uji aktivitas penangkapan radikal … kimia khususnya reaksi redoks yang sangat rumit. 8. semua...
TRANSCRIPT
i
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOLIK
ALGA COKLAT Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Lina
NIM: 058114093
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2008
ii
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOLIK
ALGA COKLAT Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Lina
NIM: 058114093
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2008
iii
iv
v
Jangan ingatkan diri pada ketakutan Anda, tetap ingatlah harapan dan impian Anda.
Jangan pikirkan frustasi Anda, tetapi pikirkan potensi yang belum Anda penuhi.
Jangan khawatirkan diri Anda sendiri dengan apa yang telah Anda coba tapi gagal,
tapi dengan apa yang masih mungkin Anda lakukan (Paus Yohanes XXIII).
Karya ini kupersembahkan kepada:
Tuhan Yesus Kristus, sumber segala kasih karunia sekarang dan selamanya!!
Papa,Mama,Koko dan semua keluarga ku,
Teman-temanku
Almamaterku
vi
vii
PRAKATA
Syukur kepada Allah Tuhan kita Yesus Kristus atas rahmat-Nya yang besar
sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang
berjudul “Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat
Ekstrak Metanolik Alga Coklat Sargassum hystrix v. Buxifolium (Chauvin) J. Agardh
dengan Metode Deoksiribosa”. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat
untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) pada Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam penulisan skripsi ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dari
berbagai pihak berupa material, bimbingan, dorongan, nasehat maupun sarana dan
prasarana. Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih
kepada:
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Dra. Nora Iska H., M.Si., Apt. selaku dosen pengampu proyek atas segala
bantuan material dan pengarahan yang telah diberikan.
3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang
telah memberikan bimbingan dan saran dari awal hingga teselesaikannya
skripsi.
4. Dewi Setyaningsih, M.Sc., Apt selaku dosen penguji yang telah
memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi
viii
5. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan
masukan dan saran dalam penyusunan skripsi
6. Ign.Y. Kristio Budiasmoro, M.Si. atas waktu yang diberikan untuk
membimbing penulis saat mengalami kesulitan dalam penelitian.
7. Dr. Sabikis, Apt. sebagai guru yang memberikan banyak ilmu tentang
reaksi-reaksi kimia khususnya reaksi redoks yang sangat rumit.
8. Semua dosen-dosen yang telah memberikan ilmu selama penulis
menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma, Yogyakarta.
9. Papa, mama, koko, tante dan semua keluarga yang telah memberikan
dukungan material maupun spiritual selama kehidupan penulis.
10. Felisia sebagai rekan kerja dalam penelitian, Siska, Alfa, dan Nia atas
waktu, kesabaran, dan dukungan yang diberikan dalam suka dan duka.
11. Teman-teman kos “Zusi Arib”, Mbak Mitha, Mbak Ntrie, Mbak Cici,
Mbak Evi, Madum, Kasis, Thea, Ina, Mukti, Pipi, Iles, Dona dan Jela atas
kebersamaan selama ini.
12. Teman-teman kelas B, khususnya Melda, Lise dan Lina Boy atas
persahabatan yang terjalin saat perkuliahan.
13. Teman-teman kelompok praktikum E, khususnya Rias, Yoke, Eva, Ong,
Rio, Ilon, dan Tyas atas kekompakan dan kerja sama selama perkuliahan
dan praktikum.
ix
14. Pak Parlan, Pak Prapto dan segenap staf karyawan serta laboran atas
segala bantuan dan kerja samanya selama penulis menempuh perkuliahan
dan melakukan penelitian.
15. Rekan-rekan seperjuangan laboratorium, Ko Robby, Fian, Yoyok, David,
Adryan, Happy atas keceriaan yang diberikan saat penelitian berlangsung.
16. Semua pihak dan teman-teman yang telah memberikan bantuan dan
dukungan yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
Akhir kata, penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari
sempurna. Atas keterbatasan dan kekurangan dalam penyusunannya, penulis
mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini.
Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca serta perkembangan ilmu
pengetahuan.
Yogyakarta, November 2008
Penulis
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL…………………..………….………......................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………....……................................. iii
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………………….iv
HALAMAN PERSEMBAHAN………………………..….………............................v
PRAKATA.................................................................................................................. vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................................... ix
DAFTAR ISI................................................................................................................ x
DAFTAR TABEL…................................................................................................. xiv
DAFTAR GAMBAR....................................................................………...………....xv
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................. xvi
INTISARI................................................................................................................. xvii
ABSTRACT.............................................................................................................. xviii
BAB I PENGANTAR.................................................................................................. 1
A. Latar Belakang .................................................................................................. 1
B. Perumusan Masalah........................................................................................... 3
C. Keaslian Karya................................................................................................... 3
D. Manfaat Penelitian ............................................................................................ 5
1. Manfaat teoritis ............................................................................................ 5
2. Manfaat metodologis.................................................................................... 5
xi
3. Manfaat praktis ............................................................................................ 5
E. Tujuan Penelitian .............................................................................................. 6
1. Tujuan umum ............................................................................................... 6
2. Tujuan khusus .............................................................................................. 6
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................... 7
A. Alga Coklat Sargassum hystrix v. Buxifolium (Chauvin) J. Agardh ................ 7
B. Polifenol Florotannin ........................................................................................ 8
1. Struktur polifenol florotannin………………………………………………8
2. Kelarutan florotannin……………………………………………………….9
3. Sifat antioksidan polifenol florotannin........................................................11
C. Antioksidan. .................................................................................................... 13
1. Pengertian antioksidan…………………………………………………….13
2. Jenis antioksidan……………………………………………………….....13
3. Mekanisme penangkapan radikal bebas…………………………………..14
4. Manfaat antioksidan……………………………………………………….15
D. Penyarian ........................................................................................................ 15
E. Radikal Hidroksil ............................................................................................ 19
1. Pengertian radikal hidroksil……………………………………………….19
2. Pembentukan radikal hidroksil……………………………………………20
3. Metode untuk mendeteksi radikal hidroksil………………………………21
F. Metode Deoksiribosa …….……………….………….……………………… 22
xii
G. Spektrofotometri Visibel.................................................................................. 24
H. Landasan Teori ............................................................................................... 28
I. Hipotesis …………………………………….……..………………………… 29
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..................................................................30
A. Jenis Rancangan Penelitian.............................................................................. 30
B. Variabel Penelitian ......................................................................................... 30
C. Definisi Operasional ....................................................................................... 31
D. Bahan-bahan Penelitian .................................................................................. 32
E. Alat-alat Penelitian........................................................................................... 32
F. Tata Cara Penelitian ........................................................................................ 33
1. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum hystrix v. Buxifolium (Chauvin)
J. Agardh………………………..……….……….……………………….33
a. Pembuatan serbuk sampel alga coklat ……...……………....………… 33
b. Penetapan kadar air dalam serbuk alga coklat ……………………...... 33
2. Isolasi Crude Florotannin dari Serbuk Alga Coklat Sargassum hystrix v.
Buxifolium (Chauvin) J. Agardh................................................................. 33
a. Pembuatan ekstrak metanol alga coklat …..…………………..…........ 33
b. Fraksinasi ekstrak metanol alga coklat …….....…………...………….. 34
3. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik.................................................................. 34
4. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode
Deoksiribosa……………………………………………………………... 36
xiii
a. Persiapan ................................................................................................ 36
b. Pengujian dengan metode deoksiribosa ….…..............………….....… 38
G. Analisis Data …………………………………..…………………………..... 40
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 41
A. Persiapan Sampel Alga Coklat Sargassum hystrix v. Buxifolium (Chauvin) J.
Agardh.............................................................................................................. 41
B. Isolasi Crude Florotannin dari serbuk Alga Coklat Sargassum hystrix ……. 45
C. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik ……………………………………….......… 47
D. Penentuan Operating Time.............................................................................. 48
E. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks) ........................................ 51
F . Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat.............53
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................... 60
A. Kesimpulan ..................................................................................................... 60
B. Saran................................................................................................................. 60
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 61
LAMPIRAN............................................................................................................... 69
BIOGRAFI PENULIS ............................................................................................... 93
xiv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Spektrum warna pada daerah visibel..............................................................25
Tabel II. Hasil penetapan kadar air dalam serbuk alga coklat.....................................44
Tabel III. Penurunan absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan tanin..... 53
Tabel IV. Persen scavenging dan ES50 senyawa standar tanin................................... 54
Tabel V. Absorbansi MDA-TBA pada berbagai penambahan konsentrasi fraksi etil
asetat……………………………………………………………………… 55
Tabel VI. Tabel hasil uji statistik perbandingan aktivitas fraksi dan kontrol
negatif…………………………………………………………………….56
xv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur floroglusinol dan florotannin…………….……..…….....……10
Gambar 2. Struktur kimia difloretohidroksikarmalol............................................... 12
Gambar 3. Reaksi pembentukan radikal hidroksil.................................................... 20
Gambar 4. Struktur gula deoksiribosa ..................................................................... 22
Gambar 5. Pembentukan MDA dari 2-deoksiribosa yang diserang radikal hidroksil
dengan adanya O2……..……………………………………………………………………...….... 23
Gambar 6. Struktur malonaldehid….………….............……..…………………..... 23
Gambar 7. Diagram spektrofotometer visibel .......................................................... 27
Gambar 8. Reaksi oksidasi monofenol dan difenol oleh polifenol oksidase............ 43
Gambar 9. Kurva penetapan operating time kromogen MDA-TBA........................ 49
Gambar 10. Reaksi pembentukan enol pada TBA.………….……………..…….... 50
Gambar 11. Usulan reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA.........………….... 50
Gambar 12. Struktur kromogen MDA-TBA …..…….……………...……….……. 51
Gambar 13. Kurva scanning panjang gelombang maksimum kromogen MDA-
TBA………………………………………………………………….. 52
Gambar 14. Grafik konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml) vs absorbansi rata-rata
kromogen MDA-TBA ………………......…………………………... 55
Gambar 15. Reaksi prooksidan pada senyawa fenolik……………………………. 58
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran I. Data penetapan kadar air dengan Moisture Balance…..……................. 69
Lampiran II. Data perhitungan konsentrasi reagen dan fraksi etil asetat…...……..... 71
Lampiran III. Perhitungan konsentrasi deoksiribosa pada penetapan panjang
gelombang maksimum……………………...…………...………….. 78
Lampiran IV. Uji penangkapan radikal hidroksil………………………..………..... 79
Lampiran V. Foto fraksinasi ekstrak metanol alga coklat.…………......................... 91
Lampiran VI. Foto fraksi etil asetat............................................................................ 91
Lampiran VII. Hasil uji kualitatif florotannin ........................................................... 92
xvii
INTISARI
Radikal hidroksil merupakan radikal oksigen sangat reaktif yang potensial menyebabkan kerusakan oksidatif biologis dan terlibat sebagai faktor patogenik berbagai penyakit. Polifenol florotannin dalam alga coklat diketahui sebagai antioksidan yang potensial mencegah kerusakan oksidatif melalui penangkapan radikal bebas.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya dan nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil fraksi etil asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. Buxifolium (Chauvin) J. Agardh dengan metode deoksiribosa. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam % penangkapan (% scavenging) dan effective scavenging 50 (ES50).
Metode deoksiribosa menggunakan reagen Fenton untuk menghasilkan radikal hidroksil, deoksiribosa sebagai makromolekul terdegradasi, asam trikloroasetat (TCA) dan asam tiobarbiturat (TBA) untuk membentuk suatu kromogen berwarna pink yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm. Analisis data digunakan regresi linier dengan sumbu x sebagai konsentrasi fraksi etil asetat dan sumbu y sebagai % scavenging. ES50 merupakan konsentrasi fraksi etil asetat yang memiliki % scavenging senilai 50%.
Hasil penelitian menunjukkan fraksi etil asetat tidak memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada konsentrasi 0,02 mg/ml tetapi aktivitas prooksidan pada konsentrasi 0,03 mg/ml atau lebih. Hilangnya aktivitas antioksidan disebabkan polifenol florotanin telah teroksidasi selama masa penyimpanan sehingga pengendalian stabilitas senyawa harus diperhatikan.
Kata kunci: radikal hidroksil, metode deoksiribosa, fraksi etil asetat.
xviii
ABSTRACT
Hydroxyl radical is very reactive oxygen radical, potentially causes biological oxidative damages and known as pathogenic factors in several diseases. Polyphenol phlorotannin in brown algae is an antioxidant potentially prevents oxidative damages by free radicals scavenging activity.
The aim of this study is to recognize the existence and the value of radical hydroxyl scavenging activity of ethyl acetate fraction from methanolic extract of brown algae Sargassum hystrix v. Buxifolium (Chauvin) J. Agardh by deoxyribose method. The hydroxyl radicals scavenging activity is expressed in % scavenging and effective scavenging 50 (ES50).
The deoxyribose method uses Fenton’s reagent to produce hydroxyl radicals, deoxyribose sugar as the degraded macromolecules, trichloroacetic acid (TCA) and thiobarbituric acid (TBA) to form pink chromogen which absorbs at maximum wavelength at 532 nm. Data was analysed by linier regression with concentration of ethyl acetate fraction as x-axis and % scavenging as y-axis. ES50 is concentration of ethyl acetate fraction which has 50% scavenging activity.
Ethyl acetate fraction was found have no radical hydroxyl scavenging activity at concentration 0.02 mg/ml, but prooxidant activity at 0.03 mg/ml and more. Loss of activity was caused by polyphenol phlorotannin oxidated during storage, therefore stability control must be attented.
Key words: hydroxyl radicals, deoxyribose method, ethyl acetate fraction.
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan metabolit fisiologis yang
terbentuk selama kehidupan aerobik sebagai hasil metabolisme oksigen. ROS
memiliki kategori yang luas, tidak hanya radikal oksigen seperti radikal anion
superoksida (O2·-), radikal hidroksil (OH·) atau nitro oksida (NO·), tetapi juga
beberapa derivat oksigen non radikal yang berbahaya seperti H2O2, dan anion
peroksinitrit (ONOO-) (Zusterzeel, 2001).
Diantara berbagai jenis ROS, radikal hidroksil merupakan radikal oksigen
yang paling reaktif, sangat potensial menimbulkan kerusakan oksidatif biologis dan
diketahui terlibat sebagai faktor patogenik dalam berbagai penyakit (Gutteridge dan
Halliwell, 1994). Kanker, arterosklerosis, dan arthritis merupakan penyakit-penyakit
yang disebabkan oleh kerusakan oksidatif (Gupta et al., 2007).
Antioksidan dapat mengatasi kerusakan oksidatif secara tidak langsung
dengan meningkatkan pertahanan alami sel (Aruoma, 1996; Schinella et al., 2002)
dan secara langsung dengan menangkap spesies radikal bebas (Liu dan Ng, 2000).
Penggunaan antioksidan alami mempunyai keuntungan, yaitu aman sehingga mudah
untuk diterima konsumen terutama jika komponen tersebut telah memenuhi GRAS
(Generally Recognized As Safe ) (Pokorny, 1991).
2
Di tahun belakangan ini, beberapa spesies alga yang merupakan salah satu
material alami dilaporkan mampu mencegah kerusakan oksidatif sebagai scavanger
radikal bebas dan oksigen aktif, sehingga mencegah kemungkinan pembentukan sel
kanker. Polifenol dalam alga coklat yang disebut florotannin diketahui berperan
sebagai antioksidan yang potensial (Ragan dan Glombitza, 1986). Florotannin
merupakan senyawa polifenol yang tidak ditemukan pada tumbuhan terrestrial, tetapi
hanya pada tumbuhan alga khususnya alga coklat (Burtin, 2003). Luas laut Indonesia
yang besar, sebaran yang melimpah dan kemampuan reproduksi yang besar
menjadikan alga coklat sangat potensial untuk dimanfaatkan.
Mengacu pada penelitian Stephanie (2007), alga Sargassum hystrix v.
buxifolium (Chauvin) J. Agardh diketahui mengandung polifenol florotannin dengan
kadar 5,7 ± 0,54 mg PE/g fraksi. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji lebih lanjut
mengenai potensi polifenol tersebut sebagai antioksidan. Penelitian ini telah
dilakukan secara in vitro dengan menggunakan metode deoksiribosa, yaitu
pengukuran aktivitas antioksidan polifenol berdasarkan kemampuannya dalam
menangkap radikal hidroksil. Nilai kemampuan penangkapan radikal hidroksil oleh
fraksi dinyatakan sebagai persen scavenging dan juga effective scavenging 50 (ES50)
yaitu kemampuan penangkapan radikal hidroksil senilai 50%.
