uin syarif hidayatullah jakarta isolasi metabolit...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI METABOLIT SEKUNDER ISOLAT MEC II DARI KAPANG

ENDOFIT LUMUT HATI Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

SKRIPSI

FERANI NADYN FATMA

NIM. 11141020000030

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

JAKARTA

NOVEMBER 2018

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA



SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

FERANI NADYN FATMA

NIM. 11141020000030

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

JAKARTA

NOVEMBER 2018

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri dan semua sumber baik yang dikutip

maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Ferani Nadyn Fatma

NIM : 11141020000030

Tanda tangan :

Tanggal : 9 November 2018

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK


Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi Metabolit Sekunder Isolat MEC 2 dari Kapang Endofit

Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume and Nees

Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang memiliki

berbagai aktivitas farmakologis seperti antibiotik, antivirus, antimalaria,

antikanker, antioksidan, antidiabetes, dan immunosupresan. Tujuan dari penelitian

ini adalah untuk mengetahui spesies dari kapang endofit lumut hati Marchantia

emarginata, mengisolasi metabolit sekunder dari kapang endofit lumut hati

Marchantia emarginata, mengelusidasi struktur metabolit sekunder, dan

mengevaluasi aktivitas antioksidan dari senyawa isolat. Kapang endofit dari lumut

hati Marchantia emarginata diketahui bernama Daldinia eschscholtzii. Kemudian

difermentasi dengan metode statis dalam PDA pada suhu 28o C selama 21 hari.

Hasil fermentasi kemudian difraksinasi dengan menggunakan n-heksan, etil

asetat, dan metanol. Hasil uji kualitatif antioksidan menunjukkan bahwa fraksi etil

asetat memiliki aktivitas tertinggi dengan nilai AAI 0,89 dan nilai IC50 109,35.

Fraksi etil asetat kemudian dimurnikan dengan menggunakan metode

rekristalisasi. Berdasarkan analisis menggunakan spektroskopi 1H-NMR

menunjukkan bahwa senyawa memiliki 1 CH, 1 CH2, 9 CH3.

Kata kunci : antioksidan, isolasi, kapang endofit, Marchantia emarginata,

metabolit sekunder

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Ferani Nadyn Fatma

Student ID : 11141020000030

Departement : Pharmacy

Tittle : Secondary Metabolites Isolation of MEC 2 Isolate from

Endophytic Fungi Liverworts Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees

Endophytic fungi can produce secondary metabolite which have various

pharmacological activities such as antibiotics, antiviral, antimalarial, anticancer,

antioxidant, antidiabetics, and immunosuppressive. The purpose of this research

are to know the species from endophytic fungi of Marchantia emarginata, isolate

the secondary metabolite from endophytic fungi of liverwort Marchantia

emarginata, elucidate the structure and evaluation the antioxidant activity of the

isolate compound. The endophytic fungi of Marchantia emarginata which was

identified as Daldinia eschscholtzii was fermented by using static method in PDA

at temperature of 28o C for 21 days. The result of fermentation was fractioned by

using n-hexane, ethyl acetate and methanol. The qualitative antioxidant evaluation

showed the ethyl acetate fraction has the highest activity with the AAI value is

0,89 and the IC50 value is 109,35. The ethyl acetate fraction was further purified

by using crystalisation method to give compound that have 1 CH, 1 CH2, and 9

CH3 based on the analysis of the 1H-NMR spectrum.

Keyword : antioxidant, endophytic fungi, isolation, Marchantia emarginata,

secondary metabolites.

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, Puji Syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa,

karena atas berkat dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini.

Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk

mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Saya menyadari, tanpa bantuan, dukungan, bimbingan dan doa dari

berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini,

sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Kedua orang tua saya, Ibu dan Ayah, yaitu Drs. Feriandi Syafei, M.K.M dan

Endah Sulistiani, S.Pd., M.Si., nenek saya Hj. Mariani, serta kedua adik saya

Muhammad Ferdian Faleh dan Akbar Rifki Ferdiansyah yang selalu

memberikan kasih sayang, motivasi dan doa tiada henti senantiasa mengiringi

perjalanan hidup penulis, serta dukungan baik secara moril maupun materil.

2. Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt. dan Narti Fitriana, M.Si. selaku dosen

pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, ilmu, masukan,

waktu dan dukungan dalam penyelesaian penelitian dan penyusunan skripsi

ini.

3. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM., M.Kes., selaku Dekan Fakultas Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Yuni Anggraeni, M. Farm., Apt. sebagai pembimbing akademik yang telah

membimbing dan memberikan dukungan dalam menghadapi permasalahan

akademik.

6. Saiful Bahri, M.Si. selaku dosen mikrobiologi, Puspa Novadianti Sukandar,

S.Farm serta Zakiyatul Munawaroh, S. Farm. yang telah meluangkan

waktunya untuk memberikan saran serta masukan kepada penulis.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama menempuh pendidikan di Program Studi

Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

8. Achmad Arif Hidayat yang selalu memberikan dukungan, motivasi serta

mengarahkan penulis menjadi pribadi yang lebih baik.

9. Kawan dan kakak kost Al - Muna, terutama untuk Septa Rahmadini, Nida

Auliya Rahmah serta Nurjihan Fahira untuk selalu ada disaat kebahagiaan

dan kesedihan penulis.

10. Teman-teman tim endofit, Nehta Estania Zahra dan Putri Siti Hawa yang

telah menemani dan membantu penulis selama melakukan penelitian.

11. Teman-teman tim penelitian Bu Ismi, Rizka Meirisa Putri, Luluk

Muchroyatul dan Muhammad Firmansyah yang telah mewarnai dan mengisi

hari-hari di Lab.

12. Teman-teman sejawat Program Studi Farmasi UIN Jakarta angkatan 2014

yang sanggup bertahan hingga akhir.

13. Kakak-kakak laboran lab Farmasi, Kak Walid, Kak Eris, Mbak Rani, Kak

Yaenap dan Kak Lisa atas dukungan dan kerjasamanya selama penelitian

berlangsung.

14. Semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penyelesaian

naskah skripsi baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya

tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari dalam penyusunan skripsi ini masih banyak

kekurangan. oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat

membangun demi perbaikan skripsi ini. Penulis berdoa semoga amal baik dari

semua pihak yang telah membantu penulis mendapat balasan dari Allah SWT.

Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu

pengetahuan.

Ciputat, 9 November 2018

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 11141020000030

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Ilmu Kesehatan (Fikes)

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul



Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Dengan demikian persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada tanggal : 9 November 2018

Yang menyatakan

(Ferani Nadyn Fatma)

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. iv

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .......................... x

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1

1.1. Latar Belakang .................................................................................................... 1

1.2. Perumusan Masalah ............................................................................................ 2

1.3. Pembatasan Masalah ........................................................................................... 2

1.4. Tujuan Penelitian ................................................................................................ 3

1.5. Manfaat Penelitian .............................................................................................. 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 4

2.1. Kapang Endofit ................................................................................................... 4

2.2. Lumut Hati .......................................................................................................... 5

2.3. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ................................................ 6

2.4. Fermentasi ........................................................................................................... 7

2.5. Ekstraksi .............................................................................................................. 7

2.6. Rekristalisasi ....................................................................................................... 8

2.7. Kromatografi Lapis Tipis .................................................................................... 9

2.8. Pelarut ............................................................................................................... 10

2.9. Antioksidan ....................................................................................................... 10

2.10. Spektrofotometri Inframerah ......................................................................... 12

2.11. Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ..................................... 13

BAB III METODE PENELITIAN ..................................................................... 15

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................... 15

3.2. Alat dan Bahan .................................................................................................. 15

3.3. Prosedur Penelitian ........................................................................................... 15

3.3.1. Pembuatan Media PDA (Potato Dextrose Agar) ...................................... 15

3.3.2. Pembuatan Media PDY (potato Dextrose Yeast) ...................................... 16

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.3. Peremajaan Kultur Kapang Endofit .......................................................... 16

3.3.4. Karakterisasi Kapang Endofit ................................................................... 16

3.3.5. Identifikasi Kapang Endofit ...................................................................... 16

3.3.6. Fermentasi Kapang Endofit ...................................................................... 16

3.3.7. Kurva Tumbuh .......................................................................................... 17

3.3.8. Ekstraksi hasil Fermentasi ........................................................................ 17

3.4. Isolasi dan Pemurnian Senyawa ........................................................................ 17

3.4.1. Kromatografi Lapis Tipis .......................................................................... 17

3.4.2. Rekristalisasi ............................................................................................. 18

3.4.3. KLT Dua Dimensi ..................................................................................... 18

3.5. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH .......................................................... 18

3.5.1. Uji Kualitatif Antioksidan dengan KLT ................................................... 18

3.5.2. Uji Kuantitatif Antioksidan ....................................................................... 19

3.6. Penentuan Struktur Molekul Senyawa Murni ................................................... 19

3.6.1. Spektrofotometer Inframerah FT – IR ...................................................... 19

3.6.2. 1H-NMR .................................................................................................... 19

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 20

4.1. Identifikasi Kapang Endofit .............................................................................. 20

4.2. Fermentasi dan Ekstraksi .................................................................................. 21

4.3. Kurva Tumbuh Daldinia eschscholtzii ............................................................. 22

4.4. Uji Aktivitas Antioksidan Kualitatif dengan KLT ............................................ 23

4.5. Uji Kuantitatif Antioksidan Fraksi Fermentasi ................................................. 26

4.6. Isolasi Senyawa Murni ...................................................................................... 28

4.7. Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi ............................................................ 28

4.8. Penentuan Struktur Senyawa ............................................................................ 29

4.8.1. Spektrofotometri Infra Red ....................................................................... 29

4.8.2. Resonasi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) ............................................... 30

BAB V PENUTUP ................................................................................................ 32

5.1. Kesimpulan ....................................................................................................... 32

5.2. Saran ................................................................................................................. 32

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 33

LAMPIRAN .......................................................................................................... 37

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ................. 6

Gambar 2.2. Struktur Senyawa Marchantin A ......................................... 7

Gambar 4.1. D.eschscholtzii ..................................................................... 19

Gambar 4.2. Mikroskopis D.eschscholtzii perbesaran 40x ...................... 20

Gambar 4.3. Pertumbuhan D. eschscholtzii pada Media PDY ................. 22

Gambar 4.4. Kurva Pertumbuhan D. eschscholtzii ................................... 22

Gambar 4.5. Skema Reaksi DPPH dengan Antioksidan .......................... 23

Gambar 4.6. Hasil Rekristalisasi .............................................................. 27

Gambar 4.7. KLT Dua Dimensi ............................................................... 28

