i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI TOKSISITAS AKUT GELATIN SAPI TERHADAP

TIKUS BETINA GALUR SPRAGUE DAWLEY

SKRIPSI

AZMI INDILLAH

1112102000074

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2016

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI TOKSISITAS AKUT GELATIN SAPI TERHADAP

TIKUS BETINA GALUR SPRAGUE DAWLEY

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AZMI INDILLAH

1112102000074

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2016

iii

iv

v

vi

ABSTRAK

Nama : Azmi Indillah

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Toksisitas Akut Gelatin Sapi terhadap Tikus Betina

Galur Sprague Dawley

Gelatin sapi banyak diaplikasikan sebagai eksipien farmasi yang sangat bermanfaat

seperti cangkang kapsul, pengikat tablet, penstabil, emulsi, dll. Nilai LD50 gelatin

sapi secara spesifik belum diketahui, maka penelitian ini bertujuan untuk menentukan

nilai LD50 dan tingkat keamanan dari gelatin sapi golongan farmasetik dan pro

analisis dengan uji toksisitas akut oral pada tikus betina menggunakan metode dari

OECD 425 (Up and Down Procedure). Perubahan berat badan dan tanda toksisitas

selama 14 hari serta efek histopathological pada hati dan ginjal tikus diamati. Pada

penelitian ini, tikus diberikan gelatin sapi secara oral dengan dosis tunggal 5000

mg/kgbb. Setelah diamati selama 14 hari, hasil menunjukkan bahwa tidak ada

kematian dan tidak ada perbedaan yang bermakna pada Uji Kruskal Wallis pada

perubahan bobot badan tikus (p ≥ 0,05) serta tidak terlihat adanya tanda-tanda

toksisitas pada dosis 5000 mg /kgbb, yang berarti menunjukkan bahwa gelatin sapi

aman dikonsumsi pada dosis lebih dari 5000 mg / kgbb (LD50> 5000 mg /kgbb).

Selanjutnya, pemeriksaan histopatological menggunakan statistik Uji Batas Nyata

mengungkapkan bahwa tidak ada efek kerusakan yang bermakna pada organ hati dan

ginjal tikus (p ≥ 0,05).

Kata Kunci : Toksisitas Akut, Gelatin Sapi, OECD 425

vii

ABSTRAK

Name : Azmi Indillah

Program Study : Pharmacy

Title : Acute Toxicity Study of Bovine Gelatin in Female Sprague

Dawley Rats

Bovine gelatin was useful for pharmaceutical excipients as capsule shell, tablet

binder, stabilizer, emulsion, etc. The LD50 of the specifically bovine gelatin

unknown, so the present study aimed to determine LD50 to establish the safety of

pharmaceutical and pro analysis grade of Bovine Gelatin by acute oral toxicity study

in female rats as per OECD guideline 425 (Up and Down Procedure). Change in body

weight, toxicity sign for 14 days and histhopathological effect on liver and kidney of

rat observed. Rats were administrated bovine gelatin per-oral in single dose of 5000

mg/kg body weight. Throughout 14 days of the treatment, no mortality and no

significant change in body weight were analized using Kruskal Wallis Test (p ≥ 0,05)

and no toxicity sign at 5000 mg/kgbb bod weight doses, which reveal the safety of

these bovine gelatin on the doses up to 5000 mg/kg body weight (LD50 > 5000 mg/kg

body weight). Further, histhopatological examination using Least Significance

Different Test reveal no significant adverse effect observed on the liver and kidney

(p ≥ 0,05).

Key word : Acute toxicity, Bovine Gelatin, OECD 425

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahhirabbil’alamin, segala puji bagi Allah SWT yang telah

melimpahkan rahmat, dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Uji Toksisitas Akut Gelatin Sapi Terhadap Tikus Betina Galur

Sprague Dawley”. Shalawat serta salam semoga senantiasa terlimpahkan kepada

Nabi Muhammad SAW. Penulis skripsi ini dilakukan sebagai salah satu syarat untuk

mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa dalam penelitian sampai penyusunan skripsi ini

tidak akan terwujud tanpa adanya bantuan, bimbingan, dan dukungan dari berbagai

pihak. Maka, mengucapkan terima kasih banyak kepada :

1. Ibu Dr. Azrifitria, M.Si., Apt dan Zilhadia, M.Si., Apt., selaku pembimbing

yang dengan sabar memberikan bimbingan, ilmu, masukan, dukungan, dan

semangat kepada penulis,

2. Dr. Arif Sumantri, M.KM selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

3. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4. Bapak Supandi, M.Si., Apt selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah

membimbing dan menerima keluh kesah selama perkuliahan berjalan

5. Ibu dr. Dyah Ayu Woro Setyaningrum yang telah bersedia memberikan ilmu

serta waktu kepada penulis selama pengolahan data penelitian

6. Kedua orang tua tercinta, Ayah Iskandar Sabas dan Ibu Anis Syafaat Noor

Dewati yang senantiasa memberikan kasih sayang dan dukungan baik moril

maupun materil, serta doa yang selalu menyertai setiap langkah penulis

7. Ketiga adik lelaki tercinta Banna Irfan Ibadillah, Robby Arsyadany, dan

Atana Abdan Yakhsyallah yang selalu memberikan dukungan dan doa

8. Seluruh keluarga besar Bani Ghufron dan Bani Sabas yang tidak bisa

disebutkan satu persatu atas dukungannya kepada penulis

ix

9. Bapak dan Ibu Dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan yang telah memberikan ilmunya kepada penulis

10. Sahabat seperjuangan animal house kloter pertama Ade Rachma Islamiah,

Afina Almas Ghasani, dan Denny Bachtiar yang selalu membantu, memberi

motivasi, dukungan dari awal hingga akhir penyelesaian skripsi ini

11. Teman-teman seperjuangan di laboratorium Zakiyah Zahra, Moethia, Santi

Susilawati, Nita Fitriani, Hary Abdul Rahman, Nurul Fitri, Fenny Delfiyanti,

Siti Windi, Noni Tri U, yang telah memberikan motivasi selama penelitian

12. Sahabat Cera Alba (Dian, Endang, Moethia, Zakiyah, Intan, Icha, Laila,

Risha, Icak, Nunud, Afina dan Pepew) yang telah menjadi sahabat sejak awal

perkuliahan hingga membantu dalam selesainya penelitian ini

13. Sahabat Colostrum Devi Elvina, Yossi Atika, Catur Desiana, dan Hestiningsih

yang telah memberikan motivasi dari jauh hingga penelitian selesai

14. Teman-teman Cabe Farmasi 2012 AC atas persaudaraan dan kebersamaan

yang telah banyak membantu dan memotivasi penulis baik selama pengerjaan

skripsi ini maupun selama di bangku perkuliahan

15. Seluruh pengurus HMPS periode 2014-2015 yang tidak bisa disebutkan satu

persatu atas pengalaman dan kerjasama selama masih dalam kepengurusan

yang berperan penting dalam penyusunan skripsi ini

16. Semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penyelesaian naskah

skripsi baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya tidak

dapat penulis sebutkan satu persatu

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas semua bantuan

dan dukungan yang diberikan. Saran serta kritik yang membangun sangat diharapkan.

Semoga skripsi ini bermanfaat bagi penulis dan pembaca. Aamiin Ya Rabbal’alamiin.

Jakarta, Mei 2016

Penulis

x

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ ii

HALAMAN PERSYARATAN ORISINALITAS ................................................ iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................. v

ABSTRAK ............................................................................................................... vi

ABSTRACT ............................................................................................................ vii

KATA PENGANTAR .......................................................................................... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................ x

DAFTAR ISI ............................................................................................................ x

DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiii

DAFTARGAMBAR ........................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xv

BAB 1. PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ....................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................. 4

1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................... 4

1.3.1 Tujuan Umum ............................................................................. 4

1.3.2 Tujuan Khusus ............................................................................. 4

1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................. 4

1.4.1 Manfaat Teoritis .......................................................................... 4

1.4.2 Manfaat Metodologi .................................................................... 5

1.4.3 Manfaat Aplikatif ........................................................................ 5

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 6

2. 1. Gelatin .................................................................................................. 6

2. 2. Sifat Fisika dan Kimia Gelatin ............................................................. 6

2. 3. Produksi Gelatin ................................................................................... 9

2. 4. Kegunaan Gelatin ............................................................................... 10

2.4.1 Kegunaan Gelatin pada Sediaan Farmasi .................................. 10

2.4.2 Kegunaan Gelatin pada Kosmetik ............................................. 11

2.4.3 Kegunaan Gelatin pada Makanan ............................................. 11

2. 5. Hewan Percobaan ............................................................................... 12

2.5.1 Karakteristik Tikus Betina Sprague Dawley ............................. 13

2.5.2 Data Fisiologis dan Reproduksi Rattus norvegicus .................. 13

2. 6. Toksisitas ........................................................................................... 14

2. 7. Uji Toksisitas .................................................................................... 14

2. 8. Uji Toksisitas Akut Oral ................................................................... 15

2.8.1 Penentuan LD50 ........................................................................ 18

2.8.1.1 Fixed Dose Method ........................................................ 19

2.8.1.2 Acute Toxic Class Method .............................................. 19

2.8.1.3 Up and Down Procedure ............................................... 20

xii

2. 9. Pengamatan Toksisitas ....................................................................... 24

2.9.1 Pengamatan Berat Badan .......................................................... 25

2.9.2 Tanda-tanda Toksisitas .............................................................. 25

2.9.3 Pengamatan Mikroskopik Histologi Organ ............................... 26

2.9.3.1 Organ Hati ..................................................................... 26

2.9.3.2 Organ Ginjal .................................................................. 27

2.10. Studi Literatur ................................................................................... 27

BAB 3. METODE PENELITIAN ......................................................................... 29

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................................... 29

3.2 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................... 29

3.2.1 Alat Penelitian ............................................................................ 29

3.2.2 Bahan Kimia ............................................................................... 29

3.2.3 Bahan Uji .................................................................................... 29

3.3 Rancangan Penelitian .......................................................................... 29

3.3.1 Besar Sampel .............................................................................. 29

3.3.2 Dosis Perlakuan .......................................................................... 30

3.4 Prosedur Penelitian .............................................................................. 30

3.4.1 Penyiapan Larutan Gelatin ......................................................... 30

3.4.2 Penyiapan Hewan Uji ................................................................. 30

3.4.3 Uji Toksisitas Akut ..................................................................... 31

3.4.3.1 Penentuan LD50 ............................................................... 31

3.4.4 Pengamatan Toksisitas ................................................................ 32

3.4.4.1 Perhitungan LD50 ............................................................ 32

3.4.4.2 Perhitungan Perbedaan Bobot Tikus ............................... 32

3.4.4.3 Pengamatan Perubahan Tingkah Laku Tikus ................. 32

3.4.5 Pengamatan Histopalogi Organ ................................................. 32

3.4.5.1 Organ Hati ...................................................................... 33

3.4.5.2 Organ Ginjal ................................................................... 33

BAB 4 HASIL DAN PENELITIAN .............................................................. 34

4.1 Penyiapan Larutan Gelatin ................................................................... 34

4.2 Hasil Penelitian .................................................................................... 34

4.2.1 Nilai LD50 Gelatin Sapi Golongan Farmasetik dan Pro Analisis 34

4.2.2 Hasil Bobot Tikus ....................................................................... 35

4.2.3 Pengamatan Tanda-tanda Toksisitas .......................................... 36

4.2.4 Hasil Histopatologi Organ .......................................................... 37

4.3 Pembahasan ......................................................................................... 39

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 47

5.1 Kesimpulan .......................................................................................... 47

5.2 Saran ..................................................................................................... 47

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 48

LAMPIRAN ..................................................................................................... 54

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel

Tabel 2.1 Kegunaan Gelatin pada Makanan ........................................................ 12

Tabel 2.2 Data Fisiologis dan Reproduksi Tikus ................................................. 13

Tabel 2.3 Klasifikasi Toksisitas Berdasarkan GHS ............................................. 17

Tabel 2.4 Klasifikasi Toksisitas Berdasarkan GHS ............................................. 17

Tabel 2.5 Prinsip Penentuan LD50 pada Tiga Metode Alternatif ......................... 23

Tabel 3.1 Perlakuan terhadap Tikus ..................................................................... 30

Tabel 4.1 Nilai LD50 Gelatin Sapi GF dengan software AOT 425 StatPgm ....... 35

Tabel 4.2 Nilai LD50 Gelatin Sapi PA dengan software AOT 425 StatPgm ........ 35

Tabel 4.3 Bobot Tikus .......................................................................................... 36

Tabel 4.4 Pegamatan Tanda-tanda Toksisitas ...................................................... 36

Tabel 4.5 Gambar Histopatologi Organ Hati dan Ginjal ..................................... 38

Tabel 4.6 Skoring Histopatologi Organ Hati dan Ginjal ...................................... 39

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur Asam Amino Gelatin .............................................................. 6

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Sehat Hewan Uji ..................................................... 54

Lampiran 2. Surat Keterangan Lolos Kaji Etik ........................................................ 55

Lampiran 3. Sertifikat Gelatin Sapi Golongan Farmasetik ...................................... 56

Lampiran 4. Sertifikat Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis .................................... 57

Lampiran 5. Alur Kerja ............................................................................................ 58

Lampiran 6. Rancangan Uji ..................................................................................... 59

Lampiran 7. Perhitungan Dosis ................................................................................ 60

Lampiran 8. Penarikan Kesimpulan Limit Test ......................................................... 61

Lampiran 9. Gambar Kegiatan Penelitian ................................................................ 62

Lampiran 10. Hasil Nilai LD50 ................................................................................. 63

Lampiran 11. Data Bobot Tikus ............................................................................... 65

Lampiran 12. Analisa Data Bobot Tikus .................................................................. 66

Lampiran 13. Tanda-tanda Toksisitas ...................................................................... 69

Lampiran 14. Histopatologi Organ Hati ................................................................... 71

Lampiran 15. Skoring Histopatologi Organ Hati ..................................................... 74

Lampiran 16. Analisis Skoring Histopatologi Organ Hati ........................................ 75

Lampiran 17. Histopatologi Organ Ginjal ............................................................... 79

Lampiran 18. Skoring Histopatologi Organ Ginjal .................................................. 82

Lampiran 19. Analisis Skoring Histopatologi Organ Ginjal ..................................... 83

1

BAB I

PENDAHULUAN

1. 1 Latar Belakang

Menurut National Formulary gelatin didefinisikan sebagai produk yang

diperoleh melalui proses hidrolisis parsial kolagen yang berasal dari kulit, jaringan

ikat dan tulang hewan vertebrata seperti sapi, babi, ikan dan kambing. Kegunaan

gelatin sebagai zat tambahan biasa dimanfaatkan dalam proses pembuatan makanan,

obat, dan kosmetik. (GMIA, 2012)

Pada industri farmasi, gelatin dimanfaatkan untuk pembuatan cangkang kapsul,

tablet, suppositoria, emulsi dan masih banyak sediaan farmasi lainnya. Pada kapsul,

gelatin ini dapat mempermudah kapsul untuk ditelan. Pada proses pembuatan tablet,

gelatin digunakan sebagai pengisi, pengikat, pelicin dan pelincir. Sedangkan pada

pembuatan emulsi berfungsi sebagai penstabil emulsi. (GMIA, 2012)

Dari banyaknya manfaat yang telah disebutkan, gelatin banyak digunakan

sebagai eksipien (zat tambahan). Eksipien merupakan zat tidak aktif yang

ditambahkan dalam sediaan farmasi. Eksipien ini memiliki beberapa persyaratan

seperti inert, memiliki keamanan yang tinggi, serta dalam status penanganan penting

diketahui oleh para formulator di dunia (Rowe, Sheskey dan Quinn, 2006).

Namun, pada kenyatannya tidak semua eksipien bersifat inert, beberapa juga

memiliki potensi toksik sehingga keamanannya rendah. Contoh kasus toksisitas yang

disebabkan oleh eksipien terjadi pada penggunaan dietilen glikol yang diuji secara

non klinis menyebabkan gagal ginjal, manitol yang menyebabkan diare osmotik,

lanolin yang memiliki reaksi hipersensitivitas, dan propilen glikol yang menyebabkan

kardiotoksisitas (Osteberg NA, 2003).

Sangatlah diperlukan adanya pengujian keamanan terhadap semua komponen

obat dan data hasil dari uji keamanannya. Kepedulian terhadap adanya efek toksik

yang mungkin muncul pada eksipien yang digunakan dalam produk-produk yang

beredar semakin meningkat. Maka, sangatlah perlu dilakukan uji toksisitas bagi

2

eksipien yang sering digunakan untuk memastikan keamanan penggunaannya

(U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration,

2005).

Gelatin yang biasa digunakan sebagai eksipien merupakan bahan yang tidak

mengiritasi serta bersifat non toksik. Namun, terdapat laporan bahwa kapsul gelatin

dapat menyebabkan iritasi lokal pada dinding esofagus. Pada penggunaan parenteral,

dilaporkan pula adanya kasus reaksi hipersensitifitas seperti syok anafilaktik pada

produk vaksin (Rowe, Sheskey dan Quinn, 2009).

Pengujian keamanan pada penggunaan gelatin sapi sangatlah penting seiring

dengan perkembangan pasar global terhadap produk halal yang meningkat. Hal ini

terjadi karena saat ini kehalalan dianggap sebagai standar pilihan bagi umat Islam

serta non-Muslim di seluruh dunia (Quantaniah , Noreina dan Syakinah, 2013).

Terlebih lagi dengan adanya Undang-undang No.33 tentang Jaminan Produk Halal

yang dikeluarkan oleh Pemerintah Indonesia dimana dengan adanya jaminan halal ini

bertujuan memberikan kenyamanan, keamanan, keselamatan dan kepastian dalam

penggunaan produk yang beredar.

