transformasi genetik - unud

�

TRANSFORMASI GENETIK PADA TANAMAN | Melalu� Agrobacterium tumefaciens

TRANSFORMASI GENETIK PADA TANAMAN

Melalu� Agrobacterium tumefaciens


��

Undang-Undang Republik Indonesia Nomor 28 Tahun 2014 Tentang Hak Cipta

Lingkup Hak Cipta Pasal 1 1. Hak Cipta adalah hak eksklusif pencipta yang timbul secara otomatis berdasarkan prinsip

deklaratifsetelahsuatuciptaandiwujudkandalambentuknyatatanpamengurangipembatasansesuaidenganketentuanperaturanperundang-undangan.

Ketentuan Pidana Pasal 113 1. Setiap Orang yang dengan tanpa hak melakukan pelanggaran hak ekonomi sebagaimana

dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf I untuk Penggunaan Secara Komersial dipidanadenganpidanapenjarapalinglama1(satu)tahundan/ataupidanadendapalingbanyakRp.100.000.000,00(seratusjutarupiah).

2. SetiapOrangyangdengantanpahakdan/atautanpaizinPenciptaataupemegangHakCiptamelakukanpelanggaranhakekonomiPenciptasebagaimanadimaksuddalamPasal9ayat(1)hurufc,hurufd,huruf f,dan /atauhurufhuntukPenggunaanSecaraKomersialdipidanadenganpidanapenjarapalinglama3(tiga)tahundan/ataupidanadendapalingbanyakRp.500.000.000,00(limaratusjutarupiah).

��


SWASTA NULUS2016

R�ndang Dw�yan�Hestin Yuswanti

Ida Ayu Putri DarmawatiN� Nyoman Ar� Mayadew�




�v

Hak Cipta pada Penulis. Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang :

Dilarangmengutipataumemperbanyaksebagianatauseluruhisibukuinitanpaizintertulisdaripenerbit.

Penulis:R�ndang Dw�yan�Hestin Yuswanti

Ida Ayu Putri DarmawatiN� Nyoman Ar� Mayadew�

Cover & Ilustrasi: Repro

Diterbitkan oleh:SWASTA NULUS

Jl. Tukad Batanghar� VI.B No. 9 Denpasar-Bal�Telp. (0361) 241340

Ema�l: [email protected]

Cetakan Pertama:2016, x� + 61 hlm, 15,5 x 23 cm

ISBN: 978-602-7599-24-6



v


PenulismenghaturkanpujisyukurkehadapanTuhanYangMahaKuasayangtelahmemberikan

kekuatan serta kesehatan, penerangan hati dan pikiransehinggapenulismampumenyelesaikanbukuinimeskipunmasihjauhdarisempurna.Sebuahbukusederhananamundiharapkanmampumemberikansedikit sumbangan ilmupengetahuan bagi para peneliti, dosen atau mahasiswayanginginmendapatkaninformasimengenaitransformasigenetikpadatanamanmelaluiAgrobacterium tumefaciens.

Buku ini merupakan rangkuman hasil penelitiantransformasi genetik melalui Agrobacterium tumefaciens padatanamananggrekVanda tricolor Lindl.var.suavis yangtelahdilakukanpenulismelaluipenelitian-penelitianyanghampir semuanya dibiayai kementerian Riset, Teknologidan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia melalui SkimHibah Desentralisasi. Untuk itu, penulis mengucapkanterimakasih yang tak berhingga. Demikian pula penulismengucapkanterimakasihkepadaLembagaPenelitiandanPengabdianMasyarakatUniversitasUdayana,yangtelah

PRAKATA


v�

memfasilitasipelaksanaanpenelitianinisertamemudahkanpelaksanaanpenelitiansehinggapenulisdapatmelakukanpenelitian dengan baik serta menyumbangkan hasilpenelitianinikepadamasyarakatdalambentukbuku.

Penulis menyadari bahwa tulisan ini sangat jauhdari sempurna, untuk itu penulis sangat mengharapkanmasukan berupa kritik maupun saran dari para pembacasertaparaahliilmuterkaitagarbukuinimenjadilebihbaikdanlebihsempurna.

Denpasar,Januari2016

v��


PRAKATA ................................................................................v

BAB I PENGETAHUAN DASAR MOLEKULER .............1

BAB II TRANSFORMASI GENETIK PADA TANAMAN ........................................................5 2.1 Pengertian...............................................................5 2.2 TahapandanMetodeTransformasi....................7

BAB III TRANSFORMASI GENETIK MELALUI Agrobacterium tumefaciens ...........................................9 3.1 TeknologitransfergenolehAgrobacterium tumefaciens...............................................................9 3.2 ModifikasiPlasmiddalamLaboratorium........12 3.3 KonstruksiGen.....................................................14

BAB IV TRANSFORMASI GENETIK DENGAN METODE IN VITRO ................................17 4.1 TargetTransformasi.............................................17

DAFTAR ISI


v��

4.2 TahapanTransformasi.......................................20 4.3 TransformasiGenetikSecaraIn vitropada AnggrekVanda tricolorLindl.var.suavis..........23

BAB V TRANSFORMASI GENETIK DENGAN METODE IN PLANTA ............................32 5.1 Pengertian.............................................................32 5.2 TransformasiGenPembungaandengan metodeIn PlantapadaTanamanAnggrek Vanda tricolorLindl...............................................34

BAB VI PENUTUP ................................................................41

DAFTAR PUSTAKA ............................................................44

GLOSSARIUM .......................................................................48

INDEX .................................................................................56

BIODATA PENULIS ..............................................................58

�x


DAFTAR TABEL

Tabel1. Perbedaanselprokaryotikdaneukaryotik.......4

Tabel2. Pengaruhpemberianasetosiringondan

vitaminCterhadapkandidattransgenik

yangdihasilkan....................................................27

Tabel3. JumlahPropagulyangterbentukdariirisan

eksplanyangberasaldaritanamannon

transgenikdantransgenikyangmembawa

genKNAT1padamediainduksitunas,

6minggusetelahpenanaman............................30


x

DAFTAR GAMBAR

Gambar1. TumorpadabatangtanamandikotilyangdisebabkanolehAgrobacterium tumefaciens....9

Gambar2. GambarSkhematisSelAgrobacterium tumefaciens.........................................................10

Gambar3. Plasmid(kiri)dangen-genyangada padaT-DNA(kanan)......................................12Gambar4. ContohKonstruksiT-DNA...........................16Gambar5. Transformasisecarainvitrodengan metode”leafdisc”..........................................19Gambar6. Vanda tricolorLindl.var.suavisyang berasaldariBali...............................................23Gambar7. ProtokormanggrekV. tricolorumur8 minggusetelahsemai.....................................25Gambar8. Ujikanamisinpadatanamannon-transgenik

(NT)V. tricolor................................................26Gambar9. KonfirmasikeberadaantransgenKNAT1

denganPCR ....................................................29

x�


Gambar10.KonstruksigenPaFT.......................................35Gambar11. KulturcairAgrobacterium.............................36Gambar12.PelaksanaanTransformasiIn Planta..............37Gambar13.PanenBuahdanSemaiBijisecaraIn vitro....38Gambar14.SeleksiAwaldengan10ppmhigromisin.....38Gambar15.TanamanKandidatTransgenikVanda tricolorLindl......................................................39Gambar16.HasilElektroforesis.........................................40


x��

1


Deoxyribonucleic acid(DNA)merupakanpenyusungenmahlukhidup,terdiridaritigakomponenutama,yaitu:1. Gugus gula 2-deoxyribose, yaitu gula ribosa (gula

penyusun RNA) yang kehilangan atom oksigennyapada gugus karbon nomor 2 sehingga menjadi 2-deoxyribosa;

2. GugusPhosfat(triphosfat);3. Basa-basanitrogen,ada2macam,yaitubasadengan

1 cincin yaitu purin (Thimin dan Cytosine) danbasa dengan 2 cincin yaitu pirimidin (Adeninedan Guanine). Thimin disingkat “T”, Cytosine “C”,Adenine“A”danGuanine“G”.

Ketiga gugus tersebut membentuk mononukleotida.Selanjutnya gugus mononukleotida ini berikatan dengangugusmononukleotidalainnyamelaluiikatanfosfodiestermembentuk rantai nukleotida atau polynukleotida(poly=banyak). Ikatanfosfodiestersangatkuatdanhanyabisa terpotong oleh enzim restriksi endonuclease, DNAmerupakan rantai ganda (double strand), antara rantai

BAB IPENGETAHUAN DASAR

MOLEKULER


2

satu dengan lainnya dihubungkan oleh ikatan hidrogenantar basa, yakni ikatan hydrogen antara A dengan T,danGdenganC. Ikatanhidrogeninitidakkuatdanbisadipisahkanolehpemanasan.

Rantaipolynukleotidayangmengkodesuatuproteindisebutgen.JadigenadalahurutannukleotidaataufragmenDNAtertentuyangadadalamkromosom,yangmengkodeproteinpenentukaraktersuatuorganisme.Genmerupakanunitpewarisansifatdarisuatuorganismehidup.Genakanditurunkandarisuatuindividukepadaanakannyamelaluireproduksi atau perbanyakan. Ekspresi dari gen dimulaisaatDNAditanskripsimenjadiRNA,kemudianditranslasimenjadiprotein.Peristiwatersebutdikenaldenganistilahsentral dogma genetik.

Menurut sentral dogma genetik, dalam sel mahlukhidup, molekul DNA akan ditranskripsi menjadi RNA,selanjutnyaakanditranslasimenjadiproteinsepertiskemaberikut:

DNA dibuat transkripnya atau salinannya dalambentuk RNA, peristiwa ini disebut transkripsi. MolekulRNAterdiridarigugusgularibosa,gugusfosfatdanbasanitrogen. Bedanya dengan molekul DNA adalah terletakpadagugusgulanya,jikaRNAadalahribosa,DNAadalahdeoxyribosa;sertagugusbasanyayaituTimin(T)padaDNAmenjadiUrasil(U)padaRNA.Dengandemikian,ApadaDNAakanberpasangandenganUpadaRNAdalamproses

Menurut sentral dogma genetik, dalam sel mahluk hidup, molekul DNA akan

ditranskripsi menjadi RNA, selanjutnya akan ditranslasi menjadi protein seperti

skema berikut:

DNA dibuat transkripnya atau salinannya dalam bentuk RNA, peristiwa ini disebut

transkripsi. Molekul RNA terdiri dari gugus gula ribosa, gugus fosfat dan basa

nitrogen. Bedanya dengan molekul DNA adalah terletak pada gugus gulanya, jika

RNA adalah ribosa , DNA adalah deoxyribosa; serta gugus basanya yaitu Timin ( T )

pada DNA menjadi Urasil ( U ) pada RNA. Dengan demikian, A pada DNA akan

berpasangan dengan U pada RNA dalam proses transkripsi. RNA adalah single

strand (rantai tunggal) dan terbentuk dengan orientasi 5’ 3’, sehingga rantai tunggal

DNA dengan orientasi 3’ 5’ akan menjadi template untuk pembentukan RNA,

disebut template strand. Template strand inilah yang ditempel oleh RNA

polimerase pada saat transkripsi.. Sementara untai DNA pasangannya, yaitu yang

tidak menjadi template disebut sebagai coding strand (karena memiliki urutan basa

yang sama dengan RNA yang dibuat).

Pembentukan RNA dalam transkripsi ini dibantu oleh enzim RNA polymerase,

sampai akhirnya terbentu mRNA (messenger RNA). mRNA (messenger RNA) yang

terbentuk melalui proses transkripsi ini selanjutnya akan menjadi penentu asam

amino yang akan terbentuk, karena jenis asam amino ini ditentukan oleh urutan

basa yang ada pada mRNA. Urutan basa penentu asam amino inilah disebut kodon

atau kode genetik. Empat (4 ) basa yakni Adenin, Urasil, Citosin dan Guanin

membentuk 4x4x4= 64 kombinasi ‘tiga nukleotida’ (kodon). Dari 64 kombinasi ini

hanya membentuk 20 macam asam amino karena ada beberapa jenis asam amino

yang memiliki lebih dari satu kodon. Namun ada juga kodon yang tidak mengkode

3


transkripsi.RNAadalahsinglestrand(rantaitunggal)danterbentuk dengan orientasi 5’3’, sehingga rantai tunggalDNAdenganorientasi3’5’akanmenjaditemplateuntukpembentukan RNA, disebut template strand. Template strand inilah yang ditempel oleh RNA polimerase padasaattranskripsi..SementarauntaiDNApasangannya,yaituyangtidakmenjaditemplatedisebutsebagaicoding strand(karenamemilikiurutanbasayangsamadenganRNAyangdibuat).

