unud-29-2059782213-bab iii kerangka pikir dan hipotesis laporan disertasi terbuka

64

BAB III

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS

3.1 Kerangka Konsep

Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh mengkonsumsi babi

guling terhadap penuaan pembuluh darah. Daging babi dapat mempercepat proses

penuaan tersebut sedangkan bumbu dapat menghambatnya. Terjadinya penuaan

diukur dari akibat dari penuaan pembuluh darah yaitu aterosklerosis yang diukur

dari pembentukan sel busa yang menjadi cikal bakal terbentuknya plak

aterosklerosis. Untuk mengetahui apakah penuaan dini tersebut berkaitan dengan

tingginya radikal bebas oleh karena konsumsi lemak dan daging babi yang terus

menerus, ukuran antara yang dipakai untuk mengukur proses penuaan pembuluh

darah dalam penelitian ini adalah perubahan kadar F2-isoprostan. Perubahan ini

merupakan tanda dari peroksidasi lemak akibat adanya Reactive Oxigen Species

(ROS), yang dapat merusak sel endotil sehingga lemak teroksidasi masuk ke

lapisan intima pembuluh darah. Disamping itu apakah tingginya konsumsi lemak

dan daging babi yang terus menerus disini dapat menimbulkan reaksi inflamasi

yang selanjutnya menunjang terjadinya plak aterosklerosis melalui kerusakan

endotil, dilakukan pengukuran terhadap cytokine proinflamasi yaitu IL-6. Bumbu

disebutkan dapat berfungsi sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Dalam

penelitian ini pengaruh mengkonsumsi bumbu akan dilihat dari kadar perubahan

aktivitas antioksidan total di dalam serum. Disamping itu, untuk mengetahui

65

apakah bumbu juga dapat meningkatkan kadar antioksidan primer yang

diproduksi oleh tubuh maka dalam penelitian ini diukur juga kadar GSH di dalam

serum. Konsep pikir dari penelitian ini dapat digambarkan sebagai berikut

Gambar 3.1: Kerangka Konsep Penelitian

Makanan yang diangkat adalah b (babi) guling yang berupa daging babi

dan lemaknya yang dicampur dengan bumbunya, dan sebagai pembanding adalah

babi guling yang dikonsumsi tanpa dengan bumbunya. Bumbu b guling terdiri

dari campuran berbagai bahan yang beraneka ragam yang secara teoritis,

Pembentukan

sel busa +++

Total anti-oksidan

GSH F2 isoprostan

IL-6

Total anti-oksidan GSH

F2 isoprostan IL-6

BABI GULING

Daging + lemak

dikonsumsi tanpa

bumbu

Daging + lemak

dikonsumsi

dengan bumbu

Pembentukan

sel busa -/+

66

mengandung antioksidan seperti terpene yang merupakan induk caroten, vitamin

C, Vitamin E, phenol yang berasal dari polyphenol dan flavonoid. Kesemua

kandungan di atas dapat dikatakan bersifat ateroprotektif karena kemampuannya

sebagai antioksidan dan antiflamasi. Beberapa flavonoid yang sudah dikenal dan

tampaknya menonjol di makanan bali antara lain quercetin, yang berasal dari

umbi-umbian seperti bawang merah dan bawang putih, kunyit dan lain sebagainya,

begitu juga polyphenol 1-acetoxycavichol acetate dan catechin yang berasal dari

lengkuas.

Jadi variabel interfensi yang dilihat adalah bumbu babi guling yang terdiri

dari campuran berbagai bahan di atas, dimasukkan ke dalam perut babi, dijahit

dan kemudian dipanggang di atas bara api. Setelah matang, kesemua bumbu yang

di dalam perut kemudian dikeluarkan, dibuat ekstrak bumbu dengan

melarutkannya dalam etanol kemudian disaring, dievaporasi sehingga diperoleh

ekstrak kentalnya. Daging babi dan lemaknya dicampur, digiling untuk dibuatkan

pellet dan diberikan dalam keadaan segar kepada hewan coba. Jumlah porsi babi

guling yang diberikan kepada tikus dibuat sama, yaitu disesuaikan dengan porsi

tikus (30 gram) perharinya. Pemberian bumbu diberikan secara paksa (force

feeding) dengan menggunakan dosis yang dihitung berdasarkan berat badan dan

konsentrasi.

