2.5. Metode Jaffe

Dasar dari metode ini adalah kreatinin dalam suasana alkalis dengan asam pikrat

membentuk senyawa kuning jingga. diukur dengan alat photometer. Metode ini menggunakan

serum atau plasma yang telah di deproteinasi dan tanpa deproteinasi.

2.5.1 Cara Deproteinasi

Deproteinasi adalah dengan penambahan TCA (Trichlor Acetic Acid) 1,2 N pada serum

sebelum melakukan pengukuran, yang berfungsi mengendapkan protein dan senyawa-senyawa

kimia askorbat, aseto asetat, piruvat, sevalosporin dan metildopa. Setelah diputar dengan

kecepatan tinggi antara 5-10 menit maka protein dan senyawa-senyawa lain akan mengendap dan

filtratnya digunakan untuk pemeriksaan. Ada beberapa kelemahan dari cara deproteinasi :

a. TCA (Trichlor Acetic Acid) terlalu pekat

b. Konsentrasi TCA salah (apabila menggunakan TCA 3 N, tidak terdapat perubahan warna).

c. Waktu inkubasi tidak diperhatikan (20 menit)

d. Kekeruhan dalam supernatan setelah deproteinasi (waktu deproteinasi endapan diaduk

beberapa kali/ sebelum centrifuge didiamkan untuk beberapa menit.

e. Sampel yang diperlukan terlalu banyak dan waktu terlalu lama.

f. TCA pada suhu kamar mudah terurai maka penyimpananya di almari es (± 2-80 C).

Keuntungan cara deproteinasi adalah kandungan nitrogen dalam sampel seperti

protein, ureum, dan senyawa lainnya sudah terikat dengan TCA sehingga supernatan terbebas

dari bahan-bahan nitrogen.

2.5.2 Cara Tanpa Deproteinasi

Cara tanpa deproteinasi adalah tanpa penambahan TCA (Trichlor Acetic Acid) 1,2 N atau

disebut juga fixed kinetik, yaitu pengukuran kreatinin dalam suasana alkalis dan konsentrasi di

tentukan dengan ketepatan waktu pembacaan. Ada beberapa kelemahan dari cara tanpa

deproteinasi:

a. Pencampuran reagen kerja tidak dengan perbandingan 1:1 yang mengakibatkan hasil tinggi

palsu.

b. Adanya gangguan terhadap bilirubin, ureum, protein yang mengakibatkan hasil tinggi palsu.

Keuntungan cara deproteinasi adalah:

a. Waktu yang diperlukan cukup singkat (2 menit)

b. Sampel yang diperlukan hanya sedikit (100 mikro L)

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Fokus Penelitian

a. Menguji efek pemberian serbuk tanduk rusa sambar terhadap peningkatan kadar ureum

dan kreatinin dalam darah mencit.

b. Menguji efek pemberian serbuk tanduk rusa dengan dosis 250 mg yang digunakan

masyarakat selama ini terhadap peningkatan kadar ureum dan kreatinin dalam darah

mencit.

c. Menentukan lama waktu pemberian serbuk tanduk rusa yang mulai menyebabkan

terjadinya peningkatan kadar ureum dan kreatinin dalam darah mencit.

d. Mengkaji pengaruh kenaikan dosis dan lama pemberian serbuk tanduk rusa terhadap

perubahan peningkatan kadar ureum dan kreatinin.

e. Menilai tingkat keamanan penggunaan serbuk tanduk rusa ditinjau dari dosis dan lama

pemberian.

4.2. Bahan yang Diteliti dan Pengambilan Sampel

Bahan yang akan diteliti adalah serbuk tanduk rusa sambar yang merupakan ranggah

muda atau tanduk yang berumur 40-60 hari. Sampel ini diambil di penangkaran rusa desa Api-

api, Kabupaten Penajam Paser Utara Provinsi Kalimantan Timur. Sampel yang diteliti adalah

tanduk rusa sambar berumur 40-60 hari yang telah dibersihkan dan dipotong hingga berbentuk

kecil kemudian dikeringkan. Selanjutnya dilakukan proses penyerbukan hingga terbentuk serbuk

yang akan digunakan sebagai sampel penelitian.

4.3. Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu pelaksanaan pada September 2012 sampai dengan Desember 2012. Penelitian ini

dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan di Laboratorium Kimia Farmasi Fakultas Farmasi

Universitas Mulawarman, Samarinda.

4.4. Variabel dan Definisi Operasional

4.4.1. Variabel Penelitian

a. Dosis dan lama pemberian serbuk tanduk rusa sambar adalah variabel bebas.

b. Kadar ureum dan kreatinin adalah variabel terikat.

4.4.2. Definisi Operasional

a. Serbuk tanduk rusa sambar : Serbuk yang diperoleh dari tanduk rusa sambar yang

dipotong kecil-kecil lalu dipanaskan dan dilakukan proses penyerbukan.

b. Kreatinin : Hasil akhir metabolisme otot yang dieksresikan melalui ginjal.

c. Nilai absorbansi adalah pendeteksian instrumen terhadap indikator pengujian.

4.5. Peralatan dan Bahan Penelitian

4.5.1. Peralatan Penelitian

Peralatan yang digunakan pada penelitian ini diantaranya adalah spektrofotometer UV-

Vis digunakan sebagai instrument dalam pembacaan serapan panjang gelombang serum, spoit

injeksi digunakan sebagai alat untuk memasukkan bahan uji secara oral, sentrifus digunakan

untuk menghasilkan serum darah, tabung reaksi digunakan sebagai wadah serum darah, pipet

mikro digunakan untuk pengambilan serum, timbangan digunakan untuk menimbang tikus, pisau

digunakan untuk bedah, dan kandang tikus.