Pembentukan RNA dalam transkripsi ini dibantuoleh enzim RNA polymerase, sampai akhirnya terbentumRNA (messenger RNA). mRNA (messenger RNA) yangterbentuk melalui proses transkripsi ini selanjutnya akanmenjadipenentuasamaminoyangakanterbentuk,karenajenis asam amino ini ditentukan oleh urutan basa yangadapadamRNA.Urutanbasapenentuasamaminoinilahdisebut kodon atau kode genetik. Empat (4 ) basa yakniAdenin,Urasil,CitosindanGuaninmembentuk4x4x4=64kombinasi ‘tiga nukleotida’ (kodon). Dari 64 kombinasiini hanya membentuk 20 macam asam amino karena adabeberapa jenis asam amino yang memiliki lebih dari satukodon.Namunadajugakodonyangtidakmengkodesuatuasam amino yang disebut ’stop codon’. Asam amino iniakan membentuk polimer yang disebut polypeptida atauprotein.ProsespenerjemahanurutannukleotidayangadapadamolekulmRNAmenjadirangkaianasam-asamaminoyangmenyusunsuatupolipeptidaatauproteininidisebuttranslasi. Kode genetik atau kodon bersifat universal,


4

artinya semua mahluk hidup menggunakan kode genetikyang sama. Hal inilah yang membuat dimungkinkannyatransfergendarisatumahlukhidupyangsatukemahlukhiduplainnya.

Proses terjadinya sentral dogma genetik berbedaantaratipeseleukaryotiksepertisel-seltanaman,hewandanmanusiadengantipeselprokaryotik,sepertibakteri,sepertiterlihatpadaTabel1.Padaselprokaryotiksemuaproses,yakni transkripsi dan translasi terjadi dalam sitoplasma,sementra pada sel eukaryotik, transkripsi terjadi dalaminti,ketikasudahterbentukmRNA,makamRNAiniakandiekspor ke sitoplasma dan ditranslasi menjadi protein.Pemahamanmengenaisentraldogmagenetikinidiperlukansebelum mempelajari lebih jauh mengenai transformasigenetikpadatanaman.

Tabel 1. PerbedaanselprokaryotikdaneukaryotikSel prokaryot Sel Eukaryot

Sel tidak memiliki dinding inti sehingga tidak ada batas yang jelas antara inti dan sitoplasma

Sel dengan dinding inti sehingga ada batas yang jelas antara inti dan sitoplasma

DNA tidak mengandung intron, konsekuensinya proses transkripsi hanya berlangsung 1 tahap

DNA mengandung intron, konsekuensinya proses transkripsi berlangsung 2 tahap. Tahap 1 adalah pembentukan transkrip RNA awal (primary RNA) yang masih memiliki intron, tahap 2 adalah proses splicing yaitu proses penghilangan intron sehingga akhirnya dihasilkan mRNA yang tidak memiliki intron

Seluruh proses, yakni transkripsi dan translasi berlangsung di dalam sitoplasma

Proses transkripsi hingga terbentuknya mRNA berlangsung di dalam inti, sedangkan translasi yakni perubahan mRNA menjadi protein berlangsung di sitoplasma

5


BAB IITRANSFORMASI GENETIK

PADA TANAMAN

2.1 Pengertian

Transformasi genetik pada tanaman adalahmentransfer gen asing yang diperoleh dari

tanaman, virus, bakteri, hewan, atau manusia pada suatuspesies tanamantertentu. Ataubisa jugadikatakansuatuproses untuk mendapatkan tanaman transgenik. Genasingyangdiperolehdarimahlukhiduptertentutersebutdirekayasa secara molekuler sehingga bisa disisipkan kedalamgenomtanaman.Genasinghasilrekayasagenetikayang disisipkan pada spesies tanaman tertentu disebuttransgen,sehinggatanamanyangtersisipitransgendisebuttanamantransgenik.Dengandemikian,tanamantransgenikdapatdidifinisikansebagaitanamanyangtelahdisisipigenasingyangberasaldarimahlukhiduplainnya,bisasesamatanaman,hewan,ataupunbakteri.

Tujuan dari pembuatan tanaman transgenik adalahuntuk mendapatkan tanaman unggul yang lebih baikdari tanaman aslinya. Pada awal dibuatnya tanaman


6

transgenik sebenarnya untuk mengatasi masalah pangandunia. Meningkatnya jumlah penduduk menyebabkanproduksi pangan tidak dapat memenuhi kebutuhanpanganmereka.Untukmeningkatkanluasarealpertaniantidak memungkinkan karena semakin sempitnya luaslahan pertanian. Sementara intensifikasi budidayapertanian(melaluipenggunaanpupukkimiadanpestisida)menimbulkandampakburukpadalingkungandandampakresidu pada produk yang membahayakan konsumen. Disisi lain, diketahui bahwa kehilangan produksi pertaniansebagianbesardisebabkanolehhama,penyakitdangulma.Dengandemikiandilakukanlahupayapembuatantanamantransgenikyangtahanterhadaphama,penyakitdantahanterhadap herbisida. Jadi tujuan awal utamanya adalahpeningkatanproduksipangan.

Seiiringdenganperkembanganteknologiyangsemakinpesatsehinggamemudahkandilakukannyametodetransfergen pada tanaman, maka penciptaan tanaman transgeniktidak hanya untuk peningkatan produksi dan mengatasimasalahhama,penyakitdangulma,namunmulaimengarahpada peningkatan kualitas untuk mendapatkan tanamandengankualitasyanglebihbaik.

Demikian pula untuk jenis komoditi, tidak hanyauntuktanamanpanganutamasepertipadi,jagung,namunjugabanyakdilakukanpadatanamanhiassepertitanamananggrek, krisan, dan lain sebagainya. Rekayasa genetikapadatanamanhiasdilakukanuntukmendapatkankultivar-kultivar baru dengan kualitas yang lebih baik, misalnyaberbungalebihcepatataupunwarnabungalebihcerah.

7


2.2 Tahapan dan Metode Transformasi

Proses transformasi genetik pada tanaman melewatibeberapatahapanyaitu:Insersi transgen;integrasi transgenkegenomtanaman;danekspresi transgenyangterintegrasipada genom. Pada tahapan insersi transgen dibutuhkansuatu metode bagaimana transgen bisa terinsersi ke seltanaman. Apabilatransgensudahmasukkeseltanaman,tahapanselanjutnyaadalahtransgentersebutharusbenar-benar terintegrasi ke genom tanaman. Artinya transgenbenar-benarbersatudenganDNAkromosomyangadadidalam inti sel tanaman. Jika transgen benar-benar telahterintegrasi, selanjutnyaakan terekspresibersamadenganekspresi gen tanaman. Pada tahapan ini, DNA sudahditranskripsi menjadi RNA dan selanjutnya terbentukprotein yang dikode oleh gen tersebut melalui prosestranslasi.Padatahapinisuatugendapatdikatakansecarafungsionalsudahberfungsi.

Metode Insersi transgen dapat dilakukan denganberagamcara,diantaranyaadalah:1. Agrobacterium-mediated transformation (metode

transformasidenganbantuanAgrobacterium)2. Microprojectile bombardment (penembakan dengan

pelurumikro)3. Electroporation(Elektroforasi)4. Silicon carbide-mediated transformation (transformasi

denganmediakarbidsilikon)


8

Metode1dan2adalahyangpalingbanyakdigunakan.Namundalambahasanselanjutnyaakanmenekankanpadametode 1 yaitu transformasi menggunakan Agrobacterium tumefacienssebagaimediator.MenurutAldemita&Hodges(1996) metode ini memiliki kelebihan dibanding metodelainnya, yaitu menghasilkan tanaman transgenik fertil,relatif mudah dilakukan, biaya murah dan transgen yangdisisipkan ke genom tanaman dapat diturunkan kepadaprogeninyamelaluihukumMendel.

9


3.1 Teknologi transfer gen oleh Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciensadalahbakterigramnegatif

yang secara alamiah menginfeksi tanaman dikotil danmenyebabkantumorpadabatangtanaman(Gambar1).

Gambar 1. Tumor pada batang tanaman dikotil yang disebabkan oleh Agrobacterium tumefaciens

(Sumber:Storey,2015denganijin)

BAB IIITRANSFORMASI GENETIK MELALUI

Agrobacterium tumefaciensBAB III. TRANSFORMASI GENETIK MELALUI Agrobacterium tumefaciens

A. Teknologi transfer gen oleh Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri gram negatif yang secara alamiah

menginfeksi tanaman dikotil dan menyebabkan tumor pada batang tanaman

(Gambar 1).

Gambar 1. Tumor pada batang tanaman dikotil yang disebabkan olehAgrobacterium tumefaciens

(Sumber: Storey, 2015 dengan minta ijin)

A.tumefaciens memiliki dua macam DNA, yakni DNA yang terletak di dalam

kromosom dan DNA plasmid yang berbentuk circular (melingkar) yang terletak di

luar kromosom (Gambar 2). Pada saat A.tumefaciens menginfeksi sel tanaman,

ada sepenggal DNA yang ada pada plasmid tersebut yang terintegrasi dengan stabil

ke genom tanaman, kemudian terekspresi dan menyebabkan tumor. Sepenggal

DNA tersebut dikenal sebagai T-DNA (Transferred-DNA). Sedangkan plasmid yang


10

A.tumefaciensmemilikiduamacamDNA,yakniDNAyang terletak di dalam kromosom dan DNA plasmidyang berbentuk circular (melingkar) yang terletak di luarkromosom(Gambar2).PadasaatA.tumefaciensmenginfeksisel tanaman,adasepenggalDNAyangadapadaplasmidtersebutyangterintegrasidenganstabilkegenomtanaman,kemudianterekspresidanmenyebabkantumor.SepenggalDNAtersebutdikenalsebagaiT-DNA(Transferred-DNA).Sedangkan plasmid yang membawa T-DNA disebut Tiplasmid(Ti=tumorinducing).T-DNAinidibatasiolehLeftborder(LB)sertaRightborder(RB)yangpanjangnya25bp.

Gambar 2. Gambar Skhematis Sel Agrobacterium tumefaciens

Pada T-DNA terdapat dua tipe gen. Yang pertamaadalahgenyangmengkodepembentukanhormonauksindan sitokinin. Ketika T-DNA terintegrasi ke genomtanaman,geniniterekpresipadatanaman,makaauksindansitokininakandiproduksisecaraberlebihanolehtanamandanmenstimulasipertumbuhanselyangtidakterorganisirsehinggaterbentuktumor.Yangkeduaadalahgenuntuk

membawa T-DNA disebut Ti plasmid (Ti=tumor inducing). T-DNA ini dibatasi oleh

Left border (LB) serta Right border (RB) yang panjangnya 25bp.

Gambar 2. Gambar Skhematis Sel Agrobacterium tumefaciens

Pada T-DNA terdapat dua tipe gen. Yang pertama adalah gen yang

mengkode pembentukan hormon auksin dan sitokinin. Ketika T-DNA terintegrasi ke

genom tanaman, gen ini terekpresi pada tanaman, maka auksin dan sitokinin akan

diproduksi secara berlebihan oleh tanaman dan menstimulasi pertumbuhan sel yang

tidak terorganisir sehingga terbentuk tumor. Yang kedua adalah gen untuk sintesis

opine. Gen sintesis opine ini terekspresi pada sel tanaman sehingga sel tanaman

mensintesis opine, dan opine ini selanjutnya digunakan oleh Agrobacterium sebagai

sumber karbon / nitrogen (makanan) untuk pertumbuhan Agrobacterium itu sendiri.

Selain itu plasmid juga membawa sekelompok gen Vir yang membantu dalam

proses transfer namun tidak ikut tertransfer dan terintegrasi ke genom tanaman.

Keberadaan gen Vir ini sangat penting dalam proses transfer. Proses transfer T-

DNA dimediasi oleh kerjasama dari protein-protein yang dikode oleh gen-gen Vir

11


sintesisopine. Gensintesisopine ini terekspresipadaseltanamansehinggaseltanamanmensintesisopine,danopineini selanjutnya digunakan oleh Agrobacterium sebagaisumberkarbon/nitrogen(makanan)untukpertumbuhanAgrobacteriumitusendiri.

SelainituplasmidjugamembawasekelompokgenVir yang membantu dalam proses transfer namun tidak ikuttertransferdanterintegrasikegenomtanaman.Keberadaangen Vir ini sangatpentingdalamproses transfer. Prosestransfer T-DNA dimediasi oleh kerjasama dari protein-proteinyangdikodeolehgen-genVirtersebutyangterdapatpada virulence region pada Ti plasmid dan juga oleh gen-genyangterdapatpadakromosombakteri.SecaraalamiahpadapembentukantumorkarenainfeksiA.tumefaciens, seltanamanyanglukamenghasilkanasetosiringon(AS)yaitusuatu senyawa kimia yang berfungsi sebagai ‘attractant’bagiAgrobacterium.ASmengaktifkansekelompokgenVirpadaplasmiddidalamselbakterisehinggamenyebabkangenVirterekspresidanmenghasilkanproteinVir.ProteinVir yang dihasilkan oleh gen Vir ini memungkinkanterjadinyatransferT-DNAkegenomtanaman.ProteinVirinilahyangmembantuterlepasnyaT-DNAsehinggamasukkesitoplasma,kemudiankeintiseldanterintegrasikeDNAtanamanpadakromosom.SelanjutnyaT-DNAterekspresidan secara fenotipik terlihat sebagai tumor. Gambar 3memperlihatkansecaraskhematisT-DNAdengangen-genyangadadidalamnya.


