UBI JALAR UNGU SEBAGAI STIMULATOR PENINGKATAN KEMAMPUAN ANGIOGENESIS PADA TIKUS YANG DIBERI LUKA

HALAMAN JUDUL

Proposal Penelitian

diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan di Fakultas Kedokteran (S1)

dan mencapai gelar Sarjana Kedokteran

Oleh

Achmad Hariyanto

NIM 092010101062

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS JEMBER

2012

1.1 Latar Belakang

Diabetes melitus (DM) merupakan penyebab terpenting terjadinya penyakit vaskular dan

berhubungan dengan peningkatan resiko aterosklerosis. Secara klinis, tingkat keparahan dari

penyakit oklusi vaskular pada diabetes sebagian karena kegagalan perkembangan pembuluh

darah kolateral. Ulkus kaki diabetes merupakan komplikasi DM yang berkaitan dengan

morbiditas akibat dari komplikasi makrovaskuler dan mikrovaskuler. Ulkus kaki diabetes

diperkirakan terjadi kurang lebih 15% dari semua pasien dengan diabetes, dengan resiko

terjadinya kekambuhan dalam 5 tahun sebesar 70% dan 84% penyebab amputasi kaki

penderita diabetes (Amos, et al., 1997, ADA 2000).

Komplikasi DM menyebabkan munculnya gangguan mikroangiopati dan

makroangiopati serta neuropati, yang menyebabkan gangguan pada proses angiogenesis,

epitelialisasi, deposisi kolagen dan beberapa proses esensial lain pada tahapan

penyembuhan luka. Pada ulkus diabetes terdapat gambaran fungsi dasar sel yang mengalami

kegagalan wound healing. Penyembuhan luka pada diabetes menunjukkan terhentinya proses

perbaikan luka dan penurunan kekuatan regangan dari penyembuhan luka (Brownlee, 2005).

Kegagalan penyembuhan ulkus diabetes terjadi akibat terganggunya sejumlah proses dalam

tahapan penyembuhan luka yaitu inflamasi, proliferasi sel, migrasi sel, permeabilitas

vaskuler dan angiogenesis akibat defisiensi growth factor dan sitokin proangiogenik, deposisi

matriks dan remodeling jaringan (Sushil, et al., 2000). Hal ini akan mempengaruhi proses

angiogenesis penyembuhan luka pada kasus diabetes.

Angiogenesis memegang peranan penting dalam regenerasi jaringan, perbaikan

jaringan pasca iskemia pada infark dan stroke, patogenesis kanker, rheumatoid arthritis,

serta penyakit mikrovaskuler diabetik. Proses angiogenesis dikendalikan oleh growth factor

angiogenik seperti VEGF, TGF, bFGF, PDGF dan beberapa growth factor lainnya (Ding, 2000).

Dari berbagai growth factor proangiogenik, VEGF memegang peranan paling dominan.

VEGF merupakan growth factor penting yang terlibat dalam pemacuan angiogenesis.

VEGF mampu menstimulasi proliferasi dan migrasi sel endotel pada pembentukan tabung

pembuluh darah. Pada mencit diabetik, aplikasi topikal VEGF menunjukkan progresi pada

penyembuhan luka dan berperan dalam mobilisasi serta perekrutan progenitor vaskuler (Ding,

2000; Thum, et al., 2007). Penurunan aktivitas VEGF pada ulkus diabetik, mengakibatkan

terjadinya abnormalitas angiogenesis (Thum, et al., 2007).

Di Indonesia, konsumsi ubi jalar di masyarakat cukup besar, 89% produksi ubi jalar

digunakan sebagai bahan pangan dengan tingkat konsumsi 7,9 kg/kapita/tahun, sedangkan

sisanya dimanfaatkan untuk bahan baku industri, terutama saus, dan pakan ternak. Penelitian

sebelumnya menunjukan bahwa umbi jalar ungu mengandung antosianin dengan kadar yang

cukup tinggi, yaitu 110-210 mg per 100 gram (Suprapta, 2004). Senyawa antosianin yang

terdapat pada ubi jalar diketahui berfungsi sebagai antioksidan dan antihiperglisemik. Ubi jalar

ungu dengan efek antioksidannya menghalangi reactive oxygen spesies (ROS) yang merusak

DNA dan menyebabkan mutasi (Maheswari, 2000 ;Utami, 2003). Penelitian tentang efektifitas

ubi jalar dalam meningkatkan kemampuan angiogenesis belum pernah dilakukan. Karena itu

penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efektifitas ubi jalar pada penyembuhan ulkus diabetik

sangat diperlukan, sehingga akan dapat menambah nilai mutu dari ubi jalar ungu sebagai nutrisi

yang kaya antioksidan.