Gambar 4.8. Spektrum Infra Merah Senyawa C2EA ............................... 28

Gambar 4.9. Spektrum 1H – NMR Fraksi Etil Asetat Isolat MEC 2 ........ 30

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Klasifikasi Antioksidan Berdasarkan AAI .......................... 12

Tabel 4.1. Data Perolehan Bobot Ekstrak Fermentasi Isolat Kapang

Endofit ................................................................................. 21

Tabel 4.2. Pengujian Aktivitas Antioksidan Kuantitatif Ekstrak

Fermentasi Kapang Endofit ................................................. 24

Tabel 4.3. Hasil Uji Antioksidan Kuantitatif ........................................ 26

Tabel 4.4. Data Bilangan Gelombang Spektrum FT-IR Senyawa

C2EA ................................................................................... 29

Tabel 4.5. Tabel Pergeseran Kimia Senyawa C2EA ............................ 30

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian .......................................................... 36

Lampiran 2. Bagan Peremajaan Kapang .................................................. 37

Lampiran 3. Bagan Karakterisasi Kapang Endofit ................................... 37

Lampiran 4. Hasil Identifikasi Kapang Endofit Isolat MEC 2 ................. 38

Lampiran 5. Bagan Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit ............... 39

Lampiran 6. Bagan Kurva Tumbuh .......................................................... 40

Lampiran 7. Data Berat Miselia Kapang .................................................. 41

Lampiran 8. Panjang Gelombang Maksimum DPPH .............................. 43

Lampiran 9. Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji

Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Fraksi Ekstrak

Fermentasi Etil Asetat Isolat MEC 2 ................................... 44

Lampiran 10. Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear

Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Vitamin C ................ 45

Lampiran 11. Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks

Aktivitas Antioksidan (AAI) ............................................... 46

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Indonesia dikenal sebagai salah satu dari 7 negara yang memiliki

keanekaragaman hayati terbesar kedua setelah Brazil (Radji, 2005). Salah satu

spesies tanaman yang tumbuh di Indonesia adalah lumut. Lumut secara taksonomi

berada di antara alga dan paku-pakuan. Lumut terdiri dari 3 divisi, yaitu

Bryophyta atau mosses (lumut daun sebanyak 14.000 spesies), Marchantiophyta

atau liverworts (lumut hati sebanyak 6.000 spesies), dan Anthocerotophyta atau

hornworts (lumut tanduk sebanyak 300 spesies) (Asakawa, 2012; Sharma & Bhat,

2009; Sulistyowati, 2014).

Salah satu jenis lumut yang banyak tumbuh di Indonesia adalah lumut hati.

Pada penelitian yang dilakukan oleh Asakawa (2012) menyatakan pada lumut hati

terdapat senyawa lipofilik monoterpenoid, sesquiterpenoid, dan diterpenoid,

senyawa aromatic (bibenzyl, bis-benzyl, benzoat, sinamat, alkil fenol rantai

panjang, naftalen, isokumarin) dan asetogenin.

Lumut hati memiliki aktivitas biologis seperti antioksidan, antimikroba,

antifungi, antihepatotoksik, sitotoksik, kardiotonik, antifeedant serangga, dan

relaksan otot (Ludwiczuk et al, 2008). Salah satu lumut hati yang dapat ditemukan

di Indonesia adalah Marchantia emarginata dan belum banyak penelitian yang

dilakukan terkait spesies ini.

Namun, jika lumut hati digunakan secara berlebihan sebagai bahan baku obat

maka dikhawatirkan tanaman tersebut akan musnah. Oleh karena itu, perlu

dilakukan sumber alternatif yang dapat menghasilkan senyawa metabolit dan

aktivitas biologi yang serupa yaitu dengan menggunakan kapang endofit (Strobel

G, 2003).

Radji (2005) menyatakan bahwa kapang adalah organisme yang sering

diisolasi sebagai endofit. Kapang endofit dapat berfungsi sebagai pelindung bagi

tanaman inang dari stres lingkungan dan kompetisi mikroba yang diisolasi dari

bunga, buah, batang, daun, akar dan biji (Hung, 2007). Sekitar 6500 kapang

endofit dari tanaman herba dan pohon serta alga telah diskrining dan diisolasi


untuk mengetahui aktivitas biologis serta menentukan struktur senyawa aktif

(Schulz et al, 2002).

Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa yang berfungsi sebagai

antibiotik, antivirus, antimalaria, antikanker, antioksidan, antidiabetes, dan

imunosupresif (Radji, 2005). Kemampuan kapang endofit memproduksi senyawa

metabolit sekunder yang sama dengan tanaman inangnya merupakan peluang

yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder

melalui kapang endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sukandar (2017) menyatakan

bahwa pada kapang endofit yang dihasilkan oleh lumut hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume & Nees terdapat 3 isolat yang memiliki aktivitas

antioksidan yaitu MEB 1, MEC 1, MEC 2. Namun, senyawa yang didapat belum

diketahui strukturnya. Oleh karena itu, penelitian ini bermaksud untuk mengetahui

dan menentukan struktur senyawa aktif pada kapang endofit lumut hati

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian pada latar belakang dapat dirumuskan beberapa

permasalahan yaitu sebagai berikut.

1) Apa spesies dari isolat MEC II dari kapang endofit lumut hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume & Nees?

2) Apa kandungan senyawa aktif yang terdapat pada isolat MEC II dari kapang

endofit lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ?

3) Apakah struktur senyawa aktif yang terdapat pada isolat MEC II dari kapang

endofit lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ?

1.3. Pembatasan Masalah

Pembatasan masalah pada penelitian yaitu meliputi isolasi metabolit sekunder

dan penentuan struktur senyawa aktif pada kapang endofit lumut hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume & Nees.


1.4. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk menjawab beberapa permasalahan yang

telah disebutkan, yakni sebagai berikut.

1) Untuk mengetahui spesies isolate MEC II dari kapang endofit lumut hati

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

2) Untuk mengetahui senyawa aktif yang terdapat pada isolat MEC II dari

kapang endofit lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees.

3) Untuk menentukan struktur senyawa aktif yang terdapat pada isolat MEC II

dari kapang endofit dari Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees.

1.5. Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah diharapkan dapat memberikan informasi

tentang kandungan senyawa aktif pada isolat MEC II dari kapang endofit lumut

hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees. dan menentukan struktur

senyawa aktif tersebut sehingga dapat dimanfaatkan khususnya dalam bidang

farmasi.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kapang Endofit

Endofit berasal dari Bahasa Yunani ’Endo’ berarti di dalam dan ‘fit” (phyte)

berarti tumbuhan. Kapang endofit merupakan mikroorganisme yang hidup pada

jaringan tanaman serta berinteraksi dengan tanaman inangnya. Kapang endofit

yang hidup di dalam tanaman tidak bersifat merugikan inangnya. Hal tersebut

terkait dengan kontribusi senyawa bioaktif yang dihasilkan mikroba tersebut

(Melliawati, 2006). Interaksi yang dilakukan berupa hubugan saling

ketergantungan. Kekhususan organ yang dibentuk disebabkan adanya adaptasi

kapang endofit dengan kondisi mikroekologi khusus dan kondisi fisik lingkungan.

Kapang endofit dapat diisolasi dari bunga, buah, batang, daun, akar dan biji

(Huang et al, 2007). Organ tumbuhan yang akan diisolasi kemudian disterilkan

permukannya. Permukaan tanaman disterilkan dengan etanol 70%, NaCl 2 -10%,

HgCl, Cu(NO3)2, dan formalin 30 – 50% di dalam laminar-flow hood. Hal ini

dilakukan untuk mengeliminasi mikroba yang berada di permukaan sampel

(epifit). Jaringan luar dipisahkan dari sampel ditempatkan secara hati-hati pada

media. Setelah diinkubasi beberapa hari, ujung hifa diambil dan diletakkan pada

media potato dextrose agar (Strobel G, 2003; Wilson, 1995). Teknik isolasi

adalah salah satu tahapan penting dalam penelitian mengenai jamur endofit

mengingat sekitar 99% dari total jamur endofit tidak dapat tumbuh pada kondisi

artifisial (unculturable) (Ganley & Newcombe, 2006).

Karakterisasi kapang dilakukan dengan mengamati morfologi secara

makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan secara makroskopis morfologi kapang

endofit meliputi warna dan struktur koloni yaitu ada atau tidaknya tetes eksudat

(exudate drops) dan melihat ada atau tidaknya lingkaran konsentris (zonasi).

Pengamatan koloni dilakukan dari awal penanaman hingga pada waktu tertentu

dan mencatat semua perubahan yang terjadi (Gandjar, 2006).

Secara mikroskopis, kapang endofit diamati hifa (sekat, percabangan, dan

warna) serta konidia (ada atau tidaknya dan bentuk) menggunakan mikroskop

pada pengamatan terakhir (5 hingga 7 hari). Parameter warna hifa meliputi hialin,


transparan, atau gelap. Parameter bentuk konidia yang diamati yaitu bulat,

lonjong, berantai, atau tidak beraturan.

Kapang endofit berpotensi memiliki metabolit yang sama dengan tanaman

inangnya. Kapang endofit diketahui menghasilkan metabolit seperti alkaloid,

terpenoid, steroid kuinon, derifat isokumarin, flavonoid, fenol, asam fenolik, dan

peptida (Zhang et al, 2013).

2.2. Lumut Hati

Marchantiophyta (liverworts) atau lumut hati mencakup tiga kelas yaitu

Haplomitriopsida, Marchantiopsida, dan Jungermanniopsida, dengan 15 ordo, 82

famili, 316 genus dan 6.000 spesies. Kelompok tanaman kecil ini terdistribusi

hampir di mana-mana di dunia (Asakawa, 2004).

Klasifikasi morfologi lumut hati tergolong sulit akibat gametofitnya yang

kecil (Ludwiczuk et al, 2008). Lumut hati melekat pada substrat dengan rhizoid

uniselluler (Sulistyowati et al, 2014). Secara mendasar, terdapat 2 tipe morfologi

lumut hati yaitu lumut hati bertalus (thalloid liverwort) dan lumut hati berdaun

(leafy liverwort) (Sulistyowati et al, 2014). Talus (thallus) merupakan massa

jaringan yang rata (Simpson, 2006).

Lumut hati bertalus memiliki talus yang dikotomus bercabang, memiliki pori-

pori dan pada umumnya terdiri dari beberapa sel yang tebal. Jaringan bagian atas

(dorsal) bersifat longgar akibat dari ruang udara internal. Bagian permukaan

bawah (ventral) biasanya memiliki dua jenis rhizoid, yaitu halus dan dengan

tonjolan (Glime, 2017).