Metode deoksiribosa merupakan metode yang sederhana (simple test-tube
method) (Halliwel dan Gutteridge, 1988), memiliki sensitivitas tinggi, tidak
memerlukan alat yang canggih dalam analisisnya (Halliwell dan Grootveld, 1988 cit
Conte, 1996) serta memiliki tingkat validitas yang baik (Purwantoko, 2006). Metode
3
ini telah digunakan secara luas untuk pengujian radikal bebas. Prinsip metode ini
berdasarkan pemecahan oksidatif 2-deoksiribosa oleh senyawa radikal hidroksil
(Halliwell dan Grootveld, 1988 cit Conte, 1996) yang dihasilkan dari reagen Fenton.
B. Perumusan Masalah
Dari uraian di atas, maka rumusan masalah difokuskan sebagai berikut :
1. Apakah fraksi etil asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v.
buxifolium (Chauvin) J. Agardh memiliki aktivitas penangkapan radikal
hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dengan persen
scavenging ?
2. Berapakah nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat
ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J.
Agardh dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai effective
scavenging 50 (ES50) ?
C. Keaslian Karya
Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji penangkapan radikal
hidroksil dengan metode deoksiribosa pernah dilakukan oleh:
1. Purwantoko (2006) dengan judul “Validasi Metode Deoksiribosa sebagai Uji
Penangkapan Radikal Hidroksil oleh vitamin C secara In Vitro”
4
2. Setyawati (2006) dengan judul “Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh
Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Teh Hitam dengan Metode
Deoksiribosa”
3. Kuntari (2007) dengan judul “ Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil
oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa.
Penelitian tentang potensi antioksidan alga coklat pernah dilakukan oleh:
1. Ahn et al. (2007) dengan judul “ Antioxidant Activities of Phlorotannins
Purified from Ecklonia cava on Free Radical Scavenging Using ESR and
H2O2-Mediated DNA Damage”. Penelitian menggunakan spesies alga coklat
yang berbeda yaitu Ecklonia cava dan metode Electron Spin Resonance untuk
mendeteksi radikal hidroksil.
2. Heo et al. (2006) dengan judul “ Identification of Chemical Structure and Free
Radical Scavenging Activity of Diphlorethohydroxycarmalol Isolated from a
Brown Alga, Ishige okamurae”. Penelitian menguji aktivitas isolat florotannin
difloretohidroksikarmalol dari spesies alga coklat yang berbeda yaitu Ishige
okamurae menggunakan metode Electron Spin Resonance untuk mendeteksi
radikal hidroksil.
3. Patra et al. (2008) dengan judul “Evaluation of Antioxidant and Antimicrobial
Activity of Seaweed (Sargassum sp) Extract: A Study on Inhibition of
Glutathione-S-Transferase Activity”. Penelitian menggunakan ekstrak
metanol alga coklat Sargassum sp untuk uji aktivitas penangkapan radikal
hidroksil dengan metode deoksiribosa.
5
Perbedaan dengan penelitian sebelumnya adalah bahwa pada penelitian ini
akan dilakukan uji penangkapan radikal hidroksil menggunakan metode deoksiribosa
pada fraksi etil asetat ekstrak metanolik spesies alga coklat yang berbeda, yaitu
Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh.
D. Manfaat Penelitian
1. Manfaat teoritis
Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil
asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium
(Chauvin) J. Agardh yang dinyatakan sebagai persen scavenging dan
effective scavenging 50 (ES50).
2. Manfaat metodologis
Penelitian ini dapat dijadikan acuan penggunaan metode
deoksiribosa pada uji daya antioksidan.
3. Manfaat praktis
Penelitian ini dapat memberi informasi tentang daya antioksidan alga
Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh, sehingga bisa
dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif pemeliharaan kesehatan
manusia.
6
E. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum
Tujuan umum penelitian ini adalah menguji daya antioksidan fraksi
etil asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium
(Chauvin) J. Agardh dengan metode deoksiribosa.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui adanya aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi
etil asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v.
buxifolium (Chauvin) J. Agardh yang dinyatakan dengan persen
scavenging.
b. Mengetahui nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi
etil asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v.
buxifolium (Chauvin) J. Agardh yang dinyatakan sebagai effective
scavenging 50 (ES50).
7
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Alga Coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh Alga Sargassum merupakan salah satu marga Sargassum termasuk dalam
kelas Phaeophyceae. Habitat alga Sargassum tumbuh diperairan pada kedalaman 0,5-
10 m ada arus dan ombak. Alga Sargassum tumbuh berumpun dengan untaian
cabang-cabang. Pertumbuhan alga ini sebagai makro alga melekat pada substrat dasar
perairan. Di daerah tubir tumbuh membentuk rumpun besar, panjang thalli utama
mencapai 0,5-3 m dan tiap-tiap percabangan terdapat gelembung udara berbentuk
bulat yang disebut “bladder”, berguna untuk menopang cabang-cabang thalli
terapung ke arah permukaan air untuk mendapatkan intensitas cahaya matahari (Kadi,
2007).
Ciri-ciri Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh adalah ukuran
tanaman sedang, tinggi sampai 5 dm, dengan beberapa cabang utama dan banyak
cabang lateral pendek tempat melekatnya daun, panjang daun mencapai 6 cm, lebar
1,5 cm, bentuk oval atau memanjang, tepi daun berbentuk serratus, mempunyai
beberapa stomata yang kebanyakan terletak pada bagian distal daun dan biasanya
steril (Taylor, 1972).
Kandungan bahan kimia utama dalam Sargassum sp adalah polisakarida
seperti alginat dan laminarin, iodin, protein, asam lemak, mikronutrien (vitamin E
8
dan vitamin C), mineral, karotenoid (fucoxantin, β-caroten, violaxantin) serta
polifenol (tertinggi pada alga coklat) (Burtin, 2003).
B. Polifenol Florotannin
1. Struktur polifenol florotannin
Polifenol dalam alga coklat disebut florotannin dan diketahui berpotensi
sebagai antioksidan. Florotannin terbentuk dari polimerasi monomer floroglusinol
(1,3,5-trihidroksibenzen) dan disintesis melalui jalur asetat malonat dalam alga laut
(Ragan dan Glombitza, 1986). Senyawa florotannin memiliki struktur unik yang tidak
ditemukan dalam tanaman terrestrial (Shibata et al., 2003). Senyawa dengan rangka
dibenzo-1,4-dioksin ini memiliki bobot molekul rendah (300-800) dan struktur yang
rigid sehingga memungkinkan dalam berinteraksi kuat dengan berbagai molekul
biologis (Kang et al., 2003; Glombitza dan Gerstberger, 1985). Kandungan tertinggi
florotannin ditemukan dalam alga coklat, berkisar dari 5-15 % berat kering (Ragan
dan Craigie, 1973; McInnes et al., 1984; Glombitza dan Keusgen, 1995).
Florotannin adalah dehidro-oligomer dan dehidropolimer floroglusinol yang
strukturnya sudah terelusidasi lebih dari 150 senyawa (Ragan dan Glombitza, 1986).
Unit-unit monomer terhubung melalui ikatan aril-aril dan ikatan diaril eter
membentuk berbagai kelompok florotannin yang berbeda (Glombitza dan Pauli,
2003). Ketika cincin aromatis terhubung hanya melalui ikatan aril-aril, terbentuklah
kelompok fucol (Gambar 1, ii). Floretol terbentuk hanya melalui ikatan aril eter
9
(Gambar 1, iii). Fuhalol terdiri dari unit floroglusinol yang dihubungkan dengan
ikatan eter pada posisi para dan orto serta satu tambahan gugus –OH di setiap cincin
ketiga (Gambar 1, v). Ketika ada satu atau tiga cincin dengan komponen
dibenzodioksin yang tersubstitusi gugus fenoksil pada C-4, kelompok ini dinamakan
eckol (Gambar 1, vii). Endofucofloretol (Gambar 1, iv) and isofuhalol (Gambar 1, vi)
merupakan kelompok kecil, khusus dan jarang ditemukan (Koivikko, 2008).
2. Kelarutan polifenol
Senyawa fenolik umumnya paling larut dalam cairan penyari yang kurang
polar daripada air. Pemilihan pelarut yang disarankan adalah campuran air dan
metanol, etanol atau aseton (Waterman dan Mole, 1994). Menurut Koivikko et al.
(2005), kelarutan florotannin paling besar adalah di larutan 70% aseton dalam air,
sedangkan pada penelitian yang dilakukan Nagayama et al. (2002), isolasi florotannin
dari alga coklat diawali dengan ekstraksi 800 g alga coklat menggunakan metanol
2400 ml dan dilanjutkan dengan fraksinasi menggunakan metanol (240 ml),
kloroform (480 ml) dan akuades (180 ml). Fase metanol-akuades kemudian
diekstraksi dua kali menggunakan etil asetat (300 ml). Fraksi etil asetat inilah yang
diketahui mengandung florotannin. Pada penelitian yang dilakukan oleh Heo et al.
(2006) dan Ham et al. (2007), isolat murni florotannin juga terdapat pada fraksi etil
asetat.
10
(i) (v )
(ii) (vi)
(iii) (vii)
(iv)
Gambar 1. Struktur floroglusinol (i) dan florotannin [tetrafucol A (ii), tetrafloretol B (iii), fucodiflorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] (Ragan dan Glombitza, 1986).
11
3. Sifat antioksidan polifenol florotannin
Florotannin dalam alga coklat (Phaeophyta) tersimpan dalam vesikel dalam
sel (Ragan dan Glombitza 1986; Schoenwaelder dan Clayton, 2000). Florotannin
memiliki peran yang penting dalam konstruksi dinding sel alga coklat
(Schoenwaelder dan Clayton, 1998) dan seperti tanin dalam tanaman vaskular,
mereka mempunyai kemampuan dalam mempresipitasikan protein dan menyerap
radiasi UV. Terlebih lagi, senyawa ini merupakan polifenol yang memiliki sifat
antioksidan yang kuat (Shin et al., 2006). Kim et al. (2004) dan Kang et al. (2006)
melaporkan bahwa beberapa florotannin pada penelitian aktivitas antioksidan alga
coklat memperlihatkan efek inhibisi terhadap lipid peroksidasi dan efek sitoprotektif
terhadap stress oksidatif yang menginduksi kerusakan sel.
Mekanisme aksi polifenol sebagai antioksidan adalah melalui kemampuan
gugus fenol untuk menangkap radikal bebas dengan memberikan atom hidrogennya
melalui proses transfer elektron, sehingga fenol berubah menjadi radikal fenoksil
(Janeiro dan Brett, 2004). Sifat antioksidan polifenol meningkat sesuai dengan
reaktivitasnya sebagai donor elektron atau hidrogen dan kemampuannya dalam
mengkelat ion logam transisi (Rice-Evans et al., 1997) serta kemampuan radikal
derivat polifenol untuk menstabilkan dan mendelokalisasikan elektron tidak
berpasangan (fungsi pemutusan rangkaian reaksi).
Aktivitas antioksidan florotannin telah dilaporkan oleh Kang et al. (2003) dan
Nakamura et al. (1996). Park et al. (2005) menemukan bahwa Sargassum thunbergii
memiliki efek kuat sebagai penangkap radikal alkil dan Ahn et al. (2007)
12
melaporkan bahwa salah satu oligomer florotannin, dieckol yang diisolasi dari
Ecklonia cava memiliki aktivitas penangkapan radikal alkil sebesar 90% pada
konsentrasi 50 μg/ml.
Pengujian aktivitas antioksidan alami dari alga laut juga dilakukan oleh Heo
et al. (2006) dengan menggunakan ekstrak metanolik alga coklat Ishige okamurae.
Aktivitas penangkapan radikal bebas yang poten ditemukan dalam fraksi etil asetat.
Fraksi ini mengandung senyawa-senyawa polifenol, dan antioksidan yang poten
terelusidasi sebagai salah satu jenis florotannin, difloretohidroksikarmalol (gambar 2)
melalui data spektroskopi resonansi magnet inti dan massa.
Difloretohidroksikarmalol ditemukan memiliki IC50 sebesar 114,80 µM pada uji
penangkapan radikal hidroksil.
HO
OH
O O
OHO
OH
OH
OH
O
HO
OH
OH
Gambar 2. Struktur kimia difloretohidroksikarmalol (Heo et al., 2006)
13
C. Antioksidan
1. Pengertian antioksidan
Definisi antioksidan secara umum adalah senyawa yang melawan oksidasi
atau menghambat reaksi yang dipicu oleh oksigen atau peroksida. Kebanyakan
senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam berbagai produk
(misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk menunda ketengikan dan
perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi).
Pengertian antioksidan yang lebih relevan secara biologis ialah senyawa alami atau
sintetik yang ditambahkan ke dalam produk untuk mencegah atau menunda
kerusakan yang disebabkan oleh oksigen udara (Huang et al., 2005).
Menurut Halliwell (1994), antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa
yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat
teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut.
2. Jenis antioksidan
Menurut mekanismenya, antioksidan dapat digolongkan menjadi 2 macam
yaitu:
a. Preventive antioxidant
Antioksidan preventif merupakan antioksidan yang menghambat
oksidasi dengan mengurangi kecepatan inisiasi. Dalam kebanyakan
produk hidroperoksida, oksidasi ROOH merupakan penyebab proses
inisiasi. Antioksidan preventif mengubah hidroperoksida menjadi produk
14
molekul yang tidak potensial sebagai radikal bebas (Burton et al., 1985).
Beberapa enzim seperti glutation peroksidase dapat mengubah H2O2
menjadi H2O (Krishnaiah et al., 2007).
b. Chain breaking antioxidant
Antioksidan ini kebanyakan merupakan fenol dan amin aromatis,
bekerja dengan cara menangkap radikal peroksil (Krishnaiah et al., 2007).
Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam,
yaitu:
a. Antioksidan sintetik
Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang dibuat melalui
sintesis secara kimia, contohnya: BHA, BHT, PG dan TBHQ (Gulcin et
al., 2004).
b. Antioksidan alami
Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diproduksi langsung
oleh tanaman, contohnya: senyawa polifenol flavonoid dan tanin (Gulcin
et al., 2004).
3. Mekanisme penangkapan radikal bebas
Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat dibedakan
menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim yang dapat
berperan sebagai antioksidan adalah superoksid dismutase (SOD), glutation
peroksidase, katalase, tioredoksin reduktase dan peroksiredoksin (Masella et al.,
15
2005). Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu
sebagai:
a. penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E.
b. pengkelat logam transisi, misalnya EDTA.
c. inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen.
d. kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation
peroksidase (Huang et al., 2005).
4. Manfaat antioksidan
Antioksidan bermanfaat dalam mencegah kerusakan oksidatif yang
disebabkan radikal bebas dan ROS sehingga mencegah terjadinya berbagai macam
penyakit seperti jantung koroner (Ames, 1983; Harman, 1993; Finkel dan Holbrook,
2000), kanker serta penuaan dini (Velavan et al., 2006). Penambahan antioksidan ke
dalam formulasi makanan, juga efektif mengurangi oksidasi lemak yang
menyebabkan ketengikan, toksisitas dan destruksi biomolekul yang ada dalam
makanan (Decker, 1998).
D. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang
tidak dapat larut dengan pelarut cair. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian
16
adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan
penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut.
1. Maserasi
Maserasi adalah ekstraksi suatu obat dengan pelarut melalui pengojogan dan
penggetaran selama berhari-hari pada temperatur ruangan (List dan Schmidt, 2000).
Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel sehingga
zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif
di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar
(Anonim, 1986). Keuntungan maserasi adalah dapat diaplikasikan dalam sampel
dalam jumlah sedikit, atau dengan batch tertentu (List dan Schmidt, 2000), cara
pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan.
Kerugiannya adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna
(Anonim, 1986).
2. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan
penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip perkolasi adalah serbuk
simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian bawahnya diberi
sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut,
cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai
keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan
cairan di atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan.
17
Cara perkolasi lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi karena:
a. Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang
terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga
meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi.
b. Ruangan di antara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran
tempat mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler
tersebut, maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan
batas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim,
1986).