Sedangkan variabel tergantung yang ingin dilihat adalah munculnya sel

busa yang menjadi tanda awal munculnya fatty streak dan berlanjut kepada

aterosklerosis. Untuk melihat proses kerusakan endotel akibat terjadinya

67

peroksidasi lemak dan proses inflamasi kronis, dilihat konsentrasi F2-isoprostan

dan IL-6 di dalam darah dan ekspresinya di dinding pembuluh darah.

Penghambatan proses kerusakan endotel oleh antioksidan yang berasal

dari makanan ataupun berasal dari respon tubuh, diukur dari aktivitas antioksidan

total dan kadar GSH di dalam darah. Pengamatan dilakukan pada awal

percobaan, pada minggu III untuk melihat fase akut, minggu ke XII untuk melihat

mulai terbentuknya sel busa, dan pada akhir percobaan yaitu pada minggu XX

dimana diharapkan plak aterosklerosis sudah terbentuk.

3.2 Hipotesis:

Hipotesis utama yang akan dibuktikan adalah

1. Konsentrasi F2 isoprostan pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi

babi guling dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan dengan yang

mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.

2. Kadar IL-6 pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi babi guling

dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan dengan yang mengkonsumsi

babi guling diolah tanpa bumbu

3. Aktifitas antioksidan total pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi

babi guling dengan bumbu, lebih tinggi dibandingkan dengan yang

mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.

68

4. Kadar GSH pada darah tikus Wistar yang mengkonsumsi babi guling

dengan bumbu, lebih tinggi dibandingkan dengan yang mengkonsumsi

babi guling diolah tanpa bumbu

5. Jumlah sel busa pada dinding pembuluh darah tikus Wistar yang

mengkonsumsi babi guling dengan bumbu, lebih rendah dibandingkan

dengan yang mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu

Untuk memperjelas bagaimana kerusakan endotel di dinding pembuluh darah

akibat raddikal bebas yang ditunjukkan oleh tingginya kadar F2 isoprostan dan

inflamasi yang ditunjukkan oleh kadar IL-6, ekspresi dari kedua substrat tersebut

juga dilihat. Sehingga hypothesis tambahannya adalah

1. Ekspresi F2 isoprostane pada pembuluh darah tikus Wistar yang


dengan yang mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.

2. Ekspresi IL-6 pada dinding pembuluh darah tikus Wistar yang


dengan yang mengkonsumsi babi guling diolah tanpa bumbu.

69

BAB IV

METODE PENELITIAN

Untuk menjawab permasalahan di atas, penelitian ini akan menggunakan

rancangan eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui dampak dari

mengkonsumsi bumbu yang dicampur dengan daging terhadap penuaan pembuluh

darah.

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian adalah penelitian eksperimental dengan rancangan pre-post test

with control design, dilaksanakan di laboratorium yaitu Laboratorium Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dan Bagian Ilmu Kedokteran

Komunitas dan Kedokteran Pecegahan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana,

dengan menggunakan percobaan binatang. Penelitian dilakukan selama 14 bulan

dengan rincian 12 minggu melakukan penelitian pendahuluan, 20 minggu untuk

pelaksanaan perlakuan, 12 minggu untuk mengumpulkan data, 12 minggu untuk

mengolah data dan membuat laporan.

4.2 Rancangan Penelitian

Eksperimentasi ini menggunakan tikus jenis Wistar (Rattus Novergicus

Wistar Race) untuk mengetahui bagaimana pengaruh dari asupan berbagai

makanan di bawah ini terhadap munculnya sel busa yang merupakan akibat dari

penuaan pembuluh darah. Sebagai faktor risiko dari aterosklerosis, dipelajari juga

70

kadar antioksidan total, GSH (glutation), F2 isoprostan, dan IL-6. Jenis makanan

tersebut adalah:

- Campuran lemak, daging dari babi guling yang dikonsumsi tanpa

bumbu

- Campuran lemak, daging dari babi guling yang dikonsumsi dengan

bumbunya.