Di Inggris, pada tahun 1986 pertama kali ditemukan kasus Bovine Spongiform

Encelopathy (BSE) pada sejumlah besar hewan ternak. BSE adalah penyakit yang

berasal dari makanan hewani (misalnya daging, tepung dan tulang) yang terkena TSE

(Transmissible Spongiform Encephalopathies). Negara-negara lain juga mengalami

kasus BSE, baik pada hewan yang diimpor dari Inggris atau hewan asli. Oleh karena

itu, pendekatan secara hati-hati terus dilakukan jika bahan biologis dari spesies alami

dipengaruhi oleh penyakit TSE, terutama spesies sapi yang digunakan untuk

pembuatan produk obat atau makanan lainnya (Europian Comission, 2011). Maka,

gelatin yang digunakan dalam produk obat yang diproduksi dari tulang atau kulit sapi

juga perlu diperhatikan keamanan penggunaannya.

Suatu senyawa dibagi menjadi golongan farmasetik dan non-farmasetik.

Golongan non-farmasetik meliputi golongan pro analisis, teknis, reagen,

laboratorium, dan makanan. Semua prosedur uji yang membutuhkan hewan uji harus

menggunakan senyawa golongan farmasetik yang telah sesuai dengan FDA dan buku

3

resmi lainnya. Penggunaan senyawa golongan farmasetik dapat memastikan bahwa

zat yang diberikan memenuhi standar kemurnian dan komposisi yang sesuai serta

mencegah efek buruk pada hewan atau hasil penelitian biologis. Salah satunya

contohnya adalah senyawa pro analisa yang biasa digunakan untuk keperluan analisis

dimana memiliki tingkat kemurnian 99,9% (IACUC, 2015).

Uji toksisitas adalah suatu uji untuk mendeteksi efek toksik suatu zat pada

sistem biologi dan untuk memperoleh data dosis-respon yang khas dari sediaan uji.

Sedangkan uji toksisitas akut oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek

toksik yang muncul dalam waktu singkat setelah pemberian sediaan uji yang

diberikan secara oral dalam dosis tunggal, atau dosis berulang yang diberikan dalam

waktu 24 jam (BPOM RI, 2014).

Salah satu parameter untuk melihat keamanan dari suatu zat adalah dengan

menghitung nilai LD50. Nilai LD50 merupakan dosis yang perlu diwaspadai yang

menyebabkan hewan uji mati sebanyak 50%. Penentuan nilai LD50 ini bertujuan

untuk mengetahui dosis dari suatu zat yang perlu diwaspadai dan dihindari

penggunaannya. Telah disyaratkan bahwa nilai LD50 pada gelatin sebesar 5g/kgBB

(Rowe, Sheskey dan Quinn , 2009). Namun belum banyak penelitian yang menguji

keamanan gelatin yang digunakan dalam berbagai sediaan farmasi.

Berdasarkan uraian di atas, maka dilakukan uji toksisitas akut terhadap gelatin

sapi. Ada dua macam gelatin sapi yang diuji, yaitu golongan farmasetik dan pro

analisis. Produk gelatin yang penggunaannya sangat luas digunakan oleh masyarakat

sangat jarang yang mencantumkan data LD50 atau keamanannya. Data yang

dihasilkan ini diharapkan dapat menunjukkan keamanan kedua golongan gelatin

tersebut.

Metode uji toksisitas akut yang dipilih adalah Up and Down Procedure pada

tikus serta diamati histologi hati hewan uji dan tanda toksisitas seperti bulu, tremor,

konvulsi, salivasi, letargi, dan sebagainya. Metode ini dipilih karena mudah, jumlah

hewan dan dosis uji yang dibutuhkan lebih sedikit serta waktu yang dibutuhkan cepat

dan efisien. (OECD, 2008)

4

1. 2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan diatas, maka dapat

diambil rumusan masalah sebagai berikut :

1. Penelitian ini perlu dilakukan karena terdapat kasus penyakit Bovine Spongiform

Encelopathy (BSE) atau sapi gila pada penggunaan produk yang berasal dari

hewan sapi

2. Nilai LD50 gelatin sapi belum pernah diteliti dan dipublikasikan

sebelumnya

3. Toksisitas gelatin sapi serta pengaruhnya terhadap organ hati dan ginjal

belum pernah diketahui sebelumnya

1. 3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengamati efek toksisitas akut gelatin sapi

golongan farmasetik dan pro analisis yang diukur dengan LD50 dan

pengaruhnya terhadap organ hati dan ginjal tikus.

1.3.2. Tujuan Khusus

a. Menentukan nilai LD50 gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis

pada tikus betina

b. Mengamati tanda toksisitas yang dapat timbul akibat efek toksik setelah

pemberian gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis

c. Mengamati perubahan yang terjadi pada histopatologi organ hati dan

ginjal hewan uji setelah pemberian gelatin sapi golongan farmasetik dan

pro analisis

1. 4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Teoritis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah ilmu pengetahuan

serta wawasan mengenai keamanan yang ditinjau dari nilai LD50 gelatin sapi

golongan farmasetik dan pro analisis yang sering digunakan sebagai eksipien

pada bidang farmasi.

5

1.4.2 Manfaat Metodologi

Metode yang dipakai pada penelitian adalah metode Up and Down

Procedure yang mengacu pada OECD (The Organization for Economic

Cooperation and Development) dan diharapkan metode ini dapat dijadikan

referensi untuk penelitian mengenai uji toksisitas akut lainnya.

1.4.3 Manfaat Aplikatif

Hasil penelitian ini diharapkan dapat dijadikan rujukan terhadap data

keamanan atau toksisitas akut gelatin sapi golongan farmasetik dan pro

analisis terhadap tikus betina dan memperkirakan resiko penggunaannya pada

manusia, sehingga nantinya penggunaan gelatin sapi dapat digunakan secara

aman. Selain itu juga sebagai dasar bagi pengembangan lebih lanjut gelatin

sapi sebagai zat tambahan dalam sediaan farmasi.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin

Dalam Food Chemicals Codex gelatin didefinisikan sebagai produk yang

diperoleh dari hidrolisis kolagen asam, basa, atau enzimatik, komponen protein utama

dari kulit, tulang, dan jaringan ikat hewan, termasuk ikan dan unggas. Tidak ada

gelatin yang bersumber dari tanaman dan bahan kimia (GMIA, 2012)

Gelatin adalah produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen.

Gelatin merupakan protein yang larut yang bisa bersifat sebagai gelling agent (bahan

pembuat gel) atau sebagai non gelling agent. Sumber bahan baku gelatin dapat

berasal dari sapi (tulang dan kulit jangat), babi (hanya kulit) dan ikan (kulit).

Gelatin memiliki fungsi yang masih sulit digantikan dalam industri pangan

maupun obat-obatan. Gelatin merupakan bahan penting yang berguna dalam produksi

makanan, sediaan farmasi dan industri fotografi serta keperluan teknis beragam. Hal

ini juga dikarenakan gelatin bersifat serba bisa, yaitu bisa berfungsi sebagai bahan

pengisi, pengemulsi (emulsifier), pengikat, pengendap, pemerkaya gizi, sifatnya juga

luwes yaitu dapat membentuk lapisan tipis yang elastis, membentuk film yang

transparan dan kuat, kemudian sifat penting lainnya yaitu daya cernanya yang tinggi

(Hastuti et al, 2007).

2.2 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin (GMIA, 2012)

Gelatin memiliki sifat hampir berasa dan tidak berbau. Bersifat rapuh padat dan

berwarna agak kuning. Bersifat hidrat, maka ketika butiran gelatin direndam dalam

air dingin maka partikel gelatin akan membesar dengan ukuran yang bervariasi. Pada

keadaan hangat, partikel besar tadi larut menjadi bentuk larutan. Metode dalam

pembuatan larutan gelatin ini lebih disukai, terutama saat diinginkan pada konsentrasi

yang tinggi. Sifat larutan gelatin dipengaruhi oleh suhu, pH, kadar abu, metode

pembuatan, serta konsentrasi dan suhu saat pembuatan larutan.

7

Gelatin larut dalam larutan air dari alkohol polihidrat seperti gliserol dan

propilen glikol. Gelatin tidak larut dalam pelarut organik yang kepolarannya kurang

seperti benzena, aseton, alkohol primer dan dimetilformamida.

Gelatin dapat disimpan dalam wadah kedap udara pada suhu kamar tetap untuk

jangka waktu yang lama. Ketika gelatin kering dipanaskan di atas suhu 45 ° C pada

kelembaban relatif tinggi (di atas 60% RH) kemampuan gelatin dalam membengkak

kemudian larut akan hilang.

Dua sifat yang paling berguna pada gelatin yaitu kekuatan gel dan

viskositasnya. Kemampuan keduanya akan menurun pada suhu di atas 40o C. Pada

pH tinggi dan degradasi enzim proteolitik, larutan gelatin akan mengalami degradasi

sehingga meningkatkan resiko munculnya mikroorganisme.

Gelatin terdiri dari 50,5% karbon, 6,8% hidrogen, 17% nitrogen dan 25,2%

oksigen.

Gambar 2.1. Struktur Asam Amino Gelatin (GMIA, 2012)

Karena berasal dari kolagen, gelatin diklasifikasikan sebagai turunan protein.

Hal ini menyebabkan protein memiliki beberapa reaksi dan dihidrolisis secara khas

oleh sebagian besar enzim proteolitik untuk menghasilkan komponen peptida atau

asam amino.

a. Sifat Amfoter

Gelatin dalam larutan bersifat amfoter, mampu bertindak baik sebagai asam

atau sebagai basa. Pada larutan gelatin yang bersifat asam memiliki muatan

8

positif (kation) dalam medan listrik. Dalam larutan gelatin yang bersifat basa

memiliki muatan negatif (anion). pH terletak pada titik tengah di mana

muatan bersih adalah nol dan tidak ada gerakan yang terjadi, dikenal sebagai

Titik isoelektrik. Gelatin tipe A memiliki rentang titik isoelektrik yang luas

(pH 7 dan 9). Sedangkan Gelatin tipe B memiliki rentang isoelektrik yang

lebih sempit antara pH 4,7 dan 5,4.

b. Turunan kimia

Gelatin dapat diberi perlakuan secara kimia untuk mengubah sifat fisika dan

kimianya secara signifikan. Perubahan ini adalah hasil dari modifikasi

struktural dan atau reaksi kimia. Reaksi khas yang sering terjadi seperti

asilasi, esterifikasi, deaminasi, cross-linking dan polimerisasi, serta reaksi

sederhana dengan asam dan basa.

c. Kekuatan Gel

Pembentukan gel yang termoreversibel dalam air adalah salah satu sifat

gelatin yang paling penting. Ketika larutan gelatin dengan konsentrasi lebih

besar dari 0,5% didinginkan sampai suhu 35-40 ° C itu dapat meningkatkan

viskositas, dan membentuk gel. Kekuatan gel tergantung pada konsentrasi

gelatin, kekuatan intrinsik dari gelatin, pH, suhu, dan adanya zat tambahan.

d. Viskositas

Viskositas yang digunakan sesuai dengan konsentrasi dimana gelatin tersebut

akan digunakan. Distribusi berat molekul berperan penting dalam efek pada

viskositas yang mempengaruhi kekuatan gel. Beberapa gelatin dengan

kekuatan gel yang tinggi memiliki viskositas yang lebih rendah daripada

gelatin dengan kekuatan gel yang rendah. Viskositas larutan gelatin

meningkat dengan meningkatnya konsentrasi gelatin dan dengan penurunan

suhu.

e. Warna

Warna gelatin tergantung pada sifat dari bahan baku yang digunakan. Dan

tergantung gelatin yang dihasilkan merupakan hasil ekstraksi pertama, kedua

atau ketiga.

9

2.3 Produksi Gelatin

Penjelasan tentang proses produksi gelatin akan membantu dalam memahami

sifat dan karakteristik gelatin pada beberapa tipe dan kualitas. Seperti dijelaskan

sebelumnya, gelatin berasal dari kolagen yang merupakan kandungan utama dari

jaringan ikat dan tulang hewan vertebrata. Kolagen memiliki kandungan asam amino

siklik prolin dan hidroksiprolin yang sangat tinggi. Kolagen terdiri dari tiga rantai

polipeptida heliks yang dihubungkan dengan ikatan silang antarmolekul.

Cara pembuatan gelatin secara umum adalah : kulit atau tulang hewan yang

kaya akan kolagen direndam dalam asam atau basa, kemudian diekstrasi dengan

panas secara bertingkat, yaitu dilakukan pada evaporator atau tangki biasa pada suhu

60,70, 80, 90, dan 100o C untuk menghasilkan mutu gelatin yang berbeda-beda. Hasil

ekstrak yang mengandung gelatin dibersihkan dari kotoran halus dan mineral dengan

cara penyaringan, sentrifugasi, demineralisasi dengan ion echanger. Filtrat

disterilisasi UHT, dikeringkan, digiling dan terakhir dikemas dan siap dipasarkan.

Proses lain yaitu filtrat hidrolisa lebih lanjut dengan enzim protease, sehingga

dihasilkan peptida atau sampai ke tingkat asam amino yang disebut sekitar gelita sol

(GMIA, 2012).

Bahan utama dari pembuatan gelatin adalah senyawa kolagen. Kolagen

banyak terdapat pada kulit, urat, tulang rawan dan tulang pada hewan. Kolagen

merupakan protein yang mengandung 35 % glisin (C2H5NO2) dan 11 % alanin

(C3H7NO2) serta kandungan prolin (C5H9NO2). Komposisi protein inilah yang

menjadi dasar produksi gelatin. (Lehninger, 1990).

Gelatin komersial yang ada di pasaran dikategorikan sebagai gelatin tipe A

dan tipe B. Pengelompokan ini berdasarkan jenis prosesnya, yaitu proses perendaman

asam dan basa. Proses perendaman asam menghasilkan gelatin tipe A dan

perendaman basa menghasilkan gelatin tipe B. Gelatin tipe A umumnya berasal dari

kulit babi yang memiliki titik iisoelektrik (titik pengendapan protein) pada pH yang

lebih tinggi (7.5 – 9.0) dari pH isoelektrik gelatin tipe B (4.8 – 5.0). Sedangkan

gelatin tipe B biasanya bersumber dari kulit jangat sapi dan tulang sapi. Sedangkan

gelatin ikan dikategorikan sebagai gelatin tipe A. Dalam perkembangannya, proses

10

pembuatan gelatin yang berasal dari tulang dapat dilakukan juga dengan

menggunakan cara asam yang lebih sederhana yang akhirnya juga menggeser pH

isoelektrik pada sekitar 5.5 – 6.0.

Secara ekonomis, proses asam lebih disukai dibandingkan dengan proses

basa. Hal ini karena perendaman yang dilakukan dalam proses asam relatif lebih

singkat yaitu (3-4 minggu) dibanding dengan proses basa (sekitar 3 bulan).

Setelah mengalami perendaman, bahan dinetralkan untuk kemudian

diekstraksi dan dipekatkan (evaporasi). Bahan yang telah mengalami pemekatan

dikeringkan untuk kemudian mengalami proses penggilingan atau penghancuran

menjadi partikel yang lebih kecil atau sesuai dengan standar tertentu (Hastuti et al,

2007).

2.4. Kegunaan Gelatin

2.4.1. Kegunaan Gelatin pada Sediaan Farmasi (GMIA, 2012)

a. Kapsul Keras dua lapis : Kekuatan, fleksibilitas, dan kemurnian, dari gelatin

memberikan karakteristik yang unik untuk memproduksi tablet berbagai

ukuran, warna dan desain untuk menjamin penutupan yang rapat setelah

pengisian.

b. Tablet : Formulasi tablet terdiri dari zat aktif dan zat tambahan yang dikenal

sebagai eksipien. Semua tablet mengandung pengisi, pengikat, pelincir dan

pelumas. Gelatin berperan dalam proses granulasi dan sebagai pengikat dalam

tablet.

c. Tablet coating : Proses coating membutuhkan basis air yang memungkinkan

dalam penggunaan gelatin. Formulasi khas untuk coating seperti gula,

pigmen, dan gelatin sebagai pembentuk film.

d. Suppositoria : Gliserin biasanya digunakan sebagai bahan pembantu untuk

supositoria untuk dimasukkan ke dalam rektum, vagina atau uretra. Dengan

memvariasikan konsentrasi gelatin dalam formula. Kriteria untuk formulasi

supositoria adalah bahwa basis (gelatin) tidak beracun dan tidak menimbulkan

11

iritasi selaput lendir, kompatibel dengan berbagai obat, basis meleleh atau

larut dalam cairan tubuh, dan basis harus stabil pada penyimpanan.

e. Emulsi Gelatin : Gelatin di industri digunakan sebagai stabilizer, agen

texturizing, pembentuk film, dan sebagai media pendukung koloid. Persiapan

emulsi minyak dengan gelatin yang digunakan topikal harus dipastikan

distribusi dan ukuran globlet stabil dalam penyimpanan.

f. Mikroenkapsulasi : Gelatin digunakan untuk menghasilkan minyak

mikroenkapsulasi untuk berbagai keperluan baik dalam gizi dan aplikasi

farmasi. Metode tradisional enkapsulasi dikenal sebagai koaservasi di mana

minyak terdispersi dengan bantuan gelatin pada antarmuka antara fase berair

dan fase berair. Contoh umum dari hal ini adalah suplemen vitamin untuk

berbagai makanan dan untuk multi-vitamin.

g. Media Pertumbuhan Bakteri : Setiap eksipien pada sediaan farmasi sering

ditemukan berbagai jenis bakteri. Gelatin farmasi dimurnikan dan disterilkan

untuk menghilangkan kekhawatiran ini. Namun, karena gelatin adalah berasal

dari kolagen, gelatin dapat digunakan sebagai nutrisi untuk bakteri.

2.4.2 Penggunaan Gelatin pada Kosmetik

Pada kosmetika, gelatin digunakan untuk menstabilkan emulsi pada produk

sampo, penyegar, pelinduung kulit (lotion, krim), sabun (cair), lipstick, cat kuku, busa

cukur, dan lain-lain. (Hastuti et al, 2007)

2.4.3 Kegunaan Gelatin pada Produksi Makanan

Pada daging olahan, bermanfaat untuk meningkatkan daya ikat air atau

rendemen, konsistensi, tekstur dan stabilitas produk seperti pada sosis, kornet, ham,

dan lain sebagainya. Pada produk susu olahan bermanfaat memperbaiki tekstur,

konsistensi, stabilitas produk dan menghindari sineresis pada yoghurt, es krim, susu

asam, keju. Pada produk bakery, bermanfaat menjaga kelembaban roduk, tektur,

sebagai perekat, bahan pengisi, dan lain-lain. Minuman sebagai penjernih sari buah

(juice), bir dan wine. Buah-buhan sebagai pelapis (melapisi pori-pori buah sehingga

12

terhindar dari kekeringan dan kerusakan oleh mikroba) untuk menjaga kesegaran dan

keawetan buah. (Hastuti et al, 2007)

Tabel 2.1. Kegunaan Gelatin pada Makanan (GMIA, 2012)

Kegunaan Aplikasi

Pembentuk Gel Makanan penutup gel, daging, gula.

