Retroviruslike Elements (Elemen Seperti Retrovirus)

Retroviruslike Element ditemukan di berbagai jenis eukariot, di antaranya ragi,

tumbuhan, dan hewan. Meskipun berbeda dalam hal ukuran dan sekuen nukleotida, kesemuanya

memiliki struktur dasar yang sama: sebuah daerah pusat pengkodean diapit oleh LTRs (Long

Terminal Repeats), yang berorientasi dalam arah yang sama. Sekuen ulangan khasnya berupa

ratusan pasang nukleotida yang panjang.

Daerah pengkodean Retroviruslike Elements mengandung sejumlah kecil gen, biasanya

hanya dua. Gen-gen tersebut se-homolog pada gen gag dan pol yang ditemukan di retrovirus;

gag mengkode sebuah protein struktural dari kapsul virus, dan pol mengkode sebuah protein

reverse transcriptase/integrase. Retrovirus memiliki gen ketiga, yang mengkode sebuah

komponen protein dari pembungkus virus. Pada retroviruslike elements, protein gag dan pol

memainkan peranan penting dalam proses transposisi.

Salah satu dari pembelajaran penting dari retroviruslike elements adalah Transposon Ty1

pada kapang Saccharomyces cerevisiae. Elemen tersebut kira-kira memiliki panjang 5,9 pasang

kilobasa; LTRs-nya kira-kira sepanjag 340 pasang basa, dan menghasilkan sebuah 5-bp duplikasi

daerah target pada penyisipan ke kromosom. Sebagian besar strain kapang memiliki kira-kira 35

salinan elemen Ty1 di dalam genomnya. Ty1 memiliki dua gen, TyA dan TyB, yang sehomolog

pada gen gag dan pol dari retrovirus. Studi biokimia telah menunjukkan bahwa dua gen tersebut

dapat membentuk partikel-partikel seperti virus di dalam sitoplasma sel kapang. Transposisi

elemen Ty1 melibatkan transkripsi balik dari RNA (Gambar 11.14). setelah DNA disintesis dari

DNA Ty1, sebuah reverse transcriptase dikode oleh gen TyB menggunakannya sebagai sebuah

pola untuk membuat DNA untai ganda, keungkinan di dalam partikel seperti virus. Kemudian

DNA tersintesis yang baru diangkut menuju nukleus dan disisipkan di suatu tempat di dalam

genom, membuat sebuah elemen Ty1 yang baru.

Gambar 11.14: Transposisi elemen Ty1 kapang.

Retroposons

Retroposons, atau non-LTR Retrotransposons, merupakan suatu kelas dari

retrotransposon yang terdistribusi besar dan luas. Termasuk di antaranya elemen F, G, dan I

Drosophila dan beberapa macam elemen pada mamalia. Elemen-elemen tersebut berpindah

melalui sebuah molekul RNA yang ditranskripsi balik ke DNA, biasanya oleh protein yang

dikode oleh elemen-elemennya sendiri. Meskipun mereka membuat duplikasi situs target ketika

mereka masuk ke dalam kromosom, mereka tidak memiliki pengulangan balik atau langsung

sebagai bagian integral dari termini mereka. Sebaliknya , mereka dibedakan oleh urutan

homogen A: pasangan basa T pada salah satu ujungnya. Urutan ini berasal dari transkripsi balik

dari poli (A) ekor yang ditambahkan dekat ujung 3’ RNA retroposon selama pematangannya.

Oleh karena itu retroposons yang terhubung (terintegrasi) menunjukkan sisa-sisa asal mereka

sebagai transkripsi balik dari RNAs polyadenylated.

Pada Drosophila, retroposons khusus ditemukan di ujung (telomere) kromosom, di mana

mereka melakukan fungsi kritis pengisian DNA yang hilang oleh replikasi kromosom yang tidak

lengkap. Dengan setiap putaran dari replikasi DNA, kromosom menjadi lebih pendek.

Pemendekan terjadi karena DNA polimerase hanya bisa bergerak dalam satu arah, menambahkan

nukleotida ke ujung 3’ sebagai primer (dasar). Biasanya, primer adalah RNA, dan ketika

dihapus, daerah beruntai tunggal yang tersisa pada akhir rangkap DNA. Di langkah replikasi

berikutnya, untai yang kurang menghasilkan rangkap yang lebih pendek daripada yang asli.

Sebagaimana proses ini terus berlanjut, siklus demi siklus, kromosom kehilangan bahan dari

ujungnya.