Gambar 4.1: Rencana Kerja Perlakuan

Keterangan:

S : Sampel

SS : Subsampel (0)

PI : Perlakuan dengan memberikan makanan aterogenik

PII : Perlakuan daging babi plus bumbu dosis maksimum

PIII : Perlakukan daging babi plus bumbu dosis optimum

PIV : Perlakuan daging babi plus bumbu dosis minimum

PV : Perlakuan dengan daging babi saja tanpa bumbu

PVI : Perlakuan dengan makanan asli tikus

OI : Perlakuan selama 3 minggu

O II : Perlakuan selama 12 minggu

O III : Perlakuan selama 20 minggu

OI O III O II

PI

PII

PIII S

SS

PIV

PV

PVI

71

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan

melakukan pre-post test with control design. Tikus dengan umur, jenis kelamin

yang sama dan berat badan yang relatif sama dipisahkan secara random menjadi 6

(enam) kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan akan diberikan makanan

yang berbeda-beda, yaitu Perlakuan I mendapatkan diet makanan yang bersifat

aterogenik yang mana kemampuan aterogenitasnya sudah diketahui (Muliartha &

Mulyohadi, 2002), Perlakuan II mendapatkan diet makanan babi guling yang

diolah dengan bumbu, perlakuan III mendapatkan diet makanan babi guling yang

diberikan tanpa bumbu, dan perlakuan IV yang hanya mendapatkan makanan asli

tikus (Muliartha & Mulyohadi, 2002). Bumbu diberikan dalam bentuk 3 dosis

yaitu dosis maksimal, dosis optimal dan dosis minimal dan pemberiannya

disesuaikan dengan berat badan tikus. Jumlah makanan yang diberikan

disesuaikan dengan porsi makanan tikus dalam bentuk makanan segar (pelet segar)

dengan berat masing-masing 30 gram. Evaluasi awal (pretest) dilakukan pada

separate sample sebelum dilakukan intervesi dan selanjutnya post test dilakukan

pada minggu III, XII dan XX.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi penelitian untuk rancangan eksperimental adalah tikus tipe

kolesterol sensitif yaitu jenis Rattus Novergicus Wistar Race. Jumlah tikus yang

dipakai sebagai sampel dihitung berdasarkan rumus yang diambil dari Metode

Perancangan Percobaan oleh Ir. Vincent Gaspersz, sebagai berikut:

(t - 1) (n 1) > 15

72

t = jumlah perlakuan

n = jumlah ulangan

Dengan rumus di atas dan dengan perlakuan sebanyak 6 (enam) jenis perlakuan,

maka jumlah ulangan yang diperlukan minimal adalah 4 (empat) kali. Bila setiap

kali ulangan diwakili oleh satu sekor tikus maka jumlah tikus yang diperlukan

minimal 4 (empat) ekor di setiap kelompok perlakuan.

4.3.1 Kriteria Inklusi

Untuk menjaga homogenitas sampel maka diberlakukan kriteria inklusi sebagai

berikut:

Umur pada waktu pemilihan berada pada kisaran: 4-5 minggu,

Jenis kelamin jantan,

Berat berada pada kisaran : 80 120 gram

Hanya tikus yang sehat

4.3.2 Kriteria eksklusi

Untuk kriteria eksklusi adalah bila tikus itu menderita cacat bawaan akan diekslusi

dari penitian ini

4.3.3 Drop Out

Tikus yang mati selama percobaan di drop out dan dicarikan penggantinya

(substitusi), dengan kriteria yang sama dengan kriteria inklusi.

Dari 100 tikus yang memenuhi kriteria inklusi dan tidak tereleminasi

kemudian dipilih secara acak sederhana, untuk mendapatkan tikus-tikus yang akan

73

memperoleh kelompok perlakuan. Dan setiap kelompok perlakuan diwakili oleh 4

tikus sehat.

4.4 Variable Penelitian

4.4.1 Identifikasi dan Klasifikasi Variabel Penelitian

Variabel yang diukur adalah untuk rancangan eksperimental, diagramnya ada di

gambar 4.2

1. Variabel bebas : yaitu daging babi guling yang bersifat

aterogenik sehingga dapat meningkatkan Radikal

Bebas dan Inflamasi.