Lumut hati berdaun memiliki rhizoid yang terdiri atas 1 sel (uniseluler).

Beberapa spesies memiliki 2 – 3 baris daun yang melekat pada batang terbagi atas

dua baris daun dorsal (lobe), satu baris daun ventral (under leaf) yang biasanya

memiliki ukuran lebih kecil daripada daun dorsal atau bahkan tidak ada.

Pada beberapa spesies, daunnya memiliki modifikasi membentuk cuping

yang disebut lobule. Lobule adalah perluasan daun yang bisa menangkap atau

menampung air yang berada di bagian ventral (Sulistyowati et al, 2014).

Lumut hati tumbuh subur di wilayah yang lembab dan ternaungi (Simpson,

2006). Lumut hati (liverworts) telah disurvei terdapat pada habitat khusus tertentu,


seperti hutan bakau dan hutan pesisir, tempat beriklim sedang, dan tempat hutan

hujan tropis.

Spesies Marchantiophyta dapat diamati di Pulau Yaku, Jepang dan di

Selandia Baru. Banyak spesies lumut hati telah ditemukan di daerah tropis, seperti

Asia Tenggara, Borneo, Sumatra dan Papua Nugini serta Kolombia, Ekuador dan

Venezuela. Di Ekuador dan Kolumbia, spesies Marchantiophyta tumbuh di

pegunungan tinggi lebih dari 2.000 meter (Asakawa, 2004, 2012)

2.3. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Secara taksonomi, Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

diklasifikasikan sebagai berikut (Goffinet. B, 2009) kingdom : plantae, divisi :

marchantiophyta, kelas : marchantiopsida, ordo : marchantiales, family :

marchantiaceae, genus : marchantia, spesies : Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees

Gambar 2.1. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees (Novarienti, 2017)

Marchantia merupakan sumber antioksidan alami. Kandungan senyawa yang

terdapat di dalam Marchantia seperti flavonoid, tannin dan senyawa fenolik

memainkan peran utama sebagai penangkap radikal bebas, sehingga bertindak

sebagai antioksidan alami (Gupta et al, 2015)

Senyawa Marchantin A yang dapat diisolasi dari spesies Marchantia

emarginata menunjukkan aktivitas antibakteri, antifungi, antioksidan, bahan

sitotoksik, dan relaksan otot rangka (W. J. Huang et al, 2010).


Gambar 2.2. Struktur Senyawa Marchantin A (W. J. Huang et al, 2010)

2.4. Fermentasi

Istilah fermentasi digunakan sebagai proses untuk penguraian metabolik

senyawa organik oleh mikroorganisme yang menghasilkan energy (Shirly Kumala

& Pratiwi, 2014). Fermentasi dapat menghasilkan biomassa, enzim, metabolit

baik primer seperti etanol, asam sitrat, polisakarida dan vitamin serta metabolit

sekunder (Sulistyaningrum, 2008).

Menurut Kumala & Pratiwi (2014) fermentasi dapat dibedakan menjadi dua

berdasarkan jenis media, yaitu fermentasi media padat dan fermentasi media cair.

Fermentasi media padat adalah proses fermentasi dengan substrat tidak larut dan

tidak mengandung air bebas, tetapi cukup mengandung air untuk keperluan

mikroba. Fermentasi media cair adalah proses fermentasi dengan substrat yang

larut atau tersuspensi dalam fase cair. Fermentasi media cair disebut fermentasi

kultur terendam yang umumnya memerlukan aerasi dan agitasi. Pembentukan

produk hasil fermentasi mikroba dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti

substrat dan nutrien, suhu, pH, aerasi dan agitasi (Shirly Kumala & Pratiwi,

2014).

2.5. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan pemisahan senyawa aktif dari jaringan tumbuhan

maupun hewan dengan menggunakan pelarut selektif berdasarkan standar

prosedur. Parameter yang mempengaruhi kualitas dari ekstrak, menurut Prashant

Tiwari et al (2011) adalah bagian dari tumbuhan yang digunakan, pelarut yang

digunakan untuk ekstraksi dan prosedur ekstraksi.


Beberapa metode umum dalam proses ekstraksi adalah maserasi, infusi,

perkolasi, digesti, dekoksi, ekstraksi panas kontinyu (Soxhlet), fermentasi,

ekstraksi menggunakan microwave, ekstraksi ultrasonik (sonikasi), ekstraksi

cairan superkritis, dan ekstraksi fitonik (dengan pelarut hidrofluorokarbon). Untuk

tanaman aromatis, dapat digunakan metode ekstraksi hydrodistillation (distilasi

air, uap, serta uap dan air), maserasi hidrolitik yang diikuti dengan distilasi,

expression, dan enfleurage (ekstraksi lemak dingin). Beberapa pelarut yang

digunakan dalam proses ekstraksi antara lain air, etanol, metanol, kloroform, eter,

dan aseton. Pemilihan pelarut dilakukan berdasarkan kegunaan ekstrak dan

senyawa yang ingin diisolasi dari tanaman (Prashant Tiwari et al, 2011).

2.6. Rekristalisasi

Rekristalisasi adalah pemurnian suatu zat padat dari campuran atau

pengotornya dengan cara mengkristalkan kembali zat tersebut setelah dilarutkan

dalam pelarut yang cocok. Rekristalisasi merupakan metode yang sangat penting

untuk pemurnian komponen larutan organik. Ada tujuh metode dalam

rekristalisasi yaitu memilih pelarut, melarutkan zat terlarut, menghilangkan warna

larutan, memindahkan zat padat, mengkristalkan larutan, mengumpul dan mencuci

kristal, mengeringkan poduknya (Kenneth L. Williamson, 2011).

Prinsip rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara zat yang dimurnikan

dengan kelarutan zat pencampur dan pencemarnya. Larutan yang terjadi

dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat yang diinginkan dikristalkan

dengan cara menjenuhkannya. proses kristalisasi adalah kebalikan dari proses

pelarutan (Pinalia, 2012).

Mula-mula molekul zat terlarut membentuk agregat dengan molekul pelarut,

lalu terjadi kisi-kisi diantara molekul zat terlarut yang terus tumbuh membentuk

kristal yang lebih besar diantara molekul pelarutnya, sambil melepaskan sejumlah

energi. Kristalisasi dari zat akan menghasilkan kristal yang identik dan teratur

bentuknya sesuai dengan sifat kristal senyawanya. Dan pembentukan kristal ini

akan mencapai optimum bila berada dalam kesetimbangan. Senyawa dilarutkan

kedalam pelarut yang sesuai kemudian dipanaskan sampai semua senyawanya


larut sempurna. Pemanasan hanya dilakukan apabila senyawa tersebut belum atau

tidak larut sempurna pada keadaan suhu kamar (Pinalia, 2012).

Salah satu faktor penentu keberhasilan proses kristalisasi dan rekristalisasi

adalah pemilihan zat pelarut. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam

memilih pelarut yang sesuai yaitu pelarut tidak hanya bereaksi dengan zat yang

akan dilarutkan, pelarut hanya dapat melarutkan zat yang akan dimurnikan dan

tidak melarutkan zat pencemarnya, titik didih pelarut harus rendah (hal ini akan

mempermudah pengeringan kristal yang terbentuk), titik didih harus lebih rendah

dari titik leleh zat yang akan dimurnikan agar zat tersebut tidak terurai (Pinalia,

2012).

Ukuran kristal yang terbentuk selama pengendapan, tergantung pada dua

faktor penting yaitu laju pembentukan inti (nukleasi) dan laju pertumbuhan kristal.

Jika laju pembentukan inti tinggi, banyak kristal yang akan terbentuk, tetapi tidak

besar, jadi terbentuk endapan yang terdiri dari partikel-partikel kecil (Svehla. G,

1985).

Laju pembentukan inti tergantung pada derajat lewat jenuh dari larutan.

Semakin tinggi derajat lewat jenuh, semakin besar kemungkinan untuk

membentuk inti baru, jadi laju pembentukan inti menjadi lebih besar. Laju

pertumbuhan kristal merupakan faktor lain yang mempengaruhi ukuran kristal

yang terbentuk selama pengendapan berlangsung. Jika laju ini tinggi, kristal-

kristal yang besar akan terbentuk (Svehla. G, 1985).

2.7. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan fisika,

kimia dan kromatografi cair paling sederhana yaitu dengan menggunakan plat

kaca atau plat aluminium yang dilapisi silika gel dan menggunakan pelarut

tertentu (Harborne, 1987).

Metode kromatografi ini menggunakan pelat kaca atau aluminium yang

dilapisi dengan penjerap (sorbent; seperti gel silica) pada ketebalan tertentu

bergantung pada jumlah sampel yang diujikan pada pelat. Tebal pelapis pada pelat

analitik umumnya 0,2 mm, sementara pada pelat preparatif tebalnya 1 hingga 2

mm. Campuran senyawa diujikan pada pelat di posisi 1 hingga 2 cm dari ujung


bawah pelat sebagai totolan (spot) atau pita kontinyu (continuous band). Pelat

kemudian disimpan di dalam wadah berisi pelarut yang telah ditentukan sehingga

pelarut akan bermigrasi dan memisahkan komponen-komponen campuran

senyawa berdasarkan polaritas (Michael Heinrich et al, 2012).

2.8. Pelarut

Pelarut adalah zat yang sering digunakan untuk melarutan zat lain. Sifat

pelarut yang baik untuk ekstraksi yaitu toksisitas rendah, mudah menguap pada

suhu rendah, dapat mengekstraksi komponen senyawa dengan cepat, dapat

mengawetkan dan tidak menyebabkan ekstrak terdisosiasi (Prashant Tiwari et al,

2011).

Metanol merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga dapat

melarutkan analit yang bersifat polar dan nonpolar. Metanol dapat menarik

alkaloid, steroid, saponin, dan flavonoid dari tanaman (Astarina et al, 2013).

Etil asetat merupakan pelarut dengan karakteristik semipolar. Etil asetat

secara selektif akan menarik senyawa yang bersifat semipolar seperti fenol dan

terpenoid (Pranoto et al, 2012).

n-Heksana mempunya karakteristik sangat tidak polar, volatile, mempunyai

bau khas yang dapat menyebabkan pingsan. Berat molekul n-heksan adalah 86,2

gram/mol dengan titik leleh -94,3o C sampai –95,3o C. Titik didih n-heksan pada

tekanan 760 mmHg adalah 66o C sampai 71o C (Dainith, 1994). n-Heksan

biasanya digunakan sebagai pelarut untuk ekstraksi minyak nabati.