3. Sokhletasi
Sokhletasi merupakan salah satu penyarian berkesinambungan menghasilkan
ekstrak cair yang dilanjutkan dengan proses penguapan. Alat yang digunakan disebut
sokhlet. Prinsipnya uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa samping, kemudian
diembunkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun ke labu melalui tabung yang
berisi serbuk simplisia. Cairan penyari sambil turun melarutkan zat aktif serbuk
simplisia. Karena adanya sifon maka setelah cairan mencapai permukaan sifon,
seluruh cairan akan kembali ke labu. Keuntungan metode ini adalah cairan penyari
yang dibutuhkan lebih sedikit dan secara langsung hasil yang diperoleh lebih pekat,
serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni maka dapat menyari zat aktif
lebih banyak dan penyarian dapat diteruskan sesuai keperluan tanpa menambah
volume cairan penyari (Anonim, 1986).
18
4. Infundasi
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan dengan menyari simplisia
dengan air pada temperatur 900C selama 15 menit. Infundasi adalah proses penyarian
yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air
dari bahan-bahan nabati. Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak
stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu, sari yang
diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Cara ini sangat
sederhana dan sering digunakan oleh perusahaan obat tradisional (Anonim, 1986).
5. Ekstraksi dengan corong pisah
Ekstraksi pelarut merupakan metode yang baik dan populer. Prinsip metode
ini didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua
pelarut yang tidak saling campur, seperti benzen dan karbon tertraklorida atau
kloroform (Khopkar, 1990).
Menurut hukum distribusi Nernst: Jika [X1] adalah konsentrasi zat terlarut
dalam fase 1 dan [X2] adalah konsentrasi zat terlarut dalam fase 2, maka pada
kesetimbangan, X1, X2 didapat:
KD = [X2] [X1]
dimana, KD = koefisien distribusi
Digunakan istilah perbandingan distribusi (D) dengan memperhitungkan
konsentrasi total zat di dalam kedua fase. Perbandingan distribusi dinyatakan sebagai
berikut:
19
D = (Khopkar, 1990)
E. Radikal Hidroksil
1. Pengertian radikal hidroksil
Radikal bebas ialah spesies yang memiliki satu atau lebih elektron tidak
berpasangan pada orbitalnya. Contoh radikal bebas adalah superoksida (O2·-) dan
hidroksil (OH·) yang keduanya merupakan radikal oksigen, thiyl (RS·, radikal sulfur),
triklorometil (CCl3·, radikal karbon yang terbentuk oleh metabolisme CCl4 di hati)
dan nitro oksida (NO·). Radikal hidroksil merupakan radikal oksigen sangat reaktif
yang menyerang kebanyakan molekul biologis dengan abstraksi atom hidrogen.
Berikut ini salah satu mekanisme radikal hidroksil dalam menimbulkan peroksidasi
lipid (L-H) menjadi radikal lipid (L·) :
L-H + OH· H2O + L· (Halliwell dan Chirico, 1993)
Radikal hidroksil mampu mengoksidasi kebanyakan makromolekul termasuk
DNA, protein, lipid dan karbohidrat (Frank et al.,1989; Breen dan Murphy, 1995;
Dean et al., 1997). Kerusakan oksidatif DNA karena ROS dihipotesiskan memainkan
peranan penting dalam proses biologis seperti mutagenesis, penuaan, dan
karsinogenesis (Ames, 1983; Cerruti, 1984; von Sonntage, 1987).
20
2. Pembentukan radikal hidroksil
Pembentukan radikal hidroksil dapat melalui 2 mekanisme, yaitu reaksi ion
logam transisi dengan H2O2 yang disebut reaksi Fenton dan reaksi fisi homolitik air
karena terpapar radiasi ionisasi (Halliwell dan Chirico, 1993).
Reaksi Fenton merupakan reaksi yang penting untuk menghasilkan radikal
hidroksil. Reaksinya disebut reaksi Harber-Weiss (Kehrer, 2000), seperti berikut:
Fe (II) + H2O2 →Fe (III) + ·OH + OH-
Besi merupakan katalis yang penting dalam reaksi redoks (Kanner et al.,
1988). Kombinasi antara H2O2 dan garam besi merupakan mekanisme utama dalam
menghasilkan radikal hidroksil yang sangat reaktif (Gutteridge et al., 1981; Kanner
et al., 1988; Halliwell dan Gutteridge, 1999). Reaksi ini juga menggunakan EDTA.
Pengkelatan Fe (II) oleh EDTA mencegah ion logam transisi untuk berikatan dengan
makromolekul yang dipelajari (Shcherbakova et al., 2006). Penambahan asam
askorbat dalam sistem reaksi meningkatkan kecepatan pembentukan ·OH dengan
mereduksi Fe3+ menjadi Fe2+ sehingga memperbanyak jumlah radikal hidroksil.
Reaksi terlihat pada gambar 3, terjadi saat inkubasi pada temperatur 370C (sesuai
dengan temperatur tubuh manusia) dengan pH 7,4 selama 30 menit.
Fe3+-EDTA O
OHHO
HO
OH
OFe2+-EDTA
O
OO
HO
OH
O
Fe2+ - EDTA + H2O2 Fe3+-EDTA + OH + OH
++
Gambar 3. Reaksi pembentukan radikal hidroksil (Yen et al., 1997)
21
3. Metode untuk mendeteksi radikal hidroksil
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mendeteksi radikal hidroksil,
yaitu:
a. Metode pemerangkapan salisilat
Prinsipnya terjadi hidroksilasi salisilat oleh radikal hidroksil
membentuk produk 2,3- dan 2,5- DHBA (dihydroxybenzoic acid) yang dapat
diukur menggunakan HPLC (Hashimoto et al., 2003).
b. Metode reaksi dengan dimetilsulfoksida (DMSO)
Metode ini melibatkan reaksi cepat antara radikal hidroksil dengan
DMSO menghasilkan radikal karbon (radikal metil), yang selanjutnya
bereaksi dengan fluorescamine yang terderivatisasi nitroksida untuk
menghasilkan produk stabil o-metilhidroksilamin. Produk o-
metilhidroksilamin dipisahkan dengan HPLC fase terbalik dan dikuantifikasi
secara fluorometri (Gutierrez, 2000).
c. Metode EPR (Electro Paramagnetic Resonance)\
Prinsipnya radikal hidroksil akan ditangkap oleh DMPO (5,5s-dimetil-
1-pirolina-1-oxida) menghasilkan produk radikal bebas lain yang
menyebabkan kenaikan garis kuartet pada EPR dengan rasio ketinggian
1:2:2:1 (Gutierrez, 2000).
Selain ketiga metode di atas, terdapat satu metode lagi yang bisa
mendeteksi radikal hidroksil yaitu metode deoksiribosa.
22
F. Metode Deoksiribosa Metode deoksiribosa adalah metode yang sederhana, memiliki sensitivitas
tinggi dan tidak memerlukan alat yang canggih dalam analisisnya. Metode ini telah
digunakan secara luas untuk pengujian radikal bebas. Prinsip metode ini berdasarkan
pemecahan oksidatif 2-deoksiribosa (gambar 4) oleh senyawa radikal hidroksil
(Halliwell dan Grootveld, 1988 cit Conte, 1996).
O
CH2OH OH
HOH H
Gambar 4. Struktur gula deoksiribosa (Murray et al., 1997)
Radikal hidroksil yang terbentuk dari reaksi Fenton akan menyerang
deoksiribosa dan mendegradasinya menjadi fragmen-fragmen (Gupta et al., 2007).
Proses reaksi degradasi ini dapat dijelaskan sebagai berikut: Radikal hidroksil akan
menyerang deoksiribosa dengan cara abstraksi (pemisahan) hidrogen pada atom C
dan membentuk suatu radikal deoksiribosa yang dengan adanya oksigen akan secara
cepat diubah menjadi radikal gula peroksil pada posisi atom C-4 (gambar 5).
23
OH2C OH
HO
HO OHO
H2C OH
HO
HO O2
OH2C OH
HO
HO
OO
H2C OH
HO
HO
O
O2
OH2C OH
O
HO
OHO2HO2
H2O2
O2
OH2C OH
HO
HO
OO
CH2OHCO2H
O O
++
+
Gambar 5. Mekanisme pembentukan MDA dari atom karbon C-1, C-2,dan C-3 dari 2- deoksiribosa yang diserang radikal hidroksil dengan adanya O2 (Cheeseman et al., 1988)
Selanjutnya, radikal gula peroksil ini akan mengalami serangkaian reaksi yang
meliputi disproporsionasi, penataan ulang, dan pemecahan ikatan C – C sehingga
menghasilkan suatu produk karbonil yang disebut malonaldehid (MDA) (Halliwell
dan Gutteridge, 1999). MDA (gambar 6) terbentuk dari atom karbon C-1, C-2, dan C-
3 pada molekul deoksiribosa (Cheeseman et al., 1988).
O O
Gambar 6. Struktur Malonaldehid
24
Adanya pemanasan dengan asam tiobarbiturat (TBA) pada pH rendah, maka
produk tersebut akan bereaksi membentuk kromogen berwarna pink yang dapat
diukur absorbansinya pada 532 nm. Kromogen ini berasal dari reaksi kopling antara
asam tiobarbiturat dengan malonaldehid (TBA-MDA). Reaksi kopling ini terjadi
antara dua molekul TBA dengan satu molekul MDA. Hasil degradasi deoksiribosa
dapat diinhibisi oleh penambahan scavenger ·OH (Halliwell dan Gutteridge, 1988).
G. Spektrofotometri Visibel
Setiap molekul analit memiliki kemampuan untuk menyerap gelombang
tertentu dari radiasi elektromagnetik. Dalam proses ini, energi radiasi untuk
sementara dipindahkan ke molekul sehingga intensitas radiasi akan berkurang (Skoog
et al., 1994).
Panjang gelombang daerah ultraviolet dan tampak yang diserap oleh molekul
bergantung pada mudahnya promosi elektron. Senyawa yang menyerap cahaya pada
daerah tampak (yakni senyawa berwarna) memiliki elektron yang lebih mudah
dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang ultraviolet
yang lebih pendek (Fessenden dan Fessenden, 1994).
Daerah visibel adalah sinar daerah panjang gelombang yang dapat dilihat oleh
mata manusia (cahaya tampak sebagai warna yang daerah spektrumnya terlihat pada
tabel 1), memanjang dari daerah UV dekat 380 nm sampai sekitar 780 nm (Christian,
2004).
25
Suatu senyawa organik mampu menyerap radiasi elektromagnetik karena
mereka memiliki elektron valensi yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang
lebih tinggi. Absorpsi radiasi ultraviolet atau visibel oleh molekul atau atom M dapat
dijelaskan melalui dua tahap, yaitu eksitasi yang ditunjukkan dengan persamaan
berikut:
M + hv M*
Produk reaksi antara M dan foton hv adalah partikel yang secara elektronik
tereksitasi dengan simbol M*. Waktu tinggal partikel yang tereksitasi hanya sebentar
(108- 10-9 s) kemudian diakhiri dengan proses relaksasi. Proses ini melibatkan
perubahan energi eksitasi menjadi panas, yaitu:
M* M + panas (Skoog, 1985)
Tabel 1. Spektrum warna pada daerah visibel (Skoog et al., 1994)
Daerah panjang gelombang, nm
Warna yang diserap Warna komplementer (terlihat mata)
400-435 Ungu Kuning-hijau 435-480 Biru Kuning 480-490 Biru-hijau Orange 490-500 Hijau-biru Merah 500-560 Hijau Merah lembayung 560-580 Kuning-hijau Ungu 580-595 Kuning Biru 595-650 Orange Biru-hijau 650-750 Merah Hijau-biru
Kuantitas energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding terbalik dengan
panjang gelombang radiasi:
ΔE = hv =
26
Dengan: ΔE = energi yang diabsorpsi, dalam erg
h = tetapan Planck, 6,6 x 10-27 erg det
v = frekuensi, dalam Hz
c = kecepatan cahaya, 3 x 1010 cm/det
λ = panjang gelombang, dalam cm (Fessenden dan Fessenden,
1994
Menurut hukum Beer’s, absorbansi mempunyai hubungan yang linier dengan
konsentrasi absorban (c) dan tebal kuvet (b) yang dirumuskan sebagai berikut:
Dengan : A = Absorbansi;
P0 = Kekuatan radiasi yang datang
P = Kekuatan radiasi setelah melewati kuvet yang
mengandung analit
b = Tebal larutan (cm)
c = Konsentrasi (mol.Lt-1)
ε = Absorptivitas molar (Lt.mol-1.cm-1) (Skoog et al.,
1994)
Untuk absorptivitas molar, hubungan ε dengan parameternya, dirumuskan
sebagai berikut:
A = log (P0/P) = ε b c
ε = 8,7 x 1019 PA
27
Dengan: P = probabilitas transisi elektron
A= luas daerah molekul target (cm2)
ε = Absorptivitas molar (Lt.mol-1.cm-1) (Skoog, 1985)
Instrumen yang digunakan untuk mempelajari absorpsi atau emisi radiasi
elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang disebut spektrometer atau
spektrofotometer. Komponen yang esensial dalam spektrofotometer (gambar 7) yaitu:
(1) sumber radiasi energi, (2) sistem lensa, cermin dan celah yang memfokuskan
sinar, (3) monokromator yang mengubah radiasi menjadi beberapa panjang
gelombang, (4) wadah transparan untuk menampung sampel, (5) detektor radiasi
yang dihubungkan dengan recorder (Pescok et al., 1976).
Gambar 7. Diagram Spektrofotometer single beam
28
H. Landasan Teori Radikal hidroksil merupakan jenis radikal bebas paling reaktif. Di dalam
tubuh manusia, radikal hidroksil dalam tubuh akan menyerang DNA sehingga
menyebabkan kerusakan biologis. Polifenol dalam fraksi etil asetat alga coklat yang
disebut florotannin, diketahui berperan sebagai antioksidan yang potensial sehingga
mampu mencegah kerusakan oksidatif sebagai scavanger radikal bebas.
Aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat ekstrak
metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh dapat diuji
dengan metode deoksiribosa. Radikal hidroksil yang terbentuk dari reaksi Fenton
akan menyerang deoksiribosa sehingga menghasilkan produk tertentu
(malondialdehid). Adanya pemanasan dengan asam tiobarbiturat (TBA) pada pH
rendah menyebabkan reaksi kopling antara TBA dengan malonaldehid (TBA-MDA)
membentuk kromogen berwarna pink yang dapat diukur absorbansinya pada 532 nm.
Dengan penambahan senyawa yang berperan sebagai scavenger radikal hidroksil,
hasil degradasi deoksiribosa akan terhambat. Semakin besar konsentrasi senyawa
antioksidan yang ditambahkan, radikal hidroksil yang ditangkap menjadi lebih
banyak sehingga jumlah kromogen MDA-TBA menjadi semakin berkurang dan
absorbansi menurun.
29
I. Hipotesis
Berdasarkan landasan teori, dapat dihipotesiskan bahwa fraksi etil asetat
ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh
memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil yang dinyatakan dengan %
scavenging dan effective scavenging 50 (ES50).
30
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena dalam
penelitian ini subjek uji diberi perlakuan yaitu penambahan berbagai konsentrasi
fraksi etil asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium
(Chauvin) J. Agardh yang diuji dengan metode deoksiribosa.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini berupa konsentrasi fraksi etil asetat
ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh
yang diuji dengan metode deoksiribosa.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung berupa aktivitas penangkapan radikal hidroksil fraksi etil
asetat ekstrak metanolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J.
Agardh yang dinyatakan dalam % scavenging.
31
3. Variabel pengacau
Variabel pengacau dalam penelitian ini ada dua jenis, yaitu:
a. Variabel pengacau terkendali, termasuk di dalamnya adalah temperatur
dan waktu inkubasi yang digunakan dalam penelitian.
b. Variabel pengacau tak terkendali, termasuk di dalamnya adalah
kestabilan bahan (vitamin C) dalam larutan.
C. Definisi Operasional
1. Ekstrak metanolik alga coklat adalah ekstrak hasil proses sokhletasi serbuk alga
coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh dengan penyari
metanol hingga larutan jernih.
2. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak metanolik alga coklat dengan
menggunakan etil asetat.
3. Larutan kontrol merupakan larutan yang terdiri dari reagen Fenton, larutan
deoksiribosa, bufer fosfat, asam trikloroasetat, dan asam tiobarbiturat.
4. Larutan sampel merupakan larutan kontrol yang telah diberi fraksi etil asetat (butir
2) dengan berbagai konsentrasi.