2. Variabel interfensi : adalah bumbu babi guling yang dapat

meningkatkan aktivitas antioksidan total termasuk

antioksidan primer atau interna. Bumbu ini

terbagi dalam tiga dosis yaitu dosis maksimum,

dosisi optimum dan dosis minimum.

3. Variabel tergantung : terbentuknya sel busa sampai dengan plak

aterosklerosis pada dinding pembuluh

darah tikus Wistar oleh karena tingginya radikal

bebas dan proses inflamasi

4. Variabel antara : kadar F2 isoprostan yang mengukur tingginya

Radikal Bebas dan IL-6 yang mengukur proses

inflamasi; Aktivitas Antioksidan total dan kadar

74

GSH yang dapat menekan munculnya Radikal

bebas dan proses inflamasi.

Gambar 4.2: Gambar Hubungan antar Variabel

4.4.2 Definisi Operasional Variabel

Untuk keseragaman penelitian maka variabel penelitian didefinisikan

seperti di bawah ini :

1. Babi guling: Babi guling yang diolah secara tradisional. Anak babi jenis

landrace yang telah dibunuh, dibersihkan dan isi perutnya

dikeluarkan. Babi kemudian dipanggang secara utuh sambil terus

diolesi dengan minyak dan kunyit sampai dianggap matang.

Dalam penyajiannya semua daging dan lemak disatukan, dicampur

merata, dihaluskan dan kemudian dibuat pelet dengan berat

V. bebas

Daging dan Lemak

Babi Guling F2 isoprostan

IL-6 SEL BUSA

V. tergantung V. antara

Bumbu Antioksidan total dan GSH

V. perlakuan

75

masing-masing 30 gram. Dan disimpan di dalam Freezer sampai

waktunya diberikan secara segar kepada hewan coba (Lampiran 11,

gambar 2.1 sd 3.2).

2. Makanan aterogenik: adalah makanan tikus yang sudah diketahui dapat

menimbulkan plak aterosklerosis pada tikus, yaitu yang terdiri dari:

2% kolesterol, 0.2% asam kolat (Cholic acid), dan 10% minyak

babi (Muliartha & Mulyohadi 2002, Arjuna R., 2008)

3. Makanan tikus: adalah makanan untuk tikus Wistar yang sebetulnya dipakai

untuk makanan ayam yaitu jenis Confeed PARS (Muliartha, 2006,

Arjuna R., 2008).

4. Bumbu babi guling : adalah bumbu khas untuk makanan olahan tradisional bali

yang digunakan untuk membuat babi guling yang berisi tiga

komponen campuran bahan yaitu base genep, base penyanggluh

dan base panglemes. Komposisi bumbu disesuaikan berdasarkan

bumbu yang umum digunakan untuk babi guling. Bumbu

kemudian dipanaskan dalam perut babi sehingga matang, diekstrak

kemudian dilarutkan untuk mendapatkan dosis yang diperlukan

sebelum diberikan secara paksa kepada hewan coba. Pemberian

diberikan berdasarkan dosis yaitu dosis maksimum, dosis optimum

dan dosis minimum. Bahan dan cara pembuatan bumbu dapat

dilihat di lampiran 9 dan lampiran 11, gambar 1.1 sd 1.3).

76

4.1. Bumbu Dosis maksimum (PII): adalah jumlah mililiter bumbu yang di

sondekan ke dalam lambung tikus untuk mendapatkan dosis 100%

test DPPH, yang diperoleh dari perhitungan. Dosis ditentukan per

100 gram berat tikus (lihat lampiran 10 menentukan dosis).

4.2. Bumbu Dosis optimum (PIII): adalah jumlah mililiter bumbu yang di




4.3. Bumbu Dosis minimum (PIV): adalah jumlah mililiter bumbu yang di




5. Aktivitas total anti-oksidan: adalah Aktivitas anti-oksidan total dalam darah

tikus yang diukur pada awal pelaksanaan, pada minggu III, minggu

XII dan XX dengan menggunakan tehnik pengujian dengan ELISA

untuk kadarnya dalam plasma. Kadar dinyatakan dalam bentuk

angka kuantitatif (Cayman Chemical, 2009).