Dengan demikian pada penelitian ini akan dilakukan pengujian terhadap efek langsung

dari ubi jalar ungu sebagai stimulator peningkatan kemampuan angiogenesis pada tikus model

ulkus diabetes. Berdasarkan kemungkinan keterkaitan diabetes melitus dengan potensi ubi jalar

ungu sebagai antioksidan dan pemicu angiogenesis serta kemudahan untuk didapatkan dan

keamanan yang lebih tinggi, maka penelitian ini perlu dilakukan.

1.2. Rumusan Masalah:

1. Bagaimana pengaruh ubi jalar ungu terhadap kadar gula darah tikus model ulkus

diabetes?

2. Bagaimana peranan ubi jalar ungu sebagai stimulator peningkatan rkspresi VEGF pada

tikus model ulkus diabetes?

1.3. Tujuan dan Manfaat :

Tujuan:

1. Mengetahui pengaruh ubi jalar ungu terhadap kadar gula darah pada tikus model ulkus

diabetes.

2. Mengetahui peranan ubi jalar ungu sebagai stimulator peningkatan ekspresi pada tikus

model ulkus diabetes.

Manfaat:

1. dapat mengungkap manfaat ubi jalar ungu bagi kesehatan terutama dalam meningkatkan

kemampuan angiogenesis pada kasus ulkus diabetik sehingga ubi jalar ini mempunyai

nilai tambah disamping sebagai bahan pokok makanan.

2. dapat memberikan pengetahuan kepada masyarakat tentang manfaat konsumsi ubi jalar

ungu sehingga dapat memberikan dampak terhadap frekuensi konsumsi ubi jalar ungu.

3. dapat memberikan dorongan kepada para petani ubi jalar untuk meningkatkan mutu

varietas ubi jalar.

II. Tinjauan Pustaka/Kemajuan yang telah dicapai dan Studi Pendahuluan yang telah dilaksanakan

2.1 Studi Pustaka

2.1.1 Diabetes dan Komplikasi Diabetes Mellitus

Diabetes adalah penyakit kronis yang disebabkan karena kelainan metabolik oleh karena

tingginya kadar gula darah (glukosa) di dalam darah. Gula darah di kontrol oleh insulin, suatu

hormon yang dihasilkan oleh pankreas, dengan adanya insulin memungkinkan sel untuk

menyerap gula di dalam darah, defisiensi insulin bisa diakibatkan oleh kekurangan sekresi

insulin dan hambatan kerja insulin pada reseptornya. Kadar gula darah yang tinggi dapat

mengakibatkan kerusakan organ dalam tubuh (ADA 2000; Suarez, et al., 2007).

Hiperglikemia akan menimbulkan ROS (Reactive Oxygen Species) yang akan memicu

komplikasi mikrovaskuler dan makrovaskuler, ROS terjadi melalui empat mekanisme utama

akibat hiperglikemi yaitu, peningkatan refluk polyol pathway; peningkatan pembentukan

advanced glycation end product (AGEs); pengaktifan protein isoform kinase C (PKC);

dan peningkatan hexosamine pathway. Pada konsentrasi rendah ROS bermanfaat untuk

stimulasi pertumbuhan dari sel dan mikroorganisme. Peningkatan kadar ROS akan

mempengaruhi aktivasi signaling pathway dan memicu apoptosis. Kenaikan ROS yang sangat

tinggi akan mengakibatkan kematian sel melalui mekanisme nekrosis (Bonnefont-Rousselot,

2002; McAnuff, 2003).

2.1.2 Patogenesis Ulkus Diabetes

Patogenesis ulkus diabetes sebagai akibat komplikasi mikrovaskular dan makrovaskuler

sangat kompleks. Peran komplikasi mikrovaskuler dan makrovaskuler pada ulkus kaki

diabetes adalah timbulnya neuropati dan gangguan vaskuler berupa arteriosklerosis.