12

Gambar 3. Plasmid (kiri) dan gen-gen yang ada pada T-DNA (kanan)(Sumber:Shailes,2013)

SistemtransferT-DNAdariplasmidbakterikegenomtanamaninilahyangkemudiandiadopsiolehparapekerjarekayasagenetikauntukmentransfergenyangdiinginkan(gene of interest)kegenomtanamanmelaluiA. tumefaciens.

3.2 ModifikasiPlasmiddalamLaboratorium

Teknologi transfer gen oleh Agrobacteriumdimodifikasi untuk mentransfer gen yang diinginkan kegenomtanaman.TeknologitransfergenolehA. tumefaciensdapatdiringkassebagaiberikut:- Sepenggal DNA yang disebut T-DNA tertransfer ke

genom tanaman ketika A. tumefaciens menginfeksitanaman.

- Pada T-DNA tersebut terdapat gen-gen pengkodehormon auksin dan sitokinin yang terintegrasi kegenomtanamandanterekpresikanolehtanamandanmenyebabkan tumor. Juga terdapat gen pengkodesintesaopineyangjugaterekspresisehinggatanaman

tersebut yang terdapat pada virulence region pada Ti plasmid dan juga oleh gen-gen

yang terdapat pada kromosom bakteri. Secara alamiah pada pembentukan tumor

karena infeksi A.tumefaciens, sel tanaman yang luka menghasilkan asetosiringon

(AS) yaitu suatu senyawa kimia yang berfungsi sebagai ‘attractant’ bagi

Agrobacterium. AS mengaktifkan sekelompok gen Vir pada plasmid di dalam sel

bakteri sehingga menyebabkan gen Vir terekspresi dan menghasilkan protein Vir.

Protein Vir yang dihasilkan oleh gen Vir ini memungkinkan terjadinya transfer T-DNA

ke genom tanaman. Protein Vir inilah yang membantu terlepasnya T-DNA sehingga

masuk ke sitoplasma, kemudian ke inti sel dan terintegrasi ke DNA tanaman pada

kromosom. Selanjutnya T-DNA terekspresi dan secara fenotipik terlihat sebagai

tumor. Gambar 3 memperlihatkan secara skhematis T-DNA dengan gen-gen yang

ada di dalamnya.

Gambar 3. Plasmid (kiri) dan gen-gen yang ada pada T-DNA (kanan)(Sumber: Shailes, 2013)

Sistem transfer T-DNA dari plasmid bakteri ke genom tanaman inilah yang

kemudian diadopsi oleh para pekerja rekayasa genetika untuk mentransfer gen yang

diinginkan (gene of interest) ke genom tanaman melalui A. tumefaciens.

13


memproduksi opine untuk kelangsungan hidupAgrobacterium.

Menurut Zupan & Zambryski (1995) dan Opabode(2006),untukkeperluanrekayasagenetika,T-DNAdalamplasmid inidirekayasa secarabuatan dalam laboratoriumsehinggadihasilkanplasmidmodifikasi.Plasmidtersebutdiisolasi,kemudiandilakukanmodifikasisebagaiberikut:- Genuntuk sintesisauksindan sitokinindihilangkan

supayatidakterbentuktumor- Gensintesisopinejugadihilangkankarenaproduksi

opine oleh sel-sel tanaman akan mengganggupertumbuhan sel tanaman disebabkan terpakainyabahan-bahanfotosintatuntuksintesisopine.

- Ukuran plasmid yang besar (±200kbp) diperkecildengan membuang segmen DNA yang tidakdiperlukan

- Ori (Origin of replication) untuk E.coli harusditambahkan,agarplasmiddapatdiperbanyakdalamE.coli.BakteriE.colimemilikicopynumberyangbesardalam replikasi plasmid, sehingga dalam rekayasagenetika digunakan untuk kloning (memperbanyakplasmidyangmembawagenyangkitainginkan).

- Pada T-DNA kemudian disisipkan konstruksi genyangdiiinginkan.

Selanjutnya, plasmid modifikasi yang sudahmembawagene of interesttersebutditransformasikedalam


14

A. tumefaciens kembali dan digunakan untuk mentransfergenkegenomtanaman.MakaketikaT-DNAyangsudahmengandunggene of interesttersebutterintegrasikegenomtanaman,selanjutnyaterekspresiuntukmenghasilkansuatukaraktertanamansesuaidengankarakteryangdibawaolehgene of interesttersebut.

3.3 Konstruksi Gen

Konstruksigenyangdibuatmenyerupaikondisigendialam,yakniterdiridari:1. Promotersebagaipenginisiasidanpengarahekspresi

gen,contohnyaadalahpromoteryangberasaldari:- Agrobacterium tumefaciens dan A. rhizognes: nos

(nopalinesynthase);ocs(octopinesynthase);mas (mannopinesynthase)

- DariCauliflowermosaicvirus(CaMV):35S RNA, 19S RNA

- DariJagung:Adh1-Alcoholdehydrogenase12. Terminatorsebagaipengakhirekspresi.3. Selectable marker / reporter gene untuk seleksi

awal dari sel-sel tanaman yang ditransformasi,sehinggadiketahuisel-selyangdidugaterinsersiolehtransgenyangdigunakandalam transformasi. Yangbaikdigunakanuntukselectable marker / reporter gene adalah gen dimana secara alamiah tanaman tidakmemilikinya. Beberapa contoh selectable marker /reportergeneadalah:

15


- lux : luciferase (firefly): secaranormaltanamantidakadayangmemiliki

aktivitasluciferase(visualmarker)- gus :ß-glucuronidase mengkode enzim β glucuronidase dari E.coli.

Enzimyangaktifbisa dideteksi dengan X-gal ,yangdapatmembentukwarnabiruyangintensifakibatprosesenzimatik

- GFP :Green Fluorescent Protein(jellyfish) SelyangmengekspresikanGFPakanmemendar

hijau pada cahaya biru. Tidak memerlukansubstratataucofactor

- Gen ketahanan terhadap antibiotik : NPTII (terhadap kanamisin), HPT IV (terhadaphigromisin).

- Genketahananterhadapherbisida:dhfr(resistanttomethotrexate)

ContohkonstruksiT-DNAdalamAgrobacteriumdapatdilihatpadaGambar4.

Padakonstruksiini,genKNAT1adalahgene of interest,sebagai selectable marker digunakan gen NPTII. Padamasing-masinggen,baikKNAT1maupunNPTII,keduanyadisertaidenganpromoter(PnosuntukgenNPTIIdan35SRNAdariCaMVuntuk genKNAT1). Konstruksi gen inidisisipkan ke dalam vektor pGreen (pG). Dari gambarkonstruksi gen ini, jelas terlihat bahwa setiap gen yangdisisipkan pada T-DNA harus memiliki promoter (Pnos


16

untukgenNPTII;35SRNAdariCaMVuntukgenKNAT1)dan memiliki terminator (Tnos untuk gen NPTII dan genKNAT1).

Gambar 4. Contoh Konstruksi T-DNAKeterangan: Plasmid biner pGreen digunakan sebagai vektor. Gen KNAT1 dikontrololeh promoter 35S dari Cauli flower Mosaic Virus (CaMV). RB = Right Border; LB = Left Border;Pnos=promoterdarigennopalinsynthase;Tnos=polyadenylationsitedarigennopalinsynthase;NPTII=Genneomycinphosphotransferaseyaitugenketahananuntukantibiotikkanamisin;KNAT1F1danKNAT1R1adalaholigonukleotidaprimerspesifikuntukmengamplifikasigenKNAT1sepanjang1,2kb(Sumber:Semiartiet al.,2007).

Dalampembuatankonstruksigensertamenyatukan

T-DNAbuatankeplasmidmodifikasidiperlukanduamacamenzim yang sangat penting, yaitu enzim endonukleaserestriksi, yakni enzim yang bertugas memotong DNA(memotongikatanphospodiester);sertaenzimDNAligase,yaknienzimyangbertugasmenyatukanpotongan-potonganDNA.

Gambar 4. Contoh Konstruksi T-DNAKeterangan: Plasmid biner pGreen digunakan sebagai vektor. Gen KNAT1 dikontrol olehpromoter 35S dari Cauli flower Mosaic Virus (CaMV). RB = Right Border; LB = Left Border;Pnos = promoter dari gen nopalin synthase; Tnos = polyadenylation site dari gen nopalinsynthase; NPTII = Gen neomycin phosphotransferase yaitu gen ketahanan untuk antibiotikkanamisin; KNAT1 F1 dan KNAT1 R1 adalah oligonukleotida primer spesifik untukmengamplifikasi gen KNAT1 sepanjang 1,2 kb (Semiarti et al., 2007).

Dalam pembuatan konstruksi gen serta menyatukan T-DNA buatan ke

plasmid modifikasi diperlukan dua macam enzim yang sangat penting, yaitu enzim

endonuklease restriksi, yakni enzim yang bertugas memotong DNA (memotong

ikatan phospodiester); serta enzim DNA ligase, yakni enzim yang bertugas

menyatukan potongan-potongan DNA.

17


BAB IVTRANSFORMASI GENETIK

DENGAN METODE IN VITRO

4.1 Target Transformasi

Transformasi in vitro adalah proses transformasiyang dilakukan secara in vitro di laboratorium. Padatransformasiin vitrodibutuhkanpengetahuansertakeahliandibidangkulturjaringan.Keahlianinidibutuhkanuntukmenghasilkantargettransformasi,melakukantransformasidanmenumbuhkantargetmenjaditanamantransgenik.

Targettransformasiadalahsuatusel/jaringantanamanyang dijadikan target dimana nantinya transgen (yangmengandung gene of interest) diharapkan bisa terintegrasipada sel-sel target. Pada transformasi genetik melalui A. tumefaciens, target transformasi ini diinokulasi dengansuspensi A. tumefaciens yang sudah membawa transgen.Selanjutnya,targetyangsudahtersisipigeninilahyangakanditumbuhkan menjadi tanaman transgenik. Target untuktransformasi memiliki beberapa persyaratan, diantaranya:tidakrekalsitran,artinyamemilikiresponterhadapmediatumbuh; suceptible terhadap infeksi Agrobacterium (dapatatau mudah terinfeksi); serta dapat beregenerasi menjaditanamanutuh.


18

Target transformasi untuk transformasi yang dilakukansecarainvitrodapatberupa:- Protocorm / protokorm : adalah bentukan warna

kuning/hijauyangmerupakanbentukperkembangandaribijianggrekyangdisemai.

- Protocorm like bodies / plb : adalah bentuk yangmenyerupai protokorm, namun berasal dari kultursel-selsomatik

- Kalus:strukturyangtidakterdiferensiasiyangmunculdarijaringan/organyangmengalamidediferensiasi,misalnya irisan daun yang ditanam pada mediadengan 2,4-D. 2,4-D merupakan ZPT yang sangatpentingdalampembentukankalus.KalusdihasilkandarikulturorganbarukemudiandilakukaninokulasidenganAgrobacterium.

Kalus juga bisa terbentuk setelah suatu organdiinokulasi dengan Agrobacterium, contohnya adalahmetodetransformasidenganleaf discsepertiterlihatpadaGambar 5 dengan penjelasan sebagai berikut: a. Organtanaman (daun) diambil sebagai eksplan dengan ’corkborrer’sehinggatampakpotonganeksplanyangberbentukbulatsepertipiring(leaf disc);b.EksplandirendamdengansuspensiAgobacterium(diinokulasi);c.Eksplankemudianditanam pada media padat untuk induksi kalus selama3 hari (ko-kultivasi); d. Eksplan dicuci bersih denganantibiotik untuk eliminasi Agrobacterium, kemudianditumbuhkan pada media padat untuk induksi kalus; e.

19


Selanjutnya kalus ditumbuhkan menjadi tunas denganmelakukansub-kulturpadamediainduksitunas;f.Tunas-tunas yang tumbuh selanjutnya di sub kultur ke mediaseleksisebagaiseleksiawaluntukmendapatkankandidattransgenik. Seleksi awal biasanya digunakan antibiotiktertentu tergantung gen selectable marker yang digunakan.Misalnya untuk gen hpt, digunakan antibiotik higromisinuntukseleksiawaltransgenik;g.Tunas-runasyangtetaphijau ditumbuhkan menjadi plantlet dan disebut sebagaikandidat tanaman transgenik. Konfirmasi gendilakukandengan PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan suatuprimer spesifik yang bisa digunakan untuk mendeteksikeberadaantransgendalamgenomtanaman.

Gambar 5. Transformasi secara in vitro dengan metode ”leaf disc”a=pengambilan bahan eksplan untuk target transformasi dengan ’cork borrer;

b=eksplandirendamdengansuspensiAgrobacteriumyangmembawatransgen(inokulasi);c= eksplanditanampadamedia induksikalus selama3hari (ko-kultivasi);d=eksplandicucibersihdenganantibiotik(eliminasi)danditanampadamediauntukinduksikalushinggakalustumbuh;e=kalusditanampadamediainduksitunashinggatumbuhtunas;f=tunas ditanam pada media dengan senyawa tertentu (umumnya antibiotik) untukseleksiawaltanamantransgenik;g=tunasyangtetaphijauditumbuhkanmenjadiplantletdandisebutsebagaikandidattransgenik/transforman.