6. Kadar GSH: adalah kadar GSH dalam darah tikus yang diukur pada awal

pelaksanaan, pada minggu III, XII dan XX. Untuk mengukur kadar

dalam plasma digunakan reagen Cayman Chemical GSH assay kit.

Kadar dinyatakan dalam bentuk angka kuantitatif (Biovision, 2009).

77

7. Kadar F2-isoprostan: adalah kadar F2-isoprostan dalam darah tikus yang diukur

pada awal pelaksanaan, pada minggu III, XII dan XX. Untuk

mengukur kadar, digunakan enzym immunoassay kit (Cayman)

untuk 8-iso-PGF2. Kadar ditentukan dengan metode ELISA dan

dinyatakan dalam bentuk angka kuantitatif (Morrow etal., 1995;

Cell Biolabs, 2009).

8. Ekspresi F2-isoprostan : adalah jumlah sel endotel yang terekspresi terhadap

F2-isoprostan pada awal dengan pengecatan immunohistokimia,

minggu III, XII dan pada minggu ke XX. Pembacaan

menggunakan mikroskop dengan pembesaran 200, 400, 900 kali.

Penghitungan dilakukan dengan semikuantitatif yaitu dengan

menghitung sel endotel yang terekspresi pada lapangan pandang

(Muliartha, 2002, Pratic D. etal., 1997, Ika Fikriah, 2007).

9. Kadar IL-6: adalah aktivitas IL-6 dalam darah tikus yang diukur pada awal

pelaksanaan, pada minggu III, XII dan XX dengan menggunakan

tehnik elisa untuk kadarnya dalam plasma. Kadar dinyatakan

dalam bentuk angka kuantitatif (Bender MedSystem, 2009).

10. Ekspresi IL-6: adalah ekspresi sel endotel yang tercat dengan pengecatan

imunohistokimia untuk ekspresi IL-6. Pengukuran dilakukan pada

awal pelaksanaan, minggu III, XII dan XX. Pembacaan

menggunakan mikroskop dengan pembesaran 200, 400, 900 kali.

Penghitungan dilakukan dengan semikuantitatif yaitu dengan

78

menjumlahkan sel endotel yang terekspresi pada lapangan pandang

(Terebuh P.D. etal., 1992; Muliartha, 2002).

11. Sel busa: adalah sel yang berbentuk seperti busa, yang merupakan hasil dari

makrofag yang memakan LDL yang teroksidasi, dilihat di bawah

mikroskop dengan pewarnaan Oil Red O akan berwarna

merah.Yang dihitung adalah jumlah sel busa yang ada di cell

endotel perlapangan pandang pada pembesaran 100 kali. Sampel

diambil dari potongan melintang dinding pembuluh darah aorta

yang telah beku dengan alat microtome (Cryo-Cut) setipis 3-5

mikron dan telah diperlakukan untuk pewarnaan Oil Red O

( Schieffer B. etal., 2004; Ika Fikriah, 2007).

4.5. Bahan dan Alat Penelitian

4.5.1 Bahan penelitian

Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian ini berbentuk Kit, dan macam-

macam Kit tersebut adalah:

1. Kit untuk memeriksa aktivitas Antioksidan total dalam darah

2. Kit untuk memeriksa aktivitas GSH

3. Kit untuk memeriksa aktivitas F2-isoprostan

4. Kit untuk memeriksa ekspresi F2-isoprostan

5. Kit untuk memeriksa aktivitas IL-6

6. Kit untuk memeriksa ekspresi IL-6

7. Parafin, Oil Red O dan Haematoxylin Eosin untuk pemeriksaan Sel busa

79

4.5.2. Alat penelitian

Alat-alat yang dibutuhkan antara lain

1. Obyek glass

2. Alat vortex

3. Test tube

4. Microscoop

4.6 Protokol Penelitian

Pada penelitian eksperimen, persiapan meliputi pencarian tikus percobaan,

menghubungi laboratorium pelaksana dan mempersiapkan metode memelihara

binatang coba, tehnik pengambilan darah dan metode pengiriman sampel

khususnya sampel makanan dan sampel darah ke laboratorium.

