MIKROBIOLOGI INDUSTRIPRODUKSI ZAT ANTIBIOTIK

Oleh:Kelompok IV

Ida Ayu Made Kesuma Dewi (1108505038)Ni Nym Tri Andyani Nayaka Putri (1108505039)Wayan Sudiasmara(1108505040)Made Riani Cahyani(1108505043)Diah Ayu Nirmala Kosasih (1108505044)Ni Komang Yuni Trisdayanti (1108505045)Eka Sunariyani (1108505046)Luh De Sri Wedarini(1108505047)A.A Made Istri Rismayanti(1108505048)Maria Fiani Cahyani(1108505051)

JURUSAN FARMASIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS UDAYANA2014

BAB IPENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang. Antibiotikadalah segolongan senyawa, baik alami maupun sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Penggunaan antibiotika khususnya berkaitan dengan pengobatan penyakit infeksi, meskipun dalam bioteknologi dan rekayasa genetika juga digunakan sebagai alat seleksi terhadap mutan atau transforman. Antibiotika bekerja seperti pestisida dengan menekan atau memutus satu mata rantai metabolisme, hanya saja targetnya adalah bakteri (Abdurahman, 2006). Antibiotika adalah suatu metabolit sekunder yang dihasilkan organisme tertentu yang dalam jumlah kecil mampu membunuh atau menghambat pertumbuhan organisme lain. Beberapa antibiotik diperoleh dari berbagai mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan yang ekstrim seperti di daerah dengan suhu tinggi, suhu rendah, laut bagian dalam, padang pasir, lapisan es, sumber air panas, dan minyak. Mikroorganisme penghasil antibiotik terdiri dari beberapa genus bakteri dan jamur seperti Micromonospora, Streptomyces, Actinomycetes, dan Bacillus (Sulistyaningsih, 2008).Bakteri memproduksi antibiotika pada fase stasioner dalam siklus kehidupannya, karena pada fase ini mulai terjadi persaingan untuk mendapatkan nutrisi. Untuk memenangkan persaingan, bakteri memproduksi antibiotik untuk menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroorganisme lainnya. Untuk mengisolasi antibiotika, umumnya bakteri penghasil antibiotika ditanam (difermentasi) dalam medium cair tertentu sampai fase stasionernya. Isolasi mikroorganisme merupakan rangkaian cara yang dilakukan untuk memisahkan mikroorganisme dari lingkungan sekitar. Hasil dari isolasi adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies mikroorganisme. Biakan murni merupakan biakan yang setiap koloni mikroorganisme hanya memiliki satu jenis mikroorganisme (Sulistyaningsih, 2008).Sebagian besar antibiotika digunakan secara medis untuk mengobati penyakit bakteri, meskipun sebagian diketahui efektif menyerang penyakit fungi. Antibiotik digunakan dalam berbagai bentuk-masing-masing menetapkan persyaratan manufaktur agak berbeda. Untuk infeksi bakteri di permukaan kulit, mata, atau telinga, antibiotikdapat diterapkan sebagai salep atau krim. Jika infeksi internal, antibiotik dapat ditelan atau disuntikkan langsung ke dalam tubuh. Dalam kasus ini, antibiotik dikirim seluruh tubuh denganpenyerapan ke dalam aliran darah. Secara ekonomi dihasilkan lebih dari 100.000 ton antibiotika per tahun, dengan nilai penjualan hampir mendekati $ 5 milyar (Kusnadi, 2009). Berdasarkan informasi diatas tentang berbagai manfaat yang diperoleh dari penggunaan antibiotik untuk mengobati pengakit infeksi terutama oleh bakteri, maka kami tertarik untuk mengetahi bagaimana cara mengisolasi mikroorganisme penghasil zat antibiotik.

1.2. Rumusan MasalahBerdasarkan latar belakang diatas maka diperoleh masalah : Bagaimana cara mengisolasi mikroorganisme penghasil zat antibiotic ?