5. Persen scavenging (% scavenging) adalah persen yang menyatakan kemampuan
suatu senyawa untuk menangkap suatu radikal bebas.
6. Effective Scavenging 50 (ES50) merupakan nilai konsentrasi fraksi etil asetat yang
menghasilkan penangkapan 50% radikal hidroksil.
32
D. Bahan-bahan Penelitian
Alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh (dari pantai
Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta), akuades (Laboratorium Kimia Organik Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan bahan-bahan kualitas p.a. E. Merck yaitu:
metanol, etil asetat, kalium hidroksida, natrium klorida, tanin, natrium karbonat,
dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, ferri klorida heksahidrat,
Natrium etilendiamin asam tetraasetat (Na EDTA), larutan hidrogen peroksida 30%,
L (+) asam askorbat (vitamin C), asam tiobarbiturat (TBA), dan asam trikloroasetat
(TCA). Sementara bahan yang lain: kloroform, gelatin croda (Brataco Chemica),
reagen Folin Ciocalteau dan 2-deoksi-D-ribosa (Sigma Chem. Co., USA).
E. Alat-alat Penelitian
Seperangkat spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20, pH-meter
Metrohm 632, Vacuum rotaevaporator (Janke & Kunkel), Timbangan elektrik BP
160 readability 0.01 mg, Waterbath (Emerson), Mikropipet 200-1000 µL (Acura 825,
Socorex), Tabung reaksi bertutup (Scott-Germany), Hot plate (Heidolph), Freezer
(Toshiba), Alat-alat untuk sokhletasi, yaitu Sokhlet, Labu alas bulat (Schott Duran,
Germany), Heating mantle, Termometer, Corong pisah, Oven, Blender, Pengayak,
dan alat-alat gelas yang lazim digunakan untuk penelitian di laboratorium analisis
(Pyrex-Germany).
33
F. Tata Cara Penelitian
1. Persiapan Sampel Alga Coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J.
Agardh
a. Pembuatan serbuk sampel alga coklat
Alga dikumpulkan pada tanggal 23 Maret 2007 di pantai Drini, Gunung
Kidul, Yogyakarta, kemudian dicuci dengan air mengalir. Alga diautoklaf
pada temperatur 1000C selama 30 menit dan dikeringkan dengan oven pada
temperatur 90 °C selama 6 hari. Setelah itu, alga diserbuk menggunakan
blender lalu diayak dengan ayakan nomor mesh 20/30.
b. Penetapan kadar air dalam serbuk alga coklat
Serbuk alga ditimbang sebanyak 5 g, kemudian dimasukkan ke dalam
alat moisture balance yang sudah ditara terlebih dulu. Panaskan alat pada
temperatur 110 0C selama 15 menit. Catat persen sisa bobot zat setelah
pemanasan seperti yang tertera dalam alat.
2. Isolasi Crude Florotannin dari Serbuk Alga Coklat Sargassum hystrix v.
buxifolium (Chauvin) J. Agardh
a. Pembuatan ekstrak metanol alga coklat
Serbuk alga yang ditimbang sebanyak 80 g, dimasukan ke dalam kantong
kertas saring, kemudian dimasukkan ke labu sokhlet dan diberi pelarut
metanol sebanyak 2 kali sirkulasi. Proses sokhletasi dilakukan sampai tetesan
pelarut jernih dengan temperatur ± 80 oC. Setelah selesai, hasil sokhletasi
34
diuapkan pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai
volume yang kecil (1/10 dari volume mula-mula).
b. Fraksinasi ekstrak metanol alga coklat
Ekstrak yang telah diuapkan ditambahkan 60 ml metanol, 120 ml
kloroform, dan 45 ml akuades. Kocok campuran beberapa kali, kemudian
diamkan hingga terbentuk dua lapisan. Pisahkan keduanya, selanjutnya
lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat dua kali @75 ml. Kumpulkan fraksi
etil asetat, uapkan di waterbath dengan temperatur 80 0C sampai kering,
sehingga diperoleh fraksi yang merupakan crude phlorotannin. Fraksi
kemudian disimpan di dalam freezer.
3. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik
a. Pembuatan larutan sampel fraksi etil asetat
Timbang 0,025 g fraksi etil asetat, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml.
Tambahkan akuades hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1
mg/ml.
b. Pembuatan larutan standar tanin
Timbang 0,025 g standar tanin, masukkan ke dalam labu ukur 25 ml.
Tambahkan akuades hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1
mg/ml.
c. Uji pendahuluan
Sebanyak 1 ml larutan sampel pada butir a) ditambah 10 ml akuades,
dipanaskan selama 30 menit dalam tabung reaksi. Larutan disaring dengan
35
kapas. Larutan berwarna kuning sampai merah menunjukkan adanya senyawa
yang mengandung kromofor dengan gugus hidrofilik. Jika ditambah larutan
KOH 6,5% b/v, warna larutan menjadi lebih intensif (Tejada, 2002).
d. Uji tanin (zat samak)
Sebanyak 1 ml larutan sampel pada butir a) dan 1 ml larutan tanin pada
butir b) (sebagai kontrol positif) ditambah 1 ml NaCl 2%. Bila terjadi suspensi
(endapan) disaring melalui kertas saring. Filtrat ditambah 5 ml larutan gelatin
1%. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin (Evans, 2002).
e. Uji polifenol
Sebanyak 1 ml larutan sampel pada butir a) dan 1 ml larutan tanin pada
butir b) ditambah 3 tetes besi (III) klorida 9% b/v. Jika terjadi warna biru
menunjukkan adanya senyawa fenolik (Farnsworth et al., 1970).
f. Uji dengan reagen Folin Ciocalteau
Pipet 5 ml larutan sampel pada butir a) dan 5 ml larutan tanin pada butir
b) dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung 2,5 ml pereaksi
fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Diamkan
selama 2 menit. Tambahkan 7,5 ml Na2CO3 1,9 M. Terbentuknya warna biru
menunjukkan adanya polifenol (Singleton, 1965).
36
4. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa
a. Persiapan
Pembuatan reagen Fenton
1. Larutan FeCl3 1 mM
Timbang seksama lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O, masukkan ke
dalam labu ukur 10 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda. Ambil
2,0 ml larutan tersebut, masukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Kemudian
encerkan dengan akuades hingga tanda.
2. Larutan EDTA 1 mM
Timbang seksama lebih kurang 18,61 mg Na EDTA, masukkan ke
dalam labu ukur 10 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda. Ambil
2,0 ml tersebut dan masukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Kemudian
encerkan dengan akuades hingga tanda.
3. Larutan vitamin C 1 mM
Timbang seksama lebih kurang 17,61 mg vitamin C, masukkan ke
dalam labu ukur 10 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda. Ambil
1,0 ml larutan tersebut masukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Kemudian
encerkan dengan akuades hingga tanda.
4. Larutan H2O2 20 mM
Ambil sebanyak 0,091 ml larutan H2O2 30 %, masukkan ke dalam
labu ukur 10 ml dan tambahkan akuades hingga tanda. Dari larutan
37
tersebut, diambil sebanyak 2,5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10
ml. Kemudian encerkan dengan akuades hingga tanda.
Pembuatan larutan Deoksiribosa 2,5 mM
Timbang seksama lebih kurang 20,95 mg deoksiribosa, masukkan ke
dalam labu ukur 10 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda. Dari
larutan ini, diambil sebanyak 4,0 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25
ml. Kemudian encerkan dengan akuades hingga tanda.
Pembuatan larutan TCA 5 %
Timbang seksama 2,5 g TCA, masukkan ke dalam beker glass 50 ml dan
tambahkan akuades secukupnya. Pindahkan larutan ke labu ukur 50 ml dan
tambahkan akuades hingga tanda.
Pembuatan larutan TBA 1 %
Timbang seksama 0,25 g TBA, masukkan ke dalam beker glass 100 ml
dan tambahkan akuades secukupnya, kemudian dipanaskan di atas hot plate
hingga seluruh TBA larut. Setelah itu, pindahkan larutan TBA tersebut ke
dalam labu ukur 25 ml dan tambahkan akuades hingga tanda.
Pembuatan larutan bufer fosfat
Timbang seksama sebanyak 1,4196 g Na2HPO4, masukkan ke dalam
labu ukur 500 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda. Kemudian
timbang seksama sebanyak 0,6805 g KH2PO4, masukkan ke dalam labu ukur
250 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda. Masukkan Na2HPO4
38
secukupnya ke dalam beker glass dan tambahkan larutan KH2PO4 bertetes-
tetes hingga tercapai pH 7,4 dengan bantuan pH meter.
Preparasi larutan standar tanin
Timbang 0,025 g serbuk tanin, larutkan di gelas beker dengan akuades
lalu masukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Tambahkan akuades hingga tanda,
sehingga diperoleh konsentrasi 1 mg/ml.
Preparasi Larutan Sampel fraksi etil asetat
Timbang 0,025 g fraksi etil asetat, larutkan di gelas beker dengan
akuades lalu masukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Tambahkan akuades hingga
tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 1 mg/ml.
b. Pengujian dengan Metode Deoksiribosa
Penentuan OT (Operating Time)
Pada tabung reaksi bertutup masukkan 300 µl larutan deoksiribosa 2,5
mM kemudian tambahkan 300 µl FeCl3 1 mM, 300 µl EDTA 1 mM, 300 µl
H2O2 20 mM, 4200 µl bufer fosfat pH 7,4 dan 300 µl asam askorbat 1 mM.
Inkubasikan pada temperatur 37 0C selama 30 menit, kemudian tambahkan 1
ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran tersebut dipanaskan pada
waterbath temperatur 80 0C selama 30 menit. Dinginkan dengan bantuan air
mengalir selama 5 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang
maksimum teoritis 532 nm selama 1 jam.
39
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks)
Pada tabung reaksi bertutup, masukkan berturut-turut, 200, 300, dan 400
µl larutan deoksiribosa 2,5 mM, kemudian pada masing-masing tabung
tersebut tambahkan 300 µl FeCl3 1 mM, 300 µl EDTA 1 mM, 300 µl H2O2
20 mM, bufer fosfat pH 7,4 dan 300 µl asam askorbat 1 mM (penambahan
bufer fosfat disesuaikan dengan volume deoksiribosa sehingga volume akhir
campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada temperatur 37 0C selama 30 menit,
kemudian tambahkan 1 ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran tersebut
dipanaskan pada waterbath temperatur 80 0C selama 30 menit. Dinginkan
dengan bantuan air mengalir selama 5 menit dan lakukan scanning absorbansi
pada panjang gelombang 400-600 nm.
Pengujian Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil Standar dan Larutan
Sampel
Pada 14 tabung reaksi, dimasukkan 600 µl larutan deoksiribosa 2,5 mM
dan larutan uji alga sebanyak 0 (sebagai kontrol negatif), 100, 200, 300, 400,
500, 600, 700, 800, 900 dan 1000 µl. Sebagai kontrol positif, masukkan 200,
400, 600, dan 800 µl larutan standar tanin ke dalam 4 tabung lainnya.
Kemudian ke dalam masing-masing tabung tersebut di atas, tambahkan 300 µl
FeCl3 1 mM, 300 µl EDTA 1 mM, 300 µl H2O2 20 mM, bufer fosfat pH 7,4,
dan 300 µl asam askorbat 1 mM (penambahan bufer fosfat disesuaikan
dengan volume larutan uji yang ditambahkan sehingga volume akhir
campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada temperatur 37 0C selama 30 menit,
40
kemudian tambahkan 1 ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran tersebut
dipanaskan pada waterbath temperatur 80 0C selama 30 menit, dinginkan dan
dibaca absorbansinya pada daerah operating time dan panjang gelombang
maksimum hasil pengukuran. Dari hasil absorbansi yang diperoleh
selanjutnya dihitung % scavengingnya dan dibuat persamaan regresi linier
yang merupakan hubungan antara konsentrasi fraksi etil asetat vs %
scavenging untuk menentukan nilai ES50. Lakukan replikasi sebanyak 5 kali.
G. Analisis Data
Aktivitas penangkapan radikal hidroksil dari larutan uji dilaporkan sebagai %
inhibisi degradasi deoksiribosa yang dihitung sebagai :
% Scavenging = x 100%
A kontrol = Absorbansi campuran reaksi kontrol
A uji = Absorbansi campuran larutan uji
Nilai ES50 ditetapkan menggunakan persamaan regresi linier, dengan sumbu x
adalah konsentrasi fraksi etil asetat alga dan sumbu y adalah % scavenging.
41
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Persiapan sampel Alga Coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin)
J. Agardh
Alga coklat Sargassum diambil dari Pantai Drini, Gunungkidul, Yogyakarta
pada musim penghujan, tepatnya pada tanggal 23 Maret 2007. Pengambilan sampel
ini dilakukan saat air laut surut sekitar 300 m dari tepi pantai pada pukul 16.00-17.00
BBWI dan temperatur air laut mencapai 270C. Terdapat banyak karang pada daerah
pantai tempat diambilnya alga coklat Sargassum. Hal ini dikarenakan secara ekologis,
alga coklat berperan dalam pembentukan ekosistem terumbu karang. Umur alga
coklat Sargassum yang dipanen tidak dapat diketahui secara pasti karena alga ini
langsung diambil dari alam dan bukan merupakan jenis alga coklat Sargassum yang
dibudidayakan (Stephanie, 2007).
Identifikasi spesies alga dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan
Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Berdasarkan hasil
identifikasi, sampel alga coklat Sargassum termasuk dalam ordo Fucales, famili
Sargassaceae, genus Sargassum, dan spesies Sargassum hystrix v. buxifolium
(Chauvin) J. Agardh (Stephanie, 2007) .
Alga coklat Sargassum tumbuh dalam suatu ekosistem biota laut yang terdiri
dari berbagai jenis spesies alga. Maka perlu dilakukan pemisahan spesies alga coklat
42
Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh. dari spesies alga coklat
Sargassum lainnya. Pemisahan dilakukan dengan melihat ciri-ciri fisiknya yaitu daun
panjang, lurus (tidak bergelombang), dan mempunyai banyak percabangan.
Pencucian alga utuh dilakukan dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-
kotoran yang menempel pada permukaan alga berupa epifit, sedimen, pasir yang
mengandung silikat, zat kapur, dan bahan organik asing yang bukan berasal dari alga
coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh, yang dapat mengganggu
proses analisis kuantitatif polifenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau
(Stephanie, 2007).
Setelah proses pencucian, alga coklat di autoklaf pada temperatur 1000C
selama 30 menit untuk menginaktifasi enzim polifenol oksidase. Enzim ini dapat
mengkatalisis 2 reaksi oksidatif dengan kombinasi molekul oksigen, yaitu:
hidroksilasi monofenol menjadi o-difenol (oksidasi monofenol) dan oksidasi difenol
menjadi o-kuinon (oksidasi difenol) (Whitaker, 1996), seperti terlihat pada gambar 8.
Proses oksidasi polifenol ini menyebabkan polifenol kehilangan gugus –OH, gugus
yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan.
Enzim polifenol oksidase bersifat termolabil. Menurut penelitian Gonzalez et
al. (1992), polifenol oksidase dalam ekstrak alpukat akan kehilangan aktivitasnya
sebesar 98 % pada pemanasan temperatur 800C selama 30 menit, sedangkan pada
penelitian Chutintrasri dan Noomhorm (2003), polifenol oksidase yang terkandung
dalam buah nanas akan kehilangan aktivitas sebesar 99,7% pada pemanasan
43
temperatur 900C selama 30 menit. Oleh karena itu, dibutuhkan temperatur yang lebih
besar dari 900C untuk menginaktifasi enzim tersebut.
OH
CH3
OH
OH
O2
O2
BH2
OH
CH3
OH
O
O
B
2H2O
H2O
p-Cresol
+ +
Donor proton
+ +
4-Methyl cathecol
1. Oksidasi Monofenol
2. Oksidasi Difenol
2 + 2 +
Cathecol o-Benzoquinone
Gambar 8. Reaksi oksidasi monofenol dan difenol oleh polifenol oksidase
(Miyawaki, 2006)
Selanjutnya, sampel alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J.