4.6.1 Pemeliharaan Binatang Coba (Tikus Wistar)

Alur pelaksanaan eksperimen dari awal hingga akhir dapat dilihat pada gambar

4.3. Pada awal penelitian, sebelum dilakukan eksperimen, tikus yang termasuk

dalam kriteria inklusi dipilih secara acak sederhana untuk dijadikan sampel. Dari

100 ekor tikus yang memenuhi syarat, akan dipilih masing-masing 24 (dua puluh

empat) ekor untuk penelitian 3, 12 dan 20 minggu dan 4 (empat) ekor tambahan

untuk memperoleh data awal (separate sampel).

Untuk mendapatkan waktu pembedahan yang bersamaan maka waktu

pemilihan tikus dibuat berbeda, yang pertama dipilih yang akan dipelihara selama

20 minggu, kemudian 12 minggu dan yang terkahir dipilih yang akan dipelihara

selama 3 minggu. Tikus-tikus kemudian dipisahkan menjadi 6 kelompok

80

perlakuan, setiap tikus akan diberi tanda sesuai dengan kelompoknya dan

ditempatkan pada kandang yang telah dilengkapi dengan tempat pemberian makan

dan minum dan sekam untuk tidur. Setiap 2 ekor tikus ditempatkan dalam satu

kandang. Pemberian makan dilakukan secara ad libutum dimana makanan tikus

disiapkan sebanyak 30 gram perhari dan tikus dapat makan dan minum sesuai

dengan kemauannya. Sisa makanan dan minuman diukur setiap hari sebelum

diberikan makanan dan minum yang baru. Selanjutnya dilakukan adaptasi untuk

tikus dapat mengkonsumsi makanan yang harus dikonsumsinya (Lampiran 11,

gambar 3.3 sd 4.6).

Gambar 4.3: Rencana Alur Kerja Penelitian

TIKUS COBA

TIKUS COBA

Minggu III

B guling - bumbu

B guling + bumbu

TIKUS COBA

Minggu XII

B guling - bumbu

B guling, bumbu +

Antioksidan, GSH, F2 -

isoprostan, IL-6,

Sel busa

TIKUS COBA

Minggu XX


isoprostan, IL-6, Sel busa





B guling bumbu -

B guling, bumbu +

81

Untuk data awal, 4 ekor tikus (separate sample) dengan berat dan usia

yang sama dengan usia tikus waktu pemilihan sebelum dipelihara diambil

darahnya untuk memperoleh data awal (normal) tentang kadar IL-6, kadar F2-

isoprostan, aktifitas anti-oksidan total dan GSH; dan pembuluh darahnya untuk

mendapatkan data tentang jumlah sel busa, ekspresi IL-6, ekspresi F2-isoprostan.

Selanjutnya, di tiap kelompok perlakuan, untuk mendapatkan 4 (empat) kali

ulangan, masing-masing kelompok terdiri dari 4 (empat) ekor tikus.

Pada masa eksperimen, semua tikus mendapat makanan sesuai dengan

kelompok perlakuannya masing-masing, yaitu babi guling tanpa bumbu, babi

guling plus bumbu, makanan aterogenik tikus dan makanan tikus asli. Pemberian

makan akan dilakukan setiap hari dengan jumlah 30 gram dan bila ada sisa pada

keesokan harinya, maka sisa akan ditimbang sebelum diberikan makanan yang

baru, sehingga dapat diketahui dengan pasti berapa jumlah makanan yang

dikonsumsi.

Selama masa eksperimen, tikus percobaan dipelihara oleh petugas khusus

pemelihara tikus (lihat lampiran 8) yang bertugas memelihara dan mengawasi

kesehatan tikus, memberi makan dan menyonde. Selama waktu ini tidak

ditemukan tikus yang sakit, tetapi ditemukan seekor tikus mati di awal penelitian

dan sudah disubstitusi dengan tikus yang sejenis dan dapat dikatakan sama.