Gambar 5. Transformasi secara in vitro dengan metode ”leaf disc” a=pengambilan bahan eksplan untuk target transformasi dengan ’cork borrer; b=eksplan direndam dengan suspensi Agrobacterium yang membawa transgen (inokulasi); c= eksplan ditanam pada media induksi kalus selama 3 hari (ko-kultivasi); d= eksplan dicuci bersih dengan antibiotik (eliminasi) dan ditanam pada media untuk induksi kalus hingga kalus tumbuh; e= kalus ditanam pada media induksi tunas hingga tumbuh tunas; f=tunas ditanam pada media dengan senyawa tertentu (umumnya antibiotik) untuk seleksi awal tanaman transgenik; g= tunas yang tetap hijau ditumbuhkan menjadi plantlet dan disebut sebagai kandidat transgenik/transforman

gh

a

b

c

d

ef

g


20

Menumbuhkantargettransformasimenjaditanamansecara utuh merupakan pekerjaan dalam kultur in vitro,sehingga diwajibkan untuk pekerja di bidang rekayasagenetik untuk memahami serta memiliki keahlian bidangkulturinvitro.

4.2 Tahapan Transformasi Secara umum, tahapan transformasi melalui A.

tumefaciens secarain-vitrodilakukansebagaiberikut:

1. Pre-kultur target transformasi. Pre-kultur dilakukan dengan memindahkan target

transformasikemediumbaru.Prekulturinidilakukan3 hari sebelum protokorm diinokulasi dengansuspensi Agrobacterium. Tujuannya adalah untukmempersiapkan target supaya memiliki sel-sel yangkompeten untuk ditransformasi. Untuk jaringaneksplanyyangmemilikikadarfenoltinggi,prekulturpada media baru memberikan penyegaran kembali(refresh) bagi jaringan eksplan karena pada medialama seringkali mengandung senyawa fenol yangcukupbanyaksehinggamenghambatperkembangandanpertumbuhansel/jaringaneksplan.

2. Pembuatan suspensi kultur A. tumefaciens. Yaitu dibuat dengan jalan mengencerkan kultur cair

bakteridenganjalanmenambahkanmediakulturcair(misal media cair dari media dasar MS/Murashige

21


& Skoog; media dasar NP / New Phalaenopsis).Pengencerandapatdilakukan4hingga10kali.

3. Inokulasi target dengan suspensi A. tumefaciens. Target transformasi direndam dengan suspensi

kultur A. tumefaciens. Lamanya perendaman bisabervariasi dan bisa digunakan sebagai perlakuan/treatmentdalampenelitian.Padatahapinijugadapatditambahkan asetosiringon untuk meningkatkanefisiensitransformasi.

4. Ko-kultivasi. Targettersebutpadatahap3selanjutnyadipindahke

media kultur padat. Pada tahap ini jaringan targetdibiarkanhidupbersamadenganA. tumefaciensselama3hingga7hari.Asetosiringonjugadapatditambahkanpadamediako-kultivasiuntukmeningkatkanefisiensitransformasi.

5. Eliminasi A. tumefaciens. Eliminasi A. tumefaciens dapat dilakukan dengan

antibiotik karbenisilin atau cefotaxime. Antibiotikdipilih yang membunuh bakteri namun aman bagijaringantarget.Konsentrasiantibiotikyangdigunakanmerupakanhasiltrial and errordantidakbisadilakukansembarangan.


22

6. Seleksi kandidat tanaman transgenik Target yang sudah ditransformasi tersebut diseleksi

sesuai dengan selectable marker yang digunakan.Sebagai contoh, jika digunakan gen NPTII (genketahanan terhadap kanamisin) sebagai selectable marker, maka pada tahap ini target harus diseleksidenganmenanamnyapadamediayangmengandungkanamisin. Target yang masih hidup pada mediaseleksi disebut kandidat tanaman transgenik danselanjutnyadiregenerasiuntukmenjaditanaman.

7. Analisis Molekuler Kandidat transgenik yang sudah dihasilkan pada

tahap sebelumnya selanjutnya dianalisis secaramolekuler untuk mengetahui dengan pasti apakahtransgen benar-benar terintegrasi secara stabil kegenomtanaman.AnalisismolekulerdilakukandenganmetodePCR(Polymerase Chain Reaction);ataumetodehibridisasisepertiSouthern blotted, Northern blotted dan Western blotted.

23


4.3 Transformasi Genetik Secara In vitro pada Anggrek Vanda tricolor Lindl. var. suavis

Padasub-babinidiberikancontohtransformasigenetikmelaluiA. tumefacienssecarain vitroyangdilakukanpenulisterhadap spsesies anggrek alam Vanda tricolor Lindl. var.suavis.AnggrekalamIndonesiayangmemilikibungatigawarna ini (tri-tiga; color-warna) menjadi fokus perhatianpenulis pada beberapa tahun terakhir melalui penelitian-penelitian yang intensif. V. tricolor var. suavis memilikiwarna dasar bunga putih dengan totol-totol berwarnamerahkeunguandanlabelumungu(Gambar6).Anngrekini terdapatdibeberapadaerahdi Indonesia,diantaranyaBali,Yogyakarta(lerengGunungMerapi),Jawabarat,Jawatengah,JawatimurdanSulawesi.

Gambar 6. Vanda tricolor Lindl. var. suavis yang berasal dari Bali (Dok.pribadi)

Gambar 6. Vanda tricolor Lindl. var. suavis yang berasal dari Bali(Dok. pribadi)

Transformasi yang dilakukan pada contoh ini adalah transformasi Gen

KNOTTED 1-like Arabidopsis thaliana (KNAT1). Gen KNAT1 diisolasi dan

dikarakterisasi dari tanaman Arabidopsi thaliana. Pada beberapa spesies tanaman,

overekspresi gen KNAT1 menghasilkan fenotipe banyak tunas atau pembentukan

struktur menyerupai tunas. Misalnya, pada tanaman selada (Lactuca sativa)

overekspresi gen KNAT1 menginduksi pembentukan struktur yang menyerupai daun

pada bagian tepi daun (Frugis et al. 1999, 2001). Pada tanaman tembakau

(Nicotiana tabaccum), overekspresi gen KNAT1 menyebabkan terbentuknya

meristem ektopik pada daun (Chuck et al., 1996). Pada anggrek Phalaenopsis

amabilis, overekspresi gen KNAT1 dengan menggunakan promoter 35S

menghasilkan fenotipe banyak tunas (Semiarti et al., 2007). Alasan ini yang menjadi

acuan penulis untuk mengoverekspresikan gen KNAT1 pada tanaman anggrek

dengan tujuan mendapatkan tanaman transgenik yang memiliki sel-sel tanaman

dengan totipotensi tinggi sehingga jika dilakukan mikropropagasi pada tanaman

tersebut akan dihasilkan lebih banyak progeni atau anakan baru.

Target transformasi yang digunakan adalah protokorm anggrek V. tricolor

Lindl. yang berumur 8 minggu seperti terlihat pada Gambar 7.

Gambar 6. Vanda tricolor Lindl. var. suavis yang berasal dari Bali(Dok. pribadi)

Transformasi yang dilakukan pada contoh ini adalah transformasi Gen

KNOTTED 1-like Arabidopsis thaliana (KNAT1). Gen KNAT1 diisolasi dan

dikarakterisasi dari tanaman Arabidopsi thaliana. Pada beberapa spesies tanaman,

overekspresi gen KNAT1 menghasilkan fenotipe banyak tunas atau pembentukan

struktur menyerupai tunas. Misalnya, pada tanaman selada (Lactuca sativa)

overekspresi gen KNAT1 menginduksi pembentukan struktur yang menyerupai daun

pada bagian tepi daun (Frugis et al. 1999, 2001). Pada tanaman tembakau

(Nicotiana tabaccum), overekspresi gen KNAT1 menyebabkan terbentuknya

meristem ektopik pada daun (Chuck et al., 1996). Pada anggrek Phalaenopsis

amabilis, overekspresi gen KNAT1 dengan menggunakan promoter 35S

menghasilkan fenotipe banyak tunas (Semiarti et al., 2007). Alasan ini yang menjadi

acuan penulis untuk mengoverekspresikan gen KNAT1 pada tanaman anggrek

dengan tujuan mendapatkan tanaman transgenik yang memiliki sel-sel tanaman

dengan totipotensi tinggi sehingga jika dilakukan mikropropagasi pada tanaman

tersebut akan dihasilkan lebih banyak progeni atau anakan baru.

Target transformasi yang digunakan adalah protokorm anggrek V. tricolor

Lindl. yang berumur 8 minggu seperti terlihat pada Gambar 7.


24

Transformasiyangdilakukanpadacontohiniadalahtransformasi Gen KNOTTED 1-like Arabidopsis thaliana(KNAT1). Gen KNAT1 diisolasi dan dikarakterisasi daritanamanArabidopsi thaliana.Padabeberapaspesiestanaman,overekspresi gen KNAT1 menghasilkan fenotipe banyaktunas atau pembentukan struktur menyerupai tunas.Misalnya,padatanamanselada(Lactuca sativa)overekspresigen KNAT1 menginduksi pembentukan struktur yangmenyerupai daun pada bagian tepi daun (Frugis et al.1999,2001).Padatanamantembakau(Nicotiana tabaccum),overekspresi gen KNAT1 menyebabkan terbentuknyameristem ektopik pada daun (Chuck et al., 1996). Padaanggrek Phalaenopsis amabilis, overekspresi gen KNAT1denganmenggunakanpromoter35Smenghasilkanfenotipebanyaktunas(Semiartiet al.,2007).Alasaniniyangmenjadiacuan penulis untuk mengoverekspresikan gen KNAT1pada tanaman anggrek dengan tujuan mendapatkantanamantransgenikyangmemilikisel-seltanamandengantotipotensi tinggisehingga jikadilakukanmikropropagasipada tanaman tersebut akan dihasilkan lebih banyakprogeniatauanakanbaru.

Targettransformasiyangdigunakanadalahprotokormanggrek V. tricolor Lindl. yang berumur 8 minggu sepertiterlihatpadaGambar7.

25


Gambar 7. Protokorm anggrek V. tricolor umur 8 minggu setelah semai(Dok.pribadi)

Agrobacterium tumefaciens yang digunakan adalahstrain LBA4404 dengan T-DNA yang membawa genketahananterhadapantibiotikkanamisin(NPTII)dangenKNAT1yangdikontrololehpromoter35SdariCauliflower Mosaic Virus, dalam vektor biner pGreen (pG). Selain itu,juga digunakan A. tumefaciens strain LBA4404 pembawahelper plasmidpSoupyangmengandunggenVir.Konstruksigen yang digunakan dalam transformasi ini dapat dilihatpadaGambar4.

Tahapantransfergenyangdilakukanadalah:prekultur,pembuatansuspensiAgrobacterium,inokulasi,ko-kultivasi,eliminasibakteri,seleksitransgenikpadamediaantibiotikdanPCRdenganprimerspesifikuntukKNAT1.

Seleksi transgenik dilakukan dengan menggunakanmediayangditambahkanamisin.GenKNAT1yangdisisipkanpada transformasi ini mengandung gen NPTII (neomycin

Gambar 7. Protokorm anggrek V. tricolor umur 8 minggu setelah semai(Dok. pribadi)

Agrobacterium tumefaciens yang digunakan adalah strain LBA4404 dengan T-DNA

yang membawa gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin (NPTII) dan gen

KNAT1 yang dikontrol oleh promoter 35S dari Cauliflower Mosaic Virus, dalam

vektor biner pGreen (pG). Selain itu, juga digunakan A. tumefaciens strain LBA4404

pembawa helper plasmid pSoup yang mengandung gen Vir. Konstruksi gen yang

digunakan dalam transformasi ini dapat dilihat pada Gambar 4.

Tahapan transfer gen yang dilakukan adalah : prekultur, pembuatan suspensi

Agrobacterium, inokulasi, ko-kultivasi, eliminasi bakteri, seleksi transgenik pada

media antibiotik dan PCR dengan primer spesifik untuk KNAT1.

Seleksi transgenik dilakukan dengan menggunakan media yang ditambah

kanamisin. Gen KNAT1 yang disisipkan pada transformasi ini mengandung gen

NPTII (neomycin phosphotransferase) yakni gen ketahanan terhadap salah satunya

antibiotik kanamisin yang digunakan untuk seleksi tanaman transgenik. Konsentrasi

kanamisin yang digunakan di sini yaitu 300 mg/liter. Penentuan konsentrasi ini

berdasarkan penelitian tahap awal yakni uji kanamisin pada protokorm wild type V.

tricolor umur 8 minggu. Setelah empat minggu aplikasi kanamisin, 50% protokorm

mati pada dosis 300 ppm (LD50), sehingga konsentrasi 300 ppm ini digunakan

sebagai seleksi (Gambar 8).