1.3. TujuanTujuan kami membuat makalah ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara mengisolasi mikroorganisme penghasil antibiotik.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 AntibiotikaAntibiotika (L. anti = lawan, bios = hidup) adalah zat-zat kimia yang dihasilkanoleh fungi dan bakteri, yang memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kcil. Turunan zat-zat ini yang dibuat secara semi-sintesis, juga termasuk kelompok ini, begitu pula semua senyawa sintetis dengan khasiat antibakteri. Kegiatan antibiotik untuk pertama kalinya ditemukan oleh dr. Alexander Flemming pada 1928 secara kebetulan. Tetapi penemuan ini baru dikembangkan dan digunakan pada permulaan perang dunia II ditahun 1941, dimana saat itu kebutuhan antibiotik sangat diperlukan untuk menanggulangi infeksi dari luka-luka akibat pertempuran. Kemudian, para peneliti di seluruh dunia menghasilkan banyak zat lain dengan khasiat antibiotik. Tetapi berhubung dengan sifat toksis pada manusia, hanya sebagian kecil saja yang dapat digunakan sebagai obat. Adapun antibiotik yang penting diantaranya adalah streptomisin (1944), k;loramfenikol (1947), tetrasiklin (1948), neomisin (1949), eritromisin (1952), vankomisin (1955), rifampisin (1960), gentamisin (1963), bleomisin (1965), doksorubisin (1969), minosiklin (1972) dan tobramisin (1974) (Tjay dan Rahardja, 2007).Antibiotik merupakan obat yang sangat penting dan digunakan untuk memberantas berbagai penyakit infeksi. Zat kimia ini dihasilkan oleh organisme, terutama jamur dan bakteri tanah, dan mempunyai khasiat bakteriostatik atau bakterisid terhadap satu atau beberapa mikroorganisme lain yang rentan terhadap antibiotik. Antibiotik adalah senyawa organik yang dihasilkan oleh berbagai spesies mikroorganisme dan bersifat toksis terhadap spesies mikroorganisme lain (Sumardjo, 2006).Antibiotik biasanya diklasifikasikan berdasarkan strukturnya dan atau fungsi dari antibiotik itu sendiri. Klasifikasi antibiotik meliputi golongan Beta laktam (-laktam) dan Aminoglikosida. Beta laktam (-laktam)Beta-laktam (-laktam) merupakan asam organik yang terlarut di dalam air. Di pasaran saat ini terdapat sekitar 50 antibiotik dengan perbedaan struktur -laktam. Dimana semuanya bersifat bakterisidal, tidak toksik, relatif murah. Turunan antibiotik ini memiliki mekanisme aksi sebagai inhibitor sintesis dinding sel bakteri. AminoglikosidaAntibiotik dengan struktur aminoglikosida memiliki mekanisme aksi dalam menghambat sintesis protein bakteri. Turunan golongan ini perlu dilakukan monitoring terhadap efek terapeutiknya untuk mengetahui efek bakterisidalnya dan mencegah terjadinya efek samping. (bioMerieux,Inc, 2008)Adapun beberapa mekanisme kerja dari antibiotika adalah perintangan sintesis protein, sehingga kuman musnah atau tidak berkembang lagi misalnya kloramfenikol, tetrasiklin, aminoglikosida, makrolida dan linkjomisin. Selain itu, beberapa antibiotika bekerja terhadap dinding sel (penisilin dan sefalosporin ) atau membran sel (polimiksin, zat-zat polyen dan imidazol), lihat pendahuluan seksi II. Antibiotika tidak aktif terhadap kebanyakan virus kecil, mungkin karena virus tidak memiliki proses metabolisme sesungguhnya, melainkan tergantung seluruhnya dari metabolisme host (Tjay dan Rahardja, 2007).Keberhasilan bioteknologi dalam mencari metabolit mikroba untuk digunakan sebagai senyawa antimikroba (antibiotik) adalah hal yang penting untuk memerangi penyakit pada manusia, hewan dan tumbuhan. Mikroorganisme merupakan suatu sumber yang menghasilkan senyawa dengan efek farmakologis, fisiologis, medis atau aplikasi pertanian. Antibiotik terus memainkan peran penting dalam pengembangan teknik kultur jaringan dan skrining dasar, terutama dalam biokimia, biologi molekuler, mikrobiologi dan genetika (termasuk rekayasa genetika) dan ke tingkat lebih rendah, farmakologi dan kimia organik (Nanjwade et al., 2010).