Whipping agent Marshmalllow, sifon, whipped cream

Pelindung koloid Es krim, makanan penutup beku

Agen pengikat Keju, produk beku

Clarifying agent Bir, wine, jus buah, cuka

Pembentuk film Pelapis untuk buah dan daging

Thickener Bubuk campuran minuman, kaldu, saus, sup, puding,

jeli, sirup, produk susu

Bahan Penolong Proses Mikroenkapsulasi warna, rasa, minyak, vitamin

Emulgator Sup krim, saus, perasa, pasta daging, whipped

cream, produk susus

Penstabil Krim keju, susu coklat, yogurt, pengisi krim

Agen Adesif untuk mengikat bumbu untuk produk daging.

Kegunaan Aplikasi

2.5. Hewan Percobaan

Menurut Krinke (2000) berikut merupakan klasifikasi tikus putih (Rattus

novergicus):

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Kelas : Mammalia

Ordo : Rodentia

Subordo : Odontoceti

Familia : Muridae

Genus Spesies : Rattus norvegicus

13

2.5.1. Karakteritik Tikus Betina Sprague Dawley

Umumnya, untuk pengujian toksisitas digunakan hewan pengerat dengan jenis

kelamin betina. Betina lebih disarankan karena betina bersifat lebih sensitif

dibandingkan jantan (OECD, 2008). Untuk galur, baru-baru ini tikus putih yang

sering digunakan sebagai hewan percobaan antara lain Wistar dan Sprague dawley

(Sengupta, 2013). Dibandingkan dengan galur Wistar, galur Sprague Dawley lebih

dipilih karena lebih sensitif (Zmarowski, et al., 2013)

2.5.2. Data fisiologis dan reproduksi Rattus norvegicus

Data mengenai fisiologis dan reproduksi hewan uji tikus bisa dilihat di tabel.

Tabel 2.2. Data Fisiologis dan Reproduksi Tikus (Sengupta, 2013)

Data Fisiologis Umum

Suhu Tubuh 37o C

Laju Respirasi 75-115 nafas/menit

Detak jantung 260-400 detak/menit

Konsumsi air perhari 10-12 ml/100 gram berat badan

Konsumsi makanan per hari 10 gram/100gram berat badan

Berat saat lahir 5 gram

Umur menyusui 21 hari

Kematangan seksual 7 minggu

Durasi pembiakan 12-16 bulan

Berat jantan dewasa 450-550 gram

Berat betina dewasa 250-300 gram

Masa hidup 2,5-3,5 tahun

Parameter Reproduksi Tikus Jantan

Umur saat perkawinan 8-10 minggu

Berat badan saat perkawinan 250-300 gram

Parameter Reproduksi Tikus Betina

Umur saat perkawinan 8-10 minggu

Berat saat perkawinan 180-225 gram

14

2.6. Toksisitas

Toksisitas adalah ilmu yang digunakan untuk memprediksi efek biologi atau

efek samping yang tidak diinginkan pada makhluk hidup sebagai akibat terpaparnya

senyawa kimia atau alam. Seperti terjadinya perubahan yang merugikan terkait

pengobatan yang mempengaruhi organisme dalam bertahan hidup, reproduksi atau

beradaptasi dengan lingkungan. Dengan demikian peran utama pengujian toksikologi

adalah untuk mengidentifikasi bahaya pada manusia sebagai konsekuensi dari

terpaparnya zat kimia juga dapat mengetahui hubungan antara dosis-respon toksik

untuk mengidentifikasi dosis toksiknya. (Hau dan Hoosier, 2003)

Toksikologi adalah ilmu yang mempelajari potensi bahan untuk menghasilkan

satu atau lebih efek yang merusak pada organisme. Beberapa zat terbukti mampu

menghasilkan efek samping untuk manusia dan hewan yang terpapar. Kerentanan,

rute, dosis, dan durasi paparan zat tertentu dapat mempengaruhi adanya efek samping

dan keparahannya. Pengujian toksisitas akut dilakukan untuk menentukan efek dari

paparan tunggal suatu zat. Efek akut biasanya menjadi nyata segera setelah suatu

paparan, meskipun tergantung pada bahan penyebab dan mekanisme aksinya, periode

laten mungkin mendahului manifestasi dari efek. Pengujian toksisitas subkronis dan

kronis dilakukan untuk mengetahui keberadaan efek yang menjadi jelas setelah durasi

paparan yang lama. Penting diketahui bahwa pada suatu bahan beracun, apakah

mereka menyebabkan efek akut atau jangka panjang, maka perlu diidentifikasi

dengan prosedur dan praktek yang berkembang dan diimplementasikan untuk

mencegah cedera dan penyakit. (Sass, 2016)

2.7. Uji Toksisitas

Uji toksisitas adalah suatu uji untuk mendeteksi efek toksik suatu zat pada

sistem biologi dan untuk memperoleh data dosis-respon yang khas dari sediaan uji.

Data yang diperoleh dapat digunakan untuk memberi informasi mengenai derajat

bahaya sediaan uji tersebut bila terjadi pemaparan pada manusia, sehingga dapat

ditentukan dosis penggunaannya demi keamanan manusia (BPOM RI, 2014)

15

Tiga tujuan utama dari pengujian toksisitas adalah untuk mengetahui :

1. Spektrum toksisitas, bertujuan untuk mendeteksi efek samping senyawa

pada spesies uji dan menggambarkan hubungan dosis respon pada range

dosis tertentu,

2. Ekstrapolasi, untuk memprediksi efek samping pada spesies lainnya,

khususnya manusia

3. Keamanan, mengetahui tingkat keamanan dari paparan suatu zat pada

spesies lainnya, seperti manusia

Data toksikologi dapat diketahui dari uji secara in vitro, pada hewan uji, dan

bisa pada manusia. Uji secara in vitro yaitu memanfaatkan sel, jaringan, atau organ

yang diisolasi untuk mengetahui tingkat toksik. Umumnya, data toksisitas yang

tersedia untuk menilai bahaya paparan suatu zat merupakan hasil uji menggunakan

hewan uji. Sedangkan, data toksikologi yang didapatkan dari hasil uji pada manusia

akan lebih terpercaya dalam memprediksi efek toksik. Namun pada kenyataannya

data hasil uji toksik pada manusia sulit dan jarang tersedia (Hau dan Hoosier, 2003).

Uji toksisitas menggunakan hewan uji sebagai model berguna untuk melihat

adanya reaksi biokimia, fisiologik dan patologik pada manusia terhadap suatu sediaan

uji. Hasil uji toksisitas tidak dapat digunakan secara mutlak untuk membuktikan

keamanan suatu bahan atau sediaan pada manusia, namun dapat memberikan

petunjuk adanya toksisitas relatif dan membantu identifikasi efek toksik bila terjadi

pemaparan pada manusia.

Faktor-faktor yang menentukan hasil uji toksisitas secara in vivo dapat

dipercaya meliputi pemilihan spesies hewan uji, galur dan jumlah hewan; cara

pemberian sediaan uji; pemilihan dosis uji; efek samping sediaan uji; teknik dan

prosedur pengujian termasuk cara penanganan hewan selama percobaan. (BPOM RI,

2014).

2.8. Uji Toksisitas Akut Oral

Uji toksisitas akut dengan menggunakan hewan percobaan diperlukan untuk

mendeteksi efek toksik yang muncul dalam waktu singkat setelah pemberian suatu zat

16

dalam dosis tunggal atau dosis berulang yang diberikan dalam waktu tidak lebih dari

24 jam; apabila pemberian dilakukan secara berulang, maka interval waktu tidak

kurang dari 3 jam. (BPOM RI, 2014)

Toksisitas akut meliputi adanya efek samping yang terjadi pada periode waktu

yang singkat, umumnya selama 24 jam, yang muncul setelah adanya paparan suatu

senyawa dengan dosis tunggal atau beberapa dosis dalam jangka waktu 24 jam. Data

toksisitas akut tersebut digunakan untuk mengklasifikasikan tingkat bahaya dari suatu

zat serta untu memberi pelabelan. Dengan demikian, parameter yang digunakan untuk

mengemukakan toksisitas akut merupakan nilai LD50. Dimana LD50 adalah dosis

yang menyebabkan kematian hewan uji sebesar 50% (Hau dan Hoosier, 2003)

Tujuan dari pengujian toksisitas akut meliputi :

1. Mengetahui tingkat bahayan hasil paparan zat uji

2. Menentukan kerentanan populasi atau spesies tertentu terhadap zat uji

3. Mengidentifikasi organ atau jaringan tertentu yang yang terganggu akibat zat

uji

4. Memberikan informasi yang dapat digunakan untuk mengevaluasi resiko dari

zat uji

5. Memberikan informasi kepada dokter untuk meminimalisir pemberian obat

yang beresiko

(Sass, 2016)

Suatu senyawa dapat diklasifikasikan berdasarkan nilai toksisitas akut. Nilai

toksisitas akut dinyatakan sebagai LD50. Hasil toksisitas akut dievaluasi berdasarkan

kriteria bahaya dari GHS (Globally Harmonised Classification System for Chemical

Substances and Mixtures) dan juga berdasarkan kategori dari Loomis. Kategori ini

bertujuan untuk penentuan kategori toksisitas akut bahan kimia serta untuk

pelabelannya.

17

Tabel 2.3. Klasifikasi Toksisitas Berdasarkan GHS

TOKSISITAS AKUT ORAL

Kategori 1 Kategori 2 Kategori 3 Kategori 4 Kategori 5

LD50 ≤ 5 mg/kg > 5 < 50

mg/kg

≥ 50 < 300

mg/kg

≥ 300 <

2000 mg/kg

≥ 2000 <

5000 mg/kg

Simbol

Tidak ada

symbol

Istilah Berbahaya Berbahaya Berbahaya Peringatan Peringatan

Pernyataan

bahaya

Fatal jika

ditelan

Fatal jika

ditelan

Beracun

jika ditelan

Berbahaya

jika ditelan

Mungkin

berbahaya

jika ditelan

(United Nations, 2011)

Tabel 2.4. Klasifikasi Toksisitas Berdasarkan Loomis

No Nilai LD50 Klasifikasi

1. ≤ 1 mg/kgbb Sangat Toksik

2. 1-50 mg/kgbb Toksik

3. 50-500 mg/kgbb Toksik Sedang

4. 500-5000 mg/kgbb Toksik Ringan

5. 5000-15.000 mg/kgbb Praktis Tidak Toksik

6. ≥15.000 mg/kgbb Relatif Tidak Membahayakan

(Loomis dan Hayes, 1996)

Prinsip toksisitas akut yaitu pemberian secara oral suatu zat dalam beberapa

tingkatan dosis kepada beberapa kelompok hewan uji. Penilaian toksisitas akut

ditentukan dari kematian hewan uji sebagai parameter akhir. Hewan yang mati

selama percobaan dan yang hidup sampai akhir percobaan diotopsi untuk dievaluasi

adanya gejala-gejala toksisitas dan selanjutnya dilakukan pengamatan secara

makropatologi pada setiap organ. Tujuan uji toksisitas akut adalah untuk

18

mengidentifikasi bahan kimia yang toksik dan memperoleh informasi tentang bahaya

terhadap manusia bila terpajan. Uji toksisitas akut digunakan untuk menetapkan nilai

LD50 suatu zat. (BPOM, 2014)

2.8.1. Penentuan LD50

LD50 adalah dosis yang menyebabkan kematian hewan uji sebesar 50% (Hau

dan Hosier, 2003). LD50 diperoleh ketika lebih dari setengah, tetapi kurang dari 90%

dari hewan mati setelah terpapar dosis tinggi, dan kurang dari 50% tetapi lebih dari

10% dari hewan mati dari dosis rendah. Dosis ketiga idealnya akan menghasilkan

kematian 50% dari hewan. Dosis keempat yang digunakan untuk meningkatkan

kemungkinan bahwa beberapa dosis yang digunakan akan jatuh dalam rentang yang

diinginkan. Kebutuhan hewan yang digunakan untuk pengujian ini cukup banyak

(hingga 200) sehingga diakui memiliki kelemahan yang parah, sedangkan adanya

nilai LD50 penting diketahui dan masuk ke dalam protokol pengujian untuk klasifikasi

Toksisitas akut bagi beberapa kelas bahan kimia. Maka, The Organization for

Economic Cooperation and Development (OECD 1981) menganjurkan menggunakan

metode pengujian toksisitas akut yang lebih manusiawi. Keuntungan utama dari

metode ini adalah penggunaan hewan yang jumlahnya sedikit dan berguna

mendapatkan informasi dengan tidak menentukannya berdasarkan kematian namun

tanda-tanda toksisitas (Sass, 2000).

Panduan dari OECD (The Organisation for Economic Co-operation and

Development) yang membahas tentang uji toksisitas menjelaskan bahwa semua

panduan dari OECD melibatkan pemberian dosis tunggal dari sampel uji untuk

hewan dewasa muda yang sehat secara oral, pengamatan dilakukan sampai hari ke–14

setelah administrasi dosis, dengan pencatatan berat badan dan nekropsi dari semua

hewan. Dosis dapat diberikan berdasarkan pada volume konstan atau konsentrasi

konstan tergantung pada kebutuhan toksikologi. Setiap hewan dipilih secara acak.

Pada saat pemberian sampel uji, setiap hewan harus berumur antara 8-12 minggu dan

beratnya harus dalam interval ±20% dari berat rata-rata semua hewan. Titik akhir

19

untuk Panduan 423 dan 425 adalah angka kematian, tetapi untuk Pedoman 420 itu

adalah pengamatan tanda-tanda jelas yang menunjukkan toksisitas (OECD,2001).

2.8.1.1 Fixed Dose Method (Panduan 420)

Pendekatan ini tidak menggunakan kematian hewan sebagai titik akhir, dan

hanya mengandalkan pengamatan pada tanda-tanda toksisitas yang jelas terlihat pada

satu dari serangkaian tahapan Fixed Dose Method. Penelitian pada uji in vivo dan

menggunakan model menunjukkan bahwa prosedur ini reprodusibel, menggunakan

hewan yang lebih sedikit dan mengurangi penderitaan yang dialami hewan uji

dibandingkan dengan metode konvensional serta dapat mengurutkan zat dalam cara

yang mirip dengan metode pengujian toksisitas akut lainnya. Terdapat uji

pendahuluan untuk memilih dosis awal yang tepat dan meminimalkan jumlah hewan

yang digunakan. Dosis yang digunakan adalah 5, 50, 300 dan 2000 mg/kgBB.

Kelompok hewan dilakukan pemberian setiap tingkat dosis sampel secara bertahap,

dengan dosis awal yang terpilih diharapkan menghasilkan beberapa tanda-tanda

toksisitas. Kelompok hewan selanjutnya diberikan dosis yang lebih tinggi atau lebih

rendah, tergantung pada tanda-tanda toksistas, sampai tujuan dicapai, yaitu klasifikasi

zat uji berdasarkan identifikasi dosis yang menyebabkan evident toxicity. Setiap

kelompok dalam satu tingkatan dosis terdiri dari lima hewan dari satu jenis kelamin.

Hewan diamati secara individu pada tiap-tiap tingkatan dosis. Jumlah hewan yang

digunakan antara 5-7 hewan, dan 5 hewan yang digunakan dalam limit test. (OECD,

2001)

2.8.1.2 Acute Toxic Class Method (Panduan 423)

Acute Toxic Class Method adalah prosedur bertahap dengan menggunakan 3

hewan dari satu jenis kelamin tiap langkah. Penilaian toksisitas akut pada metode ini

membutuhkan sekitar 2 hingga 4 langkah namun tergantung pada jumlah hewan yang

mati. Prosedur ini bersifat reprodusibel, membutuhkan jumlah hewan yang sedikit

dan mampu mengurutkan senyawa sama seperti dua metode lainnya. Acute Toxic

Class Method dan Fixed Dose Method berdasarkan evaluasi biometric mampu

mengklasifikasikan senyawa dan melihat keamanan senyawa. Dosis yang digunakan

20

adalah 5, 50, 300, dan 2000 mg/kgBB. Pemberian sampel uji pada tiap kelompok

hewan dilakukan secara bertahap, dengan dosis awal yang terpilih diharapkan

menghasilkan mortalitas pada beberapa hewan. Kelompok hewan selanjutnya

diberikan dosis yang lebih tinggi atau lebih rendah, tergantung pada kematian, sampai

tujuan dicapai, yaitu klasifikasi zat uji berdasarkan identifikasi dosis yang

menyebabkan kematian, kcuali bila tidak ada efek pada dosis tertinggi. Pengujian ini

meggunakan 3 hewan dari satu jeni kelamin dalam tiap kelompok. Rata-rata jumlah

hewa yang digunakan adalah 7, 6 hewan yang digunakan dalam limit test. (OECD,

2001).

2.8.1.3 Up and Down Procedure (Panduan 425)

Konsep pengujian Up and Down Procedure pertama kali dijelaskan oleh

Dixon dan Mood. Pada tahun 1985, Bruce mengusulkan untuk menggunakan Up and

Down Procedure untuk penentuan toksisitas akut bahan kimia. Terdapat beberapa

variasi dari desain eksperimental Up and Down Procedure untuk memperkirakan

LD50. Sebuah studi yang membandingkan hasil yang diperoleh dengan Up and Down

Procedure , Fixed Dose Method, dan metode konvensional diterbitkan pada tahun

1995.

Pada metode ini terdapat dua macam pengujian toksisitas akut secara oral, yaitu

limit test dan main test. Limit test digunakan ketika diketahui bahwa zat uji yang akan

diujikan memiliki toksisitas yang rendah, mempunyai dosis toksik di bawah batas

dosis yang telah ditentukan. Sedangkan ketika terdapat sediki atau tidak ada

informasi tentang toksisitas zat uji tersebut atau diduga toksik, maka langsung

dilakukan Main Test.