26

phosphotransferase) yakni gen ketahanan terhadap salahsatunya antibiotik kanamisin yang digunakan untukseleksi tanaman transgenik. Konsentrasi kanamisin yangdigunakandisiniyaitu300mg/liter.Penentuankonsentrasiiniberdasarkanpenelitiantahapawalyakniujikanamisinpadaprotokormwild typeV. tricolorumur8minggu.Setelahempat minggu aplikasi kanamisin, 50% protokorm matipadadosis300ppm(LD50),sehinggakonsentrasi300ppminidigunakansebagaiseleksi(Gambar8).

Gambar 8. Uji kanamisin pada tanaman non-transgenik (NT) V. tricolor.Persentaseprotokormmatiberturut-turutdarikirikekanan:

0%,30%,40%,50%,70%,dan95%;Skala:1000µm(Sumber:Dwiyaniet al2010;Dwiyani,2012).

Perlakuan pemberian Asetosiringon (0 ppm dan 25ppmAsetosiringon)diberikanpadasaatinokulasidanko-kultivasi. Selain itu juga diberikan pemberian perlakuanvitaminCsetelahko-kultivasi(0ppmdan50ppmvitaminC).HasilpenelitiandirangkumpadaTabel2.

Gambar 8. Uji kanamisin pada tanaman non-transgenik (NT) V. tricolor.Persentase protokorm mati berturut-turut dari kiri ke kanan : 0%, 30%, 40%, 50%, 70%, dan95%; Skala : 1000 µm (Sumber : Dwiyani, 2012).

Perlakuan pemberian Asetosiringon (0 ppm dan 25 ppm Asetosiringon)

diberikan pada saat inokulasi dan ko-kultivasi. Selain itu juga diberikan pemberian

perlakuan vitamin C setelah ko-kultivasi (0 ppm dan 50 ppm vitamin C). Hasil

penelitian dirangkum pada Tabel 2.

Tabel 2. Pengaruh pemberian asetosiringon dan vitamin C terhadap kandidattransgenik yang dihasilkan

Sumber: Dwiyani (2012)

Hasil penelitian pada Tabel 2 menunjukkan bahwa asetosiringon dibutuhkan

baik pada saat inokulasi maupun ko-kultivasi untuk mendapatkan kandidat

Perlakuan

PerlakuanAS saatinokulasi( mg/l)

PerlakuanAS saatKo-kultivasi( mg/l )

PerlakuanVitamin Csetelah ko-kultivasi( mg/l )

Nama Perlakuan

Jumlahprotokorm yangditransformasi

Protokormhijausetelahseleksi

Protokorm hijausetelahregenerasi /Kandidattransgenik

0 0 0 AS0+ 0,Vit C0 393 4 (1, 02 %) 1 (0,25 %)

0 25 0 AS0+25,VitC0 932 28 (3,00 %) 5 (0.54 %)

25 0 0 AS25+0,VitC0 692 11(1, 59 %) 3 (0,43 %)

25 25 0 AS25+25,VitC0 561 30 (5,35%) 5 (0,89%)

0 0 50 AS0+ 0,Vit C50 932 31 (3,33 %) 8 (0,86 %)

0 25 50 AS0+25,VitC50 450 52 (11,56 %) 25 (5,56 %)

25 0 50 AS25+0,VitC50 498 43 (8,63 %) 9 (1,81 %)

25 25 50 AS25+25,VitC50 449 83 (18,49 %) 39 (8,69 %)

0 mg/l 100 mg/l 200 mg/l 300 mg/l 400 mg/l 500 mg/l

27


Tabel 2.PengaruhpemberianasetosiringondanvitaminCterhadapkandidattransgenikyangdihasilkan

PerlakuanJumlah

protokorm yang

ditransfor-masi

Protokorm hijau setelah

seleksi

Protokorm hijau

setelah regenerasi / Kandidat transgenik

Perlakuan AS saat

inokulasi ( mg/l)

Perlakuan AS saat Ko-

kultivasi( mg/l )

Perlakuan Vitamin C

setelah ko-kultivasi ( mg/l )

Nama Perlakuan

0 0 0 AS0+ 0,Vit C0 393 4 (1, 02 %) 1 (0,25 %)

0 25 0 AS0+25,VitC0 932 28 (3,00 %) 5 (0.54 %)

25 0 0 AS25+0,VitC0 692 11(1, 59 %) 3 (0,43 %)

25 25 0 AS25+25,VitC0 561 30 (5,35%) 5 (0,89%)

0 0 50 AS0+ 0,Vit C50 932 31 (3,33 %) 8 (0,86 %)

0 25 50 AS0+25,VitC50 450 52 (11,56 %) 25 (5,56 %)

25 0 50 AS25+0,VitC50 498 43 (8,63 %) 9 (1,81 %)

25 25 50 AS25+25,VitC50 449 83 (18,49 %) 39 (8,69 %)

Sumber:Dwiyani(2012)

Hasil penelitian pada Tabel 2 menunjukkan bahwa

asetosiringondibutuhkanbaikpadasaatinokulasimaupunko-kultivasi untuk mendapatkan kandidat transgenikterbanyakpadatransformasigenetikmelaluiA. tumefacienspadaanggrekV. tricolorLindl.var. suavis. Selain itu jugadapatdisimpulkanbahwaaplikasivitaminCjugapentinguntuk meningkatkan jumlah kandidat transgenik yangdihasilkan. Asetosiringon berperan dalam pengaktifangenVir yangadapadaAgrobacterium tumefaciens.Aktivasigen Vir menyebabkan terbentuknya protein Vir. Protein


28

Vir inilah yang membantu proses transfer gen dari A. tumefacienskegenomtanaman.SedangkanfungsivitaminC disini lebih berperan dalam mencegah terjadinyapencoklatan (browning) pada jaringan tanaman sehinggameningkatkanjumlahprotokormhiduppaskatransformasidan secara tidak langsung juga meningkatkan jumlahkandidat transgenik yang dihasilkan. Pencoklatan padajaringantargetdilaporkanseringterjadipadatransformasigen melalui A. tumefaciens, sehingga aplikasi vitamin Csebagaiantioksidankuatsangatberperandalammencegahpencoklatan.PencoklatandalamhalinididugaditimbulkanolehinfeksiolehA. tumefaciens.

Langkah selanjutnya adalah konfirmasi keberadaantransgenpadakandidattransgenikmelaluiPCR.Kandidattransgenik yang sudah dihasilkan ditumbuhkan hinggamenjadiplantlet.PlantletiniselanjutnyadiambildaunnyauntukisolasiDNA.MetodeisolasiDNAyangdigunakanadalahmetodeDoyledanDoyle (1990). Deteksi transgendilakukan dengan metode PCR dengan menggunakanprimer spesifik untuk KNAT1. Reaksi PCR dilakukandengan kondisi sebagai berikut: 94oC selama 5 menit(denaturasi awal), kemudian dilakukan 30 siklus yangterdiridari94oCselama45detik(denaturasi),58oCselama1 menit (annealing), dan 72oC selama 1 menit 30 detik(elongation).Pemanjanganwaktuselama5menitdilakukanpadasuhu72oC,danterakhirsuhudijagapada4oC.DNAhasil amplifikasi selanjutnya dicek dengan elektroforesisdengan gel agarose 1%, kemudian divisualisasi dengan

29


UV transluminator. Gambar 9 adalah hasil amplifikasiDNAyangmenunjukkanpitasepanjang1200bp.Hasilinimengindikasikan bahwa transgen KNAT1 memang benardapatterintegrasikegenomtanaman.

Gambar9.KonfirmasikeberadaantransgenKNAT1 dengan PCR V1-V8=kandidattransgenik;NT=nontransgenik;M=DNAMarka;TandapanahkuningmenandakanamplifikasifragmenDNAsepanjang1200bp

(Sumber:Dwiyani,2012)

Selanjutnya pembuktian bahwa gen KNAT1 dapat berfungsi untuk meningkatkan totipotensi seldalam mikropropagasi dilakukan dengan melakukanmikropropagasi terhadap kandidat transgenik maupunnon-transgenik. Mikropropagasi yang dilakukan padatahap selanjutnya menunjukkan bahwa Jumlah propagulyang dihasilkan dari eksplan yang berasal dari tanamantransgenik anggrek V. tricolor jauh lebih tinggi daripadaeksplan yang berasal dari tanaman non transgenik (NT)

divisualisasi dengan UV transluminator. Gambar 9 adalah hasil amplifikasi DNA

yang menunjukkan pita sepanjang 1200 bp. Hasil ini mengindikasikan bahwa

transgen KNAT1 memang benar dapat terintegrasi ke genom tanaman.

Gambar 9. Konfirmasi keberadaan transgen KNAT1 dengan PCRV1-V8 = kandidat transgenik; NT = non transgenik; M =DNA Marka ; Tanda panahkuning menandakan fragmen DNA sepanjang 1200 bp teramplifikasi (Sumber:Dwiyani, 2012)

Selanjutnya pembuktian bahwa gen KNAT1 dapat berfungsi untuk

meningkatkan totipotensi sel dalam mikropropagasi dilakukan dengan melakukan

mikropropagasi terhadap kandidat transgenik maupun non-transgenik.

Mikropropagasi yang dilakukan pada tahap selanjutnya menunjukkan bahwa

Jumlah propagul yang dihasilkan dari eksplan yang berasal dari tanaman

transgenik anggrek V. tricolor jauh lebih tinggi daripada eksplan yang berasal dari

tanaman non transgenik (NT) (Tabel 3). Hal ini menunjukkan bahwa organ

tanaman transgenik 35S::KNAT1 memiliki totipotensi sel yang lebih tinggi

dibandingkan organ tanaman NT, dan ini berarti bahwa secara dominan transgen

KNAT1 berperan dalam menginduksi pembentukan tunas.

1000bp1200bp

500bp

100bp

M V1 V2 V3 V5V4 V6 V7 V8 NT

800bp


30

(Tabel 3). Hal ini menunjukkan bahwa organ tanamantransgenik35S::KNAT1memilikitotipotensiselyanglebihtinggi dibandingkan organ tanaman NT, dan ini berartibahwa secara dominan transgen KNAT1 berperan dalammenginduksipembentukantunas.

Tabel 3.JumlahPropagulyangterbentukdariirisaneksplanyangberasaldari tanamannontransgenikdantransgenikyang membawa gen KNAT1 pada media induksi tunas, 6minggusetelahpenanaman

Jenis Eksplan Tanaman Non Transgenik

Tanaman transgenik 35S::KNAT1

Irisan batang 1 68Pangkal daun 0 30

Sumber:Dwiyani(2012)

Beberapahaldapatdisimpulkandarihasilpenelitianini.Yangpertama,bahwatransformasigenetikmelaluiA. tumefacienspadaanggrekV. tricolormembutuhkanaplikasiasetosiringondanvitaminCpadaprosestransformasiuntukmeningkatkanjumlahkandidattransgenikyangdihasilkan.Yang kedua, bahwa dengan prosedur transformasi yangsangatsederhanaini,ternyatatransgenberhasilterintegrasipada genom tanaman. Yang ketiga, bahwa overekspresigen KNAT1 yang berperan sebagai gen kunci dalampembentukan tunas ternyata secara fungsional mampumeningkatkan totipotensi sel tanaman yang ditunjukkandengan meningkatnya jumlah propagul yang terbentukdalammikropropagasi.

31


Mengenai peningkatan jumlah propagul yangterbentuk pada mikropropagasi tanaman yang membawagen KNAT1 ini, Yanal et al. (2005) menjelaskan bahwaprotein KNOX1 pada tanamanArabidopsismengaktifkanbiosintesisdarisitokinindalamtubuhtanaman.Frugiset al.(2001) jugamendapatkanbahwaoverekspresigenKNAT1padatanamanseladaberhubunganeratdenganakumulasisitokinin.KemungkinanhalinijugaterjadipadatransgenikKNAT1 V. tricolor dari hasil penelitian ini. Overekspresigen KNAT1 mengaktifkan gen yang bertanggung jawabterhadap biosintesis sitokinin yang ada pada tanamansehingga organ-organ tanaman transgenik lebih banyakmenghasilkan propagul dalam mikropropagasi. Telahdiketahui bahwa hormon sitokinin dalam kultur in vitromemacupertumbuhantunas.


32

BAB VTRANSFORMASI GENETIK

DENGAN METODE IN PLANTA

5.1 Pengertian

Transformasi in planta adalah transformasidimana proses insersi gen (inokulasi dengan

Agrobacterium)dilakukantidaksecarainvitro,melainkandiluarlaboratorium.Transformasiinplantamenjadilebihefisien dibandingkan in vitro karena pekerjaan ”menjagakondisi steril” secara in vitro dapat dihindari. Menjagakondisi steril dalam proses transformasi secara in vitrosangatrumit.MisalnyaovergrowthdariAgrobacteriumyangsangat sulit dieliminasi dan pada akhirnya menimbulkankematian eksplan atau target transformasi. Selain itu,dalam tahapan eliminasi, beberapa jaringan eksplantidak tahan terhadap antibiotik yang digunakan untukmengurangiataumenghilangkanAgrobacteriumsehinggamenimbulkankematianjaringantarget.Padatransformasiinplanta,pekerjaanrumittersebutdapatdihindari.