2.2 CarriomycinCarriomycin merupakan antibiotik polieter, dapat diisolasi dari kaldu kultur Streptomyces hygroscopicus strain T-42082. Antibiotik ini aktif terhadap bakteri Gram-positif, beberapa jamur, ragi dan Mycoplasma. Selain itu, telah dilaporkan bahwa, analisis unsur menghasilkan nilai berikut: asam bebas, C 64.01, H 9.30, O 26,04 (%); garam natrium, C 62.27, H 8.99, Na 2.50 (%); garam kalium, C 61.62, H 8.79, K'-.25 (%). Asam bebas dari carriomycin menghasilkan prisma tidak berwarna yang memiliki rumus molekul C47H80O15 (MW 885,15), dan mp 120-1220C. Tidak memiliki karakteristik penyerapan maxima dalam spektrum ultraviolet. Adanya satu karboksil dan tiga kelompok metoksi diamati dari yang inframerah, PMR dan spektrum CMR. Spektrum penyerapan inframerah dari carriomycin sebagai berikut: asam bebas, 2940, 1700, 1462, 1383, 1085, 972 cm-1, garam natrium, 2935, 1610, 1461, 1382, 1080, 972 cm-1. Puncak pada 1700 cm-1 dan 1610 cm-1 sesuai dengan COON dan COO-, masing-masing (El-Safey et al., 2013).

2.3 Streptomyces hygroscopicusKingdom: BacteriaPhylum: ActinobacteriaClass: ActinobacteriaOrder: ActinomycetalesFamily: StreptomycetaceaeGenus: StreptomycesSpecies: S. Hygroscopicus(OWW, 2014)Streptomyces hygrocopicus umumnya ditemukan di tanah. Streptomyces adalah bateri batang gram positif, non-motil, memproduksi spora, dan merupakan bakteri aerobik obligat. Membentuk filamen lunak yang disebut hifa / miselium dengan fragmen yang jarang (Health Protection Agency, 2009). Genus Streptomyces adalah salah satu genus yang dominan dan dikenal untuk menghasilkan antibiotik dan mayoritas molekul bioaktif lebih tinggi dibandingkan produksi oleh mikroba lain seperti jamur dan ragi. Streptomyces hygroscopicus adalah spesies Streptomyces sp. yang berpotensi menghasilkan antibiotik sebagai metabolit sekunder. Pembentukan metabolit hasil dari proses fermentasi mikroba dan sangat tergantung pada tingkat biomassa filamen, profil morfologi, serta lingkungan seperti hutan hujan tropis, laut, gurun, dan es (Rivo et al., 2013).Banyak actinomycetes akan tumbuh pada media bakteriologi umum yang digunakan di laboratorium, seperti nutrient agar, trypticase agar kedelai, blood agar, dan bahkan brain-heart infusion infus agar. Antibiotik merupakan produk paling terkenal dari actinomycete. Morfologi dari actinomycete yang tumbuh pada agar dapat memberikan petunjuk yang berguna dan cepat untuk Identitasnya (Nanjwade et al., 2010).

2.4 Produksi AntibiotikaAntibiotika dibuat secara mikro-biologi, yaitu fungi dibiakkan dalam tangki-tangki besar bersama zat-zat gizi khusus. Oksigen atau udara steril disalurkan ke dalam cairan pembiakan guna mempercepat pertumbuhan fungi dan meningkatkan produksi antibiotikumnya. Setelah diisolasi dari cairan kultur, antibiotikum dimurnikan dan aktivitasnya ditentukan. Antibiotika semisintetis.Apabila pada persemaian (culture substrate) dibubuhi zat-zat pelopor tertentu, maka zat-zat ini diinkorporasi ke dalam antibiotikum dasarnya. Hasilnya disebut senyawa semi-sintetis, misalnya penisilin-V. Antibiotika sintesis.Tidak lagi dibuat dengan cara biosintesis, melainkan seluruhnya melalui sintesa kimiawi, misalnya kloramfenikol.(Tjay dan Rahardja, 2007).

2.5 FermentasiFermentasi adalah teknik konversi biologis substrat kompleks menjadi senyawa sederhana oleh berbagai mikroorganisme seperti bakteri dan jamur. Dalam perjalanan metabolik ini, mereka juga melepaskan beberapa senyawa tambahan selain dari produk fermentasi biasa, seperti karbon dioksida dan alkohol. Senyawa tambahan ini disebut metabolit sekunder. Metabolit sekunder berkisar dari beberapa antibiotik hingga peptida, enzim dan faktor pertumbuhan. Metabolit sekunder juga disebut 'senyawa bioaktif' karena mereka memiliki aktivitas biologis. Baru-baru ini, peneliti telah menunjukkan bahwa beberapa metabolit sekunder dapat diproduksi secara industri dan memiliki nilai ekonomi. Metabolit sekunder telah digunakan dalam berbagai industri seperti farmasi dan makanan, khususnya di bidang probiotik dan prebiotik. Munculnya industri ini telah menyebabkan amplifikasi teknik yang digunakan di laboratorium dalam skala besar (Subramaniyam and Vimala, 2012).

