebagai kultur suspensi. Pada umumnya kultur padat menggunakan agar dengan konsentrasi antara 0,6 sampai 1 %.

Beberapa saran dalam memilih medium

Pemilihan medium tergantung pada spesies, jaringan atau organ tanaman yang akan dikulturkan dan tujuan percobaannya. Berbagai komposisi medium dapat diperoleh dari pustaka. Sebagai langkah awal yang cocok untuk memulai kalus jaringan tanaman dikotil dapat digunakan medium MS. Disarankan menggunakan campuran vitamin MS, myo inositol (100mg/l), dan sukrose (2-3%). Modifikasi campuran vitamin MS adalah meningkatkan kandungan thiamin. Penambahan 2,4-D (0,2-2,0 mg/l) adalah efektif untuk pembentukan kalus dari kebanyakan jaringan, penambahan sitokinin (0,5-2,0 mg/l) juga bermanfaat. Kombinasi lain untuk menghasilkan kalus adalah 2,4 D dengan air kelapa. Apabila kombinasi ini gagal memberikan hasil yang diinginkan, dapat dicoba penambahan asam amino dari ekstrak tanaman alami.Kode Kandungan Konsentrasi Stok Konsentrasi dlm Medium MS

A Hara makro mg/l

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2.2H2O 440

MgSO4.7H2O 370

KH2PO4 170

B Besi mg/100 ml (200x) mg/l (5 ml stok memberikan)

Na2EDTA 745 37,25

FeSO4.7H2O 557 27,85

C Hara Mikro mg/500 ml (100x) mg/l (5 ml stok memberikan)

MnSO4.4H2O 2230 22,3

ZnSO4.7H2O 860 8,6

H3BO3 620 6,2

KI 83 0,83

Na2MoO4.2H2O 25 0,25

CuSO4.5H2O 2,5 0,025

CoCl2.6H2O 2,5 0,025

D Vitaminmg/100 ml (100x) mg/100ml (1 ml stok memberikan)

Glisin 20 0,2

Niacin 5 0,05

Pyridoxine –HCl 5 0,05

Thiamin – HCl 1 0,01

E Sitokinin mg/l (100x) mg/l (1 ml stok memberikan)

Kinetin 10 0,1

Myo inositol

IAA

Sukrose

Agar

pH 5,7-5,8 100 mg

10 mg

30 g

8-10 g

1 molar = berat molekul dalam g/liter

1mM = berat molekul dalam mg/liter

Ppm = satu per sejuta = mg/liter

Pengenceran :

= volume stok yang diberikan

A. Tujuan

Tujuan dan sasaran : memberikan panduan dasar dalam menyusun sistem penyiapan media kultur. Sasaran adalah bagi pemakai agar memahami bagaimana menyiapkan media dan bagaimana menyusun cara kerja yang aman dan efisien.

B. Alat dan Bahan

Autoklaf, almari inokulasi, almari pendingin, timbangan analitik, pH meter, stirrer, gelas piala, pipet, botol media, label, bahan kimia untuk medium MS, air suling.

Hara makro : (NH4)NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4.

Besi : Na2EDTA, FeSO4.7H2O.

Hara mikro : MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O

Vitamin : Glisin, Niacin< Pyridoxin – HCL, thiamin – HCL

Sitokinin (BAP), Myo – inositol, IAA/NAA (ZPT), Sukrosa, Agar, pH.

C. Cara Kerja

a. Penyiapan larutan stok

a) Stok besi

- Masukkan 80 ml air kedalam gelas piala volume 100 ml.

- Timbang dan larutkan kedua senyawa, dan larutkan sesuai dengan urutannya karena kedua bahan ini sukar larut dalam air, tambahkan beberapa tetes HCl dan kemudian dipanaskan.

- Pindahkan larutan kedalam erlemeyer 100 ml dan tambahkan aquades sampai mencapai volume 100 ml.

- Beri label larutan stok besi 200x, 5 ml/l. jadi karena membuat 500 ml diambil 2,5 ml.

b) Stok hara mikro

- Siapkan gelas piala 500 ml dan isi dengan 300 ml aquades.

- Timbang bahan kimia hara mikro dan masukan satu per satu ke dalam gelas piala yang telah berisi air. Setiap kali memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan.

- Larutan yang sudah jadi kemudian ditambah aquadea sampai volume 500 ml.

- Botol ditutup rapat kemudian diberi label hara mikro 100x, 5 ml/l.

- Untuk membuat 1 liter medium memerlukan 5 ml stok dan untuk membuat 500 ml medium memerlukan 2,5 ml larutan stok.

c) Stok vitamin

- Isilah gelas piala 100 ml dengan aquades kira-kira 50 ml.

- Timbang dan larutkan tiap bahan vitamin yang diperlukan.

- Tambah larutan vitamin dengan aquadea sampai volume 100 ml.

- Beri label larutan vitamin 100x, 1 ml/l. untuk 500 ml medium maka diambil 0,5 ml larutan stok.