Agardh. dikeringkan dalam oven dengan temperatur 900C hingga benar-benar kering
(simplisia mudah dihancurkan dengan kekuatan tangan). Ketebalan lapisan alga
coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh di oven harus
diperhatikan agar pengeringan dapat berjalan sempurna sehingga mencegah
tumbuhnya jamur dan mikroba lain yang dapat merusak senyawa-senyawa yang
terkandung dalam alga coklat. Tujuan pengeringan adalah mempermudah
penyerbukan simplisia yang selanjutnya akan mempermudah proses penyarian juga.
44
Serbuk simplisia kemudian diayak dengan derajat halus 20/30. Serbuk yang terlalu
halus akan mempersulit penyaringan, karena butir-butir halus tadi membentuk
suspensi yang sulit dipisahkan dengan hasil penyaringan. Dengan demikian hasil
penyarian tidak murni lagi tetapi bercampur dengan partikel-partikel halus tadi.
Dengan penyerbukan yang terlalu halus juga menyebabkan banyak dinding sel yang
pecah sehingga zat yang tidak diinginkanpun ikut ke dalam hasil penyarian (Anonim,
1986).
Penetapan kadar air dilakukan menggunakan moisture balance dimana serbuk
alga coklat dipanaskan selama 15 menit pada suhu 1100C dan dicatat persen bobot
sisa serbuk setelah pemanasan. Serbuk diambil dari wadah plastik yang disimpan
pada temperatur kamar. Tujuan penetapan kadar air adalah menjamin bahwa kadar air
dalam simplisia memenuhi standar yang ditetapkan, sehingga dapat menghindari
pertumbuhan mikroorganisme atau jamur yang menyebabkan rusaknya kandungan
kimia dalam serbuk. Selain itu, adanya lembab dalam simplisia juga mempermudah
terjadinya oksidasi polifenol. Standar yang dipergunakan adalah kadar air dalam
serbuk simplisia tidak boleh lebih dari 10% (Anonim, 1995).
Tabel 2. Hasil penetapan kadar air dalam serbuk alga
Replikasi Kadar air (%) I 9,33 II 9,31 III 9,74
Rata-rata 9,46 SD 0,243 CV 2,566
45
Dari hasil yang ditunjukkan tabel 2, didapatkan bahwa kadar air dalam serbuk
simplisia kurang dari 10%, sehingga serbuk simplisia masih memenuhi persyaratan
yang ditetapkan.
B. Isolasi Crude Florotannin dari Serbuk Alga Sargassum hystrix
Serbuk alga Sargassum hystrix yang telah ditimbang, diekstraksi dengan cara
sokhletasi. Pemilihan cara ekstraksi ini didasarkan atas efisiensi dan efektivitas
sokhletasi, yaitu pelarut yang digunakan untuk menyari zat aktif selalu baru dan tidak
perlu diganti sehingga kapasitas dalam menyari zat aktif lebih besar. Proses
sokhletasi dilakukan pada temperatur 800C (temperatur di atas titik didih metanol,
64,51 0C) sampai cairan penyari menjadi jernih dengan total waktu 33 jam. Pada
penelitian ini tidak dilakukan optimasi waktu proses sokhletasi. Alasan penggunaan
metanol sebagai cairan penyari dibandingkan aseton 70% adalah karena sifat metanol
yang lebih polar, sehingga lebih selektif dalam mengekstraksi senyawa-senyawa
polar terutama florotannin. Penggunaan metanol sebagai cairan pengekstraksi
mengacu pada penelitian Nagayama et al. (2002).
Setelah proses sokhletasi selesai, ekstrak diuapkan menggunakan vacuum
rotary evaporator sampai volume kecil (sekitar 1/10 volume mula-mula). Tujuan
penguapan ialah memekatkan ekstrak sehingga mempermudah proses fraksinasi.
Proses fraksinasi mengacu pada fraksinasi yang dilakukan oleh Nagayama et
al. (2002) menggunakan metanol, kloroform dan air dengan perbandingan 60: 120:
45 ml. Proses fraksinasi dilakukan sampai terjadi kesetimbangan antara fase atas dan
46
fase bawah. Kloroform memiliki berat jenis yang lebih besar dari pada metanol-air,
sehingga fase kloroform berada di bawah dan fase metanol-air berada di atas. Fase
kloroform yang lebih non polar dibandingkan dengan metanol-air akan melarutkan
senyawa-senyawa yang non polar seperti pigmen, lipid dan vitamin E sedangkan fase
metanol-air akan menarik senyawa-senyawa yang lebih polar seperti polisakarida,
florotannin, iodin, vitamin C, mineral dan garam alginat. Fase metanol-air kemudian
diekstraksi sebanyak 2 kali menggunakan pelarut etil asetat dengan perbandingan 75:
75 ml. Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali karena hasil ekstraksi lebih baik jika
jumlah ekstraksi yang dilakukan berulang-ulang dengan jumlah pelarut sedikit-sedikit
(Khopkar, 1990). Pelarut etil asetat akan menarik zat-zat yang bersifat relatif lebih
non polar seperti florotannin sedangkan fase metanol akan menarik senyawa-senyawa
yang lebih polar seperti vitamin C, iodin, garam alginat, mineral dan polisakarida,
sehingga akan didapatkan fraksi yang lebih murni.
Fraksi etil asetat dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur 80 0C
(temperatur di atas titik didih etil asetat; 77,11 oC) sampai kering sehingga diperoleh
crude florotannin yang akan diuji aktivitas antioksidannya. Untuk meminimalkan
kerusakan polifenol florotannin, fraksi dibungkus dengan aluminium foil dan
disimpan di dalam freezer. Penyimpanan di dalam freezer mengacu pada penelitian
yang dilakukan Koivikko et al. (2005).
47
C. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik
Florotannin merupakan senyawa polifenol oleh karena itu, dilakukan uji
tabung yang mampu mengidentifikasi adanya polifenol.
1. Uji pendahuluan
Adanya penambahan KOH (basa) akan menyebabkan polifenol dalam fraksi
mudah teroksidasi oleh udara menjadi bentuk kuinon sehingga hasil positif
ditunjukkan dengan warna larutan yang lebih gelap karena adanya perpanjangan
gugus kromofor. Pemanasan akan mempercepat proses oksidasi tersebut. Pada uji
tabung, larutan uji menunjukkan hasil negatif.
2. Uji tanin
Florotannin merupakan subkelompok dari tanin (Koivikko et al., 2005), oleh
karena itu dilakukan uji gelatin untuk mengidentifikasi florotannin. Tanin dapat
berikatan dengan protein gelatin (ikatan hidrogen atau interaksi hidrofobik) sehingga
menyebabkan presipitasi (Bruneton, 1999). Penambahan NaCl meningkatkan
sensitivitas reaksi melalui fenomena salting out pada kompleks tanin-protein. Apabila
presipitasi hanya terjadi saat penambahan garam, disebut reaksi positif palsu
(Fansworth et al., 1970). Pengujian menunjukkan hasil negatif karena tidak terbentuk
endapan sedangkan kontrol positif tanin menghasilkan suspensi (larutan menjadi
keruh).
3. Uji polifenol
Penambahan FeCl3 berfungsi membentuk kompleks warna biru dengan gugus
hidroksil pada polifenol florotannin (Farnsworth et al., 1970). Larutan uji
48
memberikan hasil negatif (tidak terdapat warna biru), sedangkan kontrol positif tanin
menunjukkan terbentuknya warna biru.
Ketiga uji tabung di atas memberikan hasil negatif dikarenakan konsentrasi
polifenol yang kecil sehingga uji tabung tidak cukup sensitif untuk mendeteksi
keberadaan polifenol.
4. Uji dengan reagen Folin-Ciocalteau
Uji ini didasarkan pada reaksi oksidasi reduksi yaitu pada suasana basa, ion
fenolat yang berasal dari senyawa fenolik mudah teroksidasi oleh asam fosfomolibdat
sementara juga mereduksinya membentuk produk berwarna biru (Waterman dan
Mole, 1994). Pengujian menunjukkan hasil positif larutan bewarna biru. Hal ini
menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung polifenol.
D. Penentuan Operating Time
Tujuan penetapan operating time ialah menentukan rentang waktu dimana
kromogen MDA-TBA menunjukkan absorbansi yang stabil, sehingga pengukuran
bisa reprodusibel dan kesalahan analisis diminimalkan. Penetapan operating time
dilakukan dengan mengukur absorbansi kromogen MDA-TBA pada panjang
gelombang teoritis 532 nm setiap 2 menit selama 60 menit. Hasilnya terlihat pada
gambar 9, yaitu pada menit ke-0 sampai ke-60, absorbansi memberikan nilai yang
stabil yang menunjukkan bahwa reaksi antara MDA dan TBA sudah sempurna dan
berhenti.
49
Pembentukan warna dilakukan dengan mereaksikan campuran reaksi yang
telah diinkubasi dengan asam trikloroasetat (TCA) dan asam tiobarbiturat (TBA).
Penambahan TCA berfungsi untuk menurunkan kecepatan reaksi degradasi
deoksiribosa oleh radikal hidroksil karena dalam suasana asam proses oksidasi
vitamin C akan terhambat. Dengan terhambatnya proses oksidasi vitamin C maka
proses reduksi dari Fe3+ menjadi Fe2+ akan terhambat pula sehingga pembentukan
radikal hidroksil juga akan terhambat. Reagen TCA juga memberikan suasana asam
sehingga mengkatalisis reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA.
Gambar 9. Kurva penetapan operating time kromogen MDA-TBA
50
N
N
H
O
HH
O
H
S
N
N
H
O
HO
H
S H
+H
H
Gambar 10. Reaksi pembentukan enol pada TBA (Purwantoko, 2006)
N
N
H
O
H
O
H
S H O
H
O
H
N
N
H
O
O
H
S
H
OH
H
H
O
N
N
H
O
H
O
H
SH
N
N
H
O
O
H
S
N
N
OH OH
HH
H
O S
OH
H
H
H
N
N
H
O
O
H
S
N
N
OH
HH
O S
H
O
H
H
H
-H2O N
N
H
O
O
H
S
N
N
HH
O S
H
OH
H
H
N
N OH
OH
S
N
NHO SH
OHMDA-TBAberwarna pink
OHH
H
OHH
H
N
N
H
O
O
H
S
N
N
HH
O S
H
OH
H
N
N
H
O
O
H
S
N
N
HH
O S
H
OH
H
OH
HH
- H2ON
N OH
OH
S
N
NHO S
OHH
Gambar 11. Usulan reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA (Purwantoko, 2006)
51
Pembentukan warna diawali dengan pengubahan salah satu gugus keton pada
TBA menjadi gugus enol yang lebih reaktif sehingga TBA mudah bereaksi dengan
MDA (gambar 10). Reaksi terjadi antara 2 molekul TBA dengan 1 molekul MDA dan
melepaskan dua molekul air seperti yang terlihat pada gambar 11. Reaksi ini terjadi
saat pemanasan pada suhu 80 0C. Pemanasan berfungsi mempercepat reaksi
pembentukan kromogen antara MDA dan TBA.
E. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks)
Panjang gelombang maksimum (λmaks) adalah panjang gelombang dimana
kromogen MDA-TBA memberikan absorbansi maksimum. Pengukuran absorbansi
perlu dilakukan pada λmaks karena pada λmaks sedikit perubahan konsentrasi akan
memberikan perubahan absorbansi yang besar sehingga didapatkan sensitivitas
analisis yang maksimum. Selain itu, kurva pada λmaks relatif datar sehingga adanya
sedikit pergeseran panjang gelombang karena variasi instrumental, absorbansi tetap
stabil.
= gugus kromofor = gugus auksokrom
Gambar 12. Struktur kromogen MDA-TBA
52
Penetapan (λmaks) dilakukan dengan scanning terhadap kromogen MDA-TBA
dengan konsentrasi 0,079; 0,1185 dan 0,158 mM pada panjang gelombang visibel
(400-600 nm). Kromogen bisa terukur pada daerah visibel karena adanya reaksi
pengkoplingan antara MDA dan TBA yang mengakibatkan adanya perpanjangan
gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom sehingga terbentuk warna pink
(gambar 12). Pemilihan rentang panjang gelombang ini didasarkan atas warna
kromogen yang berwarna merah muda berada pada rentang panjang gelombang 490-
560 nm, oleh karena itu scanning juga dilakukan di daerah sekitar rentang tersebut.
Gambar 13. Kurva scanning panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA
53
Dari hasil scanning pada gambar 13, didapatkan bahwa ketiga konsentrasi
memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang yang sama, yaitu 531,5
nm dengan nilai absorbansi berturut-turut 0,250; 0,323 dan 0,372. Panjang
gelombang ini mendekati panjang gelombang teoritis 532 nm (Halliwell dan
Gutteridge, 1988) dan akan digunakan dalam pengukuran selanjutnya.
F. Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Heo et al. (2006), fraksi etil asetat
alga coklat mengandung florotannin yang memiliki aktivitas antioksidan. Florotannin
mengandung gugus OH fenolik yang berperan besar dalam menangkap radikal
hidroksil. Pengujian aktivitas pada penelitian ini dilakukan dengan penambahan
berbagai seri konsentrasi larutan fraksi etil asetat ke dalam campuran reagen Fenton.
Penggunaan kontrol negatif berfungsi sebagai pembanding untuk mengetahui
nilai absorbansi kromogen MDA-TBA apabila dalam campuran reaksi tidak terdapat
senyawa yang beraktivitas antioksidan. Penggunaan kontrol positif tanin berfungsi
sebagai pembanding terhadap senyawa uji jika dalam campuran reaksi terdapat
senyawa standar yang beraktivitas antioksidan.
Tabel 3. Penurunan Absorbansi Kromogen MDA-TBA pada Penambahan Tanin
Absorbansi Konsentrasi senyawa tanin (mg/ml) Rep I Rep II Rep III Rep IV Rep V
0 0,540 0,519 0,519 0,531 0,568 0,0333 0,397 0,378 0,373 0,381 0,409 0,0677 0,263 0,251 0,246 0,253 0,277
0,1 0,198 0,169 0,164 0,179 0,199 0,1333 0,149 0,128 0,130 0,136 0,158
Ket: Rep = Replikasi
54
Tabel 4. Persen scavenging dan ES50 senyawa standar tanin
% scavenging Konsentrasi senyawa tanin (mg/ml) Rep I Rep II Rep III Rep IV Rep V
0,0333 26,481 27,167 28,131 28,249 27,993 0,0677 51,296 51,638 51,638 52,354 51,232
0,1 63,333 67,437 68,401 66,290 64,965 0,1333 72,407 75,337 74,952 74,388 72,183
Persamaan regresi Y = 451,838x +
15,619
Y = 483,201x +
15,0112
Y = 473,825x +
16,181
Y = 571,741x +
10,658
Y = 441,093x +
17,229 Nilai r 0,974 0,976 0,973 0,991 0,973
ES50 (mg/ml) 0,076 0,072 0,071 0,069 0,074 Rata-rata ES50 (mg/ml) 0,0724
SD 2,7019 x 10-3 CV (%) 3,73
Ket: Rep = Replikasi
Berdasarkan tabel 3 dan tabel 4, kontrol negatif menunjukkan nilai absorbansi
yang lebih besar dibandingkan dengan berbagai seri larutan kontrol positif. Hal ini
disebabkan pada kontrol negatif tidak mengandung senyawa penangkap radikal
hidroksil, sehingga jumlah radikal hidroksil yang dihasilkan reagen Fenton lebih
banyak. Akibatnya, molekul MDA yang terbentuk juga lebih banyak sehingga jumlah
MDA-TBA lebih banyak dan absorbansi lebih tinggi.
Semakin besar konsentrasi tanin yang ditambahkan, maka jumlah tanin yang
menangkap radikal hidroksil semakin banyak dan proses degradasi deoksiribosa oleh
radikal hidroksil semakin sedikit sehingga MDA yang terbentuk juga semakin sedikit.
Hal ini menyebabkan penurunan jumlah kromogen MDA-TBA sehingga absorbansi
menurun dibandingkan dengan kontrol negatif. Besarnya kemampuan fraksi dalam
menangkap radikal hidroksil dinyatakan dengan % scavenging. Pada penelitian ini,
didapatkan korelasi yang linier antara konsentrasi tanin yang ditambahkan dengan %
55
scavenging (terlihat pada nilai r yang ditunjukkan tabel 4) sehingga ES50 dapat
dianalisis. Nilai ES50 merupakan konsentrasi tanin yang memberikan aktivitas
penangkapan radikal hidroksil sebesar 50%. Nilai ES50 rata-rata tanin yang
didapatkan dari penelitian ini adalah 0,07 mg/ml.