BAB IIIPEMBAHASAN

3.1 PembahasanTingkat resistensi bakteri terhadap berbagai jenis antibiotika semakin meningkat. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memproduksi, mempurifikasi dan menguji aktivitas biologi dari antibiotik Carriomycin. Carriomycin merupakan antibiotik polieter yang diisolasi dari kultur bakteri Streptomyces hygroscoprcus. Antibiotik ini aktif untuk membunuh bakteri gram positif, beberapa jamur, khamir dan mycoplasma (El safey et al., 2013).Antibiotik diproduksi dalam media dengan komposisi starch, KNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl dan CaCO3. Ph medium dikondisikan 7.4 sebelum disterilisasi. Streptomyces hygroscoprcus kultur hari ke 5 diinokulasi ke dalam 250 ml Erlenmeyer mengandung 75ml medium untuk memproduksi antibiotik. Erlenmeyer kemudian diinkubasi pads rotary shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 5 hari pada suhu 30oC.Volume larutan yang dihasilkan sebanyak 20 liter kemudian disaring dengan kertas whatman. Setelah disaring kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Filtrat kemudian diuji aktivitasnya terhadap mikroorganisme. Media kultur disentrifugasi untuk menghilangkan biomass. Supernatant kemudian diatur pH nya (4-9) dan di ekstraksi dengan pelarut organik perbandingan 1 : 1 (v / v). Ekstrak organik kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator menggunakan batuan vakum. Ekstrak kering yang diperoleh dilarutkan dalam 1 ml DMSO dan dilakukan pengujian bioassay dengan metode paper disk diffusion.Proses presipitasi dari crude dilakukan dengan melarutkan crude pada petrolium eter dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Presipitat kemudian diambil dan dilakukan pengujian aktivitas antimikroba. Pemisahan komponenen dari senyawa antimikroba dilakukan dengan kromatografi lapis tipis. Crude kering dilarutkan dalam DMSO, kemudian ditotolkan lalu dielusi dalam sistem solvent n-butanol-asam asetat-air dengan perbandingan (3:1:1, v/v). Hasil elusi plat TLC dikeringkan selama semalam untuk menghilangkan semua sisa pelarut atau solvent. Senyawa yang terpisah dilihat dibawah UV pada panjang gelombang 254 nm (absorbansi dan pada 365 nm (flouresensi) dan spot yang aktif terdeteksi dengan bioautografi.Tahap pemurnian agen antimikroba dilakukan menggunakan kromatografi kolum (2 x 25) gel silika. Pelarut elusi yang digunakan adalah campuran kloroform-metanol-air dengan perbandingan (2:3:1, v/v/v). Kolum didiamkan selama semalam sampai silika gel (BDH 60 120 mesh) siap untuk digunakan. Satu mL endapan crude yang akan difraksinasi ditambahkan kedalam permukaan kolum gel silika dan ekstrak di adsorpsi diatas silika gel. 50 fraksinasi dikumpulkan (setiap fraksi berisi 5 ml) dan diuji aktivitas antimikrobanya.Selanjutnya akan dibahas mengenai fermentasi dan pemisahan agen antimikroba. Proses fermentasi dilakukan dilakukan selama 5 hari pada suhu 30C menggunakan media nitrat pati cair sebagai media produksi. Filtrasi dilakukan dengan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 15 menit. Filtrat bening mengandung metabolit aktif (20 L), dilakukan adjustment sampai pH 7 lalu proses ekstraksi dilakukan menggunakan n-Butanol pada level 1:1 (v/v). Fase organik diambil, dan dievaporasi dibawah tekanan menggunakan evaporator rotary. Material sisa dilarutkan pada DMSO yang masih tersisa dan disaring. Filtrat diuji aktivitas antimikrobanya. Agen antimikroba diendapkan dengan petroleum eter (bp 60-80C) dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit, lalu didapatkan endapan minyak berwarna kuning keputihan. Pemisahan agen antimikroba menjadi komponen tunggal dilakukan dengan menggunakan KLT dengan pelarut n-butanol-asam asetat-air perbandingan (3:1:1, v/v). Diantara 3 pita pengembangan, Hanya satu pita yang memiliki Rf 0,8 dan menunjukkan aktivitas antimikroba. Proses pemurnian melalui kolum kromatografi dengan silika gel mengindikasikan fraksi yang paling aktif selama pengujian organism berada pada rentang 22 sampai 28.Agen antimikroba murni memiliki karakteristik titik lebur 120C. Senyawa terlarut bebas dalam kloroform, etil asetat, n-butanol, aseton, etil alkohol, methanol dan 10% isopropyl alkohol. Namun senyawa ini tidak larut dalam air, petroleum eter, heksan dan benzene.Aktivitas biologi dari agen antimikroba ditunjukkan dari data spectrum agen antimikroba yang mengindikasikan agen aktif melawan gram positif dan uniseluler serta fungi. MIC dari antibiotik ditetapkan dan hasilnya menunjukkan minimum inhibitory concentration (MIC) dari antibiotik dihasilkan oleh Streptomyces hygroscopicus, M 1 2 1 melawan: Staph. aureus, NCTC 7447 and Bacillus subtilis, NCTC 10400 15.73 g/ ml); Micrococcus luteus, ATCC 9341; Bacillus pumilus, NCTC 8214 and S. cerevisiae ATCC 9763 (31.25 g/ ml); Candida albicans, IMRU 3669; Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani (46.9 g/ ml); Aspergillus niger IMI 31276; Asp. flavus, IMI 111023 and Botrytis fabae (52.7 g/ ml); Aspergillus fumigatus, ATCC 16424 (93.75 g/ ml) and P. chrysogenum ( 011 < g/ ml).Dari penelitian ini diperoleh formula C47H80O15 dengan C sebesar 64,02%, H sebesar 9,29%, O sebesar 26,04%, N sebesar 0,0%, dan S sebesar 0,0%. Spectrum UV menunjukkan bahwa komponen aktif terlarut dalam metanol:air pada panjang gelombang 278 nm. Hasil identifikasi dari antibiotik menunjukkan bahwa antibiotik tersebut masuk kedalam antibiotik Carriomycin dengan BM sebesar 885.