4.6.2 Pengambilan Darah dan Pembuluh Darah

Pada minggu ke III, XII dan XX dilakukan pemeriksaan aktivitas total

antioksidan, GSH, kadar F2-isoprostan dan kadar IL-6 dalam serum darah dan

82

jumlah sel busa di dinding pembuluh darah. Untuk ini, darah diambil seluruhnya

dari jantung tikus yang teranastesi. Disamping itu pembuluh darah aorta dan arteri

carotis diambil untuk memeriksa jumlah sel busa yang terbentuk dengan metode

Oil Red O, dan pewarnaan imunohistokimia untuk ekspresi dari F2-isoprostan dan

IL-6 .

4.6.3 Menghitung Jumlah Sel Busa

Setelah pembuluh darah dibuatkan dalam slide preparat dengan ketebalan

3 mikron dan dicat dengan Oil Red O (cara dapat dilihat dalam lampiran 6)

dilakukan pemeriksaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100, 400 dan 900

kali.

Dengan pembesaran 100 dapat dihitung jumlah sel busa secara umum di

sekeliling penampang melintang pembuluh darah dan zona-zona yang akan

menjadi tempat lokasi penghitungan. Keliling pembuluh darah kemudian dibagi

menjadi 8 (delapan) zona seperti arah jarum jam yaitu daerah jam 12.00, 13.30,

15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00 dan 22.30 secara membuta (Ariana Y., 2006,

Ika Fikriah, 2007). Dengan pembesaran 400 penghitungan dilakukan di tiap

bagian zona potongan melintang tersebut. Yang dihitung adalah sel busa yang

sudah bermigrasi ke endotel (LDL yang terokisdasi) yang berbentuk bulatan

berwarna merah sampai dengan sel busa yang sudah membentuk fatty streak.

Jumlah Sel busa di tiap bagian kemudian dijumlahkan untuk mendapatkan jumlah

sel busa di sekeliling potongan melintang tersebut. Bila dalam satu slide ada lebih

dari satu pembuluh darah, dengan cara yang sama, sel busa dihitung di setiap

pembuluh darah. Jumlahnya di masing-masing pembuluh darah dijumlahkan

83

untuk kemudian diambil rata-ratanya. Pembesaran 900 kali hanya dilakukan untuk

memastikan apakah itu sel busa atau bagian lemak yang lain.

4.6.4 Menghitung Ekspresi F2-isoprostan

Setelah dibuatkan slide dengan ketebalan 3 mikron dan dilakukan

pengencatan dengan menggunakan Pengecaan untuk F2-isoptostan, sel yang

terekspresi bervariasi dari berwarna coklat tua sampai dengan dinding selnya

rusak dan F2 isoprostan terpancar keluar. Yang dihitung adalah jumlah sel endotel

yang terekspresi di lingkaran melintang pembuluh darah. Cara penghitungan

dengan menggunakan metode seperti menghitung sel busa, yaitu keliling

pembuluh darah kemudian dibagi menjadi 8 (delapan) zona seperti arah jarum jam

yaitu daerah jam 12.00, 13.30, 15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00 dan 22.30.

Dengan pembesaran 400 penghitungan dilakukan di tiap bagian zona potongan

melintang tersebut.

4.6.5 Menghitung Ekspresi IL-6 di Dinding Pembuluh Darah

Setelah dibuatkan slide dengan ketebalan 3 mikron dan dilakukan

pengencatan dengan menggunakan Pengecaan untuk IL-6, sel yang terekspresi

bervariasi dari berwarna coklat tua sampai dengan dinding selnya rusak dan IL-6

nya terpancar keluar. Yang dihitung adalah jumlah sel endotel yang terekspresi di

lingkarang melintang pembuluh darah. Cara penghitungan dengan menggunakan

metode seperti menghitung sel busa.

4.7 Analisis Data

Dalam penelitian ini data yang diperoleh dianalisis seperti di bawah ini

84

4.7.1 Analisis Deskriptif

Analisis deskriptif untuk mengetahui simpang baku, rerata dan median

kadar total anti-oksidan, GSH, F2-isoprstan, IL-6, jumlah sel busa, pada semua

perlakuan binatang coba maupun di setiap kelompok perlakuan (ulangannya).

Analisis perkembangan rerata variabel pada minggu III sampai dengan XX

disajikan dalam bentuk grafik.