Tabel 5. Absorbansi MDA-TBA pada berbagai penambahan konsentrasi fraksi etil asetat
Replikasi Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
I II III IV V Rata-rata SD CV (%)
0 0,540 0,519 0,519 0,531 0,568 0,5354 0,0203 3,79 0,0167 0,564 0,542 0,530 0,584 0,587 0,5614 0,0252 4,49 0,0333 0,613 0,601 0,578 0,569 0,607 0,5936 0,0191 3,22 0,05 0,685 0,675 0,655 0,689 0,618 0,6644 0,0291 4,38
0,0677 0,703 0,690 0,671 0,675 0,651 0,678 0,0197 2,91 0,0833 0,677 0,657 0,598 0,685 0,610 0,6454 0,0394 6,10
0,1 0,680 0,698 0,676 0,647 0,662 0,6726 0,0192 2,85 0,1167 0,717 0,653 0,661 0,624 0,635 0,658 0,0361 5,49 0,1333 0,649 0,640 0,597 0,570 0,631 0,6174 0,033 5,35 0,15 0,671 0,667 0,601 0,590 0,641 0,634 0,0372 5,87
0,1677 0,680 0,694 0,623 0,617 0,631 0,649 0,0354 5,45 Konsentrasi fraksi etil asetat vs rata-rata absorbansi
A = 0,6104 B = 0,2932 r = 0,4003
Y= 0,2932x + 0,6104
Gambar 14. Grafik konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml) vs absorbansi rata-rata
kromogen MDA-TBA
56
Berbeda dengan kontrol positif, untuk fraksi etil asetat dapat terlihat pada
tabel 5 bahwa aktivitas antioksidan tidak sebanding dengan konsentrasi fraksi yang
ditambahkan. Larutan kontrol merupakan larutan yang tidak mengandung fraksi alga
dan seharusnya memiliki absorbansi yang lebih besar dari larutan uji, tetapi hasil
yang didapatkan sebaliknya. Larutan uji dengan konsentrasi terkecil 0,0167 mg/ml (~
0,02 mg/ml) memiliki absorbansi lebih besar daripada larutan kontrol, dan dengan
semakin banyaknya penambahan larutan uji absorbansi naik dan turun secara
fluktuatif (gambar 14). Berdasarkan uji statistik, diperoleh bahwa penambahan
konsentrasi fraksi etil asetat tidak berkorelasi dengan absorbansi kromogen MDA-
TBA, oleh karena itu untuk melihat adanya signifikansi perbedaan antara absorbansi
fraksi etil asetat dan kontrol negatif dilakukan uji statistik menggunakan uji t dengan
taraf kepercayaan 95%. Hasil yang didapatkan terlihat pada tabel 6.
Tabel 6. Tabel hasil uji statistik perbandingan aktivitas fraksi dan kontrol negatif
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Signifikan/ Tidak signifikan
0,0167 Tidak signifikan 0,0333 Signifikan 0,05 Signifikan
0,0677 Signifikan
0,0833 Signifikan
0,1 Signifikan
0,1167 Signifikan
0,1333 Signifikan
0,15 Signifikan
0,1677 Signifikan
Berdasarkan tabel 6, fraksi dengan konsentrasi terkecil 0,0167 mg/ml (~ 0,02
mg/ml) memiliki absorbansi yang tidak berbeda signifikan dengan kontrol negatif
57
sedangkan pada konsentrasi fraksi yang lebih besar yaitu konsentrasi 0,033 mg/ml
dan seterusnya absorbansi berbeda signifikan dengan kontrol negatif. Hal ini
membuktikan bahwa fraksi etil asetat dengan konsentrasi terkecil (0,02 mg/ml) tidak
memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil dan pada konsentrasi lebih besar,
memberikan aktivitas prooksidan yang merupakan keadaan dimana penambahan
fraksi uji tidak memberikan aktivitas penangkapan radikal hidroksil tetapi justru
menstimulasi pembentukan radikal hidroksil sehingga mempercepat kerusakan
oksidatif DNA, protein dan karbohidrat secara in vitro (Yen et al., 1997).
Aktivitas prooksidan florotannin disebabkan karena senyawa ini telah
teroksidasi selama penyimpanan oleh udara dengan katalis logam transisi yang
terkandung dalam alga coklat sendiri membentuk produk semikuinon dan kuinon
serta radikal hidroksil. Proses oksidasi polifenol dapat digambarkan dengan reaksi
pada gambar 15.
Reaksi diawali dengan oksidasi senyawa polifenol oleh Cu (II) membentuk
produk semikuinon (reaksi i) yang dapat bereaksi dengan O2 membentuk kuinon dan
O2.- (reaksi ii). Reaksi ini memiliki sifat autokatalitik, dimana O2
.- akan mengoksidasi
senyawa induk membentuk semikuinon dan H2O2 (reaksi iii). H2O2 dapat terbentuk
juga melalui disproporsionasi O2.- (reaksi 4). Dengan adanya Cu (I), H2O2 dengan
cepat diubah menjadi OH· seperti halnya reaksi Fenton (reaksi 5). Hal ini
menyebabkan jumlah radikal hidroksil dalam campuran reaksi semakin banyak
sehingga semakin banyak pula deoksiribosa yang terdegradasi dan absorbansi
58
kromogen MDA-TBA semakin besar dibandingkan dengan kontrol negatif (Sakihama
et al., 2002).
OH
OH
Cu (II)
O
O
O2
OH
OH
O2
2O2
Cu (I) H2O2
H2O2
Cu (II)
O
O
O
O
O
O
O2
Cu(I)
O2
H2O2
+ +
++
+ + + 2H+ (i)
+ 2H+ +
+ + OH + OH
DNA damage
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
Gambar 15. Reaksi prooksidan pada senyawa fenolik (Sakihama et al., 2002)
Alga coklat mengakumulasi logam dan elemen kecil lain dari lingkungannya.
Beberapa komponen dari alga coklat yang memiliki peranan penting dalam akumulasi
elemen tersebut adalah protein serta polisakarida anionik seperti alginat dan fukoidan.
Menurut penelitian yang dilakukan Krentz (2004) pada alga coklat Hiziki, ekstrak
protein alga memiliki konsentrasi Fe dengan konsentrasi paling tinggi dan ekstrak
fukoidan dengan konsentrasi Cu paling tinggi. Pada alga coklat Wakame, ekstrak
protein memiliki konsentrasi Fe dan Cu dengan konsentrasi paling tinggi. Logam
pereduksi yang terikat protein pada alga coklat seperti Cu dan Fe dapat terlepas saat
protein terdenaturasi dalam proses autoklaf. Dengan adanya logam pereduksi, kondisi
59
penyimpanan serbuk alga coklat yang tidak terkendali (adanya O2 di sekitar
lingkungan serbuk), dan kandungan lembab menyebabkan florotannin teroksidasi
selama masa penyimpanan, sehingga terbentuk produk kuinon atau semikuinon yang
tidak memiliki aktivitas antioksidan serta radikal hidroksil yang memicu aktivitas
prooksidan. Faktor lain pemicu kerusakan florotannin adalah prosedur pengambilan
sampel fraksi etil asetat yang tidak terkendali (fraksi diambil dan ditimbang sebagian
untuk pengujian aktivitas antioksidan kemudian disimpan kembali untuk pengujian
pada hari berikutnya), sehingga memungkinkan sampel kontak dengan udara luar
yaitu O2 dan cahaya.
Terjadinya proses oksidasi florotannin sama halnya dengan penelitian yang
dialami oleh Ragan dan Glombitza, 1986. Hal inilah yang memungkinkan dalam
penelitian isolasi florotannin, ekstrak florotannin sering diasetilasi menggunakan
asetat anhidrida-piridin untuk melindunginya dari oksidasi (Li dan Glombitza, 1991;
Glombitza dan Keusgen, 1995; Glombitza dan Schmidt, 1999a; Glombitza dan
Schmidt, 1999b; Sailler dan Glombitza, 1999; Glombitza dan Pauli, 2003). Menurut
Heo et al., 2006 dan Shin et al., 2006 sampel alga coklat yang digunakan dalam
pengujian aktivitas antioksidan dalam keadaan segar (setelah sampel diambil
langsung diuji) sedangkan pada penelitian ini serbuk alga coklat telah disimpan
kurang lebih 1 tahun. Hal inilah yang menyebabkan fraksi etil asetat pada alga coklat
Sargassum hystrix kehilangan aktivitasnya selama masa penyimpanan.
60
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Fraksi etil asetat ekstrak metanolik Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J.
Agardh tidak memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada konsentrasi
0,02 mg/ml tetapi menimbulkan aktivitas prooksidan pada konsentasi 0,03 mg/ml
atau lebih.
B. Saran
1. Sampel alga coklat yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan harus
benar-benar baru untuk menghindari rusaknya polifenol florotannin karena proses
oksidasi selama penyimpanan.
2. Fraksi etil asetat sebaiknya dibagi-bagi terlebih dahulu di beberapa wadah
sebelum pengujian aktivitas antioksidan untuk meminimalkan kerusakan
florotannin yang disebabkan pengambilan sampel secara berulang.
3. Perlu dilakukan studi lebih lanjut tentang cara pengendalian stabilitas polifenol
florotannin selama masa penyimpanan dan penanganan sampel.
61
DAFTAR PUSTAKA
Ahn, G. N., Kim, K. N., Cha, S. H., Song, C. B., Lee, J., Heo, M. S., Yeo, I. K., Lee,
N. H., Jee, Y. H., Kim, J. S., Heu, M. S., and Jeon, Y. J., 2007, Antioxidant activities of phlorotannins purified from Ecklonia cava on free radical scavenging using ESR and H2O2-mediated DNA damage, Eur. Food. Res. Technol., In Press, 29.
Ames, B. N., 1983, Dietary Carcinogens and Anticarcinogens: Oxygen Radicals and
Degenerative Disease, Sci., 221, (4617), 1256–1264. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1, 8-28, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 1995, Materia Medika Indonesia, Jilid VI, XIV, DepKes RI, Jakarta. Aruoma, O. I., 1996, Characterization of Drugs as Antioxidant Prophylactics, Free
Radical Biology and Medc., 20, (5), 675–705. Breen, A. P. and Murphy, J. A.,1995, Reactions of Oxyl Radicals with DNA, Free
Radic. Biol. Med., 18, 1033-1077. Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy. Phytochemistry Medicinal Plants, Edisi 2,
diterjemahkan oleh Caroline K. Hatton, 385 – 386, 11.rue Lavoisier, Paris Burtin, P., 2003 , Nutrional Value of Seaweeds, EJEAFChe , France, 2, (4) , 498-
500. Burton, G. W., Foster, D. O., Perly, B., Slater, T. F., Smith, I. C. P., and Ingold, K.
U., 1985, Biological Antioxidants, Philosophical Society of Royal Transactions of London, Series B, Biol. Sci., 311, 565-576.
Cerruti, P. A.,1994, Oxy-radicals and Cancer, Lancet, 344, 862- 863. Cheeseman, K. H., Beavis, A., and Esterbauer, H., 1988, Hydroxyl-radical-induced
iron-catalysed Degradation of 2-deoxyribose, Biochem. J., 252, 649-653. Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, Edisi VI, 460, John Wiley & Sons, Inc.,
United State of America. Chutintrasri, B. and Noomhorm, A., 2003, Thermal Inactivation of
Polyphenoloxidase in Pineapple Puree, Food. tech., 1-4.
62
Conte, D., 1996, Iron- Replaced Zinc Finger: The Effects on DNA Binding and Its Potential Use and Consequences, p.35, Thesis, Department of Biochemistry, University Of Toronto, Canada.
Dean, R. T., Fu, S., Stocker, R., and Davies, M. J., 1997, Biochemistry and Pathology
of Radical-Mediated Protein Oxidation, Biochem. J., 324, 1-18. Decker, E., 1998, Strategies for Manipulating the Prooxidative Antioxidative
Balance of Foods to Maximize Oxidative Stability, Trends Food Sci. Technol., 9, 241-248.
Evans, W. C., 2002, Trease and Evans Pharmacology, Fifteenth Edition, 224, W. B.
Saunders, China. Farnsworth, N. R., Fong, H. S., and Tin, W. M., 1970, Phytochemical Screening, 63,
Department of Pharmacognosy and Pharmacology, University of Illinois, Chicago.
Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1994, Kimia Organik Jilid II, diterjemahkan
oleh Pudjaatmaka, A.H., Edisi ketiga, 436-444, Penerbit Erlangga, Jakarta. Finkel, T. and Holbrook, N. J., 2000. Oxidants, Oxidative Stress and the Biology of
Aging. Nature, 408, (9), 239-247. Frank, H., Thiel, D., and MacLoad, J., 1989, Mass Spectrometric Detection of Cross-
linked Fatty Acids Formed during Radical Induced Lesion of Lipid Membranes, Biochem. J., 260, 873-878.
Glombitza, K. W. and Gerstberger, G., 1985, Phlorotannins with Dibenzodioxin
Structural Elements from the Brown Alga Eisenia arborea. Phytochemistry, 24, 543-551 .
Glombitza, K. W. and Keusgen, M., 1995, Fuhalols and Deshydroxyfuhalols from the
Brown Alga Sargassum spinuligerum, Phytochemistry, 38, 987-995. Glombitza, K. W. and Pauli, K., 2003, Fucols and Phlorethols from the Brown Alga
Scytothamnus australis Hook. et Harv. (Chnoosporaceae), Bot. Mar., 46, 315-320.
Glombitza, K. W. and Schmidt, A., 1999a, Nonhalogenated and Halogenated
Phlorotannins from the Brown Alga Carpophyllum angustifolium, J. Nat. Prod., 62, 1238-1240.
63
Glombitza, K. W. and Schmidt, A., 1999b, Trihydroxyphlorethols from the Brown Alga Carpophyllum angustifolium, Phytochemistry, 51, 1095-1100.
Gonzalez, A. T., Mazariegos, R. M., and Cantwell, M., 1992, Inactivation in situ of
Polyphenol Oxidase in Ripe Avocado Fruit, Proc. of Second World Avocado Congress, 409-416.
Gulcin, I., Uguz, M. T., Oktay, M., Beydemir, S., and Kufrevioglu, O. I., 2004,
Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.), Turk. J. Agric. For., 28, 25-33.
Gupta, M., Mazumder, U. K., and Gomathi, P., 2007, In Vitro Antioxidant and Free
Radical Scavenging Activities of Galega purpurea Root, Phcog. Mag., 3, (12), 219-223.
Gutteridge, J. M. C., Rowley, D. A., and Halliwell, B., 1981, Superoxide Dependent
Formation of Hydroxyl Radical in the Presence of Iron Salts, Biochem. J., 199, 263-265.
Gutteridge, J. M. C. and Halliwell, B., 1994, Antioxidants in Nutrition, Health, and
Disease, 72, Oxford University Press, Oxford, UK. Gutierrez, P. L., 2000, The Metabolism of Quinone-Containing Alkylating Agents:
Free Radical Production and Measurement, Frontiers in Biosci., 5, 629-638. Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. C., 1988, The Deoxyribose Assay: an Assay both
for 'Free' Hydroxyl Radical and for Site-Specific Hydroxyl Radical Production, Biochem., 253, 932-933.
Halliwell, B. and Chirico, S., 1993, Lipid Peroxidation: It’s Mechanism,
Measurement, and Significance, Am. J. Clin. Nutr., 57, 715S-25S. Halliwell, B., 1994, Free Radicals and Antioxidants: a Personal View, Nutr. Rev., 52,
253-265. Halliwel, B. and Gutteridge, J. M. C., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine,
Third Edition, 22, 53, Oxford University Press, New York. Ham, Y. M., Baik, J. S., Hyun, J. W., and Lee, N. H., 2007, Isolation of a New
Phlorotannin, Fucodiphlorethol G, from a Brown Alga Ecklonia cava, Bull. Korean. Chem. Soc., 2007, 28, (9), 1597.
64
Harman, D., 1993, Free Radical Involvement in Aging, Pathophysiology and Therapeutic implications, Drugs and Aging, 3, (1), 60–80.
Hashimoto, T., Mashahiko, Y., and Hajime, N., 2003, Selective Brain Hypothermia
Protects against Hypoxic-Ischemic Injury in Newborn Rats by Reducing Hydroxyl Radical Production, Kobe J. Med. Sci., 49, (4), 83-91.