3.2 KesimpulanKomponen aktif dihasilkan oleh Streptomyces hygroscoprus M 121 dan dideteksi sebagai antibiotik polyether yaitu Carriomycin (C47H80O15) dengan BM 885 g/mol dan absorbansi maksimumnya pada UV-vis yaitu pada panjang gelombang 278 nm.

DAFTAR PUSTAKA

Abdurahman, D. 2006. Biologi Kelompok Pertanian dan Kesehatan. Bandung : Grafindo Media Utama.bioMerieux,Inc. 2008. Costumer Education: Antibiotic Classification. Available at: http://www.biomerieux-usa.com/upload/VITEK-Bus-Module-1-Antibiotic-Classification-and-Modes-of-Action-1.pdf, cited: 24-okt-2014.El-Safey, M. E., H. M. Atta, and K. M. Aljaralah. 2013. Antibiotic Production by Streptomyces hygroscopicus, M 121 Isolated from Kingdom of Saudi Arabia. Life Science Journal 10 (2).Kusnadi,dkk. 2009.Mikro Industri. (Serial online). Cited 2011 November 10. Avalaibleat:http://file.upi.edu/direktori/fpmipa/jur._pend._biologi/196805091994031kusnadi/buku_common_text_mikrobiologi,_kusnadi,dkk/bab_xiii_mikro_industri.pdf.Nanjwade et al. 2010. Production of Antibiotics from Soil-Isolated Actinomycetes and Evaluation of their Antimicrobial Activities. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 9 (4): 373-377.Rivo, Y. B., et al. 2013. Metabolite extract of Streptomyces hygroscopicus Hygroscopicus inhibit the growth of Plasmodium berghei through inhibition of ubiquitin proteasome system. Tropical Biomedicine 30(2): 291300.Subramaniyam, R. And R. Vimala. 2012. Solid State and Submerged Fermentation for The Production of Bioactive Substances: a Comparative Study. International Journal of Science and Nature , VOL. 3(3). 480-486. Sulistyaningsih. 2008. Identifikasi Isolat Bakteri Penghasil Zat Antibiotik dari Cairan Kantong Tanaman Kantung Semar (Nepenthes ampullaria, Jack). Bandung: Universitas Padjajaran.Sumardjo, D. 2006. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta: Buku Krdokteran EGC. QWW. 2014. Streptomyces: Other Bits/An Introduction to Streptomyces. Available at: http://openwetware.org/wiki/Streptomyces:Other_Bits/An_Introduction_to_Streptomyces Cited : 25 Oct. 2014.Tjay, T.H. dan K. Rahardja. 2007. Obat-obat Penting: Khasiat, Penggunaan dan Efek Sampingnya. Jakarta: PT. Elex Media Komputindo.

0