Transformasi in planta dicontohkan oleh Supartana,et al (2005) pada tanaman padi. Caranya, biji-biji padi

33


direndam selama dua hari dalam air. Selanjutnya, jarumkecilyangsudahdicelupdengansuspensiAgrobacterium(yang membawa plasmid dengan gen yang diinginkan)ditusukkanpadabaianbijipadasisi(bagian)pangkaldimanaterdapatembrio.Selanjutnya,biji-bijiyangsudahdiinokulasitersebut ditumbuhkan pada media dalam pot dengankondisitidaksteril.Dibiarkanterjadipenyerbukansecaraalamiahdanterbentukbiji.Biji-bijitersebutditumbuhkanuntuk menjadi tanaman padi. Selanjutnya tanaman padiinidiseleksiawaluntukmendapatkankandidattransgenik.KonfirmasikeberadaantransgenpadakandidattransgenikdilakukandenganPCR.

Contoh lain dari transformasi in planta diberikanolehCloughandBent(1998)denganmetode”flowerdip”pada tanaman Arabidopsis thaliana. Tanaman A. thalianaditumbuhkan dalam pot dalam rumah plastik. Tunasinflorecence (bakal bunga) yang pertama dibuang untukmerangsang tumbuhnya banyak bakal bunga yang baru.Selanjutnyabakalbungayangmasihmelekatpadatanamandicelupkanselama30detikpadasuspensiAgrobacteriumyang sudah dipersiapkan. Selanjutnya bakal bungadibiarkan tumbuh menjadi bunga dan membentuk biji.Biji-biji dikoleksi untuk ditanam kembali. Tanaman yangtumbuhdaribijitersebutdiseleksiawaluntukmendapatkankandidat transgenik. Selanjutnya konfirmasi keberadaantransgenpadagenomtanamandilakukandenganPCR.


34

5.2 Transformasi Gen Pembungaan dengan metode In Planta pada Tanaman Anggrek Vanda tricolor Lindl.

Penelitianinidilakukanolehpenulis,dilatarbelakangiolehlamanyamasajuvenilanggrekgenusVanda.Padahalsebagaitanamanhias,nilaibungasebagaidayatarikestetikaamatlahpenting artinya. AnggrekgenusVanda rata-rataberbunga lima sampai tujuh tahun setelah biji disemai,sehingga upaya perbaikan sifat pembungaan ini sangatdibutuhkan.

Upaya perbaikan sifat tanaman dilakukan rekayasagenetika dengan pertimbangan waktu yang dibutuhkanlebih singkat karena perbaikan sifat langsung diarahkanpada DNA tanaman sebagai sumber heretabilitas ataupembawasifatyangditurunkanpadatanaman.

Overekspresi gen pembungaan ini diharapkanmenghasilkan kultivar baru spesies anggrek V. tricolorLindl. yang cepat berbunga. Kultivar baru ini dapatdijadikanindukpersilanganpadapemuliaankonvensionalsehingganantinyadihasilkanVandahibridyangmemilikisifatunggulyakniberbungalebihcepat.MengingatVandahibrid memiliki nilai tinggi secara ekonomis, maka hasilpenelitianiniakansangatbermanfaatbagipengembanganagribisnisanggrekkhususnyadiIndonesia.

Gen pembungaan yang digunakan dalam penelitianiniadalahPaFT(PhalaenopsisFlowering locus T),yaitusuatugen pembungaan yang diisolasi dari tanaman anggrek

35


Phalaenopsis.Overekspresigendenganpromoter35SdariCaMV(Cauliflower Mosaic Virus)diharapkanmenghasilkananggrek V. tricolor yang berbunga lebih cepat karena 35Sdari CaMV merupakan ’strong promoter’ yang bersifatkonstitutif. Gen ketahanan terhadap higromisin yaituHigromisinPosphotransferase(hpt)digunakansebagaigenpenyeleksi transgenik dan disertakan dalam konstruksigen.Gambar10memperlihatkankonstruksigenPaFTyangdigunakandalampenelitianini.KonstruksigendibuatolehSoenghoeJang(SinicaAcademia,Taiwan).

Gambar 10. Konstruksi gen PaFT(Sumber:Mercuriani,2015)

Transformasiin plantayangdilakukanpadapenelitianinididasaripemikiranbahwatanamananggreksangatmudahdilakukanpolinasi(penyerbukan)buatan.Polinasibuatandilakukandenganjalanmengambilpolen(yangberbentukgumpalan, disebut polinia) dan memindahkannya padaputik yang posisinya berada pada lekukan dari struktur’column (tugu)’. Dalam waktu 7 hari setelah polinasi,perhiasanbungaakanlayudanmengering,danbakalbuahakanmembesardanmembentukbuah.Buahdapatdipanen

ini akan sangat bermanfaat bagi pengembangan agribisnis anggrek khususnya di

Indonesia.

Gen pembungaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah PaFT

(Phalaenopsis Flowering locus T), yaitu suatu gen pembungaan yang diisolasi dari

tanaman anggrek Phalaenopsis. Overekspresi gen dengan promoter 35 S dari

CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) diharapkan menghasilkan anggrek V. tricolor yang

berbunga lebih cepat karena 35S dari CaMV merupakan ’strong promoter’ yang

bersifat konstitutif. Gen ketahanan terhadap higromisin yaitu Higromisin

Posphotransferase (hpt) digunakan sebagai gen penyeleksi transgenik dan

disertakan dalam konstruksi gen. Gambar 10 memperlihatkan konstruksi gen PaFT

yang digunakan dalam penelitian ini.

Gambar 10. Konstruksi gen PaFT(Sumber: Mercuriani, 2014)

Transformasi in planta yang dilakukan pada penelitian ini belum pernah

dilaporkan sebelumnya oleh peneliti lain, sehingga merupakan sesuatu yang bersifat

inovatif. Transformasi in planta yang dikerjakan dalam penelitian ini didasari

pemikiran bahwa tanaman anggrek sangat mudah dilakukan polinasi (penyerbukan)

buatan. Polinasi buatan dilakukan dengan jalan mengambil polen (yang berbentuk

gumpalan, disebut polinia) dan memindahkannya pada putik yang posisinya berada

pada lekukan dari struktur ’column (tugu)’. Dalam waktu 7 hari setelah polinasi,


36

setelahbiji-bijiyangadadidalamnyamemilikiembrioyangsudahcukupmatangdansiapuntukditabur.Waktupanentergantunggenusanggreknya,misalnyauntukgenusVandaperluwaktu6-7bulansetelahpolinasi,genusPhalaenopsis4-5 bulan setelah polinasi, genus Dendrobium 3-4 bulansetelah polinasi. Buah yang dipanen selanjutnya ditaburbijinya di laboratorium. Berdasarkan hal tersebut, makadilakukantransformasiin planta pada tanaman anggrekdenganurutanpekerjaansebagaiberikut:

1. Persiapan pembuatan suspensi Agrobacterium.Kultur cair Agrobacterium (dengan media LB)

dilakukanselama2x24jamdenganshaker(Gambar11).Sel bakteri dipanen untuk digunakan dalam transformasipadasaatkulturbakterimencapaiOD600=0,8.Selanjutnyadibuat suspensi kultur Agrobacterium untuk inokulasidengan jalan mencampur 1 bagian dari campuran kulturbakteri tersebut dengan 4 bagian media NP cair, danditambah20µLtween20.

Gambar 11. Kultur cair Agrobacterium(Dok.pribadi)

perhiasan bunga akan layu dan mengering, dan bakal buah akan membesar dan

membentuk buah. Buah dapat dipanen setelah biji-biji yang ada di dalamnya

memiliki embrio yang sudah cukup matang dan siap untuk ditabur. Waktu panen

tergantung genus anggreknya, misalnya untuk genus Vanda perlu waktu 6-7 bulan

setelah polinasi, genus Phalaenopsis 4-5 bulan setelah polinasi, genus Dendrobium

3-4 bulan setelah polinasi. Buah yang dipanen selanjutnya ditabur bijinya di

laboratorium. Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan transformasi in planta

pada tanaman anggrek dengan urutan pekerjaan sebagai berikut:

1. Persiapan pembuatan suspensi Agrobacterium.

Kultur cair Agrobacterium (dengan media LB) dilakukan selama 2 x 24 jam dengan

shaker (Gambar 11). Sel bakteri dipanen untuk digunakan dalam transformasi pada

saat kultur bakteri mencapai OD600 = 0,8. Selanjutnya dibuat suspensi kultur

Agrobacterium untuk inokulasi dengan jalan mencampur 1 bagian dari campuran

kultur bakteri tersebut dengan 4 bagian media NP cair, dan ditambah 20µL

tween20.

Gambar 11. Kultur cair Agrobacterium(Dok. pribadi)

2. Perendaman polen dengan suspensi Agrobacterium, polinasi buatan, danpembentukan buah (Gambar 12).

37


2. Perendaman polen dengan suspensi Agrobacterium, polinasi buatan, dan pembentukan buah (Gambar 12).

Pada tahap ini dilakukan perlakuan secara faktorialuntuk 2 faktor. Faktor 1 adalah lama perendaman polenyakni1dan2jam.Sedangkanfaktor2adalahpenambahanasetosiringon, 0 dan 25 ppm sehingga seluruhnya ada 4kombinasiperlakuan.

Gambar 12. Pelaksanaan Transformasi In Planta(Dok.pribadi)

3. Panen buah dan semai biji secara in vitroBuahyangberumur7bulansetelahpolinasidipanen

danbijinyadisemaisecarain vitro(Gambar13)

Pada tahap ini dilakukan perlakuan secara faktorial untuk 2 faktor. Faktor 1 adalah

lama perendaman polen yakni 1 dan 2 jam. Sedangkan faktor 2 adalah

penambahan asetosiringon, 0 dan 25 ppm sehingga seluruhnya ada 4 kombinasi

perlakuan.

Gambar 12. Pelaksanaan Transformasi In Planta(Dok. pribadi)

3. Panen buah dan semai biji secara in vitro

Buah yang berumur 7 bulan setelah polinasi dipanen dan bijinya disemai secara in

vitro (Gambar 13)


38

Gambar 13. Panen Buah dan Semai Biji secara In vitro(Dok.pribadi)

4. Subkultur protokorm ke media seleksiBijianggrekyangtumbuhmembentukstrukturbulat

hijau yang disebut protokorm. Protokorm ditumbuhkanhinggaberumur8minggudandipindahkemediaseleksi,yaitu media dasar MS yang ditambah dengan 10 ppmhigromisin (Gambar 14). Konsentrasi higromisin 10 ppmdiperolehmelaluirisetawalpadaprotokormwild typeumur8minggupadamediahigromisin,dimana50%darijumlahprotokormyangditanammatipadakonsentrasihigromisin10 ppm (LD50), sehingga higromisin 10 ppm digunakandalamseleksiawaltransgenik.

Gambar 14. Seleksi Awal dengan 10 ppm higromisina=protokormyangtumbuh;b=subkulturpadamediaMS+10ppmhigromisin

(Dok.pribadi)

Gambar 13. Panen Buah dan Semai Biji secara In vitro(Dok. pribadi)

4. Subkultur protokorm ke media seleksi

Biji anggrek yang tumbuh membentuk struktur bulat hijau yang disebut protokorm.

Protokorm ditumbuhkan hingga berumur 8 minggu dan dipindah ke media seleksi,

yaitu media dasar MS yang ditambah dengan 10 ppm higromisin (Gambar 14).

Konsentrasi higromisin 10 ppm diperoleh melalui riset awal pada protokorm wild type

umur 8 minggu pada media higromisin, dimana 50% dari jumlah protokorm yang

ditanam mati pada konsentrasi higromisin 10 ppm (LD50), sehingga higromisin 10

ppm digunakan dalam seleksi awal transgenik.

Gambar 14. Seleksi Awal dengan 10 ppm higromisina=protokorm yang tumbuh; b=subkultur pada media MS +10 ppm higromisin

(Dok. pribadi)

Gambar 13. Panen Buah dan Semai Biji secara In vitro(Dok. pribadi)

4. Subkultur protokorm ke media seleksi

Biji anggrek yang tumbuh membentuk struktur bulat hijau yang disebut protokorm.

Protokorm ditumbuhkan hingga berumur 8 minggu dan dipindah ke media seleksi,

yaitu media dasar MS yang ditambah dengan 10 ppm higromisin (Gambar 14).

Konsentrasi higromisin 10 ppm diperoleh melalui riset awal pada protokorm wild type

umur 8 minggu pada media higromisin, dimana 50% dari jumlah protokorm yang

ditanam mati pada konsentrasi higromisin 10 ppm (LD50), sehingga higromisin 10

ppm digunakan dalam seleksi awal transgenik.