Pada pengujian limit test, digunakan satu hewan terlebih dahulu untuk diberikan

sampel dengan dosis 2000 mg/kgBB. Jika hewan tersebut mati maka dilakukan main

test, tetapi jika hewan tersebut hidup maka digunakan empat hewan lainnya dan

diberikan dosis yang sama. Untuk limit test dengan dosis 5000mg/kgBB dilakukan

jika ada data yang menunjukkan bahwa zat tersebut memiliki toksisitas yang rendah.

Dan jumlah hewan yang digunakan pada limit test ini 3 hewan dengan jumlah. Jika

21

terdapat tiga atau lebih hewan yang masih bertahan hidup maka dosis toksik sampel

lebih dari 2000 mg/kgBB atau 5000 mg/kgBB. Tetapi jika terdapat tiga atau lebih

hewan yang mati maka dilakukan pengujian main test.

Panduan ini juga menggunaka prosedur bertahap, tetapi menggunakan hewan

tunggal, dengan hewan pertama diberikan dosis di bawah estimasi dari LD50.

Tergantung pada hasil dari hewan sebelumnya, jika hewan hidup maka dosis

dinaikkan namun jika hewan mati maka dosis diturunkan. Penambahan dan

pengurangan dosis disesuaikan dengan factor 3,2 yaitu 175, 550, 1750, 5000

mg/kgbb. Urutan ini berlanjut sampai ada pembalikan dari hasil awal, kemudian dosis

yang diberikan pada hewan selanjutnya mengikuti prinsip up and down sampai salah

satu dari kriteria stop terpenuhi.

Kriteria stop yang dimaksud adalah :

a. 3 hewan berturut-turut bertahan di atas batas dosis

b. 5 pengulangan terjadi pada 6 hewan yang diujikan Dimulai dari dosis terendah

saat ditemukan hewan uji yang hidup, setelah itu dilakukan uji pada konsentrasi

diatas dosis terendah tersebut dan uji pada kedua konsentrasi ini dilakukan

sebanyak 2 kali

c. Terjadi 3 kali kematian pada 4 konsentrasi yang sama

Pengujian ini menggunakan satu hewan dari satu jenis kelamin. Pemodelan

statistic menunjukkan bahwa rata-rata jumlah hewan yang digunakan dalam

pengujian ini adalah sekitar 6-9 hewan dan 5 hewan yang digunakan dalam limit test.

Prosedur pengujian yang dijelaskan dalam metode ini adalah meminimalkan

jumlah hewan yang diperlukan untuk memperkirakan toksisitas akut oral bahan

kimia. Selain untuk mengestimasi interval LD50, pada uji ini juga dapat dilakukan

pengamatan terhadap tanda-tanda toksisitas. (OECD, 2008)

Untuk ketiga panduan tersebut, pengamatan klinis yang cermat harus dilakukan

setidaknya dua kali pada hari pemberian dosis atau lebih sering ketika menunjukkan

respon dari hewan, dan setidaknya sekali sehari setelahnya. Pengamatan tambahan

dilakukan jika hewan terus menunjukkan tanda-tanda toksisitas. Pengamatan meliputi

perubahan kulit dan bulu, mata dan selaput lender, pernapasan, peredaran darah,

22

system saraf pusat dan otonom, aktivitas somatomotor dari tingkah laku. Pengamatan

tambahan dibutuhkan jika terdapat hewan yang menunjukkan tanda-tanda keracunan.

Pengamatan yang dilakukan meliputi tremor, konvulsi, salivasi, diare, letargi,

sedative dan koma. Jika terdapat hewan yang dalam keadaan hampir mati dan

menunjukkan kesakitan hebat atau menunjukkan stress hebat sebaiknya dibunuh dan

dianggap dalam interpretasi hasil dengan cara yang sama seperti hewan mati pada

pengujian.

23

Tabel 2.5 Prinsip Penentuan LD50 pada Tiga Metode Alternatif

Kriteria OECD 401 “AOT” OECD 420 “FDP” OECD 423 “ATC” OECD 425 “UDP”

Prinsip Pemberian dosis tunggal senyawa uji secara oral pada tikus dengan pengamatan tanda dan gejala toksisitas, berat

badan dan kematian hewan uji selama 14 hari

Jenis kelamin

hewan uji

Terdapat kelompok hewan

uji jantan dan kelompok

hewan uji betina

Hewan uji betina Hewan uji betina Hewan uji betina

Jumlah hewan

uji

Minimal 20. 5 hewan uji

untuk tiap kelompok dosis

5 hewan uji untuk tiap

kelompok dosis

3 hewan uji untuk tiap

kelompok dosis

Maksimal 14 hewan uji.

Pemberian dosis dilakukan

secara bertahap

Dosis hewan uji Maksimal 2000 mg/kg bb Kelompok dosis 5,

50, 300, dan 2000

mg/ kg bb

Kelompok dosis 5,

50, 300, dan 2000

mg/ kg bb

Dimulai dari perkiraan LD50

(175 mg/kgBB) dan

peningkatan dosisnya mengikuti

factor pengalian 3,2.

Pengamatan Perubahan berat badan, gejala toksisitas, histopatologi

Output Rentang perkiraan LD50 dan tanda-tanda toksisitas akut Estimasi interval nilai LD50 dan

tanda-tanda toksisitas akut

Masa berlaku

metode

Dihapuskan pada tahun 2002 Masih berlaku Masih berlaku Masih berlaku

Botham (2002) dan Sass (2000)

24

Keterbatasan dari ketiga metode tersebut adalah (OECD, 2011) :

1. Metode ini mungkin meiliki klasifikasi yang melebihi atau kurang tepat

terhadap nilai LD50 sesungguhnya dan hasil yang diperoleh cenderung

dipengaruhi oleh pemilihan dosis awal yang digunakan terutama pada zat

yang memiliki dosis yang rendah

2. Bisa saja zat uji menyebabkan kematian tertunda (5 hari atau lebih setelah

pemberian zat uji). Zat uji yang dapat menyebabkan kematian tertunda

berpengaruh pada penggunaan panduan 425, dimana durasi pengujian lebih

panjang dibanding metode lain. Namun dalam panduan 420 dan 423, temuan

kematian tertunda mungkin memerlukan tambahan dosis dengan tingkat yang

lebih rendah yang dilakukan secara berulang.

Nilai LD50 didapatkan dari program AOT425StatPgm (Acute Oral Toxicity

(Guideine 425) Statistical Program). Program ini adalah perangkat lunak untuk

menghitung nilai LD50. Karena metode ini bertujuan untuk menguji toksisitas jangka

pendek dari suatu senyawa kimia pada hewan pengerat, maka informasi yang

dimasukkan ke dalam program ini adalah dosis dan respon dari hewan uji

(mati/hidup). Penggunaan aplikasi ini dapat dilakukan secara bertahap, data yang

didapatkan di awal, bisa dimasukkan terlebih dahulu, data disimpan, kemudian bisa

memasukkan data selanjutnya pada hari yang berbeda. Ketika seluruh uji selesai,

program AOT425StatPgm dapat menghitung nilai LD50 berdasarkan data yang telah

dimasukkan.

Kelebihan dari program AOT425StatPgm adalah dapat menghitung dosis

rekomendasi untuk hewan setelahnya tergantung respon hewan. Serta dapat

memberikan informasi kapan waktu untuk menghentikan dosis hewa dan estimasi

nilai LD50 (Ningrum, 2012).

2.9. Pengamatan Toksisitas

Hewan uji yang telah diadministrasikan oleh zat uji, dilakukan beberapa

pengamatan :

25

2.9.1. Pengamatan Berat Badan

Secara makroskopik, hewan diamati berat badannya untuk dibandingkan

dengan berat standar atau kontrol. Pertumbuhan pada hewan pengerat seperti tikus

sangat sensitif terhadap nutrisi. Pertumbuhan yang terjadi dapat sangat cepat ataupun

menurun, hal ini dipengaruhi oleh perubahan status gizi pada hewan dengan usia

berapapun. Hewan uji tikus terutama laki-laki pertumbuhannya terus meningkat

dalam hal ukuran maupun berat sepanjang hidupnya, namun juga dipengaruhi oleh

galur. Perbedaan dari berat badan yang sangat signifikan antar hewan uji bisa

dipengaruhi akibat kekurangan atau terlalu banyak makan, mengalami gangguan

perkembangan, perifer, maupun sentral (Whishaw, Haun dan Kolb, 1999).

2.9.2. Tanda-tanda Toksisitas

Hewan diamati secara individual minimal sekali selama 30 menit setelah

pemberian dosis selama 4 jam dan setiap hari selama 14 hari, kecuali jika terjadi

kematian. Waktu dimana tanda toksisitas muncul dan tidak muncul sangat penting

untuk diamati. Kombinasi dari jenis dan durasi tanda toksisitas yang muncul sangat

penting untuk menentukan keparahannya (OECD, 2000). Tanda-tanda toksisitas

yang perlu diamati seperti perubahan piloereksi, konvulsi, tremor, nyeri, mata,

letargi, salivasi, lakrimasi, hiperaktivitas, dan kematian (Sabbani, Ramesh dan

Shobharani. 2015)

Tahapan kematian pada tikus memiliki beberapa ciri :

a. Kematian yang diprediksi bisa dilihat saat pengamatan berlangsung yaitu

kondisi ketika tikus tidak mampu mencapai air minum dan makanan

b. Kondisi hampir mati adalah jika muncul tanda-tanda indikatif seperti kejang-

kejang, penyerahan diri, dan tremor.

c. Moribound atau sekarat merupakan ketidakmampuan tikus untuk bertahan

hidup walaupun sudah dirawat.

(OECD, 2000)

26

2.9.3. Pengamatan Mikroskopik Histopatologi Organ

2.9.3.1. Organ Hati

Dilihat dari segi histologi, struktur dan komponen hati tikus pada dasarnya

sama seperti struktur pada mamalia lainnya. Hati terdiri atas beberapa komponen

selular, seperti hepatosist (sel parenkim), sel-sel sinusoidal, sel hematopoietic, sel

saraf, pembuluh darah dan limfe. Lobus hati dibungkus oleh kapsul. Lobus hati terdiri

atas kapsula fibrosa dan kapsul serosa. Kapsula dbungkus oleh peritoneum, namun

ada beberapa area kapsula yang dapat berhubungan langsung dengan diafragma dan

organ visera pada dinding abdomen posterior.

Hepatositt berbentuk polyhedral, intinya buat terletak di tengan, terdapat satu

atau lebih nucleolus dengan kromatin yang menyebar. Sering pula terlihat adanya dua

inti sebagai hasil pembelahan yang tidak sempurna dari sitoplasma. Hepatosit

tersususn atas lempeng-lempeng sel hati yang mengelilingi vena sentralis (Dellman &

Brown, 1992).

Sinusoid merupakan pembuluh darah kapiler yang mengisi lobules yang

membawa darah dari arteri dan vena interlobular, kemudian menuju vena sentralis.

Dinding sinusoid memiliki banyak celah karena dindingnya terdiri atas endotel dan

sel-sel makrofag besar yang aktif, yang disebut dengan sel Kuppfer yang berasal dari

monosit. Darah meninggalkan lobules melalui vena sentralis atau vena hepatica

terminalis yang dilapisi oleh endotel dengan lamia basalis dan adventisia tipis,

kemudian langsung berhubungan dengan sinusoid.

Vena sentralis berhubungan dengan vena sublobular atau vena interkalatus di

tepi lobules. Kedua vena tersebut terdapat di sepanjang basis lobules, dimana

sebagian bergbung membentuk vena penampung (collecting vein) yang nantinya

bergabung menjadi vena hepatica (Dellmn & Brown, 1992)

27

2.9.3.2. Ginjal

Ginjal adalah organ yang berperan mengatur keseimbangan cairan tubuh serta

mengeksresi kelebihannya yaitu air kemih. DI dalam ginjal terdiri 3 proses rangkaian

penting, yaitu proses filtrasi, reabsorbsi dan augmentasi. Ginjal terdiri dari tiga bagian

utama, meliputi korteks (bagian luar), medulla (sumsum ginjal) dan pelvis renalis

(rongga ginjal) (Utomo, 2013).

Bagian korteks mengandung banyak nefrin. Nefron merupakan unit

fungsional dan structural dari ginjal dan ginjal terdiri dari ribuan nefron. Tiap nefron

terdirir dari dua bagian, yaitu korpus renalis dimana plasma darah difiltrasi dan

tubulus renalis yang mengabsirpsi dan mensekresi cairan yang lewat. Korpus renalis

dibagi menjadi dua bagian yait glomerulus (kapiler glomerulus) dan kapsula Bowman

yang mengelilingi kapiler glomerulus. Sedangkan tubulus renalis dibagi menjadi tiga

bagian, yaitu tubulus proksimal, lengkung henle, dan tubulus distalis (Tortora, 2005).

2.10 Studi Literatur

Uji toksisitas dengan menggunakan metode Up and down procedure, sudah

banyak diterapkan oleh banyak penelitian baru- baru ini. Protokol utama yang

menjadi acuan dalam metode ini adalah di OECD (Organization for Economic Co-

operation and Development ) 425. Penelitian-penelitian yang telah dilakukan pun

juga berpanduan terhadap OECD, hal ini karena metode dalam OECD memiliki

beberapa kelebihan dan memperhatikan kesejahteraan hewan.

Daun Mitragyna speciosa Korth (MS) yang popular digunakan sebagai obat

diare, analgesic dan antipiretik di Thailand dan Malaysia. Karena cukup sering

digunakan, maka ekstrak daun MS diuji keamanannya menggunakan uji toksisitas

metode Up and down procedure pada tikus galur Sprague Dawley (Kamal dkk,

2012). Terdapat pula tanaman yang banyak digunakan sebagai obat seperti Entada

leptostachya (EL) and Prosopis juliflora (PJ). Kedua tanaman ini belum memiliki

profil toksisitas dan keamanannya, makan ditentukan dengan menggunakan uji

toksisitas akut oral. Dosis yang digunakan pada metode Up and down procedure

yaitu 175, 550, 1750, dan 5000 mg/kgBB. Hasilnya menunjukkan bahwa nilai LD50

28

yang didapatkan yaitu lebih dari 5000 mg/kgBB serta tidak muncul adanya kematian

dan tanda sakit atau stress (Kimani et al, 2014).

Pada dasarnya, uji toksisitas harus dilakukan terhadap semua zat yang

diaplikasikan ke makhluk hidup, tidak hanya dilakukan pada ekstrak tanaman. Salah

satu contohnya adalah gelatin. Gelatin sangat berguna dan sering diaplikasikan dalam

sediaan farmasi. Salah satu jenis gelatin yang telah diuji toksisitasnya yaitu gelatin

kulit ikan patin Siam (Pangasius hypophthalmus). Uji toksisitas yang dilakukan pada

gelatin ini yaitu bersifat subkronik dimana paparan zat yang diberikan kepada hewan

uji yaitu selama 4 minggu. Terdapat beberapa parameter yang dilakukan pada

penelitian ini untuk mengetahui keamanan gelatin ini. Dan hasilnya menunjukkan

bahwa pada dosis gelatin 48 mg/kgBB sudah mulai mempengaruhi kadar GOT.

Namun untuk kerusakan yang terjadi pada organ target tidak mempengaruhi secara

bermakna terhadap pemberian gelatin kulit ikan patin siam ini (Rachmawati et al,

2011).

29

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Desember 2015 hingga Mei 2016.

Pembuatan larutan gelatin dilakukan di Laboratorium Penelitian II, pemeliharaan dan

perlakuan hewan uji di Animal House (AH) Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, dan pembuatan preparat

histologi di Laboratorium Histologi Universitas Indonesia.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan terdiri dari gelas beker, gelas ukur, pipet tetes, spatula,

batang pengaduk, timbangan analitik, sonde, kandang tikus, masker, sarung tangan,

pinset, gunting bedah, kaca objek, dan mikroskop

3.2.2. Bahan Kimia

Bahan-bahan yang digunakan, yaitu : akuades, eter, dan formalin

3.2.3. Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelatin sapi golongan

farmasetik (Gelita New Zealand) dan golongan pro analisis (Sigma-Aldrich)

3.3 Rancangan Penelitian

3.3.1 Besar Sampel

Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan 3 kelompok perlakuan,

yaitu kelompok kontrol, kelompok uji gelatin sapi golongan farmasetik dan pro

analisis. Pemilihan hewan uji dilakukan secara random. Masing-masing hewan pada

kelompok uji diberikan dosis secara bertahap sesuai dengan respon hewan terhadap

dosis yang diberikan. Selain itu, penelitian ini telah lolos Kaji Etik di Komisi Etik

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (Lampiran 2).

30

3.3.2 Dosis Perlakuan

Uji toksisitas akut menggunakan metode Up and Down Procedure memiliki 2

tahap, yaitu Limit test dan Main test. Pada limit test, dosis tunggal yang diberikan

sebesar 5000 mg/kgbb. Dan karena pada 3 hewan uji tidak mengalami kematian, maka

Limit Test dihentikan dan tidak perlu dilakukan Main Test.

Tabel 3.1 Perlakuan terhadap Tikus

Tikus Perlakuan Dosis

1. Kontrol (Akuades)

2.

3.

Gelatin Sapi Golongan Farmasetik

5000 mg/kgbb

4. 5000 mg/kgbb

5. 5000 mg/kgbb

6.

Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis

5000 mg/kgbb

7. 5000 mg/kgbb

8. 5000 mg/kgbb

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Penyiapan Larutan Gelatin

Gelatin sapi yang akan diberikan kepada hewan uji dibuat dengan dosis

5000mg/kgbb. Serbuk gelatin dengan berat yang telah disesuaikan dengan bobot tikus

dilarutkan aquades dengan suhu 60o C (Rowe, Sheskey dan Quinn, 2006). Larutan

gelatin diberikan kepada hewan uji saat suhunya mencapai 30o C.