2.9. Antioksidan

Antioksidan adalah semua zat yang mampu memperlama atau menginhibisi

proses oksidasi zat secara signifikan dalam konsentrasi yang lebih rendah (Shebis

et al, 2013). Radikal bebas atau reactive oxygen species (ROS) adalah senyawa-

senyawa seperti anion superoksida, radikal hidroksil, dan nitrit oksida, yang dapat

menyebabkan gangguan fluiditas membran, denaturasi protein, dan peroksidasi

lemak melalui pembentukan stres oksidatif yang mengarah pada kerusakan sel dan

kematian (Zeng et al, 2011).


Antioksidan memiliki 2 fungsi utama antara lain fungsi primer (pendonor

atom hidrogen) dan fungsi sekunder (memperlambat laju autooksidasi). Terdapat

2 kelompok utama antioksidan di dalam sel-sel hidup yaitu antioksidan enzimatik

dan non-enzimatik. Mekanisme antioksidan terjadi pada 2 tahap reaksi: inisiasi

dan propagasi. Reaksi inisiasi merupakan tahap terbentuknya radikal bebas,

sementara reaksi propagasi adalah tahap diubahnya radikal bebas menjadi radikal

bebas lain yang lebih stabil (Shebis et al, 2013)

Salah satu cara untuk menguji aktivitas antioksidan adalah dengan

menggunakan senyawa 1,2-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). DPPH merupakan

radikal bebas yang stabil di suhu ruang dan dapat menghasilkan larutan berwarna

violet di dalam etanol. Metode peredaman radikal bebas DPPH didasarkan pada

reduksi dari radikal bebas DPPH yang berwarna oleh penghambat radikal bebas.

Prosedur ini melibatkan pengukuran penurunan serapan DPPH pada panjang

gelombang maksimalnya, yang sebanding terhadap konsentrasi penghambat

radikal bebas yang ditambahkan ke larutan reagen DPPH. Aktivitas tersebut

dinyatakan sebagai konsentrasi efektif effective concentration (EC50) atau

inhibitory concentration (IC50) (Kedare & Singh, 2011).

Aktivitas antioksidan dapat dinyatakan dengan satuan persen inhibisi. Nilai

ini diperoleh dengan rumus sebagai berikut (Molyneux, 2004).

%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 = [1 − (𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)] 𝑥100%

Berdasarkan rumus tersebut, semakin rendah nilai absorbansi sampel

terhadap milai absorbansi sampel trhadap nilai absorbansi kontrol makan semakin

tinggi aktivitas antioksidan dari sampel yang diujikan. Nilai EC50 (effective

concentration), disebut juga IC50 (inhibitory concentration), digunakan untuk

menjelaskan konsentrasi senyawa uji yang mampu menangkap 50% radikal DPPH

(W. J. Huang et al, 2010; Molyneux, 2004). Indeks aktivitas antioksidan

(antioxidant activity index / AAI) dihitung menggunakan rumus sebagai berikut

(Komala et al, 2015).


𝐴𝐴𝐼 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝐼𝐶50 ⁄

Tabel 2.1 Klasifikasi Antioksidan Berdasarkan AAI

(Sumber : Scherer dan Godoy, 2009)

Nilai AAI Klasifikasi Antioksidan

< 0,5 Antioksidan Lemah

0,5 – 1,0 Antioksidan Sedang

1,0 – 2,0 Antioksidan Kuat

> 2,0 Antioksidan Sangat Kuat

2.10. Spektrofotometri Inframerah

Spektrofotometri Inframerah (IR) merupakan salah satu alat yang dapat

digunakan untuk menganalisa senyawa kimia. Spektra inframerah suatu senyawa

dapat memberikan gambaran dan struktur molekul senyawa tersebut. Spektra IR

dapat dihasilkan dengan mengukur absorbs radiasi, refleksi atau emisi di daerah

IR.

Daerah inframerah pada spektrum gelombang elektromagnetik mencakup

bilangin gelombang 14.000 cm-1 hingga 10 cm-1. Daerah inframerah sedang 4000-

400 cm-1 berkaitan dengan transisi energi vibrasi dari molekul yang memberikan

informasi mengenai gugus-gugus fungsi dalam molekul tersebut. Daerah

inframerah jauh 400-10 cm-1 bermanfaat untuk menganalisis molekul yang

mengandung atom-atom berat seperti senyawa anorganik, namun membutuhkan

teknik khusus yang lebih baik (Schechter, 1971).

Informasi absorpsi inframerah pada umumnya diberikan dalam bentuk

spektrum dengan panjang gelombang (µm) atau bilangan gelombang (cm-1)

sebagai absis x dan intensitas absorpsi atau persen transmitan sebagai ordinat y.

Intensitas pita dapat dinyatakan dengan transmitan (T) atau absorban (A).

Transmitan adalah perbandingan antara fraksi sinar yang diteruskan oleh sampel

(I) dan jumlah sinar yang diterima oleh sampel tersebut (Io).

𝐴 = 𝑙𝑜𝑔1

𝑇= − log 𝑇 = −

𝐼

𝐼𝑜


2.11. Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Karakterisasi yang dilakukan terhadap senyawa murni adalah dengan

menggunakan alat spektrometer resonansi magnet inti proton (1H-NMR).

Spektrometri resonansi magnet inti proton (1H-NMR) merupakan alat yang

berguna pada penentuan struktur molekul organik. Spektrometri resonansi

magnetik inti proton (1H-NMR) didasarkan pada pengukuran absorbs radiasi

elektromagnetik pada daerah frekuensiradio 4-600 MHz atau panjang gelombang

75-0,5 m, oleh partikel (inti atom) yang berputar di dalam medan magnet. Teknik

ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul

(Harborne, 1987).

Spektrum 1H-NMR memberikan informasi mengenai lingkungan dan

struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hydrogen (Harborne, 1987).

Sedangkan spektrometri resonansi magnetik isotop karbon 13 (13C-NMR)

digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom

karbon pada senyawa tersebut (Sudjadi, 1985). Spektrometer (1H-NMR) biasanya

ditentukan dari larutan substansi yang akan dianalisis. Untuk itu pelarut yang

digunakan tidak boleh mengandung atom hidrogen karena akan mengganggu

puncak spektrum. Ada dua cara untuk mencegah ganggguan oleh pelarut. Pertama

dapat digunakan pelarut seperti tetraklormetana, CCl4 yang tidak mengandung

hidrogen atau pelarut yang atom hidrogennya telah diganti dengan isotopnya yaitu

deuterium, sebagai contoh CDCl3.

Adapun faktor yang mempengaruhi pergeseran kimia adalah faktor

induktif, faktor anisotropik, faktor sterik ikatan hidrogen dan pelarut yang dipakai.

Selain dipakai untuk menentukan kedudukan proton-proton, 1H-NMR dapat

menentukan perbandingan jumlah relative proton-proton tersebut yaitu dengan

mengukur intensitas dari sinyal-sinyal proton dengan alat integrator yang ada pada

1H-NMR (Silverstein et al, 1991).

Langkah yang dilakukan dalam menginterpretasikan kurva spektrum 1H-

NMR adalah jumlah sinyal menggambarkan seberapa banyak jenis proton yang

berada pada molekul analit. Kedudukan sinyal menggambarkan jenis lingkungan

kimia tempat proton tersebut berada. Intensitas sinyal menggambarkan jumlah

dari proton pada lingkungan kimia tertentu. Pemecahan puncak (splitting)


menggambarkan lingkungan kimia proton lainnya yaitu proton yang berdekatan

(bertetangga) (Silverstein et al, 1991).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada Januari hingga Agustus 2018, di Laboratorium

Farmakognosi Fitokimia Fakultas Ilmu Kesehatan (FIKes) dan Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran (FK) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

Pada penelitian ini digunakan alat-alat yaitu cawan petri (Anumbra®), neraca

analitik, spatula, gelas ukur (Pyrex®), labu Erlenmeyer (Pyrex®), beaker glass

(Pyrex®), hotplate (Cimarec®), magnetic stirrer, sumbat kapas, alumunium foil,

karet, plastic sheet, autoklaf (ALP Co., Ltd), labu ukur, buret, pinset, gunting,

kertas saring, plastic wrap, ose, sedotan steril, Laminar Air Flow Cabinet, bunsen,

botol, corong pisah, vial, vacuum rotary evaporator, spektrofotometer UV-Vis,

spektrofotometer Infra Merah FT-IR, dan spektrofotometer NMR.

Isolat endofit berasal dari penelitian Isolasi dan Uji Aktivitas Antioksidan

Kapang Endofit Lumut Hati (Sukandar, 2017). Media tumbuh kapang endofit

yang digunakan yaitu Potato Dextrose Agar (PDA) dan PDY broth (Potato

Dextrose Broth, Yeast Extract, dan akuades). Bahan yang digunakan adalah

DPPH Sigma Aldrich. Pelarut yang digunakan metanol, etil asetat, n-heksan,

akuades, alkohol 70%, dan metanol pro analisis.

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1. Pembuatan Media PDA (Potato Dextrose Agar)

Media PDA dibuat berdasarkan metode Ramadhan (2011). Ditimbang 39

gram PDA, ditambahkan 1 liter aquades, dan dipanaskan di atas heater sambil

diaduk dengan magnetic stirrer sampai homogen. Setelah itu, disterilisasi

menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121o C. media dituang ke

dalam cawan sebanyak ± 10 mL secara aseptis dan dibiarkan memadat pada suhu

ruang.


3.3.2. Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast)

Pembuatan media PDY berdasarkan metode Ramadhan (2011) yang

dimodifikasi, sebanyak 24 gram media PDB (potato dextrose broth) dilarutkan

dalam 1 L akuades. Media PDB (potato dextrose broth) kemudain ditambahkan 2

g/L yeast extract sebagai sumber nitrogen. Media diaduk sampai homogen dan pH

6-7 . Media PDY lalu disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada

suhu 121o C.

3.3.3. Peremajaan Kultur Kapang Endofit

Isolat kapang yang didapat dari penelitian Sukandar (2017) diremajakan

dengan cara menginokulasikan sedikit isolat pada media PDA baru. Kemudian

diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang (Hapsari et al, 2014). Bagan peremajan

kultur kapang endofit tertera pada lampiran 2.

3.3.4. Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi kapang dilakukan dengan mengamati beberapa karakter

morfologi baik secara makroskopis maupun mikroskopis (Hapsari et al, 2014).

Bagan karakterisasi kapang endofit tertera pada lampiran 3.

3.3.5. Identifikasi Kapang Endofit

Identifikasi kapang endofit lumut hati Marchantia emarginata dilakukan

di Indonesia Culture Center, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, kawasan

Cibinong Bogor.