Heo, S. J., Kim, J. P., Jung, W. K., Lee, N. H., Kang, H. S., Jun, E. M., Park, S. H.,
Kang, S. M., Lee, Y. J., Park, P. J., and Jeon, Y. J., 2006, Identification of Chemical Structure and Free Radical Scavenging Activity of Diphlorethohydroxycarmalol Isolated from a Brown Alga, Ishige okamurae, J. Microbiol. Biotechnol., 1-5.
Huang, D., Ou, B., and Prior, R. L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant
Capacity Assays, J. Agric. Food Chem., 53, 1841-1856. Janeiro, P. and Brett, A. M. O., 2004, Cathecin Electrochemical Oxidation
Mechanism, Anal. Chim. Acta, 518, 109–115. Kadi, A., 2007, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di Perairan Indonesia,
http://www.oseanografi.lipi.go.id/volxxxno.42.pdf, diakses tanggal 20 Februari 2007.
Kang, K., Park, Y., Hwang, H. J., Kim, S. H., Lee, J. G., and Shin, H. C., 2003,
Antioxidative Properties of Brown Algae Polyphenolics and Their Perspectives as Chemopreventive Agents Against Vascular Risk Factors, Arch. Pharm. Res., 26, 286-293.
Kang, K. A., Lee, K. H., Chae, S., Zhang, R., Jung, M. S., Ham, Y. M., Baik, J. S.,
Lee, N. H., and Hyun, J. W., 2006, Cytoprotective effect of phloroglucinol on oxidative stress induced cell damage via catalase activation, J. Cell. Biochem., 97, 609-620.
Kanner, J., Hazan, B., and Doll, L., 1988, Catalytic “Free” Iron Ions in Muscle
Foods, J. Agric. Food Chem., 36, 412-415. Kehrer, J. P., 2000, The Haber–Weiss Reaction and Mechanisms of Toxicity,
Toxicol., 149, 43–50. Khopkar, S. M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan oleh
Saptorahardjo, A., 85-86, Universitas Indonesia Press, Jakarta.
65
Kim, J. A., Lee, J. M., Shin, D. B., and Lee, N. H., 2004, The Antioxidant Activity and Tyrosinase Inhibitory Activity of Phlorotannins in Ecklonia cava, Food Sci. Biotechnol., 13, 476-480.
Koivikko, R., Loponen, J., Honkanen, T., and Jormalainen, V., 2005, Contents of
Soluble, Cell-wall-Bound and Exuded Phlorotannins in the Brown Alga Fucus vesiculosus, With Implications On Their Ecological Functions, J. Chem. Ecol., 31, ( 1), 195-208.
Koivikko, R., 2008, Brown Algal Phlorotannin – Improving and Applying Chemical
Method, 11-12, Turun Yliopisto, Turku. Krishnaiah, D., Sarbatly, R., and Bono, A., 2007, Phytochemical Antioxidants for
Health and Medicine – A Move towards Nature, Biotech. and Mol. Bio. Rev., 1, (4), 97-104.
Krentz, A. N., 2004, Investigation on the Chemical Association of Important
Elements in Seaweed Using SEC-ICP-MS, pp.15-50, Thesis, University of Cincinnati, Ohio.
Kuntari, C., 2007, Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol
Teh Hijau dan Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Li, S. M. and Glombitza, K. W., 1991, Phlorotannins from the Brown Alga
Landsburgia quercifolia (Hook. fil. et Harv.) Harv, Bot. Mar., 34, 455-457. List, P. H. and Schmidt, P. C., 2000, Phytopharmaceutical Technology, 107,109,
CRC Press, USA. Liu, F. and Ng, T. B., 2000, Antioxidative and Free Radical Scavenging Activities of
Selected Medicinal Herbs, Life Sci., 66, (8), 725–735. Masella, R., Di Benedetto, R., Varì, R., Filesi, C., and Giovannini, C., 2005, Novel
Mechanisms of Natural Antioxidant Compounds in Biological Systems: Involvement of Glutathione and Glutathione-Related Enzymes, J.Nutr.Biochem., 16, 577-586.
McInnes, A. G., Ragan, M. A., Smith D. G., and Walter J. A., 1984, High-Molecular
Weight Phloroglucinol based Tannins from Brown Algae: Structural Variants, Hydrobiologia, 116, 597-602.
66
Miyawaki, M., 2006, Control of Polyphenol Oxidase and Pectin Methylesterase Activities by Ultra High Pressure, Dissertation, Washington State University, USA.
Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., dan Rodwell, V. W., 1997, Biokimia
Harper, Edisi 24, diterjemahkan oleh dr. Andri Hartono, D. A. N., 146, Penerbit buku Kedokteran, EGC, Jakarta.
Nagayama, K., Iwamura, Y., Shibata, T., Hirayama, I., and Nakamura, T., 2002,
Bacterial Activity of Phlorotannin from the Brown Algae Ecklonia Kurome, J. Antimicrob., Chemother, 50, 889-893.
Nakamura, T., Nagayama, K., Uchida, K., and Tanaka, R., 1996, Antioxidant
Activity of Phlorotannins Isolated from the Brown Alga Eisenia bicyclis, Fisheries Sci., 62, 923.
Park, P. J., Heo, S. J., Park, E. J., Kim, S. K., Byun, H. G., Jeon, B. T., and Jeon, Y.
J., 2005, Reactive Oxygen Scavenging Effect of Enzymatic Extracts from Sargassum thunbergii, J. Agric. Food Chem., 53, 6666-6672.
Patra, J. K., Rath, S. K., Jena, K., Rathod, V. K., and Thatoi, H., 2008, Evaluation of
Antioxidant and Antimicrobial Activity of Seaweed (Sargassum sp) Extract: A Study on Inhibition of Glutathione-S-Transferase Activity, Turk. J. Biol., 32, 119-125.
Pescok, R. L.,Shields, L. D., Cairns, T., and Mc William, I. G., 1976, Modern
Methods of Chemical Analysis, 147, John Wiley & Sons, Inc., Canada. Pokorny, J., 1991, Natural antioxidants for food use, Trends Food Sci. Technol., 2,
223–227. Purwantoko, A., 2006, Validasi Metode Deoksiribosa sebagai Uji Penangkapan
Radikal Hidroksil secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Ragan, M. A. and Craigie, J. S., 1973, Phenolic Compounds in Brown and Red algae.
In: Handbook of Phycological Methods – Physiological and Biochemical methods, Edited by J.A. Hellebust & J.S. Craigie., 157-179.
Ragan, M. A. and Glombitza, K. W., 1986, Phlorotannins, Brown Algal Polyphenols.
In: Hellebustand, J.A., Craigie, J.S. (Eds.), Handbook of Phycological Methods, 2, 129-241, Cambridge University Press, Cambridge.
67
Rice-Evans, C. A., Miller N. J., and Panganga, G., 1997, Antioxidant Properties of Phenolic Compounds, Trends in Plant Sci., 2, 152-159.
Sailler, B. and Glombitza, K. W., 1999, Phlorethols and Fucophlorethols from the
Brown Alga Cystophora retroflexa, Phytochemistry, 50, 869-881. Sakihama ,Y., Michael F. C., Stephen C. G., and Hideo, Y., 2002, Plant Phenolic
Antioxidant and Prooxidant Activities: Phenolics-Induced Oxidative Damage Mediated by Metals in Plants, Toxicol., 177, 67–80.
Schinella, G. R., Tournier, H. A., Prieto, J. M., de Buschiazzo, P. M., and Rios, J. L.,
2002, Antioxidant Activity of Anti-Inflammatory Plant Extracts, Life Sci., 70, (9), 1023–1033.
Schoenwaelder, M. E. A. and Clayton, M. N., 1998, Secretion of Phenolic Substances
into the Zygote Wall and Cell Plate in Embryos of Hormosira and Acrocarpia (fucales, phaeophyceae), J. Phycol., 34, 969–980.
Schoenwaelder, M. E. A and Clayton, M. N., 2000, Physode Formation in Embryos
of Phyllospora comosa and Hormosira banksii (Phacophyceae), J. Phycol., 39, 1-9.
Setyawati, L., 2006, Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil
Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Shcherbakova, I., Mitra, S., Beer R. H., and Brenowitz, M., 2006, Fast Fenton
Footprinting: a Laboratory-Based Method for the Time-Resolved Analysis of DNA, RNA and Proteins. Nucleic Acids Res., 34, (6), USA.
Shibata, T., Nagayama, K., Tanaka, R., Yamaguchi, K., and Nakamura, T., 2003,
Inhibitory Effects of Brown Algal Phlorotannins on Secretory Phospholipase A2s, Lipoxygenases and Cycloxygenases, J. Appl. Phycol., 15, 61-66.
Shin, H. C., Hwang, H. J., Kang, K. J., and Lee, B. H., 2006, An oxidative and
antiinflammatory agent for potential treatment of osteoarthritis from Ecklonia cava, Arch. Pharm. Res., 29, (2), 165-171.
Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolics with
Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147. Skoog, D. A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, Third Edition, 182-183,
Saunders College Publishing, Japan.
68
Skoog, D. A., Donald, M. W., and F. J. Holler., 1994, Analytical Chemistry: An Introduction, Sixth Edition, 416, Sounder College Publishing, USA.
Stephanie, M., 2007, Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil Asetat Alga
Coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh Secara Spektrofotometri Metode Folin Ciocalteau, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Taylor, W. R., 1972, Marine Algae of Eastern Tropical and Subtropical Coasts of
The Americas, 279, University of Michigan Press, USA. Tejada, M. M. R., Duran, J. D. G., Ortega, A. O., Jimenez, M. E., Carpio, R. P., and
Chibowski, E., 2002, Investigation of Alumina/(+)-Catechin System Properties Part I: A Study of The System by FTIR-UV–Vis Spectroscopy, Biointerface, 24, 297-308.
Velavan, S., Nagulendran, K., Mahesh, R., and Begum, V. H., 2006, In Vitro
Antioxidant Activity of Asparagus racemosus Root, Phcog. Mag., 26-31. Von Sonntage, C., 1987, The Chemical Basis of Radiation Biology, 24, 56, Taylor &
Francis, New York, USA. Waterman, P. G. and Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plant Metabolites, 42-45,
Blackwell Scientific, Oxford. Whitaker, J. R., 1996, Enzymes. In: Food Chemistry, 431-530, Fennema OR, Marcel
Dekker, Inc., New York.
Yen, G. C., Chen H. Y. and Peng, H. H., 1997, Antioxidant and Pro-Oxidant Effects of Various Tea Extracts, J. Agric. Food Chem., 45, 30-34.
Zusterzeel, P. L. M., 2001, Biotransformation Enzymes and Oxidative Stress in
Preeclampsia, p. 35, Thesis, University Nijmegen, Nederland.
69
LAMPIRAN I
DATA PENETAPAN KADAR AIR DENGAN MOISTURE BALANCE
1. Replikasi I
Berat serbuk mula-mula = 5,001 g (100%)
Persen berat serbuk setelah pemanasan = 90,67 %
Kadar air = 100% - 90,67 %
= 9,33 %
2. Replikasi II
Berat serbuk mula-mula = 5,001 g (100%)
Persen berat serbuk setelah pemanasan = 90,69 %
Kadar Air = 100% - 90,69 %
= 9,31 %
3. Replikasi III
Berat serbuk mula-mula = 5,001 g (100%)
Persen berat serbuk setelah pemanasan = 90,26 %
70
Kadar Air = 100% - 90,26 %
= 9,74 %
Kadar air rata-rata = %
= 9,46 %
SD = 0,2427
CV = 2,5655 %
71
LAMPIRAN II
DATA PERHITUNGAN KONSENTRASI REAGEN DAN FRAKSI ETIL
ASETAT
1. Pembuatan reagen Fenton
• Larutan FeCl3 1 mM
BM: 270,33
Bobot yang ditimbang: 0,0146 g
Perhitungan kadar:
M= x
= x
= 5,4 x 10-3 M
Larutan FeCl3 dengan konsentrasi 1 mM dibuat dengan mengambil larutan
tersebut sebanyak 2 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml, sehingga
konsentrasi larutan FeCl3 adalah :
V1 x C
1 = V
2 x C
2
2 ml x 5,4 mM = 10 ml x C2
C2 = 1,08 mM
72
• Larutan EDTA 1 mM
BM Na EDTA : 372,24
Bobot yang ditimbang : 0,0182 g
Perhitungan kadar:
M= x
= x
= 4,8893 x 10-3 M
Larutan EDTA dengan konsentrasi 1 mM dibuat dengan mengambil larutan
tersebut sebanyak 2 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml, sehingga
konsentrasi larutan EDTA adalah :
V1 x C
1 = V
2 x C
2
2 ml x 4,8893 mM = 10 ml x C2
C2 = 0,9779 mM
• Larutan H2O2 20 mM
BM : 34,02
Larutan H2O2 yang tersedia adalah larutan H2O2
30%
30% = 30 g 100 ml
Konsentrasi dalam Molar adalah:
M = x
73
= x
= 8,8183 M
Volume yang diambil dari larutan H2O2 30% untuk mendapatkan larutan H2O2
dengan konsentrasi 80 mM sebanyak 10 ml adalah :
V1x C1= V2 x C2
V1 x 8,8183 x 10
3 mM = 10 ml x 80 mM
V1= 0,091 ml
Larutan H2O2 30% yang diambil : 0,091 ml
Perhitungan Kadar :
V1x C1 = V2 x C2
0,091 ml x 8818,3 mM = 10 ml x C2
C2 = 80,2465 mM
Larutan H2O
2 dengan konsentrasi 20 mM dibuat dengan mengambil larutan
tersebut sebanyak 2,5 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml, sehingga
konsentrasi larutan H2O2 adalah :
V1x C1= V2 x C2
2,5 ml x 80,2465 mM = 10 ml x C2
C2= 20,062 mM
• Larutan vitamin C 1 mM
Vitamin C 1 mM
74
BM : 176,13
Bobot vitamin C yang ditimbang : 0,0179 g
Perhitungan Kadar :
M= x
= x
= 0,0102 M
Larutan vitamin C dengan konsentrasi 1 mM dibuat dengan mengambil
larutan tersebut sebanyak 1 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml, sehingga
konsentrasi larutan vitamin C adalah :
V1x C1= V2 x C2
1 ml x 10,2 mM = 10 ml x C2
C2 = 1,02 mM
2. Deoksiribosa 2,5 mM
BM : 134,13
Bobot deoksiribosa yang ditimbang : 0,0198 g
Perhitungan Kadar :
M = x
= x
= 0,0148 M
75
Larutan deoksiribosa dengan konsentrasi 2,5 mM dibuat dengan mengambil
larutan tersebut sebanyak 4 ml dan diencerkan hingga volume 25 ml, sehingga
konsentrasi larutan deoksiribosa adalah :
V1x C1= V2 x C2
4 ml x 14,8 mM = 25 ml x C2
C2 = 2,37 mM
3. Buffer Fosfat 7,4
Na2HPO4 20 x 10-3 M
BM : 141,96
Bobot NaH2PO4 yang ditimbang : 1,4001 g
Perhitungan Kadar :
M = x
= x
= 19,73 x 10-3 M
KH2PO4 20 x 10-3 M
BM : 136,09
Bobot KH2PO4 yang ditimbang : 0,6799 g
Perhitungan Kadar :
M = x
76
=
= 0,020 M
4. Asam Trikloroasetat 5% (TCA)
Bobot TCA yang ditimbang : 1,25 g
Perhitungan Kadar:
x 100%
= x 100%
= 5 %
5. Asam Tiobarbiturat 1% (TBA)
Bobot TBA yang ditimbang : 0,2495 g
Perhitungan Kadar:
x 100%
= x 100%
= 0,998 %
6. Fraksi etil asetat
Bobot fraksi etil asetat yang ditimbang : 0,025 g = 25 mg
Fraksi dilarutkan ke dalam 25 ml aquadest, maka:
C =
= 1 mg/ml
77
Larutan fraksi etil asetat tersebut diambil 0,1 ml; 0,2ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml;
0,6 ml; 0,7 ml; 0,8 ml; 0,9 ml; dan 1 ml. Contoh perhitungan konsentrasi akhir fraksi
dalam 6 ml adalah :
V1 x C
1 = V
2 x C
2
0,1 ml x 1 mg/ml = 6 ml x C2
C2 = 0,0167 mg/ml
Dengan cara yang sama, maka konsentrasi fraksi etil asetat untuk menangkap
radikal hidroksil adalah :
Volume 0,1 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,0167 mg/ml
Volume 0,2 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,0333 mg/ml
Volume 0,3 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,05 mg/ml
Volume 0,4 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,067 mg/ml
Volume 0,5 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,083 mg/ml
Volume 0,6 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,1 mg/ml
Volume 0,7 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,1167 mg/ml
Volume 0,8 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,133 mg/ml
Volume 0,9 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,15 mg/ml
Volume 1,0 ml diperoleh konsentrasi fraksi etil asetat sebesar 0,167 mg/ml
78
LAMPIRAN III
PERHITUNGAN KONSENTRASI DEOKSIRIBOSA PADA PENETAPAN
PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM
Penetapan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi larutan
deoksiribosa, dengan perhitungan sebagai berikut.