- Simpan dalam larutan dalam almari es.

d) Stok zat pengatur tumbuh

Penentuan dosis zat pengatu tumbuh yang akan digunakan sangat penting karena dapat berakibat fatal bagi pertumbuhan jaringan. Zat pengatur tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi justru akan menghambat pertumbuhan kalus. Biasanya zat pengatur tumbuh dibuat dengan konsentrasi 1-10 mg/ml. cara membuat larutan stok IAA, NAA atau 2,4-D dengan konsentrasi 1000 ppm (1mg/ml) adalah sebagai berikut :

- Timbang bahan sebanyak 100 mg dan masukkan kedalam gelas piala 100 ml.

- Tuangkan beberapa tetes 1 N NaOH sedikit demi sedikit sampai larut dan ditambah aquades sampai mencapai 100 ml.

- Pindahkan dalam wadah stok dan beri label nama zat pengtur tumbuh, 1000 ppm. Simpan dalam almari pendingin.

- Untuk memberi pada 1 liter media, 1 ml stok setara dengan 1 mg zat pengatur tumbuh (1ppm).

b. Penyiapan medium MS (500 ml)

- Isi erlemeyer volume 1 liter dengan 400 ml aquades.

- Timbang komponen bahan kimia hara makro, kemudian masukkan satu per satu sambil digoyang agar bahn kimia benar larut.

- Ambil tiap larutan stok yang sudah disiapkan sebelumnya dan tambahkan ke dalam larutan hara makro larutan besi, hara mikro, vitamin dan IAA. Labu erlemeyer sampai digoyang.

- Menimbang mio inositol dan sukrose, kemudian masukkan kedalam erlemeyer satu per satu dan digoyang sampai larut.

- Tambahkan aquadea sampai volume larutan menjadi 450 ml. sambil mengaduk larutan, pH medium disesuaikan antara 5,7-5,8 dengan meneteskan 1N NaOH atau 1 N HCl menggunakan pipet terpisah.

- Tambahkan aquades hingga volume mencapai 500 ml.

- Masukkan agar-agar ke dalam labu erlemeyer.

- Eksplan wortel letakkan pada tutup cawan petri dengan scalpel buat potongan ukuran 1 cm kemudian letakkan pada kertas filter.

- Buka tutup botol media, lubang botol didekatkan nyala api lampu spiritus. Ambil eksplan satu per satu dan letakkan diatas media menggunakan pinset. Tutup botol dengan erat, keluarkan dari entkas dan beri label, nama, bahan dan tanggal.

- Setelah selesai matikan lampu spiritus dan bersihkan dasar entkas dengan lap. Botol berisi eksplan diletakkan di rak dalam ruang inkubasi.

- Amati pertumbuhan kalus dua hari sekali. Bila ada kontaminasi segera dibuang.

D. Pelaksanaan

Dalam acara ini penyiapan media hanya menyiapkan larutan stok hara mikro dan penyiapan medium MS, dikarenakan untuk unsur hara yang lain masih ada stok yang masih layak digunakan, dalam pembuatan stok hara mikro ini menyiapkan 300 ml aquades, kemudian memasukkan bahan kimia satu persatu yang setiap memasukkannya harus segera melarutkannya. Bahan yang dilarutkan diantaranya adalah : MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O. dan kemudian yang sudah jadi ditambah aquades sampai volume 500 ml. Kemudian dimasukkan ke dalam botol yang ditutup rapat dan diberi label.

Kemudian dalam menyiapkan medium MS yang perlu diperhatikan adalah menyiapkan 400 ml akuades dan memasukkan komponen bahan kimia hara makro, larutan hara besi, hara mikro, vitamin dan IAA. dan memasukkan satu persatu sambil bahan digoyang agar benar – benar larut. Selain itu juga memasukkan dan menimbang mio – inositol dan sukrosa. Apabila bahan sudah larut ditambahkan aquades sampai volume larutan 800 ml sambil mengaduk media yang pH nya disesuaikan antara 5,7 – 5,8 dengan meneteskan N NaOh atau I N HCL. Setelah itu menambahkan aquades hingga volume 1000 ml. Kemudian memasukkan agar – agar kedalam erlenmeyer yang kemudian dipanaskan sambil diaduk.

Setelah itu medium di tuang kedalam botol yang besar kecilnya disama ratakan namun tergantung juga pada botolnya. Selanjutnya botol ditutup rapat dan di sterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210 dan tekanan 17, 5 psi selama 15 -20 menit. Pada tahap berikutnya medium dikeluarkan dari autoklaf dan disimpan ditampat sejuk hingga siap penanaman eksplan.

E. Kesimpulan

Bahwa sebelum penanaman eksplan perlu menyiapkan medium, dalam menyiapkan medium ini perlu adanya pemilihan komponen yang sesuai dengan spesies , jaringan atau organ tanaman yang akan dikulturkan, dan tujuan percobaannya. Keberhasialn teknik menggunakan kultur sel, jaringan atau organ tanaman berkaitan dengan beberapa faktor, faktor utama pemilihan komponen hara dan zat pengatur tumbuh. Komponen medium kultur meliputi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, vitamin, asam amino dan tambahan senyawa organik, karbohidrat, air dan medium.