3.3.6. Fermentasi Kapang Endofit

Fermentasi dilakukan dengan menggunakan meggunakan metode Kumala

et al (2015) dengan modifikasi. Kapang endofit yang telah diremajakan dan

berusia 7 hari diambil 10 potong menggunakan sedotan steril berukuran 1 cm.

Potongan kapang tersebut kemudian dimasukkan ke dalam botol fermentasi 500

mL berisi 100 mL media potato destrose yeast (PDY) steril dan difermentasi

secara statis. Bagan fermentasi kapang endofit tertera pada lampiran 5.


3.3.7. Kurva Tumbuh

Pengukuran pertumbuhan kapang dilakukan berdasarkan metode

Andhikawati et al (2014) yang dimodifikasi. Isolat kapang endofit yang sudah

diremajakan ditumbuhkan pada media cair PDY. Kultur kemudian diinkubasi

pada suhu ruang selama 21 hari. Pengukuran bobot biomassa kapang dilakukan

setiap 3 hari. Miselia kapang yang tumbuh di dalam media PDY kemudian

disaring dengan menggunakan kertas saring dan dikeringkan dalam oven selama

24 jam pada suhu 105o C. Bobot kering miselia ditentukan dengan menghitung

selisih bobot antara kertas kering kosong dengan kertas saring yang berisi miselia.

Bagan kurva tumbuh tertera pada lampiran 6.

3.3.8. Ekstraksi hasil Fermentasi

Ekstraksi dilakukan pada biomassa dan supernatan. Pada biomassa,

terlebih dahulu dipisahkan dari supernatan dengan penyaringan, lalu dimaserasi

menggunaan metanol selama 7 hari. Partisi pada supernatant dilakukan

menggunakan vaccum rotary evaporator dan selanjutnya disebut sebagai fraksi

fermentasi.

3.4. Isolasi dan Pemurnian Senyawa

3.4.1. Kromatografi Lapis Tipis

Pengujian dengan KLT dilakukan dengan menggunakan plat silika gel 60

GF sebagai fase diam. Plat silika gel dibuat dengan ukuran lebar 1 cm dan panjang

5 cm pada ujung atas dan bawah diberi batas 0,5 cm. Untuk menentukan

pengembang yang optimum, dicoba berbagai komposisi pengembang.

Fraksi yang akan diuji dilarutkan terlebih dahulu dalam beberapa milliliter

pelarut yang sesuai (larutan uji), lalu ditotolkan pada titik awal pergerakan dengan

menggunakan pipa kapiler. Setelah totolan kering, dilakukan pengelusian di dalam

bejana KLT yang telah dijenuhkan dan ditutup rapat. Lempeng dikeluarkan dan

dikeringkan setelah eluen mencapai garis atas. Bercak diamati secara visual,

dengan lampu Uv pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.


3.4.2. Rekristalisasi

Hasil partisi yang berbentuk kristal dimurnikan dengan cara rekristalisasi.

Kristal yang masih terdapat pengotor dilarutkan dengan pelarut atau campuran

pelarut yang sesuai, kemudian ditambahkan dengan pelarut dengan tingkat

kepolaran berbeda. Kemudian kristal dipisahkan dari pengotornya.

3.4.3. KLT Dua Dimensi

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan menggunakan kromatografi

lapis tipis dua dimensi. KLT dua dimensi dilakukan terhadap senyawa aktif

antioksidan yang didapatkan. Plat KLT dibuat dengan bentuk bujur sangkar yang

setiap sisinya memiliki ukuran 5 cm. Fraksi yang akan diuji dilarutkan terlebih

dahulu dalam beberapa milliliter pelarut yang sesuai (larutan uji), lalu ditotolkan

pada titik awal pergerakan dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah totolan

kering, dilakukan pengelusian di dalam bejana KLT yang telah dijenuhkan dan

ditutup rapat. Lempeng dikeluarkan dan dikeringkan setelah eluen mencapai garis

atas. Kemudian plat KLT dielusi kembali pada sisi lainnya dengan menggunakan

fase gerak yang sama, bercak dilihat dibawah lampu UV 254 nm.

3.5. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH

3.5.1. Uji Kualitatif Antioksidan dengan KLT

Pengujian aktivitas antioksidan secara kualitatif dilakukan dengan

menggunakan metode Basma et al (2011) dengan modifikasi. Fraksi fermentasi

ditotolkan pada pelat KLT lalu dilakukan pemisahan menggunakan pelarut yang

sesuai hingga batas yang ditentukan. Setelah itu, dibuat reagen berupa larutan

DPPH 0,25 mM dengan cara melarutkan 4,9 mg serbuk DPPH ke dalam 50 mL

metanol pro analisis. Pelat KLT lalu disemprot menggunakan reagen hingga

seluruh permukaan pelat terbasahi. Pelat yang telah disemprot dibiarkan selama

30 menit pada ruangan tertutup. Pola bercak lalu diamati pada pelat KLT untuk

menentukan fraksi yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan.


3.5.2. Uji Kuantitatif Antioksidan

Uji ini dilakukan dengan menggunakan metode Komala et al (2015).

Fraksi fermentasi yang telah diuji aktivitas antioksidannya secara kualitatif

kemudian dibuat variasi konsentrasi (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 μg/ml) di dalam

4 ml metanol lalu ditambahkan 1 mL reagen DPPH 0,25 mM (sebanyak 4,9 mg

DPPH dilarutkan ke dalam 50 mL metanol). Campuran yang telah dibuat tersebut

kemudian dikocok kuat-kuat dan dibiarkan di dalam kondisi gelap selama 30

menit. Absorbansi dari masing-masing campuran diukur menggunakan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum DPPH yang

ditentukan dari blanko. Blanko dibuat dengan memipet 1 mL reagen 0,25 mM ke

dalam 4 mL metanol pro analisis. Pada uji digunakan vitamin C sebagai standar.

Aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan persamaan berikut (W. J.

Huang et al, 2010; Komala et al, 2015).

𝐴𝐴𝐼 = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝐼𝐶50 ⁄

3.6.Penentuan Struktur Molekul Senyawa Murni

3.6.1. Spektrofotometer Inframerah FT – IR

Analisis presipitan dilakukan dengan spektroskopi inframerah. Sampel

spektroskopi inframerah, 1 mg dicampur dengan 200 mg KBr, kemudian dibuat

pellet, sampel dimasukan ke dalam holder. Jika alat sudah siap, sampel

dimasukkan ke dalam alat dan mulai dideteksi (Soejoko et al, 2002).

3.6.2. 1H-NMR

Identifikasi dan penentuan struktur molekul dilakukan terhadap senyawa

murni dengan spektrometri resonansi magnetik inti proton (1H-NMR). Sejumlah 1

mg senyawa murni dilarutkan dengan 1 mL pelarut khusus untuk NMR yaitu

CDCl3. Selanjutnya diukur dengan alat spektroskopi 1H-NMR


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Identifikasi Kapang Endofit

Isolat kapang endofit yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari

hasil isolasi yang dilakukan oleh Sukandar pada tahun 2017. Identifikasi

dilakukan di Indonesian Culture Center, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia,

Cibinong. Hasil identifikasi isolat kapang endofit menunjukkan bahwa isolat

tersebut adalah Daldinia eschscholtzii. Surat pernyatan hasil identifikasi kapang

endofit dapat dilihat pada lampiran 4.

Secara makroskopis, D. eschscholtzi berwarna abu-abu dan hitam kehijauan,

permukaan kapang rata dan tipis, terdapat tetesan eksudat hitam, tidak terdapat

garis-garis radial, dan memiliki lingkaran-lingkaran konsentris. Warna sebalik D.

eschscholtzi yaitu abu-abu dan hitam kehijauan, dan tepi tidak rata berwarna

putih. Secara mikrokospis D. eschscholtzi memiliki septat pada hifa, dengan

pertumbuhan hifa bercabang, dan jenis hifa hialin.

(a) (b)

Gambar 4.1 Daldinia eschscholtzii tampak (a) depan (b) sebalik


Gambar 4.2 Mikroskopis D.eschscholtzii

4.2. Fermentasi dan Ekstraksi

Fermentasi yang dilakukan pada Daldinia escholtzii bertujuan untuk

mendapatkan senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan. Pada penelitian

digunakan metode statis selama 21 hari pada suhu 28o C (Kumala et al, 2015

dengan modifikasi). Hal ini dapat dibuktikan dengan dibuatnya kurva

pertumbuhan D.eschscholtzii. Periode fermentasi dimaksudkan agar kapang telah

melewati fase stasioner yang merupakan fase produksi metabolit sekunder (Shirly

Kumala & Pratiwi, 2014).

Fermentasi dilakukan dengan menggunakan media Potato Dextrose Yeast

(PDY). Media PDY digunakan karena mengandung sumber karbon yang berasal

dari kentang dan dextrose serta mengandung nitrogen yang berasal dari yeast

extract (Kumala et al, 2015). Sumber karbon merupakan komponen terpenting

dalam medium pertumbuhan karena sel-sel mikroba sebagian besar terdiri dari

unsur karbon dan nitrogen (Kusumaningtyas et al, 2010).

Pemilihan media PDY sebagai media fermentasi juga dikarenakan media

PDY merupakan media cair. Penggunaan media cair pada fermentasi memiliki

keuntungan yaitu dapat diatur jenis dan kensentrasi komponen media sehingga

dapat memberikan kondisi optimal dalam pertumbuhan kapang, serta penggunaan

media menjadi lebih efektif (Sulistyaningrum, 2008). Dengan demikian, proses

fermentasi dapat berjalan dengan maksimal dan metabolit sekunder yang

dihasilkan menjadi lebih banyak.


Hasil fermentasi disaring sehingga diperoleh supernatan dan biomassa.

Supernatan yang dihasilkan mengandung metabolit sekunder ekstraseluler dan

biomassa yang dihasilkan mengandung metabolit sekunder intra seluler (Shirly

Kumala & Pratiwi, 2014). Supernatan kemudian diekstraksi secara cair-cair

dengan menggunakan n-heksan kemudian diekstraksi lebih lanjut dengan

menggunakan etil asetat, sementara biomassa dimaserasi menggunakan metanol

selama 7 hari. Maserasi dilakukan sampai maserat berwarna bening agar

memaksilkan ekstraksi metabolit sekunder. Ekstrak yang didapat kemudian

dipekatkan menggunakan rotary vacuum evaporator. Berikut data perolehan

bobot esktrak yang didapat.