Untuk mengimbangi kerugian ini, Drosophila telah mengembangkan mekanisme aneh

yang melibatkan setidaknya dua retroposons yang berbeda, satu disebut HeT-A dan yang lain

disebut TART (for telomere-associated retrotransposon). Mary Lou Pardue, Robert Levis,

Harald Biessmann, James Mason, dan rekan-rekan telah menunjukkan bahwa kedua elemen ini

bertransposisi dengan istimewa ke ujung kromosom, memperpanjangnya dengan beberapa

kilobasa. Akhirnya, sekuen/urutan transposisi hilang oleh replikasi DNA yang tidak lengkap, tapi

kemudian transposisi baru terjadi untuk memulihkannya. Oleh karena itu HeT-A dan TART

retroposons melakukan fungsi penting dalam regenerasi ujung kromosom yang hilang.

Elemen Transposable Pada Manusia

Dengan urutan genom manusia, hal tersebut sekarang memungkinkan untuk menilai

pentingnya elemen transposabel dalam spesies kita sendiri. Setidaknya 44 persen dari DNA

manusia berasal dari elemen transposabel, termasuk elemen seperti retrovirus (8 persen dari

urutan genom), retroposons (33 persen), dan beberapa kerabat dari elemen yang bertransposisi

dengan mekanisme potong dan tempel (3 persen).

Unsur transposabel yang utama adalah retroposon disebut dengan L1. Elemen ini

termasuk dalam suatu kelas dari sekuen/urutan yang dikenal sebagai elemen nuklir panjang

yang diselingi, atau long interspersed nuclear elements (LINEs). Elemen L1 lengkap memiliki

panjang sekitar 6 kb, Elemen L1 memiliki promotor internal yang dikenal sebagai RNA

polimerase II, dan memiliki dua kerangka baca terbuka: ORF1, yang mengkode sebuah protein

ikatan asam nukleat, dan ORF2, yang mengkode sebuah protein dengan kegiatan endonuklease

dan reverse transcriptase. Genom manusia mengandung antara 3000 dan 5000 elemen L1

lengkap. Selain itu, mengandung lebih dari 500.000 elemen L1 yang dipotong pada ujung 5’-nya,

elemen-elemen L1 yang tidak lengkap ini secara transposisi tidak aktif. Setiap elemen L1 dalam

genom, apakah lengkap atau tidak lengkap, biasanya dipanggul oleh duplikasi situs target yang

pendek.

Transposisi L1 melibatkan transkripsi elemen L1 lengkap menjadi RNA dan transkripsi

balik RNA ini ke DNA (Gambar 17.15). Kedua proses ini berlangsung di dalam inti. Namun,

sebelum RNA L1 ditranskripsi balik, perjalanannya ke sitoplasma di mana ia ditranslasi ke

dalam polipeptida yang tampaknya tetap terkait dengannya saat kembali ke inti. Polipeptida yang

dikode oleh ORF2 memiliki fungsi endonuklease yang mengkatalisis pembelahan salah satu

rangkaian dari inti DNA di sebuah situs penyisipan calon/bakal di dalam kromosom. Ujung 3’

yang terbuka dari untai DNA ini dibelah kemudian berfungsi sebagai primer untuk sintesis DNA

menggunakan RNA L1 sebagai template dan mengaktifkan reverse transcriptase yang disediakan

oleh polipeptida ORF2. Dengan cara ini, urutan DNA L1 disintesis pada titik di mana kromosom

polipeptida ORF2 telah menunjukkan torehan untai tunggal. DNA L1 yang baru disintesis

selanjutnya dibuat beruntai ganda oleh sintesis DNA lebih lanjut, dan produk beruntai ganda

tersebut kemudian secara kovalen diintegrasikan ke dalam kromosom untuk membuat elemen L1

yang baru. Kadang-kadang wilayah 5’ RNA L1 tidak disalin ke DNA. Ketika ini terjadi,

penyisipan L1 yang dihasilkan akan kekurangan urutan 5’, termasuk promotor, dan tidak akan

mampu menghasilkan RNA melalui transkripsi biasa. Dengan demikian, elemen-elemen L1

lengkap ini secara transposisi akan tidak aktif.

Salinan transpos dari elemen L1 lengkap tertentu telah ditemukan melalui analisis

individu dengan penyakit genetik seperti hemofilia dan distrofi otot. Kelangkaan kasus ini

menunjukkan bahwa frekuensi transposisi L1 pada manusia rendah. Dua jenis lain dari urutan

LINE, L2 (315.000 eksemplar) dan L3 (37.000 eksemplar), ditemukan dalam genom manusia,

namun tak satu pun dari elemen ini secara transposisi aktif.

Elemen nuklir selingan yang pendek, atau SINES, kelas kedua yang paling melimpah

dari elemen transposabel dalam genom manusia. Unsur-unsur ini biasanya kurang dari 400

panjang pasang basa dan tidak mengkode protein. Seperti semua retroposons, mereka memiliki

urutan A: pasangan basa T pada salah satu ujungnya. SINEs bertransposisi melalui suatu proses

yang melibatkan transkripsi balik dari suatu RNA yang telah ditranskripsi dari promotor intern.