Gambar 14. Seleksi Awal dengan 10 ppm higromisina=protokorm yang tumbuh; b=subkultur pada media MS +10 ppm higromisin

(Dok. pribadi)

39


5. Penentuan kandidat transgenikProtokorm yang tumbuh dan bertahan tetap hijau

setelah 4 minggu pada media seleksi dengan 10 ppmhigromisindisebutsebagaikandidattransgenik.Protokormkandidat transgenik ini selanjutnya dipelihara hinggamenjaditanamankandidattransgenik(Gambar15).

Gambar 15. Tanaman Kandidat Transgenik Vanda tricolor Lindl. (Dok.pribadi)

Hasil perlakuan menunjukkan bahwa perlakuanperendaman polen selama 2 jam dan ditambah 25ppm asetosiringon memberikan persentase kandidattransgeniktertinggi.Penggunaanasetosiringon(AS)untukmenginduksigenVirdirekomendasikanpadahampirsemuaprotokol transformasi untuk tanaman monokotil (Hiei et al.,1994;Ishidaetal.,1996;Chenget al.,1997;Tingayet al.,1997;Zhao et al., 2000). Efisiensi transformasidilaporkanmeningkatdenganaplikasiasetosiringonpadatransformasigenetik dari beberapa species anggrek yaitu Cymbidiumsp. (Chinet al.,2007),Dendrobium nobile (Menet al.,2003),

5. Penentuan kandidat transgenik

Protokorm yang tumbuh dan bertahan tetap hijau setelah 4 minggu pada media

seleksi dengan 10 ppm higromisin disebut sebagai kandidat transgenik. Protokorm

kandidat transgenik ini selanjutnya dipelihara hingga menjadi tanaman kandidat

transgenik (Gambar 15).

Gambar 15. Tanaman Kandidat Transgenik Vanda tricolor Lindl.(Dok. pribadi)

Hasil perlakuan menunjukkan bahwa perlakuan perendaman polen selama 2 jam

dan ditambah 25 ppm asetosiringon memberikan persentase kandidat transgenik

tertinggi. Penggunaan asetosiringon (AS) untuk menginduksi gen Vir

direkomendasikan pada hampir semua protokol transformasi untuk tanaman

monokotil (Hiei et al., 1994; Ishida et al., 1996; Cheng et al., 1997; Tingay et al.,

1997; Zhao et al., 2000). Efisiensi transformasi dilaporkan meningkat dengan

aplikasi asetosiringon pada transformasi genetik dari beberapa species anggrek

yaitu Cymbidium sp. (Chin et al., 2007), Dendrobium nobile (Men et al., 2003),

Phalaenopsis hibrida (Mishiba et al., 2005) dan Vanda tricolor Lindl. (Dwiyani et al.,

2010). Selain itu, hasil penelitian juga menyimpulkan bahwa lama perendaman


40

Phalaenopsishibrida(Mishibaet al.,2005)danVanda tricolorLindl. (Dwiyani et al., 2010). Selain itu, hasil penelitianjugamenyimpulkanbahwalamaperendamanpolenyangsemakinmeningkatjugameningkatkanpersentasekandidattransgenikyangdihasilkan.

6. KonfirmasikeberadaantransgenPaFT dengan PCRPrimer yang digunakan adalah primer Ubiquitin

(forward: 5’-TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ’) dan TNos(reverse: 5’-GATCTAGTAACATAGAT GACACCGCG-3’).Denganmenggunakanprimerini,makaharusteramplifikasiDNAsepanjang1100bpuntukkonfirmasibahwatransgensudah terintegrasi ke genom tanaman. Dari 5 sampelkandidatyangdicoba,4diantaranyamengamplifikasipitaDNAsepanjang1100bp(Gambar16).

Gambar 16. Hasil ElektroforesisM=Marka;V1,V2,V3,V4=sampelkandidattransforman;

tandapanahmenunjukkanpanjangpita1100bpyangteramplifikasi

41


BAB VIPENUTUP

Rekayasa genetika pada tanaman awalnyadilakukanuntukmengatasikehilanganproduksi

tanaman akibat serangan hama, penyakit dan gulma.Melalui rekayasa genetika maka terciptalah tanamanbudidaya yang tahan terhadap hama, penyakit danherbisida sehinggaproduksidapatditingkatkan. Namunkinirekayasagenetikasudahdiarahkanuntukpeningkatankualitas komoditi tanaman. Contohnya adalah ”goldenrice”, produk rekayasa genetika, dimana genom tanamanpadidisisipigenPhytoene synthase (psy)daribunganarsisatau gen Lycopene cyclase (crt1) dari bakteri tanah Erwinia uredofora sehingga tanaman mampu memproduksi enzimyang mengkatalisator biosintesis carotenoids (β-carotene)dalamendospermbiji.Berasdengankandunganβ-caroteneyang tinggi ini sangat bermanfaat bagi penduduk dinegara-negaradimanamasyarakatnyamasihbanyakyangmenderitadefisiensivitaminA.

Ada banyak metode untuk melakukan rekayasagenetika, namun metode yang paling mudah dan murahadalah dengan teknologi Agrobacterium. Adanya


42

DNA plasmid dalam Agrobacterium tumefaciens yangmenyebabkan crown gall (tumor) pada tanaman dikotilternyata merupakan anugerah dari Tuhan semesta alam.PlasmidyangmembawaT-DNAdengangen-genonkogenikpenyebabtumordapatdimodifikasidilaboratoriumuntukdisisipkangene of interestdandigunakansebagaialatdalamrekayasa genetika untuk melakukan perbaikan terhadapsifat-sifattanaman.

TerlepasdariadanyaprodankontraterhadapprodukGMO (Genetically Modified Organism), namun pemerintahIndonesiamemilikisikap’menerimaprodukGMOnamundengan kehati-hatian’. Kehati-hatian diperlukan untukmenjagabahwaproduktetapharusmemilikitingkat’safety’yang sangat tinggi untuk dikonsumsi oleh masyarakat.Namun sejauh ini belum pernah dilaporkan bahwamengkonsumsiproduktransgenikmenyebabkanpenyakittertentuataupunkematian.

Namunpenulisberpendapat,kehati-hatianyangsangattinggijusterudiperlukanpadaprosespembuatantanamantransgenik, terutama dengan teknologi Agrobacterium.Limbahdariprosespembuatantanamantransgenikharusdikelola dengan baik dan benar agar tidak mencemarilingkungan. Misalnya dalam penggunaan gen ketahananterhadapantibiotikhigomisin(hpt gene)sebagai”selectablemarker”.Pembuangansecarasembaranganlimbahbakteriyangmembawagenhpt dapatmenyebabkanbakteritanahmengalami mutasi menjadi tahan terhadap higromisin.Hal ini dapat menyebabkan kesulitan dalam menangani

43


(membasmi) bakteri tersebut jika suatu saat menyerangmahluk hidup lainnya seperti tumbuh-tumbuhan, hewandan manusia. Solusinya, setiap lembaga riset atauperguruan tinggi yang mengerjakan rekayasa genetikaharusmemilikisistempembuanganlimbahyangbenaragartidakmencemarilingkungan.

Selain itu, kehati-hatian juga perlu ditingkatkanterhadapproduktransgeniktertentusepertitanamanyangtahan terhadap herbisida. Herbiside resistant crops dapatmemicupenggunaanherbisidasecaratidakterkendalidalampembasmiangulmakarenapetanitidakperlulagimerasakhawatirbahwatanamannyaakanmatiterkenaherbisida.Kondisi ini sangat berbahaya karena dapat menyebabkanpencemaranlingkungan(tanahdanairtanah)yangjusteruberdampakterhadapmahlukhiduplainnyasepertihewanatautanamanlainnyayangdikonsumsimanusia.Dengandemikian, dalam penanaman jenis komoditi transgenikseperti ini, perlu dilakukan penyuluhan intensif kepadapetaniagarpenggunaanbahankimiatetapharusdilakukansecarabenardanproporsional.


44

DAFTAR PUSTAKA

Aldemita, R.R. and Hodges, T.K. 1996. Agobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofJaponicaandIndicaricevarieties.Planta199(4):612-617

Chai,M.L.,Xu,C.J.,Senthil,K.K.,Kim,J.Y.,Kim,H.2002.Stable transformation of protocorm like bodies inPhalaenopsis orchid mediated by Agrobacteriumtumefaciens.Sci.Hort.96:213-224.

Cheng,M.,Fry,J.E.,Pang,S.Z.,Zhou,H.P.,Hironaka,C.M.,Duncan, D,R., Conner,W., Wan,Y.C. 1997. GenetictransformationofwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol.115:971-980.

Chin, D.P., Mishiba, K., Mii, M. 2007. Agrobacterium-mediatedtransformationofprotocorm-likebodies inCymbidium.PlantCellRep.26:735-743.

Chuck,G.,Lincoln,C.,Hake,S.1996.KNAT1induceslobbedleaveswithectopicmeristemswhenovererexpressedinArabidopsis.ThePlantcell8:1227-1289.

Clough, S.J, and Bent,A.F. 1998. Floral dip: a simplifiedmethod forAgrobacterium mediated transformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16(6):735-743

45


Doyle,J.J. ,Doyle, J.L. 1990.IsolationofplantDNAfromfreshtissue.Focus12:13-15.

Dwiyani,R.2012.MikropropagasitanamananggrekVandatricolorLindl.var.suavisformaBaliyangmembawagen Knotted 1-like Arabidopsis thaliana (KNAT1).Disertasi. Sekolah Pasca Sarjana Universitas GadjahMada,Yogyakarta.

Dwiyani, R., Purwantoro, A., Indrianto, A., Semiarti, E.2010. Improvement of genetic Transformation inVandatricolorOrchidUsingAcetosyringone.AnnalesBogoriensesVol14(2):27-32

Frugis,G.,Giannino,D.,Mele,G.,Nicolodi,C.,Chiappetta,A., Bitonti, M.B., Innocenti, A.M., Dewitte, W., VanOncklen,H. andMariotti,D. 2001. Overexpressionof KNAT1 in lettuce shifts determinate growth toa shoot-like indeterminate growth associated withaccumulation of isopentenyl-type cytokinins. PlantPhysiol.126:1370-1380.

Frugis,G.,Giannino,D.,Mele,G.,Nicolodi,C., Innocenti,A.M.,Chiappetta,A.,Bitonti,M.B.,Dewitte,W.,VanOncklen, H. andMariotti, D. 1999. Are HomeoboxKnotted–Like Genes and Cytokikins the LeafArchitects?PlantPhysiology119:371-373.

Hiei,Y.,Ohta,S.,Komari,T.,Kumashiro,T.1994.Efficienttransformation of rice (Oryza sativa) mediated byAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.ThePlantJournal6:271-282.

Ishida,Y.,Saito,H.,Ohta,S.,Hiei,Y.,Komari,T.,Kumashiro,T.1996.Highefficiencyoftransformationofmaize(Zea


46

mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nat.Biotechnol.14:745-750.

Men,S.,Ming,X.,Liu,R.,Wei,C.,Li,Y.2003.Agrobacterium-mediated genetic transformation of a Dendrobiumorchid. PlantCell,TissueandOrganCulture75:63-71.

Mercuriani, I.S. 2015. Analisis fungsi gen PhalaenopsisamabilisFloweringlocusT1(PaFT1)padapembungaantanaman anggrek alam Phalaenopsis amabilis (L.)Blume. Disertasi. SekolahPascaSarjanaUniversitasGadjahMada,Yogyakarta

Mishiba, K., Chin, D.P., Mii, M. 2005. Agrobacterium-mediatedtransformationofPhalaenopsisbytargetingprotocormsatanearlystageaftergermination.PlantCellRep.24:297-303.

Opabode,J.T.2006.Agrobacterium-mediatedtransformationofplants : emerging factors that influenceefficiency,Review.Biotechnol.andMol.Biol.1:12-20.

Semiarti, E., Indrianto, A., Purwantoro, A., Isminingsih,S.,Suseno,N., Ishikawa,N.T.,Yoshioka,Y.Machida,Y., Machida., C. 2007. Agrobacterium-mediatedtransformationofthewildorchidspeciesPhalaenopsisamabilis.PlantBiotechnol..24:265-272.

Shailes, S. 2013. Agrobacterium tumefaciens: a pathogenthatgeneticallymodifiesplants.https://plantscientist.w o r d p r e s s . c o m / 2 0 1 3 / 0 7 / 0 5 / a g r o b a c t e r i u m -tumefaciens-a-pathogen-that-genetically-modifies-plants(diunduh12November2015)

47


Storey, M. 2015. Agrobacterium tumefaciens,Crown gall. http://www.discoverlife.org/mp/20q?search=Agrobacterium+tumefaciens&mobile=close&flags=glean(diunduh12November2015)

Suparthana,P.,Shimizu,T.,Shioiri,H.,Nogawa,M.,Nozue,M., and Kojima, M. 2005. Development of simpleandefficientinplantatransformationmethodforrice(Oriza sativa L.) using Agrobacterium tumefaciens.J.Biosci.Bioeng.100(4):391-397

Tingay,S.,Mc.Elroy,D.,Kalla,R.,Fieg,S.,Wang,M.,Brettel,R.1997.Agrobacterium-mediatedbarleytransformation.PlantJ.:1369-1376.