Tabel 4.1 Data Perolehan Bobot Ekstrak Fermentasi Isolat Kapang Endofit

Kode Isolat

Bobot Ekstrak Fermentasi

Metanol Etil Asetat n-Heksan

D.eschscholtzii 200 mg 540 mg 200 mg

4.3. Kurva Tumbuh Daldinia eschscholtzii

Pertumbuhan D. eschscholtzii dilakukan pada media cair yaitu Potato

Dextrose Broth yang ditambahkan dengan Yeast Extract dan diinkubasi selama 21

hari pada suhu ruang dengan kondisi statis. Setelah diinkubasi selama 21 hari

dihasilkan miselium berwarna putih pada seluruh permukaan media seperti yang

terlihat pada Gambar 4.3. Pertumbuhan kapang dihitung berdasarkan berat kering

miselium. Tingkat pertumbuhan D. eschscholtzii yang diisolasi dari tumbuhan

lumut Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees berada pada kisaran 0.45-

0.94 gram.

Tingkat pertumbuhan tertinggi pada D.eschscholtzii dicapai pada hari ke 21

dengan berat miselia mencapai 0.94 gram. Pada gambar 4.4 diketahui bahwa

kurva pertumbuhan D. eschscholtzii langsung memasuki fase eksponensial pada

hari ke 0 hingga hari ke 15. Hal ini disebabkan karena media yang digunakan pada

proses peremajaan dan fermentasi sama yaitu menggunakan kentang. Fase


stasioner didapat pada hari ke 15 hingga hari ke 21. Data berat miselium kapang

tertera pada lampiran 7.

Gambar 4.3 Pertumbuhan D. eschscholtzii pada Media PDY

Gambar 4.4 Kurva Pertumbuhan D. eschscholtzii

4.4. Uji Aktivitas Antioksidan Kualitatif dengan KLT

Uji aktivitas antioksidan fraksi fermentasi D.eschscholtzii dilakukan dengan

menggunakan metode penangkapan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-1-

pikrihidrazil). Metode DPPH dipilih karena memerlukan sedikit sampel, prosedur

kerjanya yang sederhana, mudah, waktu pengerjaan yang relatif cepat dibanding

metode lain, dan peka untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari senyawa

bahan alam. Pada metode ini, DPPH bertindak sebagai model radikal bebas yang

akan berikatan dengan senyawa antioksidan (Sri Wahdaningsih et al, 2013).

Skema reaksi antara DPPH dan antioksidan dapat dilihat pada Gambar 4.5.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Be

rat

mis

elia

(g)

Waktu (hari)


Gambar 4.5 Skema Reaksi DPPH dengan Antioksidan

(Molyneux, 2004)

Pada uji kualitatif ini dilakukan dengan menggunakan metode Basma et al

(2011) dengan modifikasi. Ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol dilarutkan

sedikit ke dalam pelarutnya. Masing-masing ekstrak ditotolkan ke atas plat KLT

dengan panjang 5 cm. Plat KLT kemudian dielusi dengan eluen yang sesuai.

Eluen yang digunakan yaitu n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan 9:1.

Larutan DPPH 0,25 mM kemudian disemprotkan ke atas plat KLT yang telah

dielusi.

Pola bercak pada KLT kemudian diamati untuk menentukan fraksi mana

yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan. Fraksi yang beraktivitas

antioksidan akan menimbulkan bercak kuning pada KLT yang disemprot DPPH

0,25 mM. Hal ini terjadi akibat adanya reduksi DPPH. Ikatan antara DPPH

dengan atom hidrogen yang didonorkan oleh senyawa antioksidan akan

membentuk senyawa non radikal (difenilpikrilhidrazin) berwarna kuning pucat

(peristiwa dekolorisasi) (Molyneux, 2004). Hasil uji aktivitas secara kualitatif

pada ekstrak fermentasi D. eschscholtzii kapang endofit tertera pada tabel 4.1.

Berdasarkan hasil pengujian kualitatif, didapatkan bahwa fraksi etil asetat

dari D. eschscholtzii berpotensi sebagai antioksidan karena dihasilkan bercak

kuning yang intensif. Oleh karenanya, fraksi etil asetat tersebut akan digunakan

untuk uji kuantitatif DPPH.


Tabel 4.2 Pengujian Aktivitas Antioksidan Kuantitatif Ekstrak Fermentasi Kapang Endofit

Ekstrak Panjang Gelombang Uji Kualitatif

DPPH 254 nm 366 nm

n-Heksan

Etil Asetat

Metanol


4.5. Uji Kuantitatif Antioksidan Fraksi Fermentasi

Fraksi etil asetat D. eschscholtzii selanjutnya diuji aktivitas antioksidan

secara kuantitatif menggunakan metode Komala et al (2015). Sebelum pengujian

dibuat larutan induk sebanyak 100 ppm dengan melarutkan 5 mg sampel ke dalam

50 mL metanol pro Analisa. Dari larutan induk kemudian dibuat variasi

konsentrasi 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/mL. Variasi konsentrasi ditentukan

berdasarkan penggolongan antioksidan yaitu antioksidan sangat kuat (IC50 < 50

µg/mL), antioksidan kuat (IC50 50 – 100 µg/mL), antioksidan sedang (IC50 101 –

150 µg/mL) dan antioksidan lemah (IC50 151 – 200 µg/mL) (Blois Marden S,

1958).

Pengujian antioksidan kuantitatif dilakukan dengan menambahkan 1 mL

reagen DPPH 0,25 mM ke dalam 4 mL larutan uji. Pengujian secara kuantitatif ini

dilakukan untuk mengetahui absorbansi DPPH yang tersisa setelah ditambahkan

ekstrak. Jika suatu senyawa memiliki aktivitas sebagai antioksidan, maka akan

terjadi penurunan nilai absorbansi DPPH pada panjang gelombang maksimumnya.

Penurunan absorbansi DPPH diukur terhadap absorbansi kontrol yaitu absorbansi

DPPH dalam metanol pro analisa tanpa penambahan bahan uji. Penurunan

absorbansi DPPH ditunjukkan dengan terjadinya degradasi warna DPPH dari

warna ungu menjadi warna kuning. Perubahan warna DPPH terjadi karena adanya

senyawa yang dapat memberikan radikal hidrogen kepada radikal DPPH sehingga

tereduksi menjadi DPPH-H (l,2-difenil-2-pikrilhidrazin) (Molyneux, 2004).

Proses degradasi warna DPPH berbanding lurus dengan konsentrasi ekstrak yang

ditambahkan.

Profil absorbansi terbaik didapat dari DPPH yang dilarutkan dalam metanol

dengan konsentrasi antara 0,01 mM hingga 0,25 mM (Sharma & Bhat, 2009).

Campuran larutan uji reagen DPPH 0,25 mM yang telah dibuat kemudian dikocok

kuat-kuat dan diinkubasi di dalam ruangan gelap selama 30 menit. Pengukuran

absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

Pada hasil pengukuran panjang gelombang DPPH dengan menggunakan

spektrofotometri UV-Vis menunjukkan bahwa serapan maksimum DPPH berada

pada panjang gelombang 515,8 nm. Kurva panjang gelombang maksimum DPPH

terdapat pada lampiran 8. Hal ini menunjukkan bahwa DPPH yang digunakan


adalah benar karena sesuai dengan literatur yaitu 515-520 nm (Locatelli et al,

2009). Semua lautan uji dan pembanding diukur nilai absorbansinya pada panjang

gelombang 515,8 nm.

Nilai absorbansi DPPH yang diperoleh digunakan untuk menentukan nilai

presentasi penghambatan radikal DPPH (% inhibisi), kemudian dapat ditentukan

nilai inhibitory concentration (IC50) ekstrak yang diujikan. Setelah diperoleh nilai

IC50, dihitung nilai antioxidant activity index (AAI) dari masing-masing ekstrak.

Hasil dari pengujian kuantitatif fraksi etil asetat yang didapat tertera pada tabel 4.3

dengan data lengkap tertera pada lampiran 12.

Tabel 4.3 Hasil Uji Antioksidan Kuantitatif

No Ekstrak Persamaan Linear IC50 (ppm) AAI

1. Etil Asetat y = 0,4322x + 2,6296

R2 = 0,9872 109,35 0,89

2. Vitamin C y = 13,875x – 0,513

R2 = 0,9974 3,64 26,92

Pada penelitian didapat data IC50 dan AAI dari fraksi etil asetat adalah 109,35

µg/mL dan 0,89. Nilai IC50 dan AAI tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil

asetat memiliki aktivitas antioksidan sedang. Sedangkan data IC50 dan AAI dari

vitamin C adalah 3,64 µg/mL dan 26,92. Nilai IC50 dan AAI tersebut

menunjukkan bahwa vitamin C memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat.

Pada uji ini, vitamin C digunakan sebagai standar. Vitamin C (asam L-

askorbat) digunakan karena termasuk antioksidan yang beraksi cepat dengan

DPPH selain itu vitamin C juga berfungsi sebagai penangkap radikal bebas dan

mencegah terjadinya reaksi berantai (Barrita & Sánchez, 2013). Vitamin C

termasuk golongan antioksidan sekunder yang mampu menangkal berbagai

radikal bebas. Hal ini dikarenakan radikal bebas memiliki gugus hidroksi bebas

yang bertindak sebagai penangkap radikal bebas dan jika mempunyai gugus

polihidroksi akan meningkatkan aktivitas antioksidan (Barrita & Sánchez, 2013).


4.6. Isolasi Senyawa Murni

Berdasarkan pengujian aktivitas antioksidan dapat disimpulkan bahwa

senyawa yang terdapat pada fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan yang

baik. Sehingga dilakukan proses pemurnian senyawa tersebut dengan

menggunakan metode rekristalisasi. Teknik rekristalisasi yang digunakan

merupakan rekristalisasi dengan multi pelarut.

Fraksi etil asetat dilarutkan dalam pelarut n-heksan, kemudian ditambahkan

metanol secara perlahan. Senyawa dan pengotor akan larut dalam pelarut dan

mengendap, sedangkan senyawa yang lain (selain senyawa utama) akan tetap

berada dalam larutan. Senyawa murni didapatkan dari fraksi etil asetat untuk

kemudian dinamakan sebagai C2EA.

Gambar 4.6 Hasil Rekristalisasi

4.7. Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi

KLT dua dimensi dilakukan untuk menguji kemurnian suatu senyawa dilihat

dari bercak yang dihasilkan dengan kromatografi secara dua arah. Senyawa

dikatakan murni apabila memiliki bercak tunggal setelah dilakukan dengan

pengujian dengan KLT dua dimensi.

Pada uji ini, plat KT dipotong dengan ukuran 5x5 cm, sampel kemudian

dielusi dengan menggunakan fase gerak n-Heksan : etil asetat (9:1). Plat

selanjutnya diputar 90 derajat dan dielusi kembali menggunakan pelarut yang

sama. Bercak diamati di bawah lampu UV (panjang gelombang 254 nm dan 356

nm). Hasil KLT dua dimensi dari senyawa C2EA menunjukkan tailing, sehingga

perlu dilakukan isolasi lebih lanjut.