3.4.2 Penyiapan Hewan Uji

Hewan percobaan yang dipakai adalah tikus betina galur Sprague Dawley

yang sehat, belum kawin, dan tidak sedang hamil, berumur 8-12 minggu dengan

variasi berat badan ±20%. Tikus betina diaklimatisasi terlebih dahulu minimal 5 hari

sebelum diberikan perlakuan dengan ditempatkan dalam kandang pada suhu 22o (±3o

C). Hewan diberikan pellet untuk tikus dan air minum (ad libitum). Aklimatisasi

dilakukan agar tikus dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan pengamatan.

31

Selama proses aklimatisasi dilakukan pengamatan kondisi umum serta penimbangan

bobot tikus. (OECD, 2008)

3.4.3 Uji Toksisitas Akut (OECD, 2008)

Penentuan nilai LD50 ini menggunakan metode Up and Down Procedure

dimana terdapat dua uji yaitu limit test dan main test. Pemberian larutan uji gelatin

dilakukan dengan dosis tunggal secara oral menggunakan sonde lambung. Nilai LD50

dapat ditentukan dengan menghitung respon tikus (hidup atau mati) terhadap dosis uji

yang diberikan. Tahapan dari pengujian toksisitas akut metode Up and Down

Procedure menurut OECD 425 adalah :

a. Sebelum perlakuan, tikus dipuasakan terlebih dahulu semalaman dengan

tetap diberikan minum (ad libitum)

b. Ketika perlakuan kontrol hanya diberi akuades dengan volume yang sama

dengan volume zat uji.

c. Setelah pemberian zat uji, tikus tetap dipuasakan selama 4 jam

d. Pengamatan tanda toksisitas yang muncul diamati tiap setengah jam hingga

4 jam setelah zat uji diberikan kemudian dilanjutkan setiap hari selama 14

hari

3.4.3.1 Penentuan Nilai LD50 (OECD, 2008)

Penentuan nilai LD50 gelatin sapi menggunakan metode Up and Down

Procedure dan jenis uji yang dilakukan adalah limit test. Limit Test ini dilakukan

pada bahan uji yang telah diinformasikan bersifat tidak toksik. Dosis yang digunakan

pada limit test ini dipilih dosis 5000mg/kgbb sebab menurut Handbook of

Pharmaceutical Excipients, nilai LD50 gelatin yaitu >5000mg/kgbb. Selain diberikan

zat uji, untuk 2 tikus diperlakukan sebagai kontrol. Dimana diberikan akuades dengan

volum pemberian sama seperti tikus uji.

Setelah dipuasakan, tikus ditimbang bobotnya dan masing-masing diberikan

secara oral larutan gelatin sapi dengan dosis 5000mg/kgbb. Jika tikus uji setelah

pemberian dosis masih hidup pada hari kedua, maka dilakukan uji lagi pada dua tikus

lainnya dengan dosis yang sama.

32

Maksimal penggunaan hewan pada limit test ini yaitu 5 ekor. Dan jika

terdapat 3 hewan uji yang hidup, maka limit test ini dapat dihentikan dan bisa ditarik

kesimpulan bahwa nilai LD50 gelatin sapi yaitu sebesar >5000mg/kgbb. Pengamatan

yang meliputi bobot badan dan tanda-tanda toksisitas dilakukan hingga hari ke-14.

3.4.4 Pengamatan Toksisitas

3.4.4.1 Perhitungan Nilai LD50 (OECD, 2008)

Perhitungan nilai LD50 gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis

menggunakan software AOT 425 StatPgm. Data yang dimasukkan merupakan respon

hidup/mati hewan uji terhadap pemberian dosis uji. Dilambangkan dengan O : hidup

dan X : mati. Selain menentukan nilai LD50, software ini juga dapat membantu

penentuan dosis uji berikutnya serta menentukan saat dimana pengujian berhenti.

3.4.4.2 Perhitungan Perbedaan Bobot Tikus

Tikus kontrol dan uji dihitung bobotnya dengan menggunakan timbangan

analitik. Penimbangan dilakukan setiap hari, dimulai dari hari pertama sebelum dosis

diberikan hingga 14 hari pengamatan setelah dosis diberikan. Data bobot tikus yang

diperoleh kemudian diolah secara statitstik menggunakan Uji Kruskal Wallis.

3.4.4.3 Pengamatan Perubahan Tingkah Laku Tikus

Pengamatan pada perubahan perilaku yang dialami oleh tikus setelah

pemberian gelatin. Tingkah laku tikus diamati setiap 30 menit selama 4 jam setelah

dosis diadministrasikan dan selanjutnya diamati setiap hari selama 14 hari (OECD,

208) . Perilaku tikus yang diamati yaitu piloereksi, konvulsi, tremor, nyeri, mata,

refleks daun telinga, salivasi, lakrimasi, hiperaktivitas, mortalitas (Sabbani dkk,

2015).

3.4.5 Pengamatan Histopatologi Organ

Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop serta dilihat kelainan

patologis yang terdapat pada organ hati tikus. Pemeriksaan histopatologi dilakukan

untuk melihat pengaruh dari pemberian gelatin sapi golongan farmasetik dan pro

analisis terhadap organ hati dan ginjal

33

Tikus yang masih bertahan hidup sampai hari ke 14, dimatikan dengan cara

inhalasi menggunakan eter. Setelah tikus mati, kemudian dilakukan pembedahan

untuk mengambil organ hati pada tikus betina. Pengambilan organ hati tikus betina

dilakukan sebagai berikut :

a) Tikus betina yang telah mati ditelentangkan pada papan bedah

b) Kulit perut bagian bawah diangkat dengan pinset, kemudian pada bagian

tersebut digunting menggunakan gunting bedah

c) Pengguntingan tersebut dilanjutkan kearah perut atas sisi kanan dan kiri hingga

ke bagian bawah kedua kaki depan tikus sehingga seluruh bagian rongga perut

tikus terlihat

d) Organ yang diambil adalah hati dan ginjal

3.4.5.1 Organ Hati (Andreas, Trianto dan Ilmiwan, 2015)

Organ hati yang telah diambil di hari ke-15 dibuat preparat histologinya dan

diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 400x. Pada tiap preparat histologi hati,

diambil 10 lapang pandang dan diamati kerusakan selnya. Kerusakan yang ditemui

kemudian diberi skoring untuk mengetahui derajat kerusakannya.

Skoring : 0 : tidak terdapat degenerasi sel pada hati

1 : terjadi degenerasi sel di satu tempat

2 : terjadi degenerasi sel di beberapa tempat

3 : terjadi degenerasi sel di seluruh tempat

3.4.5.2 Organ Ginjal (Leehey et al, 2008)

Organ ginjal yang telah diambil di hari ke-15 dibuat preparat histologinya

dan diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 200x. Pada tiap preparat histologi

ginjal, diambil 30 glomerulus dan diamati kerusakan selnya. Kerusakan yang ditemui

kemudian diberi skoring untuk mengetahui derajat kerusakannya.

Skoring : 0 : glomerulus normal

1 : vasodilatasi kapiler

2 : atrofi glomerulus (sclerosis)

34

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan Larutan Gelatin

Gelatin sapi golongan farmasetik (Gelita) dan pro analisis (Sigma Aldrich)

yang akan diberikan ke tikus uji didispersikan dahulu ke dalam akuades. Secara

organoleptis, warna serbuk gelatin sapi berwarna kuning kecoklatan, namun terlihat

bahwa serbuk gelatin golongan pro analisis memiliki warna coklat yang lebih cerah.

Serbuk gelatin dengan jumlah yang telah disesuaikan dengan bobot tikus

didispersikan ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 5. Serbuk gelatin

dimasukkan ke dalam akuades yang telah dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 60o C

selama ±8 menit hingga membentuk larutan koloid berwarna kuning dan

konsistensinya sedikit kental. Perbandingan ini didapatkan karena sifat gelatin yang

menyerap air sehingga membutuhkan cukup banyak air untuk mendispersikannya.

Hasil larutan koloid gelatin yang didapatkan dengan perbandingan ini menghasilkan

kekentalan yang cukup untuk membantu pemberian larutan koloid gelatin ini dengan

sonde tikus.

4.2 Hasil Penelitian

4.2.1 Nilai LD50 Gelatin Sapi Golongan Farmasetik dan Pro Analisis

Tiga tikus uji menggunakan gelatin sapi golongan farmasetik (GF) diuji

toksisitasnya menggunakan metode Up and Down Procedure dengan dosis tunggal

5000 mg/kgbb (OECD, 2008). Setelah diamati selama 14 hari, tidak terdapat tikus

yang mengalami kematian, sehingga nilai LD50 gelatin sapi golongan farmasetik

adalah lebih dari 5000 mg/kgbb. Penentuan ini menggunakan software AOT 425

StatPgm. Nilai LD50 ini merupakan senyawa yang praktis tidak toksik.

35

Tabel 4.1 Nilai LD50 Gelatin Sapi GF dengan software AOT 425 StatPgm

BAHAN UJI : GELATIN SAPI GOLONGAN FARMASETIK

TIPE TEST : LIMIT TEST

No Dosis Respon Jangka Pendek Respon Jangka Panjang

1. 5000 mg/kgbb O O

2. 5000 mg/kgbb O O

3. 5000 mg/kgbb O O

Keterangan : O : hewan hidup, X : hewan mati

Sampel uji gelatin sapi golongan pro analisis (PA) diuji toksisitasnya pada

tiga tikus betina menggunakan metode Up and Down Procedure dengan dosis

tunggal 5000 mg/kgbb (OECD, 2008).. Setelah dilakukan pengamatan selama 14

hari, tidak terdapat pula tikus yang mengalami kematian, sehingga nilai LD50 gelatin

sapi golongan pro analisis adalah lebih dari 5000 mg/kgbb. Penentuan ini

menggunakan software AOT 425 StatPgm. Nilai LD50 ini termasuk senyawa yang

praktis tidak toksik.

Tabel 4.2 Nilai LD50 Gelatin Sapi PA dengan software AOT 425 StatPgm

BAHAN UJI : GELATIN SAPI GOLONGAN PRO ANALISIS

TIPE TEST : LIMIT TEST

No Dosis Respon Jangka Pendek Respon Jangka Panjang

1. 5000 mg/kgbb O O

2. 5000 mg/kgbb O O

3. 5000 mg/kgbb O O

Keterangan : O : hewan hidup, X : hewan mati

4.2.2 Hasil Bobot Tikus

Bobot badan hewan uji ditimbang tiap harinya mulai dari hari dimana zat uji

diberikan hingga hari ke-14. Perubahan bobot badan tikus kontrol serta tikus uji

dengan gelatin sapi golongan farmasetik maupun pro analisis dapat dilihat di tabel

4.3.

36

Tabel 4.3 Bobot Tikus

No Kelompok Rata-rata bobot tikus (gram) ± SD

1. Kontrol (Akuades) 187,70 ± 27,20

2. Gelatin Sapi Golongan Farmasetik 167,17 ± 8,44

3. Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis 180,95 ± 5,34

Perubahan bobot pada tikus uji dianalisa menggunakan analisa statistik Uji

Kruskal Wallis. Dan hasil analisis ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang

bermakna antara bobot tikus kontrol, tikus uji dengan gelatin golongan farmasetik

dan pro analisis (p ≥ 0,05) . Hal ini menjelaskan pula bahwa dengan pemberian

gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis tidak mempengaruhi bobot tikus

(Lampiran 10).

4.2.3. Pengamatan Tanda-Tanda Toksisitas

Tikus kontrol dan uji dengan gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis

diamati perubahan tingkah lakunya terhadap tanda-tanda toksisitas. Pengamatan ini

dilakukan selama 4 jam pertama setelah zat uji diberikan dan selanjutnya diamati

setiap hari selama 14 hari.

Tabel 4.4 Pengamatan tanda-tanda toksisitas

Pengamatan 0

m

60

m

120

m

180

m

240

m

H

2

H

3

H

4

H

5

H

6

H

7

H

8

H

9

H

10

H

11

H

12

H

13

H

14

Piloereksi - - - - - - - - - - - - - - - - -

Konvulsi - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Tremor - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Nyeri - - - - - - - - - - - - - - - - -

Mata (grooming) N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Refleks Daun

Telinga N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Salivasi - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Lakrimasi - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Hiperaktivitas - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Mortalitas - - - - - - - - - - - - - - - - - -

0 m – 240 m : 0 menit hingga 240 menit, H2 – H14 : Hari ke-2 hingga hari ke-14

N : Normal, (-) : tidak terjadi

37

Pengamatan tanda-tanda toksisitas yang diamati meliputi keadaan piloereksi,

konvulsi, tremor, nyeri, mata, refleks daun telinga, adanya salivasi, lakrimasi,

hiperaktivitas dan mortalitas. Pengamatan tanda-tanda toksisitas diamati pada 8 ekor

tikus meliputi dua tikus kontrol, tiga tikus uji sampel gelatin sapi golongan farmasetik

dan tiga tikus uji gelatin sapi golongan pro analisis. Hasil dari pemberian dosis

tunggal 5000 mg/kgbb gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis pada tikus

betina galur Sprague Dawley tidak muncul adanya tanda-tanda toksisitas tersebut.

Tikus uji memiliki aktivitas yang sama dengan tikus kontrol (Lampiran 11).

4.2.4. Hasil Histopatologi Organ

Pemeriksaan histopatologi dilakukan pada organ hati dan ginjal tikus kontrol

dan uji dimana organ-organ tersebut diambil di hari ke-15. Tiap organ dibuat preparat

histologinya dan diamati pada 10 lapang pandang pada preparat hati dan 30

glomerulus pada preparat ginjal. Pengamatan histopatologi dilakukan untuk melihat

adanya kelainan atau kerusakan pada organ hati dan ginjal secara mikroskopik.

Gambar histopatologi organ hati dan ginjal bisa dilihat di tabel 4.5.

38

Tabel 4.5 Gambar Histopatologi Organ Hati dan Ginjal

Organ Tikus Kontrol Tikus Perlakuan Gelatin

Sapi Golongan Farmasetik

Tikus Perlakuan Gelatin

Sapi Golongan Pro Analisis

Hati

: Vena sentralis

: Sel hepatosit

normal

: terjadi perlemakan

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

: pelebaran asinus

(degenerasi sel)

Ginjal

: glomerulus normal

: tubulus proksimal

normal

: glomerulus mengkerut

(atrofi)

: tubulus proksimal

normal

: glomerulus mengkerut

(atrofi)

: tubulus proksimal

normal

Pada pengamatan histopatologi ditemukan beberapa kerusakan pada organ

hati dan ginjal. Histopatologi hati menunjukkan bahwa terjadi degenerasi sel pada

hati tikus uji golongan farmasetik dan pro analisis. Sedangkan pada histopatologi

organ ginjal juga ditemukan kelainan yaitu terjadi atrofi glomerulus. Selain

pengamatan yang dilakukan secara deskriptif, kerusakan yang terjadi pada organ hati

dan ginjal diberikan skoring untuk mengetahui derajat kerusakan kedua organ

tersebut. Hasil dari skoring dapat dilihat di tabel 4.6.

39

Tabel 4.6. Skoring Histopatologi Organ Hati dan Ginjal

No Kelompok Organ Hati Organ Ginjal

1. Kontrol (Akuades) 0,150 ± 0,212 0,00 ± 0,00

2. Gelatin Sapi Golongan Farmasetik 1,066 ± 0,776 0,06 ± 0,03

3. Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis 1,100 ± 0,871 0,04 ± 0,07

Skoring yang dilakukan pada histopatologi organ hati dan ginjal kemudian

dianalisis menggunakan statistik. Pengujian statistik menggunakan Uji Beda Nyata

Terkecil (BNT) menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan bermakna antara

histopatologi organ hati pada kelompok kontrol, kelompok uji gelatin sapi golongan

farmasetik dan pro analisis (p ≥ 0,05). Begitu pula pada histopatologi organ ginjal,

bahwa tidak terdapat perbedaan bermakna antara kelompok kontrol, kelompok uji

gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis (p ≥ 0,05). Hal ini menunjukkan

bahwa pemberian gelatin sapi golongan farmasetik maupun pro analisis tidak

mempengaruhi histopatologi organ hati dan ginjal.

4.3 Pembahasan

Uji toksisitas akut ini dilakukan karena gelatin sapi sangat umum digunakan

sebagai zat tambahan pada sediaan makanan dan farmasi. Pada bidang farmasi sendiri

penggunaan gelatin dapat menjadi zat tambahan dalam pembuatan berbagai sediaan

farmasi seperti tablet, suppositoria, kapsul, emulsi dan lain sebagainya.

Salah satu parameter penentuan keamanan suatu senyawa adalah menentukan

nilai LD50. Persyaratan nilai LD50 dari gelatin telah dicantumkan dalam Handbook of

Pharmaceutical Excipients. Namun, untuk nilai LD50 secara spesifik gelatin sapi

belum diketahui sehingga perlu dilakukan uji toksisitas terhadap gelatin sapi untuk

mengetahui tingkat keamanan dari gelatin sapi tersebut. Pada penelitian ini gelatin

sapi yang digunakan yaitu golongan famasetik dan pro analisis. Sampel uji yang

digunakan adalah gelatin sapi golongan farmasetik (Gelita) dan gologan pro analisis

(Sigma Aldrich).

40

Pada uji toksisitas akut yang dilakukan pada gelatin sapi menggunakan

metode Up and Down Procedure (UDP). Metode ini merupakan salah satu metode

alternatif dalam pengujian toksisitas akut yang dikeluarkan oleh OECD. Jika

dibandingkan dengan metode konvensional, metode UDP ini menggunakan hewan

yang relatif lebih sedikit, bahkan sepertiga dibanding dengan metode konvensional.

Selain itu dapat menentukan estimasi nilai LD50 jika dibandingkan dengan metode

lain yang hanya dapat menentukan rentang nilai LD50 (Erkekoglu, 2011). Metode

UDP ini juga telah divalidasi untuk memastikan keakuratan metode dan hasil yang

nantinya akan didapatkan (Ningrum, 2012).