Kombinasi peran dari neuropati (sensori, autonom, motorik), trauma oleh karena tekanan

plantar yang meningkat dan deformitas sendi, gangguan vaskuler perifer, infeksi dan

kegagalan penyembuhan luka akan menimbulkan ulkus kaki diabetes (Singh, et al., 2001,

Suarez, et al., 2007).

Patofisiologi dan biomekanisme ulkus kaki diabetik pada umumnya disebabkan oleh

kombinasi dari insufisiensi arteri pada tungkai bawah, neuropati tungkai bawah yang memicu

terjadinya perubahan bentuk kaki dan juga pembentukan kalus oleh karena hypohidrosis

atau anhidrosis. Abnormalitas stress biomekanik pada kaki lebih lanjut akan menjadi

faktor yang berperan pada timbulnya ulkus kaki diabetes dan adanya trauma lokal. Dari 20 %

pasien dengan ulkus kaki diabetik diakibatkan oleh aliran darah arteri yang tidak adekuat,

50% mempunyai diabetik neuropati, dan 30 % ditimbulkan oleh keduanya (Amos, 1997;

Global Burden, 2000).

Gangguan penyebuhan ulkus kaki diabetes disebabkan oleh sejumlah faktor, dan

diperkirakan melibatkan kombinasi dari beberapa faktor tersebut. Gambaran faktor seluler

yang terlibat pada lambatnya penutupan luka antara lain, lemahnya kontraksi yang

kemungkinan akibat gangguan pada fenotip miofibroblas, efek pada granulosit, kerusakan

kemotaksis yang berkaitan langsung dengan sintesis kolagen, efek pada sel darah merah,

kerusakan kontrol apoptosis sel. Faktor seluler tidak hanya satu-satunya faktor yang

bertanggung jawab untuk lemahnya healing ulkus kaki diabetes. Faktor lain yang juga terlibat

adalah perubahan dalam metabolisme karbohidrat, lemak dan protein yang dihasilkan dari

defisiensi atau tidak adanya insulin, dimana hiperglikemia memulai pada glikasi non-

enzimatik (Hussain, 2002).

2.1.3 Peranan Angiogenesis pada Penyembuhan Luka Diabetes

Angiogenesis merupakan proses perkembangan kapiler baru dari pembuluh darah

sebelumnya, yang memfasilitasi proses fisiologi perkembangan

embrio, reproduksi wanita dan penyembuhan luka. Proses angiogenesis merupakan

mekanisme yang kompleks, yang terdiri dari degradasi enzimatik

pada membran dasar, pergerakan endotel vaskuler kedalam ruang perivaskuler, proliferasi dan

pencocokan pada bentuk struktur tabung vaskuler serta pembentukan pembuluh darah baru.

Dalam proses angiogenesis distimulasi oleh beberapa faktor antara lain bFGF, VEGF, TNF-

α, dan PDGF. Disamping itu

terdapat inhibitor endogen seperti trombospondin, cartilage derived inhibitor, dan

tissue inhibitor dari metalloprotease in vivo (Krankel, et al., 2005).

Dalam proses angiogenesis beberapa molekul pro angiogenik yang terlibat antara lain

VEGF, FGF dan angiopoietin serta beberapa molekul anti angiogenik seperti platelet factor-4,

angiostatin, endostatin dan vasostatin menjadi target dari aplikasi klinik untuk beberapa

patologi penyakit tertentu yang terkait pembentukan pembuluh darah baru. Pada beberapa

stadium perkembangan seperti pada perkembangan embrio, wound healing dan siklus

menstruasi, angiogenesis diperlukan untuk suplai oksigen dan nutrient dan juga pemindahan

produk sisa metabolisme. Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah

baru dari pre-existing vasculature, yang memegang peranan penting dalam regenerasi

jaringan, perbaikan jaringan post iskemia pada infark dan stroke, patogenesis kanker,

Rheumatoid Arthritis serta penyakit mikrovaskuler diabetik (Evans, 2003).