(a) (b)

Gambar 4.7 KLT Dua Dimensi (a) panjang gelombang 254 nm (b) panjang gelombang

356 nm

4.8. Penentuan Struktur Senyawa

4.8.1. Spektrofotometri Infra Red

Identifikasi senyawa C2EA dilakukan dengan analisis spektrofotometri

infra merah (IR) dengan pellet KBr pada rentang bilangan 4000-400 yang

bertujuan untuk mengetahui gugus fungsi dari senyawa yang diperoleh. Hasil dari

pengukuran dengan spektrofotometri infra red ditunjukkan pada Gambar 4.7.

Gambar 4.8 Spektrum Infra Merah Senyawa C2EA

Analisis spektrum infra merah dari senyawa C2EA menunjukkan

kemungkinan terdapat beberapa gugus fungsi. Pada daerah bilangan gelombang


(v) 3458,71 cm-1 yang ditandai dengan pita yang lebar dengan intensitas sedang

yang diidentifikasi sebagai ikatan O – H. Terdapat ikatan C – H pada daerah

bilangan 2920,66 cm-1 dan 2851,24 cm-1. Serta terdapat ikatan C = C alifatik pada

daerah 1634,38 cm-1. Data bilangan gelombang spectrum FT-IR senyawa C2EA

tertera pada tabel 4.4.

Tabel 4.4 Data Bilangan Gelombang Spektrum FT-IR Senyawa C2EA

Bilangan Gelombang (cm-1) Jenis Ikatan

3458,71 Regang O – H; N – H

2920,66 Regang C – H; - C ≡ ; C – H; C = C –

H; Ar – H

2851,24 Regang C – H; CH3; CH2; - H

2355,62 Regang C ≡ C; C ≡ N

1634,38 Regang C = C (alifatik dan aromatic);

C = N

1469,49 Lentur C – H

4.8.2. Resonasi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Analisis struktur kimia dengan menggunakan 1H-NMR berguna untuk

mengetahui adanya proton dalam suatu struktur molekul. Data yang didapat dari

1H-NMR berupa pergeseran kimia yang dapat dianggap sebgai ciri bagian tertentu

dari suatu struktur molekul dan dapat membantu mengidentifikasi tiap gugus

suatu senyawa. Analisa 1H-NMR dilakukan dengan menggunakan pelarut CDCl3

sistem kosol DD2, yang beroperasi pada frekuensi 500 MHz (1H). Senyawa C2EA

yang telah dianalisis menunjukkan spektrum seperti pada Gambar 4.9 dan data

pergeseran kimia proton (δH) disajikan dalam Tabel 4.5.

Dari data spektrum 1H-NMR yang diperoleh, senyawa C2EA memiliki

satu gugus hidrokarbon (CH) pada nilai pergeseran kimia antara 0,83-0,86 ppm,

satu gugus metil (CH3) pada pergeseran kimia 0,88 ppm, delapan gugus metil

(CH3) pada pergeseran 1,26 ppm, serta satu gugus metilen (CH2) pada pergeseran

kimia 1,55 ppm. Senyawa yang terdapat dalam fraksi etil asetat belum dapat


diprediksikan, sehingga diperlukan data NMR full spektrum untuk menentukan

struktur senyawa tersebut.

Tabel 4.5 Tabel Pergeseran Kimia Senyawa C2EA

δH Gugus Fungsi

0,83 – 0,86 1H (CH)

0,88 3H (CH3)

1,26 24H (8CH3)

1,55 2H (CH2)

Gambar 4.9 Spektrum 1H – NMR Fraksi Etil Asetat Isolat MEC 2


BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

1) Kapang endofit yang digunakan pada penelitian termasuk ke dalam spesies

Daldinia eschscholtzii.

2) Isolasi senyawa dilakukan terhadap fraksi aktif antioksidan terbaik yaitu fraksi

etil asetat dengan AAI sebesar 0,89 dan IC50 sebesar 109,35 yang termasuk ke

dalam antioksidan sedang.

3) Data hasil 1H – NMR menunjukkan bahwa senyawa yang didapat memiliki

gugus hidrokarbon (CH), metilen (CH2), dan metil (CH3). Namun, senyawa

tersebut belum dapat diprediksi strukturnya, sehingga diperlukan data dari

instrumen pendukung lain.

5.2. Saran

1) Dilakukan optimasi kondisi fermentasi dan ekstraksi terhadap isolat kapang

endofit.

2) Dilakukan optimasi teknik isolasi senyawa metabolit sekunder terhadap isolat

kapang endofit.

3) Diperlukan data lebih lanjut mengenai penentuan struktur senyawa yang

meliputi data LC – MS, 13C – NMR dan NMR dua dimensi (HMBC, HMQC

dan NOESY) sebagai data pendukung.


DAFTAR PUSTAKA

Agnieszka Ludwiczuk, Fumihiro Nagashima, S. Robbert Gradstein, Y. A. (2008).

Volatile components from selected Mexican, Ecuadorian, Greek, German

and Japanese liverworts, 3(2), 133–140.

Andhikawati, A., Oktavia, Y., Ibrahim, B., & Tarman, K. (2014). Isolasi dan

Penapisan Kapang Laut Endofit Penghasil Selulase. Jurnal Ilmu Dan

Teknologi Kelautan Tropis, 6(1), 219–228.

Asakawa, Y. (2004). Chemosystematics of the Hepaticae. Phytochemistry, 65(6),

623–669. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2004.01.003

Asakawa, Y. (2012). Liverworts-Potential Source of Medicinal Compounds.

Medicinal & Aromatic Plants, 01(03), 3067–3088.

https://doi.org/10.4172/2167-0412.1000e114

Astarina, N.W.G., Astuti, K.W., Warditiani, N. K. (2013). Skrining Fitokimia

Ekstrak Metanol Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb).

B, H. J. (1987). Metode Fitokimia. (K. Radmawinata, Ed.). Bandung: Penerbit

ITB.

Barrita, J., & Sánchez, M. (2013). Antioxidant Role of Ascorbic Acid and His

Protective Effects on Chronic Diseases. https://doi.org/10.5772/52181

Basma, A. A., Zakaria, Z., Latha, L. Y., & Sasidharan, S. (2011). Antioxidant

activity and phytochemical screening of the methanol extracts of Euphorbia

hirta L. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 4(5), 386–390.

https://doi.org/10.1016/S1995-7645(11)60109-0

Blois Marden S. (1958). Antioxidant Determination by the Use of a Stable Free

Radical. Group, 181(4617), 1199–1200. https://doi.org/10.1038/1811199a0

Dainith, J. (1994). Kamus Lengkap Kimia. (S. Achmadi, Ed.). Jakarta: Erlangga.

Gandjar, I. (2006). Mikologi: Dasar dan Terapan. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

Ganley, R. J., & Newcombe, G. (2006). Fungal endophytes in seeds and needles

of Pinus monticola. Mycological Research, 110(3), 318–327.

https://doi.org/10.1016/j.mycres.2005.10.005

Glime, J. M. (2017). Marchantiophyta Chapter 2-3 (Vol. 1). Michigan: Michigan

Technological University and the International Association of Bryologists.

Goffinet. B, S. A. J. (2009). Bryophyte Biology 2nd ed. New York: Cambrige

University Press.

Gupta, S. K., Sharma, A., Moktan, S., Sikkim, E., & Bengal, W. (2015). a Review

on Some Species of Marchantia With Reference To Distribution ,

Characterization and, 4(04), 1576–1588.

Hapsari, R. Q., Djauhari, S., & Sulistyowati, L. (2014). KEANEKARAGAMAN

JAMUR ENDOFIT AKAR KANGKUNG DARAT ( Ipomoea reptans Poir.)

PADA LAHAN PERTANIAN ORGANIK DAN KONVENSIONAL. Jurnal


Hama Dan Penyakit Tanaman, 2(1), 1–10.

Huang, W. J., Wu, C. L., Lin, C. W., Chi, L. L., Chen, P. Y., Chiu, C. J., … Chen,

C. N. (2010). Marchantin A, a cyclic bis(bibenzyl ether), isolated from the

liverwort Marchantia emarginata subsp. tosana induces apoptosis in human

MCF-7 breast cancer cells. Cancer Letters, 291(1), 108–119.

https://doi.org/10.1016/j.canlet.2009.10.006

Huang, W. Y., Cai, Y. Z., Hyde, K. D., Corke, H., & Sun, M. (2007). Endophytic

fungi from Nerium oleander L (Apocynaceae): Main constituents and

antioxidant activity. World Journal of Microbiology and Biotechnology,

23(9), 1253–1263. https://doi.org/10.1007/s11274-007-9357-z

Hung, P. Q., Kumar, S. M., Govindsamy, V., & Annapurna, K. (2007). Isolation

and characterization of endophytic bacteria from wild and cultivated soybean

varieties. Biology and Fertility of Soils, 44(1), 155–162.

https://doi.org/10.1007/s00374-007-0189-7

Kedare, S. B., & Singh, R. P. (2011). Genesis and development of DPPH method

of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology, 48(4), 412–

422. https://doi.org/10.1007/s13197-011-0251-1

Kenneth L. Williamson, K. M. M. (2011). Macroscale and Microscale Organic

Experiments. (S. Kiselica, Ed.). Pennsylvania: Charles Hartford.

Komala, I., Azrifitria, Y., Betha, O. S., Muliati, F., & Ni’Mah, M. (2015).

Antioxidant and anti-inflammatory activity of the indonesian ferns,

Nephrolepis falcata and pyrrosia lanceolata. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7(12), 162–165.

Kumala, S., DwiYuliani, K., & Simanjuntak, P. (2015). Antimicrobial activity of

secondary metabolites produced by endophytic fungi isolated from stems of

Jati tree (Tectonagrandis L.F). International Journal of Pharmaceutical

Sciences and Research, 6(6), 2349–2353.

https://doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.6(6).2349-53

Kumala, S., & Pratiwi, A. A. (2014). Efek Antimikroba dari Kapang Endofit

Ranting Tanaman Biduri. Penelitian Artikel, 7(2), 111–120.

Kusumaningtyas, E., Natasia, M., & Darmono. (2010). POTENSI METABOLIT

KAPANG ENDOFIT RIMPANG LENGKUAS MERAH DALAM

MENGHAMBAT PERTUMBUHAN Eschericia coli DAN Staphylococcus

aureus DENGAN MEDIA FERMENTASI POTATO DEXTROSE BROTH

( PDB ) DAN POTATO DEXTROSE YEAST ( PDY ) ( The Potentials of

Metabolite of Endoph. Seminar Nasional Teknologi Peternakan Dan

Veteriner, 819–824.