4.5.2. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan pada penelitian ini diantaranya adalah aquadest sebagai pelarut,

alkohol sebagai antiseptik, mencit sebagai hewan uji, pakan tikus, dan reagen kreatinin

digunakan sebagai substrat.

4.6. Rancangan Penelitian

Tabel 4.1. Perlakuan Dosis Serbuk Tanduk Rusa sambar terhadap hewan uji

KETRU1 KETRU2 KETRU3

D1ETRU1 D1ETRU2 D1ETRU3

D2ETRU1 D2ETRU2 D2ETRU3

Keterangan :

KETRU1 : Perlakuan Kontrol Serbuk Tanduk Rusa Ulangan ke 1

Tabel 4.2. Perlakuan pengukuran kreatinin berdasarkan lama pemberian dengan dosis 1 dan 2

PKKt0 PKKt1 PKKt2 PKKt3

PKD1t0 PKD1t1 PKD1t2 PKD1t3

PKD2t0 PKD2t1 PKD2t2 PKD2t3

Keterangan :

PKKt0 : Pengukuran Kreatinin Kontrol Serbuk Tanduk Rusa Sambar pada minggu ke 0

4.7. Teknik Pengumpulan Data

4.7.1. Data dan Sumber Data

Data penelitian ini adalah kadar kreatinin dari hewan uji mencit. Data tersebut diperoleh

dari percobaan penelitian dengan pemberian serbuk tanduk rusa. Parameter yang diukur pada

penelitian ini adalah peningkatan kadar kreatinin pada hewan uji perlakuan yang akan

dibandingkan dengan kontrol.

Tabel 4.3. Tabel Hasil Pengamatan

4.7.2.

Pelaksanaan Penelitian

a. Pembuatan sampel uji

Disiapkan serbuk tanduk rusa dan dilarutkan dengan aquadest sesuai dengan dosis yang

akan diberikan, sehingga sampel uji menjadi sediaan dalam bentuk larutan.

Gambar 4.1. Skema Pembuatan sampel uji

b. Penyiapan Hewan Uji

Serbuk Tanduk Rusa

Dilarutkan dengan aquadest

Larutan sampel uji

Perlakuan Kadar Kreatinin (mg/dL)

Kelompok ReplikasiSebelum

PerlakuanHari ke 7 Hari ke 14 Hari ke 21

Kontrol

1

2

3

n total

n rata-rata

Dosis 1

1

2

3

n total

n rata-rata

Dosis 2

1

2

3

n total

n rata-rata

Hewan uji yang digunakan adalah mencit (Mus musculus L) sebanyak 9 ekor,

jenis kelamin jantan, dewasa, usia 6-8 minggu, dengan berat badan sekitar 20-30 g dan

kondisi sehat fisik. Tahap ini mencit disiapkan sebagai hewan uji penelitian, mencit

ditempatkan pada ruangan yang berventilasi baik dan diberi pakan serta minum.

c. Penentuan Dosis Uji

Serbuk tanduk rusa dibuat 2 variasi dosis dengan menggunakan aquadest sebagai

pelarutnya. Dosis 1 yaitu dosis yang biasa dikonsumsi masyarakat 250 mg yang

dikonversi ke dosis mencit dan diperoleh sebanyak 0,91 mg dan dosis 2 yaitu dosis tinggi

merupakan dosis tiga kali lipat dari dosis yang biasa dikonsumsi masyarakat yaitu 750

mg yang dikonversi ke mencit dan diperoleh sebanyak 2,73 mg.

d. Pemberian Sampel Uji

Pada tahap pengujian diperlukan 9 ekor hewan uji. Mencit dipisahkan menjadi 3

kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit yang terdiri dari:

1. Kelompok I (K), sebagai kelompok kontrol yang diberi makanan standar (pelet) dan

minum.

2. Kelompok II (P1), sebagai kelompok perlakuan 1 yang diberi makanan standar (pelet),

minum dan serbuk tanduk rusa sebanyak 0,91 mg (setiap hari selama 21 hari).

3. Kelompok II (P2), sebagai kelompok perlakuan 2 yang diberi makanan standar (pelet),

minum dan serbuk tanduk rusa sebanyak 2,73 mg (setiap hari selama 21 hari).

e. Pengambilan Sampel Darah

Masing-masing mencit dari semua kelompok dipuasakan selama 12 jam pengambilan

darah mencit dilakukan. Sampel darah dimasukkan kedalam tabung sentrifus dengan

kecepatan 1300 rpm selama 10 menit. Cairan bening (serum) di atas sel-sel darah yang

menggumpal selanjutnya diambil. Kemudian dilakukan pengukuran kadar kreatinin.

f. Pengukuran Kadar Kreatinin

Sampel (serum) yang telah disentrifuge dari masing-masing mencit ditambahkan

Reagen 1 (NaOH) dan didiamkan selama 5 menit, kemudian ditambahkan Reagen 2

(Asam pikrat) dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya dibaca absobansi pada menit

awal (A1) dan absorbansi pada menit kedua (A2).

Blanko adalah larutan yang dibuat dengan perlakuan sama seperti pada sampel

tetapi tidak mengandung komponen sampel sehingga digunakan aquadest sebagai

pengganti serum.

Baku adalah larutan yang dibuat dengan perlakuan sama seperti pada sampel dan

mengandung komponen sampel yang telah diketahui konsentrasinya sehingga digunakan

baku kreatinin sebagai pengganti serum.

Setelah dilakukan pengukuran absorbansi dengan Spektrofotometer pada panjang

gelombang 492 nm, selanjutnya data absorbansi yang dihasilkan dianalisis untuk

menentukan kadar kreatinin dalam darah mencit.