2.1.4 Growth factor Proangiogenik dan Peranannya dalam Penyembuhan

Luka Diabetes

2.1.4.1 Vascular Endothelial Growth factor (VEGF)

Famili Vascular endothelial growth factor (VEGF) memiliki tujuh anggota

antara lain VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F dan placental

growth factor (PlGF), semuanya VEGF umumnya memiliki domain 8

area yang dikarakteristik oleh residu sistein. VEGF-A adalah molekul primer yang

terlibat didalam angiogenesis dan vasculogenesis serta menyebabkan proliferation, sprouting,

migrasi dan tube formation di sel endotel. VEGF disekresi

oleh berbagai tipe sel berbeda seperti neutrofil, makrofag yang teraktivasi, keratinosit dan

fibroblas. Ekspresi VEGF diinduksi kuat oleh kondisi hipoksia melalui transcription factor

hypoxia inducible factor-1. Ekspresi VEGF diinduksi secara umum oleh growth factor lain

serta sitokin seperti epidermal growth factor, TGF-ß, keratinocyte growth factor, IGF-I, FGF,

PDGF, TNF-α, IL-1B and IL-6. VEGF diketahui sebagai inducer penting proses

angiogenesis selama penyembuhan luka dan terjadi gangguan pada penyembuhan luka

diabetik. Aplikasi topikal VEGF memulai penutupan luka pada model hewan coba yang

mengalami kegagalan penyembuhan luka. Pada mencit, perlakuan dengan inhibitor

angiogenesis endostatin menunjukkan lemahnya Penyembuhan luka, tetapi kondisi tersebut

menjadi terbalik ketika dilakukan terapi topikal dengan VEGF. Pada mencit diabetik,

aplikasi topikal VEGF menunjukkan akselerasi dengan perbaikan luka kulit serta

memobilisasi dan merekrut progenitor vaskuler (Rehman, et al., 2003).

Kegagalan proses penyembuhan ulkus diabetes melibatkan sejumlah aspek.

Kegagalan angiogenesis luka diketahui akan melemahkan penyembuhan luka.VEGF-C memacu

angiogenesis dan limpangiogenesis di daerah luka secara signifikan dibandingkan dengan

kelompok tanpa VEGF-C. VEGF-C juga merekrut sel inflamasi dan beberapa

mengekspresikan VEGFR-3. Kepentingan secara klinik dari perfusi darah di proses

Penyembuhan luka jaringan pada pasien diabetes adalah bukti bahwa terjadi iskemia lokal

dan edema yang menghambat pengantaran suplai oksigen dan nutrien pada jaringan luka

tersebut, menyebabkan kegagalan penyembuhan luka. Ketidakcukupan perfusi darah yang

berpasangan dengan kegagalan angiogenesis menyebabkan komplikasi perbaikan jaringan di

diabetes. Inflamasi diperlukan dalam proses penyembuhan luka, tetapi proses ini menjadi

abnormal pada ulkus diabetes. Luka diabetik ditandai dengan kegagalan fungsi sel inflamasi,

penurunan sekresi sitokin dan growth factor, dan terlalu lamanya fase inflamasi. Lingkungan

mikro yang terlalu proteolitik akan memulai penurunan aktivitas VEGF di luka diabetik (Thum,

et al., 2007).

2.1.6 Peran Ubi Jalar Ungu pada Penyembuhan Luka Diabetes

Ubi jalar merupakan jenis ubi yang cukup populer di Indonesia. Senyawa antosianin yang

terdapat pada ubi jalar berfungsi sebagai antioksidan dan penangkap radikal bebas, sehingga

berperan dalam mencegah terjadinya penuaan, kanker, dan penyakit degeneratif seperti

arteriosklerosis. Selain itu, antosianin juga memiliki kemampuan sebagai antimutagenik dan

antikarsinogenik terhadap mutagen dan karsinogen yang terdapat pada bahan pangan dan produk

olahannya, mencegah gangguan fungsi hati, antihipertensi, dan menurunkan kadar gula darah

(antihiperglisemik) (Dalimartha, 2004).

Antioksidan diketahui dapat mencegah dan menangkal terjadinya radikal bebas.

Hiperglikemia merupakan kondisi yang potensial untuk terbentuknya radikal bebas. Secara

umum antioksidan dibagi menjadi 2 golongan yaitu antioksidan enzimatik dan non enzimatik.