Hewan uji yang digunakan adalah tikus betina galur Sprague Dawley berusia

8-12 minggu pada saat pemberian zat uji. Jenis kelamin hewan uji juga

mempengaruhi respon dalan toksisitas akut. Betina cenderung lebih sensitif dalam

memunculkan tanda-tanda toksisitas dibandingkan jantan (Lipnick,1995). Tikus

betina yang digunakan dalam keadaan belum pernah menikah dan tidak sedang hamil

(OECD, 2008). Galur Sprague Dawley dipilih karena merupakan galur yang paling

sering digunakan untuk penelitian serta memiliki sifat tenang dan mudah dikontrol

Selain itu galur ini bersifat lebih sensitif dibandingkan galur Wistar (Zmarowski, et

al., 2013). Selain itu penelitian ini telah lolos Kaji Etik di Komisi Etik Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia (Lampiran 2).

Sampel uji gelatin yang diberikan kepada hewan uji dipilih menggunakan rute

oral. Rute oral dipilih karena disesuaikan dengan aplikasi umum gelatin dalam

sediaan farmasi seperti tablet, kapsul, dan emulsi. Untuk mempermudah pemberian

zat uji ke hewan uji, serbuk gelatin dilarutkan terlebih dahulu dengan akuades.

Menurut Handbook of Pharmaceutical Excipients, air yang biasa disebut akuades

sangat penting untuk kehidupan biologis dan keamanannya dalam formulasi sediaan

farmasi tidak perlu diragukan lagi. Selain itu, di dalam Handbook of Toxicology

disebutkan bahwa air merupakan salah satu zat pembawa yang tidak toksik dan tidak

mengiritasi dalam pemberian rute oral (Carol, 1995). Pembuatan larutan koloid

gelatin dilakukan pada suhu 60o C dan pemberian pada hewan uji dilakukan saat

41

koloid gelatin masih bersuhu 30o C untuk mencegah pembentukan gel yang akan

mempersulit pemberian zat uji.

Uji toksisitas akut ini dilakukan pada hewan kontrol dan hewan uji untuk tiap

sampel yang digunakan. Tikus uji yang digunakan terlebih dahulu diaklimatisasi

selama 14 hari untuk proses adaptasi terhadap kondisi yang baru. Selama masa

aklimatisasi tersebut, tikus diberi makan dan minum (ad libitum). Serta diamati pula

perubahan bobot badan tikus. Karena pemberian zat uji diberikan secara oral, hewan

uji harus dipuasakan terlebih dahulu selama semalaman karena dengan adanya

makanan atau zat kimia lainnya yang berada di saluran pencernaan dikhawatirkan

akan ada reaksi antar senyawa (Jothy et al, 2011). Saat pemberian zat uji, tikus

ditimbang bobot badannya terlebih dahulu untuk menyesuaikan dengan dosis. Dan

setelah zat uji selesai diberikan, tikus tetap dipuasakan selama 4 jam. Serta

pengamatan dilakukan selama 14 hari.

Dalam metode UDP, tahap awal yang dilakukan adalah limit test. Dimana

pada tahap ini hanya dilakukan pada sampel uji yang telah diinformasikan bahwa

bersifat tidak toksik. Maksimal penggunaan hewan pada limit test adalah lima ekor.

Menurut Handbook of Pharmaceutical Excipient disebutkan bahwa gelatin memiliki

persyaratan nilai LD50 yaitu 5000 mg/kgbb. Maka, pada limit test, gelatin sapi diuji

toksisitasnya menggunakan dosis 5000mg/kgbb.

Pada prinsipnya, tahap limit test ini tidak bertujuan untuk menentukan suatu

nilai pasti LD50, namun tahap ini dapat sebagai acuan dalam mengklasifikasikan dosis

gelatin sapi kelas farmasetik dan pro analisis yang membuat hewan uji masih

bertahan hidup (Jothy et al, 2011). Setelah dilihat respon hewan uji terhadap sampel,

ternyata 3 hewan uji pertama yang dipakai tidak mengalami kematian sehingga limit

test dapat dihentikan dan tidak perlu dilakukan perlakuan pada tikus lainnya. Karena

pada limit test pengujian gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis ini tidak

terdapat hewan uji yang mati, maka uji toksisitas yang dilakukan hanya cukup sampai

limit test dan tidak perlu dilakukan main test (OECD, 2008).

Nilai LD50 ditentukan menggunakan software AOTStat425Pgm yang hasilnya

menunjukkan bahwa nilai LD50 gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis

42

yaitu >5000mg/kgbb. Menurut kategori toksisitas Loomis, senyawa dengan nilai

LD50 >5000 mg/kgbb yang diadministraikan secara oral dianggap merupakan

senyawa praktis tidak toksik (Loomis dan Hayes, 1996). Nilai LD50 gelatin sapi yang

didapatkan ini sesuai dengan persyaratan nilai LD50 gelatin yang tercantum pada

Handbook of Pharmaceutical Excipients. Pengujian toksisitas untuk gelatin sapi

belum pernah dilakukan sebelumnya, namun jika nilai LD50 gelatin sapi

dibandingkan dengan polimer lainnya yang memiliki fungsi sama yaitu sebagai zat

pengikat pada tablet seperti selulosa, tragakan, dan polietilen glikol memiliki nilai

LD50 yaitu > 5 gram/kgbb, 16,4 gram/kgbb, dan > 27,5 gram/kgbb (Rowe, Sheskey

dan Quinn, 2009). Dimana nilai-nilai tersebut jika dibandingkan dengan nilai LD50

gelatin sapi memiliki nilai yang lebih tinggi, yang berarti memiliki keamanan

penggunaan yang lebih tinggi.

Perubahan bobot badan sejak saat tikus diberikan zat uji harus diamati selama

14 hari. Secara umum, perubahan bobot badan hewan uji juga akan menggambarkan

kondisi toksisitas setelah terpapar suatu zat (Jothy et al, 2011). Hasilnya

menunjukkan bahwa bobot tikus terus mengalami kenaikan. Perubahan bobot badan

ini merupakan hal yang wajar karena perubahan bobot badan yang merupakan efek

merugikan akibat pemberian suatu zat adalah jika terjadi penurunan bobot badan yang

signifikan sebesar 10% dari bobot awal (Jothy et al, 2011). Setelah dianalisis dengan

statistik, menunjukkan bahwa pemberian gelatin sapi golongan farmasetik dan pro

analisis tidak berbeda secara bermakna (p ≥ 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa

pemberian gelatin sapi golongan farmasetik maupun pro analisis tidak mempengaruhi

bobot badan tikus.

Tanda-tanda toksisitas dari hewan uji diamati secara individu selama 14 hari

Parameter tanda toksisitas yang diamati meliputi keadaan piloereksi, konvulsi,

tremor, nyeri, mata, refleks daun telinga, adanya salivasi, lakrimasi, hiperaktivitas

dan mortalitas. Selama 14 hari pengamatan, tikus uji pada sampel gelatin sapi

golongan farmasetik dan pro analisis tidak ditemukan adanya tanda-tanda toksisitas.

Perilaku yang ditunjukkan oleh tikus uji gelatin sapi golongan farmasetik dan pro

analisis merupakan perilaku yang normal dan tidak ada perbedaan dibandingkan

43

dengan sebelum diberikan zat uji dan hewan kontrol. Pengaruh gelatin sapi terhadap

tanda-tanda toksisitas belum pernah dilakukan sebelumnya. namun untuk senyawa

yang memiliki kemiripan dengan gelatin seperti kolagen dan kitosan yang merupakan

eksipien yang berasal dari bagian tubuh hewan telah dilakukan pengamatan tanda-

tanda toksisitasnya. Menurut Marone et al (2010) pada uji toksisitas akut oral kolagen

tidak ditemukan adanya tanda-tanda toksisitas. Begitu pula pada penelitian Pokharkar

et al (2009) yang menguji toksisitas kitosan, hasil yang diperoleh menujukkan bahwa

tidak ditemukan pula tanda-tanda toksisitas ataupun perubahan perilaku pada hewan

uji.

Untuk mengamati kerusakan hewan uji terhadap zat uji, pada hari ke-15

hewan uji dilakukan terminasi. Pengamatan dilakukan pada histopatologi organ hati

dan ginjal. Organ hati dan ginjal sangat penting untuk diamati karena kedua organ

tersebut bertugas dalam menjalankan fungsi proses pencernaan. Organ hati yang

merupakan organ terbesar dan tempat utama dalam metabolisme dan detoksifikasi

obat atau senyawa lainnya. Jika terdapat penumpukan bahan-bahan toksik dalam

parenkim hati maka dapat melukai sel hepatosit dan menyebabkan terjadinya

perubahan histopatologis yang bervariasi. Sedangkan ginjal yang berfungsi sebagai

organ ekskresi dapat menjadi organ sasaran utama dari efek toksik karena peranannya

dalam mengkonsentrasikan toksikan pada filtrat, kemudian filtrat dibawa melalui sel

tubulus dan mengaktifkan toksikan tertentu (Utomo, 2015).

Hisopatologi organ hati diamati pada 10 lapang pandang di tiap preparat

(Andreas et al, 2015). Pada organ hati tikus kontrol, susunan sel-sel hepatosit

bermuara ke vena sentralis dengan normal dan tidak ditemukan adanya tanda-tanda

patologi. Sedangkan pada organ hati hewan uji, telihat adanya kelainan struktur sel

hati. Kebanyakan, kerusakan histologi hati akibat paparan senyawa yang toksik

meliputi perlemakan hati, kematian sel hati, dan lesi hepatobiliari (Amacher, 1998).

Pada pemberian gelatin sapi golongan farmasetik maupun pro analisis memiliki

kelainan patologis pada hati yang sama. Terlihat adanya tanda awal perlemakan di

hati yaitu terjadi degenerasi sel yang ditandai dengan adanya pelebaran pada asinus.

Secara teori, terjadinya degenerasi sel pada tikus uji terjadi akibat akumulasi bahan

44

toksik dan metabolit lain menyebabkan degenerasi sel (Tatukude, Loho dan Lintong,

2014). Selain itu juga ditemukan sedikit adanya perlemakan yang sudah terbentuk.

Adanya akumulasi lemak di hati merupakan salah satu tipe kerusakan oleh toksin

yang menyebabkan steatosis makrovesikular atau mikrovesikular. Steatosis

merupakan kerusakan hati yang bersifat reversible dimana kerusakan tersebut dapat

kembali normal bila penyebab kerusakan (paparan zat) dihentikan. namun terdapat

kemungkinan akan adanya perubahan sekunder atau bahkan menyebabkan kematian

sel (Amacher, 1998). Histopatologi organ hati yang muncul pada hewan uji diberi

skoring untuk mengetahui derajat kerusakan organ hati (Lampiran 13). Meskipun

ditemukan beberapa kerusakan, hasil analisis statistik dengan Uji ANOVA

menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang bermakna (p ≥ 0,5) dengan

pemberian gelatin sapi golongan farmasetik maupun pro analisis terhadap kerusakan

organ hati (Lampiran 14).

Organ ginjal pada tikus kontrol menunjukkan sel yang normal dan tidak

terlihat adanya gangguan. Namun pada tikus uji yang diberikan gelatin sapi golongan

farmasetik ditemukan adanya atrofi pada glomerulus. Begitu pula yang terjadi pada

histopatologi organ ginjal tikus uji gelatin sapi pro analisis yang juga terjadi atrofi

glomerulus, hal ini ditandai dengan melebarnya ruang antara kapsula bowman dan

glomerulus akibat mengkerutnya glomerulus. Munculnya atrofi glomerulus yang

terjadi, disebabkan akibat masuknya senyawa-senyawa yang bersifat toksik ke dalam

filter glomerulus yang menyebabkan pengecilan morfologi ginjal dan aktivitas sel-sel

tubuli yang menjadi barier dari filter glomerulus. Adanya atrofi glomerulus

menggambarkan adanya reaksi antara makromolekul yang terfiltrasi dengan dinding

filter glomerulus (Mansuroh, 2013), sedangkan kondisi tubulus proksimal pada kedua

hewan uji terlihat normal dan tidak terjadi adanya kerusakan. Pada histopatologi

ginjal, hanya ditemukan kerusakan pada glomerulus, maka dilakukan skoring

terhadap kerusakan glomerulus ginjal (Lampiran 16) yang diambil dari 30 glomerulus

di tiap preparat (Leehey et al, 2008). Hasil analisis statistik menggunakan Uji

ANOVA terhadap skoring histopatologi organ ginjal menunjukkan bahwa tidak ada

45

perbedaan yang bermakna (p ≥ 0,05) dari pemberian gelatin golongan farmasetik

maupun pro analisis terhadap kerusakan organ ginjal (Lampiran 17).

Hasil pengamatan pada organ hati dan ginjal tikus uji menunjukkan adaya

kerusakan yang terjadi di kedua organ. Terdapat beberapa kemungkinan penyebab

kerusakan pada hati tikus uji. Proses pembuatan gelatin yang melibatkan beberapa

senyawa kimia yang digunakan dalam proses ekstraksi gelatin seperti asam klorida,

asam sulfat, natrium hidroksida merupakan jenis senyawa yang toksik (Rachmawati

et al, 2011). Selain itu pada pengujian toksisitas ini menggunakan dosis tinggi yaitu

5000 mg/kgbb, sebagaimana diketahui bahwa dosis merupakan hal utama yang

menentukan apakah suatu senyawa bersifat racun atau tidak (Rasyid et al, 2011).

Meskipun demikian, hasil analisis statistik menggunakan Uji ANOVA pada

histopatologi kedua organ ini menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang

bermakna (p ≥ 0,05). Dengan hasil analisis ini dapat menjelaskan bahwa pemberian

gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis tidak mempengaruhi histopatologi

organ hati dan ginjal tikus.

Beberapa penelitian yang mengamati organ hati dan ginjal terhadap

pemberian gelatin pernah dilakukan walaupun bukan merupakan gelatin sapi.

Pengaruh dari gelatin ayam dengan dosis 5000mg/kgbb terhadap organ hati dan ginjal

pada penelitian Utomo (2015) ditemukan pula kerusakan pada organ hati dan ginjal

dimana terjadi kerusakan hati yang sama, yaitu degenrasi sel. Selain itu, Rachmawati

et al (2011) yang menguji toksisitas gelatin kulit ikan patin siam (Pangasius

hypophthalmus) juga menemukan adanya kerusakan pada organ hati hewan uji yaitu

terjadinya degenerasi sel walaupun kerusakan kedua organ tersebut juga

menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang bermakna (p ≥ 0,05) dari

pemberian gelatin terhadap histopatologi organ hati dan ginjal.

Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa pemberian sampel gelatin sapi

dengan dua golongan tidak memiliki perbedaan dalam beberapa parameter yang

diamati. Kedua golongan gelatin sapi tersebut memiliki nilai LD50 > 5000 mg/kgb

sehingga masuk dalam kategori 5, perubahan bobot badan yang mengalami kenaikan,

46

tidak adanya tanda-tanda toksisitas yang muncul, serta histopatologi organ hati dan

ginjal dengan perbedaan yang tidak bermakna.

Jika dilihat dari hasil penelitian di atas, pemberian gelatin sapi golongan

farmasetik dan pro analisis tidak memiliki perbedaan secara bermakna. Secara teori,

gelatin sapi golongan pro analisis memang bukan dimaksudkan untuk tujuan

konsumsi, namun gelatin sapi golongan ini digunakan untuk kultur sel pada analisis

di tingkat biomolekul (IACUC, 2015). Selain itu, perbedaan golongan dari kedua

gelatin ini yaitu tingkat kemurniannya, dimana golongan pro analisis memiliki

kemurnian yang lebih tinggi sehingga diduga bahwa pada proses ekstraksi gelatin

tidak terlalu memperhatikan profil keamanannya jika dibandingkan dengan gelatin

sapi golongan farmasetik.

47

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat diambil beberapa

kesimpulan, diantaranya :

1. Nilai LD50 yang didapat dari hasil uji toksisitas akut gelatin sapi golongan

farmasetik maupun pro analisis memiliki nilai lebih besar dari 5000

mg/kgbb sehingga kedua golongan ini merupakan senyawa yang tidak

toksik

2. Pengamatan tanda-tanda toksisitas yang dilakukan pada tikus yang

diberikan gelatin sapi golongan farmasetik maupun pro analisis terlihat

normal jika dibandingkan dengan sebelum pemberian dan tikus kontrol

3. Secara mikroskopis, kerusakan histopatologi organ hati dan ginjal tikus

betina pada pemberian gelatin sapi golongan farmasetik dan pro analisis

tidak memiliki perbedaan yang bermakna terhadap kelompok kontrol (p ≥

0,05).

5.2. Saran

Perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai uji toksisitas yang dilakukan

pada hewan uji jantan dan betina. Selain itu perlu dilakukan uji toksisitas subkronik

dan kronik untuk mengetahui pengaruh penggunaan dalam jangka waktu yang lama

terhadap perubahan bobot badan, tingkah laku, dan kerusakan pada organ sasaran

dengan pemberian Gelatin Sapi.

48

DAFTAR PUSTAKA

Amacher, Dav id E. 1998. Serum Transaminase Elevations as Indicators of Hepatic

Injury Following the Administration of Drugs. Drug Safety Evaluation, Pfizer

Central Research, Groton, Connecticut 06340. REGULATORY

TOXICOLOGY AND PHARMACOLOGY 27, 119–130

Andreas, Trianto dan Ilmiwan. 2015. Gambaran Histologi Regenerasi Hati Pasca

Penghentian Pajanan Monosodium Glutamat pada Tikus Wistar. Fakultas

Kedokteran Universitas Tanjungpura.Vol. 3, No. 1, Hal 2

Botham, Philip A. 2003. Acute Systemic Toxicity- prospect for tiered testing

strategies. Toxicology in Vitro 18. 227-230

BPOM RI. 2014. Peraturan Kepala dan Badan Pengawas Obat dan Makanan

Republik Indonesia Nomor 7 Tahun 2014. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan

Makanan, 20-31

Carol, S.A. Acute, Subchronic and Chronic Toxicology. In CRC Handbook of

Toxicology; Michael, J.D., Mannfred, A.H., Eds.; CRC Press Inc.: Boca

Raton, FL, USA, 1995; pp. 51-104.