Konsentrasi awal deoksiribosa 2,37 mM
Larutan deoksiribosa tersebut diambil 0,2ml; 0,3 ml dan 0,4 ml. Contoh
perhitungan konsentrasi akhir deoksiribosa dalam 6 ml adalah :
V1 x C
1 = V
2 x C
2
0,2 ml x 2,37 mM = 6 ml x C2
C2 = 0,079 mM
Dengan cara yang sama, maka konsentrasi fraksi etil asetat untuk menangkap
radikal hidroksil adalah :
Volume 0,2 ml diperoleh konsentrasi deoksiribosa sebesar 0,079 mM
Volume 0,3 ml diperoleh konsentrasi deoksiribosa sebesar 0,1185 mM
Volume 0,4 ml diperoleh konsentrasi deoksiribosa sebesar 0,158 mM
79
LAMPIRAN IV
UJI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL
Replikasi I
Fraksi etil asetat yang ditimbang = 0,0251 g
Konsentrasi fraksi etil asetat = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
Tabel 1. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 1
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
1 0 0 0,540 1 0,1 0,0167 0,564 1 0,2 0,0333 0,613 1 0,3 0,05 0,685 1 0,4 0,0677 0,703 1 0,5 0,0833 0,677 1 0,6 0,1 0,680 1 0,7 0,1167 0,717 1 0,8 0,1333 0,649 1 0,9 0,15 0,671 1 1 0,1677 0,680
Kontrol positif tanin
Berat tanin yang ditimbang = 0,025 g
Konsentrasi tanin = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
80
Tabel 2. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan tanin replikasi 1
Konsentrasi tanin (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi % Scavenging
1 0 0 0,540 - 1 0,2 0,0333 0,397 26,481 1 0,4 0,0677 0,263 51,296 1 0,6 0,1 0,198 63,333 1 0,8 0,1333 0,149 72,407
A = 15,619 B = 451,838 r = 0,974 Y = 451,838 x + 15,619
ES50 (% scavenging 50), diperoleh dengan memasukkan nilai 50% sebagai sumbu
y ke dalam persamaan regresi linier. Hasil yang didapatkan ialah ES50 = 0,076 mg/ml
Replikasi II
Fraksi etil asetat yang ditimbang= 0,025 g
Konsentrasi fraksi etil asetat= 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
81
Tabel 3. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 2
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
1 0 0 0,519 1 0,1 0,0167 0,542 1 0,2 0,0333 0,601 1 0,3 0,05 0,675 1 0,4 0,0677 0,690 1 0,5 0,0833 0,657 1 0,6 0,1 0,698 1 0,7 0,1167 0,653 1 0,8 0,1333 0,640 1 0,9 0,15 0,667 1 1 0,1677 0,694
Kontrol positif tanin
Berat tanin yang ditimbang = 0,0251 g
Konsentrasi tanin = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
Tabel 4. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan tanin replikasi 2
Konsentrasi tanin (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi % Scavenging
1 0 0 0,519 - 1 0,2 0,0333 0,378 27,167 1 0,4 0,0677 0,251 51,638 1 0,6 0,1 0,169 67,437 1 0,8 0,1333 0,128 75,337
A = 15,0112 B = 483,201
r = 0,976 Y = 483,201 x + 15,0112
82
ES50 (% scavenging 50), diperoleh dengan memasukkan nilai 50% sebagai sumbu y
ke dalam persamaan regresi linier. Hasil yang didapatkan ialah ES50 = 0,072 mg/ml
Replikasi III
Fraksi etil asetat yang ditimbang= 0,025 g
Konsentrasi fraksi etil asetat = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
Tabel 5. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 3
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
1 0 0 0,519 1 0,1 0,0167 0,530 1 0,2 0,0333 0,578 1 0,3 0,05 0,655 1 0,4 0,0677 0,671 1 0,5 0,0833 0,598 1 0,6 0,1 0,676 1 0,7 0,1167 0,661 1 0,8 0,1333 0,597 1 0,9 0,15 0,601 1 1 0,1677 0,623
Kontrol positif tanin
Berat tanin yang ditimbang = 0,0251 g
Konsentrasi tanin = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
83
Tabel 6. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan tanin replikasi 3
Konsentrasi tanin (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi % Scavenging
1 0 0 0,519 - 1 0,2 0,0333 0,373 28,131 1 0,4 0,0677 0,246 51,638 1 0,6 0,1 0,164 68,401 1 0,8 0,1333 0,130 74,952
A = 16,181 B = 473,825
r = 0,973 Y = 473,825x + 16,181
ES50 (% scavenging 50), diperoleh dengan memasukkan nilai 50% sebagai sumbu y
ke dalam persamaan regresi linier. Hasil yang didapatkan ialah ES50 = 0,071 mg/ml
Replikasi IV
Fraksi etil asetat yang ditimbang= 0,025 g
Konsentrasi fraksi etil asetat = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
84
Tabel 7. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 4
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
1 0 0 0,531 1 0,1 0,0167 0,584 1 0,2 0,0333 0,569 1 0,3 0,05 0,689 1 0,4 0,0677 0,675 1 0,5 0,0833 0,685 1 0,6 0,1 0,647 1 0,7 0,1167 0,624 1 0,8 0,1333 0,570 1 0,9 0,15 0,590 1 1 0,1677 0,617
Kontrol positif tanin
Berat tanin yang ditimbang = 0,0251 g
Konsentrasi tanin = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
Tabel 8. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan tanin replikasi 4
Konsentrasi tanin (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml
(mg/ml)
Absorbansi % Scavenging
1 0 0 0,531 - 1 0,2 0,0333 0,381 28,249 1 0,4 0,0677 0,253 52,354 1 0,6 0,1 0,179 66,290 1 0,8 0,1333 0,136 74,388
A = 10,658 B = 571,741 r = 0,991 Y = 571,741 + 10,658
85
ES50 (% scavenging 50), diperoleh dengan memasukkan nilai 50% sebagai sumbu y
ke dalam persamaan regresi linier. Hasil yang didapatkan ialah ES50 = 0,069 mg/ml
Larutan fraksi sampel diencerkan 10 kali dan diukur absorbansinya
Tabel 9. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 4 (pengenceran 10x)
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
0,1 0 0 0,531 0,1 0,1 0,0017 0,596 0,1 0,2 0,0033 0,605 0,1 0,3 0,005 0,578 0,1 0,4 0,0067 0,581 0,1 0,5 0,0083 0,591 0,1 0,6 0,01 0,602 0,1 0,7 0,0117 0,553 0,1 0,8 0,0133 0,547 0,1 0,9 0,015 0,548 0,1 1 0,01677 0,578
Larutan fraksi sampel diencerkan 100 kali dan diukur absorbansinya
Tabel 10. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 4 (pengenceran 100x)
Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
1 0 0 0,531 1 0,1 1,667 x 10-4 0,585 1 0,2 3,333x 10-4 0,583 1 0,3 5 x 10-4 0,579 1 0,4 6,667 x 10-4 0,606 1 0,5 8,333 x 10-4 0,607 1 0,6 1 x 10-3 0,586 1 0,7 1,1667 x 10-3 0,557 1 0,8 1,3333 x 10-3 0,551 1 0,9 1,5 x 10-3 0,579 1 1 1,6667 x 10-3 0,576
86
Replikasi V
Fraksi etil asetat yang ditimbang= 0,025 g
Konsentrasi fraksi etil asetat= 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
Tabel 11. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat replikasi 5
Konsentrasi fraksi asetat (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml (mg/ml)
Absorbansi
1 0 0 0,568 1 0,1 0,0167 0,587 1 0,2 0,0333 0,607 1 0,3 0,05 0,618 1 0,4 0,0677 0,651 1 0,5 0,0833 0,610 1 0,6 0,1 0,662 1 0,7 0,1167 0,635 1 0,8 0,1333 0,631 1 0,9 0,15 0,641 1 1 0,1677 0,631
Kontrol positif tanin
Berat tanin yang ditimbang = 0,0251 g
Konsentrasi tanin = 0,001 g/ ml
= 1 mg/ml
87
Tabel 12. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan tanin replikasi 5
Konsentrasi tanin (mg/ml)
Volume yang diambil (ml)
Konsentrasi uji dalam 6 ml
(mg/ml)
Absorbansi % Scavenging
1 0 0 0,568 - 1 0,2 0,0333 0,409 27,993 1 0,4 0,0677 0,277 51,232 1 0,6 0,1 0,199 64,965 1 0,8 0,1333 0,158 72,183
Konsentrasi vs Absorbansi A = 17,229
B = 441,093 r = 0,973
Y = 441,093x + 17,229
ES50 (% scavenging 50), diperoleh dengan memasukkan nilai 50% sebagai sumbu y
ke dalam persamaan regresi linier. Hasil yang didapatkan ialah ES50 = 0,074 mg/ml.
Tabel 13. Persen scavenging senyawa standar tanin
% scavenging Konsentrasi senyawa tanin (mg/ml) Rep I Rep II Rep III RepIV Rep V
0,0333 26,481 27,167 28,131 28,249 27,993 0,0677 51,296 51,638 51,638 52,354 51,232
0,1 63,333 67,437 68,401 66,290 64,965 0,1333 72,407 75,337 74,952 74,388 72,183
Persamaan regresi Y = 451,838x +
15,619
Y = 483,201x +
15,0112
Y = 473,825x +
16,181
Y = 571,741x + 10,658
Y = 441,093x + 17,229
Nilai r 0,974 0,976 0,973 0,991 0,973 ES50 (mg/ml) 0,076 0,072 0,071 0,069 0,074
Rata-rata ES50 (mg/ml) 0,0724 SD 2,7019 x 10-3
CV (%) 3,732 Keterangan : Rep = Replikasi
Nilai r yang didapat > nilai r tabel ; nilai r selang kepercayaan 95% adalah 0,950
(Muth, 1999).
88
Tabel 14. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada Penambahan Fraksi Etil Asetat
Replikasi Konsentrasi uji dalam 6 ml
(mg/ml)
I II III IV V Rata-rata (x)
SD CV
0 0,540 0,519 0,519 0,531 0,568 0,5354 0,0203 3,79 0,0167 0,564 0,542 0,530 0,584 0,587 0,5614 0,0252 4,49 0,0333 0,613 0,601 0,578 0,569 0,607 0,5936 0,0191 3,22 0,05 0,685 0,675 0,655 0,689 0,618 0,6644 0,0291 4,38
0,0677 0,703 0,690 0,671 0,675 0,651 0,678 0,0197 2,91 0,0833 0,677 0,657 0,598 0,685 0,610 0,6454 0,0394 6,10
0,1 0,680 0,698 0,676 0,647 0,662 0,6726 0,0192 2,85 0,1167 0,717 0,653 0,661 0,624 0,635 0,658 0,0361 5,49 0,1333 0,649 0,640 0,597 0,570 0,631 0,6174 0,033 5,35 0,15 0,671 0,667 0,601 0,590 0,641 0,634 0,0372 5,87
0,1677 0,680 0,694 0,623 0,617 0,631 0,649 0,0354 5,45
Analisis Korelasi ( Konsentrasi vs Absorbansi rata-rata)
A = 0,6104
B = 0,2932
r = 0,4003
Y = 0,2932x + 0,6104
Ho = Tidak ada korelasi antara 2 variabel
Hi = Ada korelasi antara 2 variabel
89
Ho ditolak apabila jika nilai r hitung melebihi nilai rn-2 (α). Nilai r tabel untuk taraf
kepercayaan 95% dan derajat bebas 8 adalah 0,632 (Muth, 1999). Dari hasil r hitung,
dapat disimpulkan bahwa variabel konsentrasi dengan variabel absorbansi tidak
memiliki hubungan korelasi.
Ho juga ditolak jika apabila t hitung > t n-2(1- α/2). Nilai t hitung, diperoleh dengan:
t =
= 1,2355
Nilai t8 (0,975) = 2,306
Nilai t hitung < t tabel, maka Ho diterima. Tidak ada korelasi antara konsentrasi
fraksi etil asetat dengan absorbansi kromogen MDA-TBA.
Uji t (Membandingkan signifikansi absorbansi antara kontrol negatif dengan larutan
uji)
Hipotesis : Ho : µk = µu
Hi : µk ≠ µu
t =
90
Dengan α = 0,05, Ho ditolak jika t > t8 (0,025)
Ho ditolak jika t > 2,306
Perhitungan : S2p =
Tabel 15. Uji statistik perbandingan aktivitas fraksi etil asetat dan kontrol negatif
Nilai Konsentrasi fraksi etil asetat (mg/ml) S2
p T Signifikan/Tidak
signifikan 0,0167 0,5236 x 10-3 1,797 Tidak signifikan 0,0333 0,3885 x 10-3
4,669 Signifikan 0,05 0,6295 x 10-3
8,129 Signifikan 0,0677 0,4001 x 10-3
11,272 Signifikan 0,0833 0,9822 x 10-3
5,550 Signifikan 0,1 0,3904 x 10-3
10,979 Signifikan 0,1167 0,8577 x 10-3
6,619 Signifikan 0,1333 0,7506 x 10-3
4,740 Signifikan 0,15 0,8980 x 10-3
5,2025 Signifikan 0,1677 0,8326 x 10-3
6,225 Signifikan
91
LAMPIRAN V
FRAKSINASI EKSTRAK METANOL ALGA COKLAT
Fraksi methanol-air (atas) dan kloroform (bawah) Fraksi etil asetat
LAMPIRAN VI
FRAKSI ETIL ASETAT
92
LAMPIRAN VII
HASIL UJI KUALITATIF FLOROTANNIN
1. Uji Pendahuluan Fraksi Etil Asetat 3. Uji polifenol
Sebelum Sesudah
pemanasan pemanasan + KOH Tanin Sampel
2. Uji tannin 4. Uji dengan reagen Folin Ciocalteau
Sampel Tanin Sampel Tanin
93
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas
Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat
Ekstrak Metanolik Alga Coklat Sargassum hystrix v.
Buxifolium (Chauvin) J. Agardh dengan Metode
Deoksiribosa” memiliki nama lengkap Lina. Penulis
lahir di Pontianak, Kalimantan Barat pada tanggal 10
Agustus 1989 dari pasangan Bapak Chua Kak Seng dan
Ibu Lim Khim Leng. Pendidikan formal yang ditempuh
oleh penulis meliputi: SD Negri 19 Pontianak pada tahun 1993-1999, SLTP Negri 1
Pontianak pada tahun 1999-2002, SMA Santo Paulus Pontianak pada tahun 2002-
2005 dan melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada tahun 2005 hingga tahun 2008. Selama kuliah, penulis aktif dalam
berbagai macam kegiatan, antara lain Paduan Suara Veronika (2005-2007), Campus
Ministry sebagai misdinar (2006-2007), Pos Kesehatan Antonius Kota Baru (2006-
2007), Panitia Lokakarya Penyusunan GBPP Mata Kuliah Profesi (2006), Panitia
Pekan Suci (2006-2008), Sie Penerima Tamu Pagelaran Sendratari Ramayana (2006),
Peserta Kampanye Informasi Obat (2006), Koordinator Sie Acara Dies Natalis
Farmasi (2007), Koordinator Sie Acara Pharmacy Perfomance (2007), Koordinator
Sie Konsumsi Dies Natalis Farmasi (2008), Sie Humas Pelantikan Apoteker (2008),
dan Koordinator Sie Konsumsi Pelepasan Wisuda (2008). Penulis juga pernah
menjadi asisten dosen mata kuliah praktikum Botani Dasar (2007), Farmasi Fisika
(2007), Spektroskopi (2007 dan 2008), Kromatografi (2008), Kimia Analisis (2008)
dan Bioanalisis (2008).