Yanal,O.,Shani,E.,Dolezal,K.,Tarkowski,P.,Sablowski,R.,Sanberg,G.,Samach,A.,Ori,N.2005.ArabidopsisKNOX Proteins Activate Cytokinin Biosynthesis.CurrentBiology15:1566-1571.

Zhao, ZY., Gu,W., Chai,T., Tagliani,L., Miller, M., Wang,N.,Pang,H.,Rudert,M.,Schroeder,S.,Hondred,D.,Seltzer,J.,Piercce,D.2000.Agrobacterium-mediatedshorgumtransformation.Plantmol.Biol.44:789-798.

Zupan, J.R., Zambryski, P.C., 1995. Transfer of T-DNAfromAgrobacterium to the plant cell. Plant Physiol.107:1041-1047.


48

GLOSSARIUM

Asetosiringon Senyawa yang secara alamiahdihasilkan oleh sel tanaman dikotilyang terluka dan menjadi attractantbagiAgrobacteriumuntukmenempelpada sel tanaman; Asetosiringonjuga menjadi senyawa pemicu untukaktifnyagenViryangadapadaplasmidA. tumefaciens.

Crown gall TumoryangterbentukpadabatangtanamandikotilyangdisebabkanolehinfeksiA. tumefaciens

DNA (Deoxyribonucleic acid) Suaturantainukleotida yang merupakan strukturpenyusungenmahlukhidup,dimanasetiapmononukleotidaterdiridaritigakomponenutama,yaitugula,phosfatdan basa-basa nitrogen (Adenin,Timin,Cytosin,Guanin)

Eliminasi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melalui

49


A.tumefaciens secara in vitro, dimanapada tahap ini pertumbuhanAgrobacterium pada jaringan targetharusditiadakan.

Gen Untaian DNA (polynuklotida) yangterdapat pada kromosom sel mahlukhidupyangmembawaataumengkodesuatusifatyangditurunkan.

GenVir Gen yang terdapat dalam plasmidpadaA. tumefaciensyangmemfasilitasiterjadinyatransferT-DNAdariplasmidA. tumefacienskegenomtanaman.

Inokulasi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens secara in vitro, dimanajaringan target direndam dalamsuspensi Agrobacterium yangmembawa transgen yang akanditransformasi.

Ko-kultivasi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens secara in vitro, dimanajaringantargetyangsudahdiinokulasidenganAgrobacterium ditumbuhkanpada suatu media. Pada fase ko-kultivasi,jaringantargetditumbuhkanbersamaA.tumefaciensselama3hari.


50

Plasmid DNAberbentukcincinyang terdapatdalam A.tumefaciens, yang dapatdirekayasa secara buatan untukkepentinganrekayasagenetika.

Promoter DNA yang merupakan penginisiasidan pengarah ekspresi gen. Lokasipromoter ada pada posisi ’upstream’darigenyangdiekspresikan.

SelEukaryotik Tipeselmahlukhidupyangmemilikisistem membran pada inti (nukleus)-nya,sehinggamemilikimembraninti.

Selprokaryotik Tipe sel dimana inti (nukleus)-nyatidakmemilikimembran.

Selectable marker DNApenandayangdigunakandalamtransformasi genetik, yang fungsinyauntukmelakukanseleksiawalinsersigenatauuntukmendapatkankandidattanamantransgenik.

Seleksi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens, dimana jaringan targetyangditransformasidiseleksidengansuatucaratergantungselectable markeryang digunakan dalam konstruksitransgen.

T-DNA(Transfer-DNA) Sepenggal DNA yang terdapat

pada plasmid Agrobacterium yang

51


tertransfer ke genom tanaman ketikatanamanterserang tumor (crown gall)yang disebabkan oleh A. tumefaciens.T-DNA dibatasi oleh left border danright border yang panjangnya sekitar25bp.PadaT-DNAterdapatgen-genpenyandi untuk biosintesis auksin,sitokinindanopine.

Transformasiin planta Transformasigenetikyangdilakukan

secara langsung pada tanaman dantidak dikerjakan secara in vitro dilaboratorium.

Transformasiin vitro Transformasigenetikyangdilakukan

secarain vitrodilaboratoriumTransgen Gen yang disisipkan ke genom

tanamanpadarekayasagenetikaTransgenik Tanamanhasilrekayasagenetika.Transkripsi ProsesterbentuknyaRNAdariDNA.Translasi Proses terbentuknya protein dari

RNA.


52

AsetosiringonCrown gall Tumor yang terbentuk pada batang

tanamandikotilyangdisebabkanolehinfeksiA. tumefaciens

DNA(Deoxyribonucleic acid) Suatu rantai nukleotida yang

merupakan struktur penyusungen mahluk hidup, dimana setiapmononukleotida terdiri dari tigakomponenutama,yaitugula,phosfatdan basa-basa nitrogen (Adenin,Timin,Cytosin,Guanin)

Eliminasi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens secara in vitro, dimanapada tahap ini pertumbuhanAgrobacterium pada jaringan targetharusditiadakan.

Gen Untaian DNA (polynuklotida) yangterdapat pada kromosom sel mahlukhidupyangmembawaataumengkodesuatusifatyangditurunkan.

GenVir Gen yang terdapat dalam plasmidpadaA. tumefaciensyangmemfasilitasiterjadinyatransferT-DNAdariplasmidA. tumefacienskegenomtanaman.

53


Inokulasi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens secara in vitro, dimanajaringan target direndam dalamsuspensi Agrobacterium yangmembawa transgen yang akanditransformasi.

Ko-kultivasi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens secara in vitro, dimanajaringantargetyangsudahdiinokulasidenganAgrobacterium ditumbuhkanpada suatu media. Pada fase ko-kultivasi,jaringantargetditumbuhkanbersamaA.tumefaciensselama3hari.

Plasmid DNAberbentukcincinyang terdapatdalam A.tumefaciens, yang dapatdirekayasa secara buatan untukkepentinganrekayasagenetika.

Promoter DNA yang merupakan penginisiasidan pengarah ekspresi gen. Lokasipromoter ada pada posisi ’upstream’darigenyangdiekspresikan.

SelEukaryotik Tipeselmahlukhidupyangmemilikisistem membran pada inti (nukleus)-nya,sehinggamemilikimembraninti.


54

Selprokaryotik Tipe sel dimana inti (nukleus)-nyatidakmemilikimembran.

Selectable marker DNApenandayangdigunakandalamtransformasi genetik, yang fungsinyauntukmelakukanseleksiawalinsersigenatauuntukmendapatkankandidattanamantransgenik.

Seleksi Suatu tahapan dalam pekerjaantransformasi genetik melaluiA.tumefaciens, dimana jaringan targetyangditransformasidiseleksidengansuatucaratergantungselectable markeryang digunakan dalam konstruksitransgen.

T-DNA(Transfer-DNA) Sepenggal DNA yang terdapat

pada plasmid Agrobacterium yangtertransfer ke genom tanaman ketikatanamanterserang tumor (crown gall)yang disebabkan oleh A. tumefaciens.T-DNA dibatasi oleh left border danright border yang panjangnya sekitar25bp.PadaT-DNAterdapatgen-genpenyandi untuk biosintesis auksin,sitokinindanopine.

Transformasiin planta Transformasigenetikyangdilakukan

secara langsung pada tanaman dan

55


tidak dikerjakan secara in vitro dilaboratorium.

Transformasiin vitro Transformasigenetikyangdilakukan

secarain vitrodilaboratoriumTransgen Gen yang disisipkan ke genom

tanamanpadarekayasagenetikaTransgenik Tanamanhasilrekayasagenetika.Transkripsi ProsesterbentuknyaRNAdariDNA.Translasi Proses terbentuknya protein dari

RNA.


56

INDEX

Asetosiringon, 11, 21, 26, 27, 30, 39, 48

Crown gall, 42

DNA(Deoxyribonucleic acid), 52

Eliminasi, 19, 21, 25, 32

Gen, 33, 34, 35

GenVi r, 39

Inokulasi, 53

Ko-kultivasi, 53

Plasmid, 10, 11, 12, 13, 16

Promoter, 24, 25, 35

SelEukaryotik, 50

Selprokaryotik, 4, 50

Selectable marker, 14, 15, 19, 22

Seleksi, 22, 25, 25

57


T-DNA(Transfer-DNA), 57

Transformasiin planta, 32, 33, 35, 35

Transformasiin vitro, 17

Transgen, 33, 40, 49

Transgenik, 5, 6, 8

Transkripsi, 2, 3, 4

Translasi, 3, 4, 7, 51


58

BIODATA PENULIS

Dr. Ir. Rindang Dwiyani,M.Sc. adalah staf dosen di ProgramStudi Agroekoteknologi, FakultasPertanian Universitas Udayanadan staf pengajar di Program S2Magister Agroteknologi dan S2Bioteknologi, Program Pasca SarjanaUniversitas Udayana . Dilahirkan diDenpasar,7Mei1962.Menyelesaikan

pendidikan SMA di SMA Negeri 1 Denpasar pada tahun1981. Menyelesaikan S1 di Institut Pertanian Bogor,jurusan Agronomi pada tahun 1985, S2 di Departementof Viticulture, Horticulture and Oenology, University ofAdelaidepadatahun1997.Pendidikandoctordiselesaikanpadatahun2012diUniversitasGadjahMada,YogyakartadibidangBioteknologitanamandengandisertasiberjudul“Mikropropagasi tanaman anggrek Vanda tricolor Lindl.varietassuavisyangmembawagenKnotted 1-like Arabidopsis thaliana (KNAT1)”. Penulis merupakan Pemenang HibahpenelitianDesentralisasiDikti sejak tahun2009dibidang

59


kulturjaringandanrekayasagenetika.Penulisaktifmenulisbukudanpublikasidijurnalinternasionalbereputasi,sertaaktifsebagaipembicaraoralpadaseminar-seminarbertarafnasionaldaninternasional.

Ir. Hestin Yuswanti, MP. adalahstaf pengajar di Program StudiAgroekoteknologi, Fakultas pertanianUniversitas Udayana. Penulis lahirdi Tulung Agung, Jawa Timur padatanggal15Maret1959.MenyelesaikanpendidikanSDhinggaSMAdiTulungAgung.MenyelesaikanpendidikanS1diUniversitasUniversitasPembangunan

Nasional (UPN) Surabaya tahun1984, Jurusan Agronomi.Pendidikan S2 di Universitas Sumatera Utara pada tahun1997, bidang kultur jaringan tanaman. Penulis banyakmemenangkan Hibah Penelitian dan Pengabdian dengansumber dana dari Universitas Udayana. Banyak menelitidanmenulistentangkulturjaringankomoditihortikultura.


60

Ida Ayu Putri Darmawati, S.P.,M.Si., lahir di Denpasar pada tanggal15 September 1971. Menempuhpendidikan di Fakultas PertanianUniversitasUdayana,Balimulaitahun1990danlulussebagaisarjanaPertanian(BudidayaPertanian)Desember1995.Kemudian melanjutkan strata 2 (S-2)mulaiSeptember2001danlulussebagai

Magister Sain (M.Si Bioteknologi) di PAU BioteknologiUniversitas Gadjah Mada Yogyakarta Juni 2003. Saat inimulai September 2015 sedang menempuh strata 3(S-3) diProgram Doktor Pascasarjana Universitas Udayana, Balipada bidang Ilmu – Ilmu Pertanian. Mulai tahun 2000sampai saat ini sebagai staf pengajar dan peneliti di UPTLaboratorium Teknik Kultur Jaringan Fakultas PertanianuniversitasUdayanadalammatakuliahBotani,PemuliaanTanaman dan Kultur Jaringan. Putri Darmawati jugamenjadi editor pada jurnal ilmiah nasionalAgrotrop danE-JurnalAgroekoteknologiTropikasampaisaatini.Selainmengajar,jugaaktifmelakukanpenelitiandanpengabdiandengan dana yang bersumber dari Dana PNBP (DosenMuda, Hibah Unggulan Udayana dan Hibah UnggulanProgramStudi).Karya–karyapenelitiantelahterpublikasidi jurnal ilmiah nasional seperti Jurnal Bumi Lestari danAgrotrop.

61


Ir.NiNyomanAriMayadewi,M.P.adalahstafpengajardiProgramStudiAgroekoteknologi,FakultasPertanian,Universitas Udayana. Dilahirkan diDenpasar pada tanggal 27 September1968.MenyelesaikanpendidikanSLTAdiSMANegeri3Denpasarpadatahun1987. Meneruskan pendidikan S1 diJurusanAgronomi Fakultas Pertanian

Universitas Udayana dan lulus tahun 1993. PendidikanS2 diselesaikan di Universitas Gadjah Mada pada tahun1998dibidangIlmu-ilmuPertanian.Penulisaktifmenelitikomoditibuah-buahandengandanayangbersumberdariHibahDesentraliDikti.


62

transformasi genetik - unud

Documents