Beberapa kelompok antioksidan enzimatik antara lain superoxide dismutase, catalase dan

glutathion peroxidase. Sedangkan antioksidan non enzimatik meliputi vitamin C, vitamin E, dan

beta karoten (Utami, 2003; Dalimartha, 2004). Selain vitamin C dan vitamin E, beberapa

flavonoid yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan terbukti berkhasiat antioksidan (Miller, 1996).

Salah satu komponen flavonoid dari tumbuh-tumbuhan yang dapat berfungsi sebagai antioksidan

adalah zat warna alami yang disebut antosianin.

Patomekanisme komplikasi mikrovaskuler dan makrovaskuler pada diabetes terjadi

akibat peningkatan kadar ROS (Reactive Oxygen Species), pada konsentrasi rendah ROS

bermanfaat untuk stimulasi pertumbuhan dari sel. Akan tetapi peningkatan kadar ROS yang

berlebihan akan mempengaruhi aktivasi jalur sinyal transduksi intraseluler dan memicu

apoptosis. Hal ini akan berdampak pada kegagalan neovaskularisasi di jaringan luka .

Senyawa antosianin yang terdapat dalam ubi jalar ungu berperan sebagai antioksidan yang akan

memutus rantai radikal bebas sehingga proses apoptosis sel dapat dicegah.

2.2 Kemajuan yang telah dicapai dan Studi Pendahuluan yang telah dilaksanakan (ROAD

MAP PENELITIAN)

Pada penelitian ini akan dilakukan pengujian ubi jalar ungu secara in vivo pada tikus model ulkus

diabetes. Penelitian yang pernah kami lakukan adalah “Optimalisasi pembuatan tikus model

diabetes mellitus”. Road map yang akan kami lakukan adalah sebagai berikut:

1. Pembuatan tikus model ulcus diabetik yang diinduksi alloxan monohidrat.

2. Pemberian ekstrak ubi jalar ungu pada tikus model ulcus diabetik yang diinduksi alloxan

monohidrat

3. Pengukuran kadar glukosa darah & kemampuan angiogenesis/VEGF pada tikus model

ulcus diabetik

4. Analisis data

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 DISAIN PENELITIAN

Penelitian ini bersifat eksperimental secara in vivo menggunakan tikus putih (Rattus

norvegicus strain Wistar) sebagai model. Kriteria tikus yang digunakan sebagai model:

Tikus putih wistar jantan, untuk menghindari pengaruh hormone (estrogen)

Tikus dewasa, yaitu berumur 8-12 minggu

Berat badan kurang lebih antara 100 - 250 gr.

Jumlah tikus yang digunakan sebagai sample adalah 30 ekor yang terbagi dalam 5

kelompok, dimana tiap kelompok terdiri dari 6 ekor. Kelompok 1: kontrol negatif (tanpa

pemberian ekstrak ubi jalar ungu), kelompok 2: kontrol positif (ulkus diabetik tanpa pemberian

ekstrak ubi jalar ungu), kelompok 3: tikus ulkus diabetik dengan pemberian ekstrak ubi jalar

ungu 0,2 mg/hari/kg BB, kelompok 4: tikus ulkus diabetik dengan pemberian ekstrak ubi jalar

ungu 0,5 mg/hari/kg BB, dan kelompok 5: tikus ulkus diabetik dengan pemberian ekstrak ubi

jalar ungu 0,8 mg/hari/kg BB.

Untuk memperoleh variabilitas dari tikus yang digunakan sebagai sample penelitian,

maka tikus pada tiap kelompok diberi kesempatan untuk terpilih sebagai sample dengan cara

randomisasi.

3.2 ALAT DAN BAHAN PENELITIAN

Bahan makanan tikus (BR-1), ekstrak ubi jalar ungu, alloxan monohidrat, antibody (sENDO)

CD133; antibody anti rat VEGF (Sigma), phosphate-buffered saline (PBS), eter timbangan,

neraca analitik, waskom, pengaduk, hand scone, gelas ukur, penggiling pakan, nampan, kandang

tikus, sonde, dan seperangkat alat bedah minor.