4.7.2 Uji Normalitas

Normalitas disribusi data anti-oksidan, GSH, F2-isoprstan, IL-6 dan

jumlah sel busa, diuji dengan uji Saphiro Wilk dengan tingkatn kemaknaan ( <

0,05), dimana distribusi data akan dianggap normal bila p > 0,05

4.7.3 Analisis Inferensial

Analisis inferensial dilakukan untuk menguji perbedaan kemaknaan rerata

kadar anti-oksidan total, GSH, F2-isoprostan, IL-6 dan jumlah sel busa pada awal,

minggu III, XII dan XX dari antara kelompok perlakuan dan perubahan rerata

kadar antioksidan total, GSH, F2-isoprostan, IL-6 dan jumlah sel busa di setiap

perlakuan pada minggu-minggu perlakuan yang berbeda. Pada data yang

terdistribusi normal, dilakukan uji statistik komparasi dengan One way ANOVA

dengan tingkat kemaknaan ( < 0.05), sedangkan data yang tidak terdistribusi

normal dilakukan uji statistik non parametrik dengan Kruskal Wallis. Hipotesis

statistik akan dinyatakan sebagai berikut:

H0 : 1 = 2 = 3 = 4 = 5 = 6

Ha : paling tidak ada kelompok yang berbeda

85

POST HOC test

Uji Post Hoc (LSD atau Temhanes T2) dilakukan pada uji ANOVA yang

terbukti signifikan, untuk mengetahui kelompok yang berbeda dengan hipotesis

statistik

1. Membandingkan kelompok perlakuan makanan asli tikus (PVI) dengan

perlakuan makanan babi guling yang diolah dengan bumbu dosis

maksimum (PII)

H0 : 2 = 6 Ha : 2 6

Bumbu dosis optimum (PIII)

H0 : 3 = 6 Ha : 3 6

Bumbu dosis minimum (PIV)

H0 : 4 = 6 Ha : 4 6

2. Membandingkan antara kelompok babi guling yang diolah tanpa bumbu

(PV) dengan kelompok perlakuan makanan asli tikus (PVI)

H0 : 5 = 6 Ha : 5 6

3. Membandingkan antara kelompok yang mendapatkan makanan asli tikus

(PVI) dengan kelompok yang memperoleh makanan yang bersifat

aterogenik (PI)

86

H0 : 1 = 6 Ha : 1 6

4. Membandingkan antara kelompok yang memperoleh makanan yang diberi

bumbu (PII-PIV) dengan yang memperoleh makanan aterogenik (PI)

Bumbu dosis maksimum (PII)

H0 : 2 = 1 Ha : 2 1


H0 : 3 = 1 Ha : 3 1


H0 : 3 = 1 Ha : 3 1

5. Membandingkan antara kelompok yang memperoleh makanan tanpa

bumbu (PV) dengan yang memperoleh makanan aterogenik (PI)

H0 : 5 = 1 Ha : 5 1

6. Membandingkan antara kelompok yang memperoleh makanan yang diolah

tanpa bumbu (PV) dengan yang memperoleh makanan diolah dengan

bumbu (PII-PIV)

Bumbu dosis maksimum (PII)

H0 : 5 = 2 Ha : 5 2

87


H0 : 5 = 3 Ha : 5 3


H0 : 5 = 4 Ha : 5 4

Korelasi antara kadar kemaknaan rerata kadar anti-oksidan total, GSH

termasuk rasio GSH:GSSG, F2- isoprostan, IL-6, dan jumlah sel busa yang

terbentuk akan dilakukan dengan

- Uji Pearson bila persyaratan korelasi dipenuhi

- Uji korelasi Spearman bila data tidak memenuhi persyaratan.

Hipotesis statistik akan dinyatakan sebagai berikut

H0 : = 0 Ha : 0

Perbedaan semua variabel penelitian antara pengukuran minggu III dengan

minggu XX pada masing-masing perlakuan akan diuji dengan uji T-pair dengan

tingkat kemaknaan ( < 0,05) dan hipotesis statistik adalah sebagai berikut

H0 : III = XX Ha : III XX

unud-29-2059782213-bab iii kerangka pikir dan hipotesis laporan disertasi terbuka

Documents