UJI FAGOSITOSIS

1. UJI FAGOSITOSIS IN VITRO

Uji fagositosis in vitro ini dilakukan dengan menggunakan yeast sebagai agen yang

difagosit.

1.1. Tahap pengambilan cairan intraperitoneal

Pengambilan cairan peritoneal kelompok P dilakukan pada hari ke-17, mencit dibius

menggunakan kloroform. Pada area di bawah kulit bagian abdomen disuntikkan salin steril

(NaCl) sebanyak 3 ml, kemudian abdomen mencit di tepuk-tepuk menggunakan gunting

bedah untuk diambil cairan peritoneal dengan menggunakan spuit berukuran 1 ml tanpa

jarum. Cairan peritoneal yang didapat dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Dengan

menggunakan haemositometer, fagosit dihitung hingga mendapatkan 106 fagosit/ml. Cairan

peritoneal dipindah ke Eppendorf kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm

selama 10 menit pada suhu 40C. Setelah disentrifugasi maka supernatan yang diperoleh

dipindahkan dan pelet hasil sentrifugasi diresuspensi hingga jumlah fagosit mencapai 106/ml.

1.2. Tahap pembuatan suspensi yeast

Pembuatan suspensi yeast dilakukan dengan cara butiran yeast dibiakkan terlebih

dahulu ke dalam 100 ml salin steril pada Erlenmeyer. Untuk mendapatkan yeast sebanyak 109

dilakukan seri pengenceran menggunakan tabung reaksi ukuran 15 ml sebanyak 9 buah dan

diisi 9 ml salin steril.

1.3. Tahap inkubasi

Fagosit yang telah diresuspensi dengan NaCl hingga 106 dan suspensi yeast sebanyak

109 dipindah dalam satu tabung reaksi dan dihomogenkan dengan perbandingan 1:1 yaitu 200

µl fagosit dengan 200 µl suspensi yeast. Kemudian tabung reaksi berisi yeast dan fagosit

diinkubasi di water bath dengan suhu 37ºC selama 30 menit.

1.4. Tahap pembuatan dan pewarnaan preparat apusan fagosit

Untuk membuat sediaan apusan fagosit, cairan hasil inkubasi diteteskan di atas gelas

objek kemudian dismear. Sediaan difiksasi dengan menggunakan karbol fuchsin dan

dikeringanginkan, kemudian objek gelas ditetesi dengan pewarna crystal violet dan

didiamkan selama kurang lebih 30 menit setelah itu obyek gelas dibilas dengan aquadest dan

dikeringanginkan.

1.5. Tahap pengamatan dan penghitungan aktivitas fagositosis

Tahap ini dilakukan dengan cara mengamati preparat apusan sel fagosit di bawah

mikroskop dengan perbesaran 1000x. Aktivitas fagositosis dapat ditetapkan berdasarkan

persentase fagosit yang melakukan fagositosis dari 100 fagosit (Kusmiardi et al., 2006).

2. UJI FAGOSITOSIS IN VIVO

Uji fagositosis in vitro ini dilakukan dengan menggunakan suspensi bakteri Escherechia

coli sebagai agen yang difagosit.

2.1. Tahap Penyiapan Suspensi Escherichia coli

Penyiapan suspensi E. coli dilakukan dengan mengambil satu ose biakan E. coli dari

agar miring lalu dilarutkan dalam media NB (Nutrient Broth) sebanyak 25 ml, kemudian

diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Setelah itu, biakan ditanam pada media agar

Eosin Methylene Blue (EMB) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam (koloni E. coli

berwarna hijau metalik pada media EMB). Kemudian diambil satu ose dari isolat,

dimasukkan ke dalam larutan fisiologis dan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan

vortex mixer untuk mendapatkan suspensi yang benar-benar homogen. Selanjutnya diukur

dan diencerkan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm, sampai

didapatkan optical density (OD) yang setara dengan jumlah bakteri 109 E. coli / ml.

Tahap Infeksi Escherichia coli pada Hewan Coba

Infeksi bakteri E. coli pada mencit (Mus musculus) dilakukan secara intraperitoneal

pada hari ke-15 dengan cara menginjeksikan 0,1 ml larutan yang berisi 108 E. coli. Tiga hari

kemudian (hari ke-18) dilakukan injeksi ulang E. coli dengan volume dan jumlah yang sama.

Infeksi E. coli dilakukan pada semua kelompok mencit (Mus musculus). Pembagian

kelompok dapat dilihat pada sub bab 3.5.

Tahap Pembuatan Sediaan Apusan Fagosit

Satu jam setelah infeksi E. coli, dilakukan peritoneal lavage dengan cara

menyuntikkan 2,5 ml larutan fisiologis berupa NaCl 0,9% steril secara intraperitoneal,

kemudian mengambil kembali cairan intraperitoneal dengan spet ukuran 3 ml tanpa jarum

melalui sayatan kecil pada otot abdomen.Tahap pembuatan sediaan fagosit dilakukan dengan

cara mengambil dan memindahkan 1 ml cairan intraperitoneal yang diperoleh pada tahap

sebelumnya pada tabung eppendorf, kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm

selama 10 menit pada suhu 4ºC. Pellet hasil sentrifus diresuspensi, lalu di apus pada object

glass. Apusan cairan peritoneal tersebut dikeringanginkan pada suhu kamar, setelah itu

difiksasi dengan etanol. Langkah selanjutnya, preparat apusan tersebut diwarnai dengan

pewarna kristal violet selama 5-10 menit, kemudian dicuci dengan akuades masak untuk

mengendapkan mineral.

3.3.7 Tahap Pengamatan dan Penghitungan Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis

Tahap pengamatan preparat apusan makrofag dan penghitungan aktivitas dan

kapasitas fagositosis dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. Aktivitas

fagositosis adalah jumlah fagosit yang aktif memfagosit sel bakteri dalam 100 fagosit yang

dinyatakan dalam persen. Sedangkan kapasitas fagositosis merupakan jumlah sel bakteri yang

difagositosis oleh 50 fagosit (Wagner dan Jurcic, 1991 dalam Wulansari et al. 2009).

PENGAMBILAN WHOLE BLOOD DAN KOLEKSI SERUM

Pengambilan darah dan koleksi serum

Pengambilan serum darah kelompok P dilakukan pada hari ke-17. Mencit setelah

dianestesi hingga beberapa saat sampai mencit tidak sadar tetapi tidak sampai mati. Mencit

kemudian dilakukan sedikit pembedahan pada bagian kulit area tulang rusuk dan dilakukan

pengambilan sampel darah melalui intrakardiak menggunakan spuit 3 mL dan jarum 26G x

½” kira-kira sebanyak 0,5 mL. Sampel darah yang diperoleh dipindahkan secara berhati-hati

pada tabung sentrifugasi ukuran 15 mL dan diletakkan dengan kemiringan ±15° kemudian

tunggu hingga terjadi koagulasi dengan perkiraan waktu 1-2 jam. Serum dipindahkan ke

tabung Eppendorf dan sisa padatan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit kemudian

serum yang diperoleh dipindahkan ke tabung Eppendorf. Serum yang diperoleh kemudian

disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC dan disimpan dalam medical freezer

suhu -20 oC hingga dilakukan uji kadar IL-12 serum.