3.3 PROSEDUR PENELITIAN

1. Persiapan Kandang

(Dilakukan di Lab. Farmakologi Fak. Kedokteran Univ. Jember)

- Menyiapkan rak besi untuk penempatan kandang tikus

- Menyiapkan kandang dari kotak plastik dengan tutup terbuat dari ram kawat,

dan didalamnya diberi sekam

- Menyiapkan tempat minum tikus

2. Persiapan Hewan Coba

Seleksi hewan yang akan digunakan sebagai model sesuai kriteria yang telah ditetapkan,

dalam hal ini tikus putih (Rattus Norvegicus strain Wistar)

Dilakukan adaptasi setelah tikus diseleksi, yaitu tikus dimasukkan dalam kandang yang sudah

disiapkan dengan diberi pakan biasa dan minum selama 3 hari.

1. Induksi alloxan monohidrat dan Pembuatan Luka Diabetik

Metode pembuatan tikus model diabetites dilakukan dengan menginduksi yang

diinjeksikan secara intravena . Digunakan dosis 75 mg/kg BB sebanyak 1 Tikus dinyatakan

diabetes bila telah mempunyai kadar glukosa lebih dari 110 mg/dl. Untuk pembuatan luka

tikus kemudian dianestesi selama sebelum percobaan pembuatan luka. Proses pembedahan

dikondisikan dibawah keadaan steril menggunakan anestesi ketamine (10 mg/kg body

weight). Tikus dianestesi secara intravena dengan 1 ml ketamine hydrochloride (10 mg/kg body

weight) dan bulu dicukur pada kedua sisi dengan pencukur elektrik. Untuk area luka dibuat

dengan membuat garis luar pada bagian punggung tikus percobaan dengan methylene blue

menggunakan sebuah penanda/pola berbentuk lingkaran. Diameter luka (Ø) dibuat dengan

ukuran 2.5 cm dan kedalaman 0.2 cm dari permukaan dermal dengan menggunakan pinset,

pisau bedah nomor 11, dan gunting ujung runcing. Luka dibiarkan tetap terbuka selama

penelitian dan dikompres dengan NaCl 0,9% (Ika, dkk, 2005). Potongan kulit dengan

diameter luka (Ø) dibuat dengan ukuran 2.5 cm dan kedalaman 0.2 cm digunakan untuk

sediaan pemeriksaan imunohistologi (Bancroft, 2002).

2. Perlakuan Ekstrak Ubi Jalar Ungu

Ekstrak ubi jalar segar dibuat dengan mencuci dan mengupas ubi jalar ungu sampai

bersih. Dalam 100 gr ubi jalar kemudian ditambahkan 1 liter aquades dan dihomogenisasi

dengan blender selama 5 menit. Homogenat lalu disaring menggunakan 3 lapis kain kasa dan

dipanaskan pada suhu mendidih selama 45 menit. Ekstrak kemudian didinginkan dan siap

digunakan untuk penelitian.

3. Pengukuran Kadar Gula Darah Tikus

4. Evaluasi VEGF menggunakan Imonohistokimia

Jaringan luka difiksasi dengan formalin kemudian dideparafinisasi untuk dibuat preparat.

Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Jaringan ditetesi dengan 0,1 % Triton-X 100 dan

diinkubasi selama 5 menit. Sel dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Jaringan ditetesi dengan 3%

H2O2 dan diinkubasi selama 20 menit. Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Jaringan

dibloking dengan 5% FBS selama 30 menit selama overnight pada suhu 4oC. Sel dicuci dengan

PBS-T 3 x 5 menit. Sel ditetesi dengan first antibody yaitu Rabbit Anti-PI3-K Polyclonal

Antibody (Sigma). Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x5 menit. Jaringan diberi dengan second

antibody IgG Biotin dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4oC. Jaringan dicuci dengan PBS-T

3 x 5 menit, inkubasi dengan Streptavidine Peroxidase selama 30 menit suhu ruang. Jaringan

dicuci dengan buffer dan inkubasi dengan kromogen DAB 10 menit. Jaringan kemudian dicuci

dengan aquades dan counterstain, selanjutnya jaringan diamati secepatnya menggunakan

mikroskop.

Analisis Data. Data disajikan dalam mean±SD. Untuk mengetahui perbedaan dan interaksi antar kelompok perlakuan digunakan analisis One way Anova SPSS versi 14 dan korelasi Pearson. Sedangkan analisis jalur menggunakan Path analysis.