Dellman. 1992. Buku Teks Histologi Veteriner Edisi III. Terj dari Text Book of

Hystology Veteriner oleh Hartono. Jakarta : UIN Press, 411-445

Erkekoglu, Giray, dan Basaran . 2011. 3R Principle and Alternative Toxicity Testing

Methods. FABAD Journal of Pharmaceutical Science, Vol 36, pp. 101-117

Europian Comission. 2011. Notices From Europian Union Institutions, Bodies,

Offices and Agencies. Official Journal of the European Union, pp 5-6

GMIA. 2012. Gelatin Manufacturers Institute of America . America, pp 6-19

49

Guyton, A.C., Hall, J.E. (1997). Buku ajar fisiologi kedoteran edisi ke-9. Jakarta:

Penerbit Buku Kedokteran EGC., 156-168, 244-260

Hastuti et al. 2007. Pengenalan dan Proses Pembuatan Gelatin. MEDIAGRO. Vol 3

No 1. Suhenry, Sri, dkk. 2015. Proses Pembuatan Gelatin dari Kulit Kepala

Sapi dengan Proses Hidrolisis Menggunakan Katalis HCl. Program Studi

Teknik Kimia, FTI, UPN “Veteran” Yogyakarta. Hal 4-6

Hau dan Hoosier. 2003. Handbook of Laboratory Animal Science. Second Edition.

Volume 2. United States of America : CRC Press

IACUC . 2015.Animals Use of Pharmaceutical & Non- Pharmaceutical Grades

Subtances in Animal. Duke University & Duke University Medical Center

Animal Care & Use Program Policy. Pp 1-3

Jothy et al. 2011. Acute Oral Toxicity of Methanolic Seed Extract of Cassia fistula in

Mice. www.mdpi.com/journal/molecules. ISSN 1420-3049, pp 5268-5282

Kamal et al. 2012. Acute Toxicity Study of Standardized Mitragyna speciosa Korth

Aqueous Extract in Sprague Dawley Rats. Journal of Plant Studies; Vol. 1,

No. 2; 2012 ISSN 1927-0461, pp 120-129

Kimani et al. 2014. Safety of Prosopis juliflora (Sw.) DC.(Fabaceae) and Entada

leptostachya Harms (Leguminosae) Extract Mixtures Using Wistar Albino

Rats. British Journal of Pharmaceutical Research. 4(21): 2475-2483, 2014

ISSN: 2231-2919

Krinke, G.J. 2000. The Laboratory Rat. San Diego, CA:Academic Press. Hal:150-152

Leehey et al. 2008. Glomerular Renin Angiotensin System in Streptozotocin Diabetic

and Zucker Diabetic Fatty Rats. Translational Research. Volume 151, No. 4,

pp 208-215

50

Lehninger. 1990. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Penerbit Erlangga, Jakarta. Hal. 178 –

183.

Lipnick, et al. 1995. Comparison oh the Up and Down, Conventional LD50, and

Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures.Fd Chem Toxic.Vol.33, No.3 pp.223-

231

Loomis dan Hayes. 1996. Loomis's Essentials of Toxicology .Fourth Edition. London

: Academic Press, Inc

Mansuroh, Farichah. 2013. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Kulit Akar Ginseng

Kuning (Rennellia elliptica Korth.) terhadap Mencit (Mus musculus). Skripsi.

FKIK : Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Marone et al. 2010. Safety and toxicological evaluation of undenatured type II

collagen. Toxicology Mechanisms and Methods, 2010; 20(4): 175–189

Ningrum, Sri Rahayu Widya. 2012. Validasi Uji Toksisitas Akut Metode

Organization For Economic Cooperation And Development (OECD) 425

Pada Mencit Betina Menggunakan Tembaga (Ii) Sulfat Pentahidrat. Skripsi.

FMIPA: Universitas Indonesia

Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). (1987). OECD

Guidelines for Testing of Chemicals. Test No. 401: Acute Oral Toxicity.

Paris: OECD, 1 -6.

Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). (2001c) OECD

Guidelines for Testing of Chemicals. Test No. 423: Acute Oral Toxcity—

Acute Toxic Class Method. Paris: OECD, 3-6.

Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). (2001a). OECD

Guidelines for Testing of Chemicals. Test No. 425: Acute Oral Toxicity: Up-

and-Down Procedure. (http://lysander.sourceoecd.org/). Paris: OECD, 1-26.

51

Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). (2001b) OECD

Guidelines for Testing of Chemicals. Test No. 420: Acute Oral Toxicity:

Fixed Dose Procedure. Paris: OECD, 4-8.

Osterberg, NA. 2003. Toxicity of Excipients—a Food and Drug Administration.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14555410 (diakses pada 20 Januari)

Pokharkar et al. 2009. Acute and Subacute Toxicity Studies of Chitosan Reduced

Gold Nanoparticles: A Novel Carrier for Therapeutic Agents. Journal of

Biomedical Nanotechnology Vol.5, 1–7, 2009

Quantaniah, Noreina, dan Syakinah. 2013. Selecting Halal Food : A Comparative

Study Of The Muslim And Non Muslim Malaysian Student Consumer.

Malaysia : Faculty of Technology Management and Busines, Universiti Tun

Hussein Onn

Rachmawati et al. 2011. Toksisitas Subkronik Gelatin Kulit Ikan Patin Siam

(Pangadius hypophthalmus) terhadap Mencit (Mus musculus). Jurnal

Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan Vol. 6 No. 1, Juni

2011, hal 81-90

Rasyid, M., Usmar, dan Subehan. 2011. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol

Lempuyang Wangi (Zingiber aromaticum Val.) pada Mencit. Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar.

Rowe, Sheskey dan Quinn . 2006. Handbook of Pharmaceutical Excipients fifth

edition. Great Britain : Butler & Tanner, Frome, Somerset, pp 295-298

Rowe, Sheskey dan Quinn . 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients sixth

edition. Great Britain : Butler & Tanner, Frome, Somerset, pp 278-281

52

Sabbani, Ramesh dan Shobharani. 2015. Acute Oral Toxicity Studies of Ethanol Leaf

Extract of Derris Scandens & Pulicaria Wightiana in Albino Rats.

International Journal of Pharmacological Research. ISSN : 2277-3312

Sass, Neil. 2000. Humane Endpoints and Acute Toxicity Testing. ILAR Journal

Volume 41, Number 2. 114-123

Sengupta, Pallav. 2013. The Laboratory Rat: Relating Its Age with Human’s.

International Journal of Preventive Medicine, Vol 4, No 6. Hal 624-630

Tatukude, Loho dan Lintong. 2014. Gambaran histopatologi Hati Tikus Wistar yang

Diberikan Boraks. Jurnal e-Biomedik (eBM), Volume 2, Nomor 3, pp 6

Tortora GL. Principles of Human Anatomy. Ed ke-10. USA: John Wiley & Sons, Inc

U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration.

2005. Guidance for Industry Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of

Pharmaceutical Excipients. United States

United Nations.2011. Globally Harmonized System of Classification and Labelling of

Chemicals. Fourth revised edition. New York dan Geneva:United Nation, 279

Utomo, Budi. 2015. Pengaruh Pemberian Gelatin Tulang Ayam terhadap Gambaran

Makroskopis Hati dan Ginjal Mencit. Skripsi Fakultas Peternakan :

Universitas Hasanuddin

Westat. (2001). Acute oral toxicity software program; AOT425StatPgm;

AOT425StatPgm Program User’s Manual; and Simulation Results for the

AOT425StatPgm Program. 12 Februari 2012.

Whishaw, Haun dan Kolb. 1999. Analysis of Behavior in Laboratory Rodents. dalam

: Modern Techniques in Neuroscience Research. Canada : University of

Lethbridge, Department of Psychology, . Chapter 44. 1243-1275

53

Zmarowski, Amy, et al., 2013. Differential Performance of Wistar Han and Sprague

Dawley Rats in Behavioral Tests: Differences in Baseline Behavior and

Reactivity to Positive Control Agents. WIL Research Europe, B.V., ’s-

Hertogenbosch, The Netherlands

54

Lampiran 1. Surat Keterangan Sehat Hewan Uji

55

Lampiran 2. Surat Keterangan Lolos Kaji Etik

56

Lampiran 3. Sertifikat Gelatin Sapi Golongan Farmasetik

57

Lampiran 4. Sertifikat Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis

58

Lampiran 5. Alur kerja

1. Penyiapan Bahan Uji

2. Uji Toksisitas

Limit Test

750 mg gelatin ditimbang

Dilarutkan dalam 4 ml Aquades padasuhu diatas 60o C

Larutan gelatin didinginkan hingga

suhu 30o C dandiberikan kepadahewan uji padasuhu tersebut

Sebelum pemberiandosis, tikus

diaklimatisasiselama 10 hari dan

dipuasakansemalaman

4 ml larutan gelatin diadministrasikanke satu hewan uji

secara oral

Amati tandatoksisitas pada tikus

tiap 30 menitselama 4 jam

Amati kematianselama 2 hari

Tikus pertama hidup, maka 2 tikus

lainnya diberiperlakuan yang

sama

Setelah diamati selama 14 hari,

ketiga tikus tetap hidup

Maka, limit test dihentikan dan tidak dilakukan main test

Dapat disimpulkan bahwa nilai LD50 ≥

5000 mg/kgbb

59

Lampiran 6. Rancangan Uji

Kelompok Jumlah

Tikus

Perlakuan Lama

Pemberian

Parameter Pengamatan

Sebelum Uji Uji Setelah Uji

Limit Test

I (Kontrol) 2

Dipuasakan selama 12 jam (tidak

diberi makan, namun tetap diberi

minum)

Tikus diberikan aquades

sebanyak ±4ml Dipuasakan selama 4 jam

setelah pemberian (tetap

diberikan minum)

1 hari

i. Tanda dan gejala toksisitas

(kulit dan bulu, mata, konvulsi,

tremor dan mati)

ii. Pengamatan organ hati II (Dosis

5000

mg/kgBB)

1 Tikus diberikan larutan

gelatin sapi dengan

dosis 5000mg/kgBB

Jika tikus uji tetap hidup setelah 48 jam pemberian larutan gelatin sapi, maka limit test dilanjutkan ke termin kedua dengan memberikan larutan gelatin sapi pada 2 ekor tikus uji

lainnya (perlakuan sebelum dan sesudah uji sama dengan tikus uji pertama). Sedangkan, jika tikus uji mati pada termin pertama limit test, maka harus dilakukan main test.

Jika hasil uji termin kedua menunjukkan tidak ada tikus uji yang mati, maka nilai LD50 >5000 mg/kg BB. Sedangkan, jika hasil uji termin kedua menunjukkan adanya kematian

pada salah satu tikus uji, maka diperlukan limit test termin ketiga.

Apabila hasil dari ketiga termin limit test menunjukkan adanya kematian hanya pada 2 ekor tikus, maka limit test dapat dihentikan dan disimpulkan bahwa nilai LD50 gelatin

sapi adalah >5000 mg/kgbb. Sedangkan jika terdapat lebih dari 2 tikus yang mati, maka pengujian harus dilanjutkan ke main test (OECD, 2008).

Main Test

Dosis yang diberikan pada uji utama adalah 55, 175, 550, 1750 dan 5000 mg/kgBB. Pemberian dosis dilakukan secara bertahap dan menggunakan tikus yang berbeda untuk

masing-masing dosis

I (Kontrol) 2

Dipuasakan selama 12 jam (tidak

diberi makan, namun tetap diberi

minum)

Tikus diberikan aquades

sebanyak ±4ml Dipuasakan selama 4 jam

setelah pemberian (tetap

diberikan minum)

1 hari

i. Tanda dan gejala toksisitas (kulit

dan bulu, mata, letargi, konvulsi,

tremor, diare dan mati)

ii. Pengamatan organ hati II (Dosis

awal 175

mg/kgBB)

1 Tikus diberikan larutan

gelatin sapi sebanyak

175mg/kgBB

Jika setelah 48 jam tikus uji bertahan hidup, maka pemberian dosis berikutnya ditingkatkan (550 mg/kgBB)

Jika setelah 48 jam tikus uji mati, maka pemberian dosis berikutnya diturunkan (55 mg/kgBB)

Uji utama dihentikan hingga uji memenuhi salah satu kriteria:

a. 3 hewan berturut-turut bertahan di atas batas dosis;

b. 5 pembalikan (reverse) terjadi pada setiap 6 hewan yang diuji berturut-turut;

c. Sedikitnya terdapat 4 hewan telah mengalami pembalikan pertama.

60

Lampiran 7. Perhitungan Dosis

Limit Test (5000 mg/kg bb)

4𝑚𝑙 =5000 (

𝑚𝑔𝑘𝑔𝐵𝐵

) 𝑥0,16 (𝑘𝑔)

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 (𝑚𝑔𝑚𝑙

)

𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 = 800𝑚𝑔/4𝑚𝑙

= 200 mg/ml

Larutan gelatin sapi diberikan kepada hewan uji dengan VAO 4 ml. Hal ini

disebabkan kelarutan gelatin sapi dalam aquades adalah 1:5 dan dosis uji yang

digunakan sangat besar. Sehingga 800 mg serbuk gelatin didispersikan dalam

4 ml akuades bersuhu 60o C. Dan konsentrasi zat uji yang diberikan yaitu

sebesar 200 mg/ml.

61

Lampiran 8. Penarikan Kesimpulan Limit Test (OECD, 2008)

Nilai LD50 kurang dari 5000mg/kgbb adalah ketika 3 atau lebih hewan mati hidup

setelah pemberian dosis uji ;

O XO XX

O OX XX

O XX OX

O XX X

Nilai LD50 lebih dari 5000mg/kgbb adalah ketika 3 atau lebih hewan hidup setelah

pemberian dosis uji ;

O OO

O XO XO

O XO O

O OX XO

O OX O

O XX OO

O : hidup

X : mati

62

Lampiran 9. Gambar Kegiatan Penelitian

Gambar Keterangan Gambar Keterangan

Serbuk Gelatin

Sapi Golongan

Farmasetik

Serbuk Gelatin

Sapi Golongan

Pro Analisis

Serbuk gelatin

dilarutkan dengan

aquades bersuhu

60o C

Larutan koloid

Gelatin Sapi

Golongan

Farmasetik dan Pro

Analisis

Penimbangan

bobot hewan uji

Larutan koloid

gelatin disonde

ke hewan uji

Hewan uji di

kandang

Pada hari ke-15,

dilakukan

terminasi pada

hewan uji

Organ hati, ginjal

kanan dan kiri

Preparat histologi

organ hati dan

ginjal

63

Lampiran 10. Hasil Nilai LD50

1. Nilai LD50 Gelatin Sapi Golongan Farmasetik

64

2. Nilai LD50 Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis

65

Lampiran 11. Data Bobot Tikus

Nama

Tikus

Hari ke-

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

K1 150 158 159 164 164 166 168 170 173 171 175 178 175 175 181

K2 183 202 196 201 206 200 205 210 210 211 208 216 216 220 220

GF1 150 155 162 162 160 161 162 158 161 164 168 164 164 169 173

GF2 162 162 174 174 176 176 177 178 181 180 180 182 182 181 189

GF3 154 161 158 159 158 163 163 162 163 165 160 166 168 168 168

PA1 184 182 179 181 185 185 183 182 187 188 191 191 194 195 196

PA2 177 165 174 179 175 176 178 179 181 183 187 184 183 186 186

PA3 168 163 170 172 171 173 179 177 177 181 186 182 182 182 184

Kelompok Rerata bobot tikus (gram)

Rerata bobot ±

SD

Kontrol 1 168,46 187,7 ± 27,20

Kontrol 2 206,93

GF 1 162,2

167,17 ± 8,44 GF 2 176,93

GF 3 162,4

PA 1 186,86

180,95 ± 5,34 PA 2 179,53

PA 3 176,46

66

Lampiran 12. Analisa Data Bobot Tikus

1. Uji Normalitas Kolmogrov-Smirnov

Tujuan : Untuk melihat distribusi data bobot tikus

Hipotesis : Ho : Data bobot tikus terdistribusi normal

Ha : Data bobot tikus tidak terdistribusi normal

Pengambilan Keputusan :

Jika nilai signifikansi ≥ 0,05 maka Ho diterima

Jika nilai signifikansi ≤ 0,05 maka Ho ditolak

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Hari_0 Hari_1 Hari_2 Hari_3 Hari_4 Hari_5 Hari_6 Hari_7 Hari_8 Hari_9 Hari_10 Hari_11 Hari_12 Hari_13 Hari_14

N 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

Normal Parametersa,b

Mean 166.0000 168.5000 171.5000 174.0000 174.3750 175.0000 176.8750 177.0000 179.1250 180.3750 181.8750 182.8750 183.0000 184.5000 187.1250

Std.

Deviation

14.19255 15.75708 12.53566 13.50132 15.62907 12.82854 13.76785 15.82945 15.36636 15.09908 14.78839 16.17262 16.30951 16.87771 15.93233

Most Extreme Differences

Absolute .176 .338 .171 .177 .209 .219 .203 .251 .201 .182 .144 .222 .250 .215 .203

Positive .176 .338 .171 .177 .209 .219 .203 .251 .201 .182 .144 .222 .250 .215 .203

Negative -.156 -.196 -.141 -.133 -.147 -.138 -.140 -.125 -.119 -.139 -.110 -.132 -.122 -.164 -.115

Kolmogorov-Smirnov Z .498 .956 .484 .501 .590 .619 .575 .710 .570 .514 .406 .629 .707 .607 .575

Asymp. Sig. (2-tailed) .965 .321 .974 .963 .877 .838 .896 .694 .902 .954 .997 .824 .699 .855 .896

a. Test distribution is Normal.

b. Calculated from data.

Keputusan : Uji normalitas bobot tikus terdistribusi dengan normal (p≥0,05)

67

2. Uji Homogenitas Levene

Tujuan : Untuk melihat data bobot tikus homogen atau tidak

Hipotesis Ho : Data bobot tikus homogen

Ho : Data bobot tikus tidak homogen

Pengambilan Keputusan :

Jika nilai signifikansi ≥ 0,05 maka Ho diterima

Jika nilai signifikansi ≤ 0,05 maka Ho ditolak

Test of Homogeneity of Variances

Levene

Statistic

df1 df2 Sig.

Hari_0 9.723 2 5 .019

Hari_1 37.995 2 5 .001

Hari_2 22.077 2 5 .003

Hari_3 29.447 2 5 .002

Hari_4 19.323 2 5 .004

Hari_5 17.468 2 5 .006

Hari_6 46.394 2 5 .001

Hari_7 28.463 2 5 .002

Hari_8 16.286 2 5 .006

Hari_9 40.752 2 5 .001

Hari_10 11.951 2 5 .012

Hari_11 24.473 2 5 .003

Hari_12 21.240 2 5 .004

Hari_13 38.610 2 5 .001

Hari_14 13.726 2 5 .009

Keputusan : Karena terdapat (p≤0,05) maka dapat disimpulkan bahwa data bobot

tikus tidak homogen, maka uji homogenitas bobot tikus dari hari ke-0 sampai hari ke-

14 dilanjutkan dengan uji Kruskal Wallis

68

3. Uji Kruskal Wallis terhadap bobot tikus

Tujuan : Mengetahui ada atau tidaknya perbedaan data bobot tikus

Hipotesis Ho : Data bobot tikus tidak berbeda secara bermakna

H1 : Data bobot tikus berbeda secara bermakna

Pengambilan Keputusan

Jika nilai signifikansi ≥0,05 maka Ho diterima

Jika nilai signifikansi ≤0,05 maka Ho ditolak

Test Statisticsa,b

Hari_0 Hari_1 Hari_2 Hari_3 Hari_4 Hari_5 Hari_6 Hari_7 Hari_8 Hari_9 Hari_10 Hari_11 Hari_12 Hari_13 Hari_14

Chi-Square 3.128 2.889 1.490 2.694 1.806 2.249 3.806 2.694 2.249 3.806 3.806 3.261 3.261 3.806 1.806

Df 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Asymp. Sig. .209 .236 .475 .260 .405 .325 .149 .260 .325 .149 .149 .196 .196 .149 .405

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: Perlakuan

Keputusan : Data bobot tikus kelompok uji dan kelompok kontrol tidak berbeda secara bermakna (p≥0,05)

69

Lampiran 13. Tanda-tanda Toksisistas

Keterangan:

K1,2: Kontrol 1,2 T1,2,3 : Tikus Uji Sampel Gelatin Sapi Golongan Farmasetik

N: Normal, (-): Tidak terjadi T4,5,6 : Tikus Uji Sampel Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis

Pengamatan 30 menit 4 jam 24 jam

K1 K2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 K1 K2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 K1 K2 T1 T2 T3 T4 T5 T6

Piloereksi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Konvulsi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Tremor - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Nyeri - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Mata

(grooming) N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Refleks Daun

Telinga N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Salivasi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Lakrimasi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Hiperaktivitas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Mortalitas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Pengamatan 48 jam 1 Minggu 2 Minggu

K1 K2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 K1 K2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 K1 K2 T1 T2 T3 T4 T5 T6

Piloereksi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Konvulsi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Tremor - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Nyeri - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Mata

(grooming) N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Refleks Daun

Telinga N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Salivasi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Lakrimasi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Hiperaktivitas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Mortalitas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

70

Keterangan :

Piloereksi Bulu hewan terlihat keras atau tegak sebagian

Konvulsi Otot-otot hewan mungkin kaku aau lembek. Hal ini berlangsung selama beberapa

detik atau mungkin lebih lama. Jika kejang berlangsung selama lebih dari satu

menit dan diulangi selama 5 kali sehari, maka hewan harus dibunuh

Tremor Hewan dapat menunjukkan otot berkedut atau gerakan kulit yang cepat

Nyeri Tikus yang nyeri akan menyipitkan bagian orbital, melipat daun telinga ke bagian

dalam dan menjauhkan kumisnya dari wajah

Mata (grooming) Hewan akan mengeluarkan cairan berwana merah yang keluar di dekat matanya.

Secara normal, hewan akan melakukan perawatan diri (grooming) dengan cairan

ini.

Refleks daun

telinga

Dengan mencubit daun telinga biasanya hewan akan mengguncang kepalanya. Jika

tidak ada reflex maka adanya ketidaknormalan

Salivasi Salivasi yang berlebhan atau abnormal ditandai dengan kegagalan untuk menelan

merupakan respon terhadap paparan zat uji.

Lakrimasi Merupakan peningkatan produksi air mata pada tikus. Cairan merah yang keluar

dari matanya mengindikasikan tikus mengalami stress.

Hiperaktivitas Merupakan reaksi yang berlebihan akibat adanya sentuhan atau suara. Bisa terjadi

akibat ketakutan berlebih atau perubahan neuronal

Mortalitas Tahapan kematian pada tikus memiliki beberapa ciri :

- Kematian yang diprediksi bias dilihat saat pengamatan berlangsung yaitu

kondisi ketika tikus tidak mampu mencapai air minum dan makanan

- Kondisi hampir mati adalah jika muncul tanda-tanda indikatif seperti

kejang-kejang, penyerahan diri, dan tremor.

- Moribound atau sekarat merupakan ketidakmampuan tikus untuk

bertahan hidup walaupun sudah dirawat.

71

Lampiran 14. Histopatologi Organ Hati

No Gambar Histopatologi Keterangan

1.

Hati kontrol (1) perbesaran 400x

: Vena sentralis

: Sel hepatosit

normal

Jaringan Normal

2.

Hati kontrol (2) perbesaran 400x

: Vena sentralis

: Sel hepatosit

normal

Jaringan Normal

3.

Hati Gelatin Sapi GF (1) perbesaran 400x

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

72

4.

Hati Gelatin Sapi GF (2) perbesaran 400x

: terjadi

perlemakan

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

5.

Hati Gelatin Sapi GF (3) perbesaran 400x

: terjadi

perlemakan

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

6.

Hati Gelatin Sapi PA (1) perbesaran 400x

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

73

7.

Hati Gelatin Sapi PA (2) perbesaran 400x

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

8.

Hati Gelatin PA (3) perbesaran 400x

: Pelebaran asinus

(degenerasi sel)

74

Lampiran 15. Skoring Histopatologi Organ Hati

Sampe

l

LP 1 LP 2 LP 3 LP 4 LP 5 LP 6 LP 7 LP 8 LP 9 LP 10 Rata-rata

GELATIN SAPI GOLONGAN FARMASETIK

GF1 3 2 2 2 2 1 2 1 0 2 1,7

GF2 1 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1,3

GF3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2

Rata-rata Skor Gelatin Sapi Golongan Farmasetik 1,06

GELATIN SAPI GOLONGAN PRO ANALISIS

PA1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1

PA2 0 2 1 2 0 2 2 2 2 2 1,5

PA3 2 2 2 2 2 2 1 2 1 1 1,7

Rata-rata Skor Gelatin Sapi Golongan Pro Analisis 1,1

GELATIN SAPI KONTROL

K1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0,3

K2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0

Rata-rata Skor Kontrol 0,15

LP : lapang pandang

Skoring : 0 : sel tampak normal

1 : ditemukan degenerasi atau nekrosis terfokus di satu tempat

2 : ditemukan degenerasi atau nekrosis terfokus di beberapa tempat

3 : ditemukan degenerasi atau nekrosis terfokus di seluruh tempat

No Perlakuan Rerata Skoring Hati

1. Kontrol (Akuades) 1,066 ± 0,776

2. Gelatin Sapi Golongan Farmasetik 1,100 ± 0,871

3. Gelatin Sapi Pro Analisis 0,150 ± 0,212

75

Lampiran 16. Analisis Skoring Histopatologi Organ Hati

1. Uji Normalitas terhadap skoring histopatologi organ hati

Tujuan : untuk melihat data skoring histopatologi organ hati terdistribusi

normal atau tidak

Hipotesis :

Ho = Data skoring histopatologi organ hati terdistribusi normal

Ha = Data skoring histopatologi organ hati tidak terdistribusi normal

Pengambilan Kesimpulan : Ho diterima jika nilai signifikan ≥ 0,05

Ho ditolak jika nilai signifikan ≤ 0,05

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Skoring

N 8

Normal Parametersa Mean 8.5000

Std. Deviation 7.63451

Most Extreme

Differences

Absolute .264

Positive .264

Negative -.222

Kolmogorov-Smirnov Z .748

Asymp. Sig. (2-tailed) .631

a. Test distribution is Normal.

Keputusan : Uji normalitas skoring histopatologi organ hati terdistribusi

dengan normal (p≥0,05)

76

2. Uji Homogenitas Levene terhadap skoring histopatologi organ hati

Tujuan : Untuk melihat data skoring histopatologi organ hati terdistribusi secara

homogen atau tidak

Hipotesis Ho : Data skoring histopatologi hati terdistribusi homogen

Ha : Data skoring histopatologi hati terdistribusi tidak homogen

Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi ≥ 0,05 maka Ho diterima

Jika nilai signifikansi ≤ 0,05 maka Ho ditolak

Test of Homogeneity of Variances

Skoring

Levene Statistic df1 df2 Sig.

2.210 2 5 .205

Keputusan : Data skoring histopatologi organ hati terdistribusi secara

homogen (p ≥ 0,05)

77

3. Uji ANOVA

Tujuan : untuk menentukan ada tidaknya perbedaan pada histopatologi organ hati

tikus pada seluruh kelompok hewan uji

Hipotesis :

Ho : Derajat kerusakan histopatologi hati tikus tidak berbeda secara bermakna

Ha : Derajat kerusakan histopatologi hati tikus berbeda secara bermakna

Pengambilan keputusan : - Jika nilai signifikansi ≥0,05, maka Ho diterima

- Jika nilai signifikansi ≤0,05, maka Ho ditolak

ANOVA

skoring

Sum of Squares Df Mean Square F Sig.

Between Groups 130.833 2 65.417 1.180 .380

Within Groups 277.167 5 55.433

Total 408.000 7

Keputusan : Skoring histopatologi organ hati tikus kelompok uji gelatin sapi

golongan farmasetik dan pro analisis tidak berbeda secara bermakna

dibandingkan terhadap kelompok kontrol (p≥0,05)

78

4. Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) terhadap skoring histopatologi organ hati

Tujuan : Untuk mengetahui letak perbedaan data skoring histopatologi organ hati

Hipotesis Ho: Data skoring histopatologi organ hati tidak memiliki perbedaan

Ha: Data skoring histopatologi organ hati memiliki perbedaan

Pengambilan Keputusan : Ho diterima jika nilai signifikan ≥ 0,05

Ha ditolak jika nilai signifikan ≤ 0,05

Multiple Comparisons

Skoring

LSD

(I) kelompok (J) kelompok

Mean

Difference (I-J)

Std.

Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Kontrol gelatin sapi gf -9.16667 6.79665 .235 -26.6380 8.3047

gelatin sapi pa -9.50000 6.79665 .221 -26.9713 7.9713

gelatin sapi gf Kontrol 9.16667 6.79665 .235 -8.3047 26.6380

gelatin sapi pa -.33333 6.07911 .958 -15.9602 15.2935

gelatin sapi pa Kontrol 9.50000 6.79665 .221 -7.9713 26.9713

gelatin sapi gf .33333 6.07911 .958 -15.2935 15.9602

Keputusan :

- Tidak ada perbedaan yang bermakna antara histopatolgi hati tikus kontrol

dengan tikus uji gelatin sapi golongan farmasetik (p ≥ 0,05)

- Tidak ada perbedaan yang bermakna antara histopatolgi hati tikus kontrol

dengan tikus uji gelatin sapi golongan pro analisis (p ≥ 0,05)

- Tidak ada perbedaan yang bermakna antara histopatolgi hati tikus uji

golongan pro analisis dengan tikus uji gelatin sapi golongan farmasetik

(p ≥ 0,05)

79

Lampiran 17. Gambar Histopatologi Organ Ginjal

No. Gambar Keterangan

1.

Ginjal Kontrol (1) perbesaran 200x

: glomerulus

normal

: tubulus

proksimal normal

2.

Ginjal Kontrol (2) perbesaran 200x

: glomerulus

normal

: tubulus

proksimal normal

3.

Ginjal Gelatin Sapi GF (1) perbesaran 200x

: glomerulus

normal

: tubulus

proksimal normal

80

4.

Ginjal Gelatin Sapi GF (2) perbesaran 200x

: glomerulus

mengkerut (atrofi)

: tubulus

proksimal normal

5.

Ginjal Gelatin Sapi GF (3) perbesaran 200x

: glomerulus

normal

: tubulus

proksimal normal

6.

Ginjal Gelatin Sapi PA (1) perbesaran 200x

: glomerulus

normal

: tubulus

proksimal normal

7.

Ginjal Gelatin Sapi PA (2) perbesaran 200x

: glomerulus

mengkerut (atrofi)

81

8.

Ginjal Gelatin Sapi PA (3) perbesaran 200x

: glomerulus

normal

: tubulus

proksimal normal

82

Lampiran 18. Skoring Histopatologi Organ Ginjal

Glomerulus ke-

GELATIN SAPI

GOLONGAN FARMASETIK

GELATIN SAPI

GOLONGAN PRO

ANALISIS

GELATIN SAPI

KONTROL

PG1 PG2 PG3 PA1 PA2 PA3 K10 K1

1 0 0 0 0 2 0 0 0

2 1 0 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0 0 0

4 0 2 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0 0 0

9 0 0 1 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0 0 0

11 0 0 0 0 2 0 0 0

12 0 1 1 0 0 0 0 0

13 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0

16 0 0 0 0 0 0 0 0

17 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 0 0 0 0

19 0 0 0 0 0 0 0 0

20 0 0 0 0 0 0 0 0

21 0 0 0 0 0 0 0 0

22 0 0 0 0 0 0 0 0

23 0 0 0 0 0 0 0 0

24 0 0 0 0 0 0 0 0

25 0 0 0 0 0 0 0 0

26 0 0 0 0 0 0 0 0

27 0 0 0 0 0 0 0 0

28 0 0 0 0 0 0 0 0

29 0 0 0 0 0 0 0 0

30 0 0 0 0 0 0 0 0

RERATA 0,03 0,10 0,06 0 0,13 0 0 0

RERATA ± SD 0,06 ± 0,03 0,04 ± 0,07 0 ± 0,00

Skoring 0 : glomerulus normal, 1 : pelebaran kapiler dan ekspansi matriks ekstraseluler, 3 : sklerosis

segmental atau global dengan runtuhnya kapiler

83

Lampiran. 19. Analisis Skoring Histopatologi Organ Ginjal

1. Uji Normalitas terhadap skoring histopatologi organ ginjal

Tujuan : untuk melihat data skoring histopatologi organ ginjal terdistribusi

normal atau tidak

Hipotesis : Ho = Data terdistribusi normal

Ha = Data tidak terdistribusi normal

Pengambilan Kesimpulan : Ho diterima jika nilai signifikan p ≥ 0,05

Ho ditolak jika nilai signifikan p ≤ 0,05

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

skoring

N 8

Normal Parametersa Mean 1.2500

Std. Deviation 1.58114

Most Extreme Differences Absolute .285

Positive .285

Negative -.215

Kolmogorov-Smirnov Z .807

Asymp. Sig. (2-tailed) .532

a. Test distribution is Normal.

Keputusan : Data skoring histopatologi organ ginjal terdistribusi secara

normal (p ≥ 0,05)

84

2. Uji Homogenitas terhadap skoring histopatologi organ ginjal

Tujuan : Untuk melihat data skoring histopatologi organ ginjal homogen atau

tidak

Hipotesis Ho : Data bobot tikus homogen

Ha : Data bobot tikus tidak homogen

Pengambilan Keputusan : Jika nilai signifikansi ≥ 0,05 maka Ho diterima

Jika nilai signifikansi ≤ 0,05 maka Ho ditolak

Test of Homogeneity of Variances

Skoring

Levene Statistic df1 df2 Sig.

5.525 2 5 .054

Keputusan : Data skoring histopatologi organ ginjal terdistribusi secara

homogen (p ≥ 0,05)

85

3. Uji ANOVA

Tujuan : untuk menentukan ada tidaknya perbedaan pada histopatologi organ

ginjal tikus pada seluruh kelompok hewan uji

Hipotesis :

Ho : Derajat kerusakan histopatologi ginjal tikus tidak berbeda secara bermakna

Ha : Derajat kerusakan histopatologi ginjal tikus berbeda secara bermakna

Pengambilan keputusan : - Jika nilai signifikansi ≥0,05, maka Ho diterima

- Jika nilai signifikansi ≤0,05, maka Ho ditolak

ANOVA

skoring

Sum of Squares Df Mean Square F Sig.

Between Groups 4.833 2 2.417 .954 .446

Within Groups 12.667 5 2.533

Total 17.500 7

Keputusan : Skoring histopatologi organ ginjal tikus kelompok uji gelatin sapi

golongan farmasetik dan pro analisis tidak berbeda secara bermakna dibandingkan

terhadap kelompok kontrol (p≥0,05)

86

4. Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) terhadap skoring histopatologi organ ginjal

Tujuan : Untuk mengetahui letak perbedaan data skoring histopatologi organ

ginjal

Hipotesis Ho: Data skoring histopatologi organ ginjal tidak memiliki perbedaan

Ha: Data skoring histopatologi organ ginjal memiliki perbedaan

Pengambilan Keputusan : Ho diterima jika nilai signifikan ≥ 0,05

Ha ditolak jika nilai signifikan ≤ 0,05

Multiple Comparisons

Skoring

LSD

(I) kelompok (J) kelompok

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Kontrol gelatin sapi gf -2.00000 1.45297 .227 -5.7350 1.7350

gelatin sapi pa -1.33333 1.45297 .401 -5.0683 2.4016

gelatin sapi gf Kontrol 2.00000 1.45297 .227 -1.7350 5.7350

gelatin sapi pa .66667 1.29957 .630 -2.6740 4.0073

gelatin sapi pa Kontrol 1.33333 1.45297 .401 -2.4016 5.0683

gelatin sapi gf -.66667 1.29957 .630 -4.0073 2.6740

Keputusan :

- Tidak ada perbedaan yang bermakna antara histopatolgi ginjal tikus kontrol

dengan tikus uji gelatin sapi golongan farmasetik (p ≥ 0,05)

- Tidak ada perbedaan yang bermakna antara histopatolgi ginjal tikus kontrol

dengan tikus uji gelatin sapi golongan pro analisis (p ≥ 0,05)

- Tidak ada perbedaan yang bermakna antara histopatolgi ginjal tikus uji

golongan pro analisis dengan tikus uji gelatin sapi golongan farmasetik (p ≥

0,05)