Meskipun rincian dari proses transposisi tidak dipahami dengan baik, tampaknya bahwa reverse

transcriptase yang dibutuhkan untuk sintesis DNA dari RNA SINE yang dilengkapi oleh elemen

LINE-tipe. Dengan demikian, SINEs tergantung pada LINEs untuk memperbanyak dan masuk

ke dalam genom. Dalam hal ini, mereka dapat dianggap sebagai retroposons yang parasit pada

retroposons yang secara fungsional otonom dan otentik seperti L1. Genom manusia mengandung

tiga keluarga dari SINEs, Alu , MIR , dan elemen Ther2/MIR3. Namun, hanya elemen Alu -

dinamakan untuk suatu enzim yang mengenali urutan nukleotida spesifik dalam dirinya - yang

secara transposisi aktif.

Genom manusia memiliki lebih dari 400.000 urutan yang berasal dari unsur-unsur seperti

retrovirus. Sebagian besar dari urutan ini adalah LTRs soliter. Meskipun lebih dari 100 keluarga

yang berbeda dari elemen seperti retrovirus telah diidentifikasi dalam DNA manusia, hanya

sedikit yang tampaknya telah aktif secara transposisi dalam sejarah evolusi baru-baru ini. Seperti

LINEs dan SINEs yang tidak aktif, hampir semua urutan seperti-retrovirus manusia adalah fosil

genetik yang tersisa dari saat mereka secara aktif bertransposisi.

Transposon Cut-and-paste merupakan komponen kecil dari genom manusia. Urutan DNA

telah mengidentifikasi dua elemen yang jauh terkait dengan elemen Ac/Ds jagung, serta

beberapa jenis lain dari unsur-unsur. Semua bukti yang ada menunjukkan bahwa jenis transposon

telah tidak aktif secara transposisi selama jutaan tahun.

Gambar 17.15: Mekanisme Hipotesis untuk transposisi elemen L1 di dalam genom manusia.

TRANSPOSON SEBAGAI MUTAGEN

Mutasi spontan seringkali merupakan hasil aktifitas dari elemen yang dapat berubah

(transposable). Pada Drosophila, contohnya, banyak dari alel mutant dari gene white terjadi

melalui penyisipan transposon. Faktanya, alel mutant dari gene white, w1, yang ditemukan oleh

T.H. Morgan, merupakan hasil dari penyisipan transposon. Hal ini menunjukkan bahwa

transposon merupakan mutagen instrinsik.

Para ahli genetika telah mengunggkap potensi mutagen dari transposon untuk merusak

gen. pembentukan mutagen dengan transposon pertama kali dilakukan pada tahun 1970an dan

1980an menggunakan elemen P dari Drosophila. Persilangan antara jantan dari strain P dan

betina dari strain M menghasilkan keturunan yang elemen P warisan dari induk jantan menjadi

sangat aktif. Element transpose ini berada pada garis keturunan dari anakan hasil persilangan,

elemen tersebut mampu menyebabkan mutasi yang dapat diperbaiki dengan menyilangkan

keturunan hybrid dengan benar.

Jenis lain dari transposon telah digunakan untuk menginduksi mutasi pada genom

nematode, ikan, tikus, dan berbagai jenis tanaman. Mutagenesis dengan transposon memiliki

keuntungan pada metode tradisional menginduksi mutasi karena sebuah gen yang telah termutasi

dengan penyisipan elemen transposable ditandai dengan sebuah sekuens DNA yang telah

diketahui. Penanda transposon dapat digunakan untuk mengisolasi gen dari, campuran DNA

yang banyak dan heterogen dengan menggunakan penanda yang berasal dari versi salinan dari

transposon, mutagenesis menggunakan penanda transposon merupakan teknik standar dalam

genetika.

PERUBAHAN GENETIK DENGAN TRANSPOSON

Beberapa transposon pada bakteri, membawa gen yang produknya tidak berhubungan

dengan transposisi. Hal ini menunjukkan bahwa transposon mungkin dapat digunakan untuk

memindahkan gen dengan jenis yang berbeda di dalam genom, efeknya, gen tersebut bertindak

sebagai kargo transposon. Mungkin juga transposon dapat digunakan untuk memindahkan gen

antar organisme, yaitu untuk merubah organisme dengan menggunakan DNA yang diperoleh

dari organisme lain.