Locatelli, M., Gindro, R., Travaglia, F., Coïsson, J. D., Rinaldi, M., & Arlorio, M.

(2009). Study of the DPPH{radical dot}-scavenging activity: Development

of a free software for the correct interpretation of data. Food Chemistry,

114(3), 889–897. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.10.035

Melliawati, R. (2006). Study on endophytic bacteria for bioactive compound

production use as plant protection agent. Biodiversitas, Journal of Biological


Diversity, 7, 221–224. https://doi.org/10.13057/biodiv/d070305

Michael Heinrich, Joanne Barnes, Simon Gibbons, E. M. Wi. (2012).

Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotherapy. Philadelpia: Elsevier.

Molyneux, P. (2004). The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-hydrazyl

(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin Journal of

Science and Technology, 26(December 2003), 211–219.

https://doi.org/10.1287/isre.6.2.144

Pinalia, A. (2012). Penentuan Metode Rekristalisasi Yang Tepat Untuk

Meningkatkan Kemurnian Kristal Amonium Perklorat (Ap). Majalah Sains

Dan Teknologi Dirgantara, 6(2), 64–70. Retrieved from

http://103.16.223.15/index.php/majalah_sains_tekgan/article/view/1635

Pranoto, E. N., Ma’ruf, W. F., & Pringgenies, D. (2012). KAJIAN AKTIVITAS

BIOAKTIF EKSTRAK TERIPANG PASIR ( Holothuria scabra )

TERHADAP JAMUR Candida albicans. Jurnal Pengolahan Dan

Bioteknologi Hasil Perikanan, 1(2005), 1–8.

Prashant Tiwari, B., Kumar, M. K., & Gurpreet Kaur, H. K. (2011).

Phytochemical screening and extraction - A review. Internationale

Pharmaceutica Sciencia, 1(1), 98–106.

https://doi.org/https://doi.org/10.1016/B978-0-12-800018-2.00009-1

R. M. Silverstein, G. C. Bassler, T. C. M. (1991). Spectrometric Identification of

Organic Compound (5th edition). New York: John Wiley & Sons Ltd.

https://doi.org/10.1002/oms.1210260923

Radji, M. (2005). Peranan Bioteknologi Dan Mikroba Endofit Dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian, 2(3), 113–126.

https://doi.org/10.7454/psr.v2i3.3388

Ramadhan, M. G. (2011). Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan α-

Glukosidase dari Kapang Endofit Daun Johar (Cassia siamea Lamk.).

Depok : Universitas Indonesia.

Schechter, M. (1971). Principles of functional analysis. New York: Academic

Press.

Schulz, B., Boyle, C., Draeger, S., Römmert, A.-K., & Krohn, K. (2002).

Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary

metabolites. Mycological Research, 106(9), 996–1004.

https://doi.org/10.1017/S0953756202006342

Sharma, O. P., & Bhat, T. K. (2009). DPPH antioxidant assay revisited. Food

Chemistry, 113(4), 1202–1205.

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.08.008

Shebis, Y., Iluz, D., Kinel-Tahan, Y., Dubinsky, Z., & Yehoshua, Y. (2013).

Natural Antioxidants: Function and Sources. Food and Nutrition Sciences,

04(06), 643–649. https://doi.org/10.4236/fns.2013.46083

Simpson, M. G. (2006). Plant Systematics. London: Elsevier Academic Press.

Soejoko, D. S., Fisika, D., Matematika, F., Alam, P., & Indonesia, U. (2002).


Hasil Presipitasi, 6(3), 117–120.

Sri Wahdaningsih, Subagus Wahyuono, E. P. S. (2013). ISOLATION AND

IDENTIFICATION OF ANTIOXIDANT COMPOUNDS IN FERN STEMS

( Alsophila glauca J . SM ) USING DPPH METHOD (2,2-Diphenyl-1-

Picryhydrazyl), 18(January), 5–10.

Strobel G, D. B. (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their

natural product. Microbiology and Molecular Biology Review, 67(4), 491–

402. https://doi.org/10.1128/MMBR.67.4.491

Sudjadi. (1985). Penentuan Struktur Senyawa Organik. Jakarta: Ghalia Indonesia.

Sulistyaningrum, L. S. (2008). Optimasi Fermentasi Asam Kojat Oleh Galur

Mutan Aspergillus falvus NTGA7A4UVE10. Fmipa Ui, (16), 4–20.

Sulistyowati, D. A., Perwati, L. K., & Wiryani, E. (2014). Keanekaragaman

Marchantiophyta Epifit Zona Montana di Kawasan Gunung Ungaran , Jawa

Tengah Desy Aristria Sulistyowati , Lilih Khotim Perwati dan Erry Wiryani

Abstrak. Bioma, 16(1), 26–32.

Svehla. G, V. A. . (1985). Buku Tekas Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan

Semimikro. (L. Setiono, Ed.). Jakarta: PT. Kalman Media Pustaka.

Wilson, D. (1995). Endophyte: The Evolution of a Term, and Clarification of Its

Use and Definition. Oikos, 73(2), 274. https://doi.org/10.2307/3545919

Zeng, P. Y., Wu, J. G., Liao, L. M., Chen, T. Q., Wu, J. Z., & Wong, K. H.

(2011). In vitro antioxidant activities of endophytic fungi isolated from the

liverwort Scapania verrucosa. Genetics and Molecular Research, 10(4),

3169–3179. https://doi.org/10.4238/2011.December.20.1

Zhang, T., Zhang, Y. Q., Liu, H. Y., Wei, Y. Z., Li, H. L., Su, J., … Yu, L. Y.

(2013). Diversity and cold adaptation of culturable endophytic fungi from

bryophytes in the Fildes Region, King George Island, maritime Antarctica.

FEMS Microbiology Letters, 341(1), 52–61. https://doi.org/10.1111/1574-

6968.12090


LAMPIRAN

Lampiran 1 Bagan Alur Penelitian

Isolat Kapang Endofit MEC 2

Peremajaan Kaoang Endofit

MEC 2

Karakteristik Kapang Endofit

MEC 2

Fermentasi dan Pembuatan

Kurva Tumbuh

Ekstraksi Kapang Endofit

Fraksi n – Heksan Fraksi Etil Asetat Fraksi Metanol

Uji Kualitatif DPPH

Uji Kuantitatif DPPH

Penentuan Struktur Molekul Senyawa Murni

Spektrofotometer

Infrared (IR)

Spektroskopi

Nuclear Magnetic

Resonance


Lampiran 2 Bagan Peremajaan Kapang

Lampiran 3 Bagan Karakterisasi Kapang Endofit

Isolat kapang

yang didapat

dari penelitian

Sukandar

(2017)

Diinokulasikan

ke dalam cawan

petri yang berisi

media PDA

Diinkubasi

selama 7 hari

pada suhu ruang

Isolat

kapang


Lampiran 4 Hasil Identifikasi Kapang Endofit Isolat MEC 2


Lampiran 5 Bagan Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit

Kapang endofit usia 7 hari

Fermentasi menggunakan

metode statis selama 14 hari

pada suhu 28o C

Disaring dengan kertas saring

Supernatan Biomassa

Diambil 5 potong isolat beruluran 1 cm

dan dimasukkan ke dalam botol 500 ml

berisi 100 mL media PDY steril

Fraksi n -

Heksan

Ekstrak

fraksi n -

Heksan

Fraksi

air

Fraksi etil

aseta

Fraksi

air

Dipekatkan

Ekstrak

fraksi etil

asetat

Dipekatkan

Ekstrak

fraksi

metanol

Dimaserasi dengan

metanol selama 7 hari,

disaring dan dipekatkan

(+) n - Heksan

(+) etil asetat


Lampiran 6 Bagan Kurva Tumbuh

Isolat kapang endofit yang

sudah diremajakan dan

ditumbuhkan pada media PDY

Pada hari ke 0, 3, 6, 9, 12, 15,

18, 21 isolat disaring dengan

kertas saring

Supernatan Biomassa

Dioven pada

suhu 105o C

selama 24 jam

Bobot kering

miselia

ditimbang


Lampiran 7 Data Berat Miselia Kapang

Hari ke – 0 0,54 gram






Lampiran 8 Panjang Gelombang Maksimum DPPH


Lampiran 9 Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji

Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Fraksi Ekstrak Fermentasi Etil Asetat Isolat

MEC II

Fraksi Ekstrak

Fermentasi Etil Asetat Absorbansi

Absorbansi Rata-

rata I (%)

Blanko 0,578 0,578 -

100 ppm

0,323

0,316 45,33 0,307

0,318

50 ppm

0,430

0,437 24,39 0,440

0,440

25 ppm

0,480

0,483 16,44 0,483

0,486

12,5 ppm

0,516

0,533 7,79 0,523

0,560

6,25 ppm

0,550

0,560 3,14 0,554

0,576

y = 0.4332x + 2.6296R² = 0.9872

0

10

20

30

40

50

0 20 40 60 80 100 120

I (%

)

Konsentrasi (µg/mL)

Ekstrak Etil Asetat


Lampiran 10 Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji

Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Vitamin C

Vitamin C Absorbansi I (%)

Blanko 0,431 -

1 ppm 0,370 14,15

2 ppm 0,318 26,22

3 ppm 0,251 41,76

4 ppm 0,200 53,59

5 ppm 0,130 69,84

y = 13.875x - 0.513R² = 0.9974

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6

I (%

)

Konsentrasi

Vitamin C


Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks Aktivitas

Antioksidan (AAI)

Fraksi Ekstrak

Fermentasi

Persamaan Regresi

Linear R2

Etil Asetat y = 0,4332x + 2,6296 0,9872

Vitamin C y = 13,875x – 0,513 0,9974

Fraksi Esktrak Fermentasi

IC50 y = 0,4332x + 2,6296

50 = 0,4332x + 2,6296

x = 109,35 µg/mL

Konsentrasi DPPH = 4,9 mg / 50 mL

= 98 µg/mL

AAI = Konsentrasi DPPH / IC50

= 98 µg/mL / 109,35 µg/mL

= 0,89

Vitamin C

IC50 y = 13,875x – 0,513

50 = 13,875x – 0,513

x = 3,64 µg/mL

Konsentrasi DPPH = 4,9 mg / 50 mL

= 98 µg/mL

AAI = Konsentrasi DPPH / IC50

= 98 µg/mL / 3,64 µg/mL

= 26,92

uin syarif hidayatullah jakarta isolasi metabolit...

Documents