Ide tersebut menginspirasi Gerald Rubin dan Allan Spradling untuk mengetahui apakah

transposon dapat membawa klon gen kepada sebuah organisme. Mereka memilih satu dari

banyak gen yang mengontrol warna mata pada Drosophila. Gen ini, disebut rosy (ry), mengkode

enzim xanthine dehydrogenase. Lalat yang kekurangan enzim ini-yaitu mutan homozigot ry-

memiliki mata coklat. Sedangkan lalat yang homozigot ry+ memiliki mata merah. Rubin dan

Spradling meggunakan teknik DNA rekombinan untuk menyisipkan gen ry+ pada elemen P

yang tidak lengkap yang telah diklon pada plasmid bakteri. Rekombinan elemen ini

dilambangkan dengan P(ry+). Pada plasmid lain, mereka mengklon elemen P yang lengkap yang

mampu mengkode tranposase elemen P. Rubin dan Spradling kemudian menginjeksikan

campuran dari dua plasmid tersebut pada embrio Drosophila yang homozygot alel mutan ry.

Mereka berharap transposase terbentuk dengan elemen P yang lengkap akan mengkatalis elemn

yang tidak lengkap untuk berpindah dari plasmidnya menuju kromosom pada sel anakan dan

membawa gen ry+ bersama sebagai kargo. Ketika lalat yang diinjeksi dewasa, rubin dan

Spradling mengawinkan lalat tersebut dengan lalat mutan ry. Pada keturunannya, mereka

menemukan banyak yang memiliki mata merah. Analisi molekuler menunjukkan bahwa lalat

dengan mata merah membawa elemen P(ry+). Rubin dan Spradling kemudian memperbaiki

warna mata mutan dengan menyisipkan gen rosy dari lalat normal pada genome lalat mutan

tersebut. Mereka secara genetis mengubah lalat mutan dengan DNA dari lalat liar yang normal.

Teknik yang dikembangkan oleh Rubin dan Spradling sekarang secara umum digunakan

untuk mengubah Drosophila dengan menggunakan klon DNA. Elemen P tidak lengkap bertindak

sebagai vector transformasi, dan elemen P lengkap bertindak sebagai sumber transposase yang

dibutuhkan untuk menyisipkan vector tersebut pada kromosom embrio yang diinjeksi. Kata

vector diambil dari bahasa Latin yaitu “pembawa”. Kata ini digunakan karena elemen P tidak

lengkap membawa fragmen DNA menuju genom. Prakteknya berbagai sekuens DNA dapat

ditempatkan pada vector dan disisipkan pada hewan.

Elemen P ini tidak efektif sebagai vector transformasi pada spesies lain. Namun, ahli

genetika telah mengidentifikasi beberapa transposon yang dpat digunakan. Contohnya

transposon piggyback dari ngengat yang dapat bertindak sebagai vector transformasi pada

berbagai spesies, dan transposon sleepingbeauty dari salmon bekerja baik pada vertebrata

termasuk manusia, yang dikembangkan sebagai agen untuk terapi gen.

Gambar. Perubahan genetis pada Drosophila menggunakan vector elemen P

TRANSPOSON DAN ORGANISASI GENOM

Beberapa daerah genom secara khusus kaya akan sekuens transposon. Pada Drosophila

contohnya, transposon terkonsentrasi pada pusat heterokromatin dan pada pada heterokromatin

yang berbatasan dengan eukromatin pada masing-masing lengan kromosom. Namun, banyak dari

transposon-transposon ini mengalami mutasi pada titik dimana mereka tida dapat dipindahkan

secara genetis.

Beberapa bukti, khususnya pada studi sitology dari Drosophila oleh Johng Lim,

menunjukkan bahwa elemen transposable berperan dalam evolusi struktur kromosom. Beberapa

transposon Drosophila berimplikasi pada penyusunan kembali kromosom, dan beberapa

menyusun kromosom pada frekuensi yang tinggi. Mekanisme yang mungkin terjadi adalah

pindah silang antara transposon homolog yang terletak pada posisi yang berbeda dalam

kromosom. Jika dua transposon dengan pasangan orientasi yang sama dan berpindah silang maka

segmen antara keduanya akan terhapus.

Gambar 2. Rekombinasi antara dua transposon dengan orientasi yang sama

Pindah silang juga dapat terjadi antara transposon yang terletak pada kromosom yang

berbeda. Pada gambar 3. Terlihat bahwa masing-masing kromatid membawa transposon yang

terorientasi pada arah yang sama. Transposon di kiri berpasangan dengan transposon di kanan

pada kromatid yang lain. Pindah silang antara pasangan transposon ini menghasilkan dua

kromatid yang mengalami perubahan, satu kekurangan segmen antara dua transposon dan yang

lainnya memiliki kelebihan segmen ini.

Gambar 3. Duplikasi dan delesi pada pindah silang transposon antara dua kromatid

Poin Utama

1. Transposon digunakan dalam penelitian genetik untuk menginduksi mutasi

2. Transposon digunakan sebagai vector untuk memindahkan DNA dalam dan antar genom

3. Pindah silang antara transposon berpasangan dapat menyebabkan penyusuna kembali

kromosom

Pertanyaan: